Artykuł metodologiczny

Test koimmunoprecypitacji z wykorzystaniem endogennych białek jądrowych z komórek hodowanych w warunkach niedotlenienia

DOI:

10.3791/57836

⸱

2 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół koimmunoprecypitacji do badania interakcji białko-białko między endogennymi białkami jądrowymi w warunkach niedotlenienia. Metoda ta jest odpowiednia do wykazania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niski poziom tlenu (niedotlenienie) wyzwala różne reakcje adaptacyjne, a kompleks czynnika indukowanego hipoksją 1 (HIF-1) działa jako główny regulator. HIF-1 składa się z heterodimerycznej podjednostki α regulowanej tlenem (HIF-1α) i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β (HIF-1β), znanej również jako translokator jądrowy receptora węglowodorów arylowych (ARNT), regulującej geny zaangażowane w różne procesy, w tym angiogenezę, erytropoezę i glikolizę. Identyfikacja białek oddziałujących z HIF-1 jest kluczem do zrozumienia szlaku sygnałowego hipoksji. Oprócz regulacji stabilności HIF-1α, niedotlenienie wyzwala również translokację jądrową wielu czynników transkrypcyjnych, w tym HIF-1α i ARNT. Warto zauważyć, że większość obecnych metod stosowanych do badania takich interakcji białko-białko (PPI) opiera się na systemach, w których poziomy białek są sztucznie zwiększane przez nadekspresję białek. Nadekspresja białek często prowadzi do niefizjologicznych skutków wynikających z artefaktów czasowych i przestrzennych. Tutaj opisujemy zmodyfikowany protokół koimmunoprecypitacji po leczeniu hipoksją przy użyciu endogennych białek jądrowych oraz jako dowód koncepcji, aby pokazać interakcję między HIF-1α i ARNT. W tym protokole niedotlenione komórki zostały zebrane w warunkach niedotlenienia, a bufor do płukania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco został również wstępnie zrównoważony do warunków hipoksyjnych przed użyciem w celu złagodzenia degradacji białka lub dysocjacji kompleksu białkowego podczas reoksygenacji. Ponadto frakcje jądrowe zostały następnie wyekstrahowane w celu zagęszczenia i ustabilizowania endogennych białek jądrowych oraz uniknięcia możliwych fałszywych wyników, często obserwowanych podczas nadekspresji białek. Protokół ten może być wykorzystany do wykazania endogennych i natywnych interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedotlenienie występuje, gdy do komórek i tkanek ciała dostarczana jest niewystarczająca ilość tlenu. Odgrywa kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak różnicowanie komórek macierzystych, stany zapalne i nowotwory1,2. Czynniki indukowane hipoksją (HIF) działają jako heterodimery złożone z regulowanej tlenem podjednostki α i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β, znanej również jako ARNT3. Do tej pory zidentyfikowano trzy izoformy podjednostek HIF-α (HIF-1α, HIF-2α i HIF-3α) oraz trzy podjednostki HIF-β (ARNT/HIF-1β, ARNT2 i ARNT3). HIF-1α i ARNT są powszechnie wyrażane, podczas gdy HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 i ARNT3 mają bardziej ograniczone wzorce ekspresji4. Kompleks białkowy HIF-1 jest kluczowym regulatorem odpowiedzi na niedotlenienie. W warunkach niedotlenienia HIF-1α stabilizuje się, a następnie przemieszcza się do jądra i dimeryzuje z ARNT5. Następnie kompleks ten wiąże się ze specyficznymi nukleotydami znanymi jako elementy reagujące na hipoksję (HRE) i reguluje ekspresję docelowych genów zaangażowanych w różne procesy, w tym angiogenezę, erytropoezę i glikolizę6. Oprócz tej "kanonicznej" odpowiedzi, szlak sygnalizacji niedotlenienia jest również znany z tego, że komunikuje się z wieloma szlakami sygnałowymi odpowiedzi komórkowej, takimi jak Notch i czynnik jądrowy-kappa B (NF-κB)7,8,9.

Identyfikacja nowych białek oddziałujących z HIF-1 jest ważna dla lepszego zrozumienia szlaku sygnalizacji niedotlenienia. W przeciwieństwie do ARNT, który jest niewrażliwy na poziom tlenu i ulega konstytutywnej ekspresji, poziomy białka HIF-1α są ściśle regulowane przez komórkowy poziom tlenu. W normoksji (21% tlenu) białka HIF-1α ulegają szybkiej degradacji10,11. Krótki okres półtrwania HIF-1α w normoksji stwarza szczególne wyzwania techniczne dla wykrywania białka z ekstraktów komórkowych, a także dla identyfikacji białek oddziałujących z HIF-1α. Ponadto kilka czynników transkrypcyjnych, w tym te należące do kompleksu HIF-1, przemieszcza się do jądra w warunkach niedotlenienia12,13,14. Większość obecnych metod stosowanych w badaniach IPP jest wykonywana z wykorzystaniem niefizjologicznej nadekspresji białek. Doniesiono, że taka nadekspresja białka powoduje różne defekty komórkowe poprzez wiele mechanizmów, w tym przeciążenie zasobów, nierównowagę stechiometryczną, rozwiązłe interakcje i modulację szlaku15,16. Jeśli chodzi o badania IPP, nadekspresja białek może prowadzić do wyników fałszywie dodatnich, a nawet fałszywie ujemnych, w zależności od właściwości i funkcji białek o nadekspresji. W związku z tym obecne metody badań IPP muszą zostać zmodyfikowane w celu ujawnienia fizjologicznie istotnych IPP w warunkach niedotlenienia. Wcześniej wykazaliśmy interakcję między HIF-1 a białkiem wiążącym czynnik transkrypcyjny GA rodziny Ets (GABP) w niedotlenionych komórkach P19, co przyczynia się do odpowiedzi promotora Hes1 na hipoksję17. W tym miejscu opisujemy protokół koimmunoprecypitacji w celu zbadania IPP między endogennymi białkami jądrowymi w warunkach niedotlenienia. Interakcja między HIF-1α i ARNT jest pokazana jako dowód słuszności koncepcji. Protokół ten jest odpowiedni do demonstrowania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a współregulatorami transkrypcji w warunkach niedotlenienia, w tym między innymi do identyfikacji białek oddziałujących z HIF-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja protokołu, która wykorzystuje ludzką embrionalną komórkę nerki 293A (HEK293A), jest zgodna z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang w Singapurze.

1. Indukcja niedotlenienia w komórkach HEK293A

  1. Przygotuj cztery 10-centymetrowe szalki i wysiej 3–5 x 106 HEK293A komórek na talerzu w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Dulbecco (DMEM, 4,5 g/l glukozy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 110 mg/l pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    UWAGA: Wysiew komórek powinien być przeprowadzany w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC). Powierzchnie wszystkich materiałów, które mają być umieszczone w BSC, należy przetrzeć 70% etanolem.
  2. 24 godziny po wysianiu, gdy komórki osiągną zbieżność 80–90%, umieścić dwie szalki w komorze podbrzusza inkubatora w komorze rękawicowej inkubatora (patrz tabela materiałów) z 1%O2 i 5% CO2 w temperaturze 37 °C, a pozostałe dwie szalki przechowywać w temperaturze normoksji (21%O2, 5% CO2 w temperaturze 37 °C) przez 4 godziny. Użyj jednego zestawu komórek normoksycznych i niedotlenionych do oceny leczenia hipoksji za pomocą Western blot i wykorzystaj drugi zestaw komórek do eksperymentów z koimmunoprecypitacją.
    UWAGA: Poziom tlenu można ustawić na poziomie 0–5%, a czas trwania leczenia hipoksji można zmieniać w zależności od typu komórki i celu badania.

2. Ekstrakcja całych komórek i jądra

UWAGA: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje na temat używanych w tym protokole.

  1. Zbierz komórki kontrolne normoksji.
    1. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i przepłukać komórki 10 ml DPBS (pH 7,0–7,2) za pomocą pipety 10 mL.
      UWAGA: Unikaj dotykania pipetą monowarstwy komórek. Podczas mycia delikatnie odpipetuj DPBS w dół ścianki płytki do hodowli komórkowej, aby uniknąć utraty komórek.
    2. Odpipetować 5 ml lodowatego DPBS do płytki i zeskrobać komórki z powierzchni płytki w lodowatym PBS za pomocą skrobaka do komórek.
    3. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.
  2. Zebrać komórki hodowane w warunkach niedotlenienia.
    1. Wstępnie zrównoważyć DPBS do warunków hipoksji, umieszczając odkrytą szklaną butelkę z odczynnikiem o pojemności 100 ml wypełnioną DPBS w podkomorze hipoksji (1 %O2 i 5 % CO2 w temperaturze 37 °C) na 24 godziny wcześniej.
    2. Około 1 godzinę przed pobraniem komórek poddanych działaniu hipoksji należy umieścić pojemnik na lód zawierający lód w komorze przetwarzania w komorze rękawicowej, która została zrównoważona z 1%O2 i 5% CO2 . Przenieść butelkę zawierającą wstępnie zrównoważony hipoksyjny DPBS z podkomory hipoksji do komory procesowej i umieścić ją na lodzie.
    3. Po 4 godzinach od zabiegu hipoksji przenieść komórki z podkomory hipoksji do komory roboczej, która została wstępnie zrównoważona z 1%O2 i 5% CO2 .
    4. Usunąć pożywkę hodowlaną przez aspirację i przepłukać komórki raz 10 ml lodowatego, wstępnie zbalansowanego, hipoksyjnego DPBS za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    5. Dodać 5 ml lodowatego, wstępnie zbalansowanego DPBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml i usunąć komórki przez skrobanie za pomocą skrobaka do komórek.
    6. Przechylić płytkę do hodowli komórkowej i zebrać oderwane komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Przenieść zawiesinę komórek w DPBS do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.
    7. Otworzyć drzwi między komorą przetwarzania i komorą buforową komory rękawicowej, z których obie zostały wstępnie zrównoważone z 1% O2 i 5% CO2 . Przenieść stożkowe probówki o pojemności 15 ml na lodzie zawierające komórki poddane działaniu hipoksji z komory przetwarzania do komory buforowej. Otworzyć drzwi komory buforowej i całkowicie wyjąć ogniwa ze schowka podręcznego.
  3. Osadzać zarówno komórki normoksyczne z 2,1, jak i komórki niedotlenione z 2,2 przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj ekstrakty z całych komórek.
    1. Zawiesić osady komórkowe w 500 μl lodowatego buforu do lizy testu immunoprecypitacji radiowej (RIPA) zawierającego 50 mM chlorowodorku trisaminometanu (Tris-HCl) pH 8,0, 150 mM chlorku sodu (NaCl), 1% NP-40 typu tergitolu (NP-40), 0,5% deoksycholanu sodu i 0,1% dodecylosiarczanu sodu (SDS), uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy (patrz Tabela materiałów), kilkakrotnie pipetując granulki komórek w górę iw dół.
    2. Przenieś lizaty komórkowe do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i trzymaj na lodzie przez 30 minut, od czasu do czasu wirując.
    3. Odwirować lizaty komórkowe przy 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Zebrać sklarowany nad osadem, podwielokrotność 50 μl supernatantu do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Przygotować ekstrakty jądrowe za pomocą zestawu do ekstrakcji jądrowej (patrz tabela materiałów).
    1. Delikatnie ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl buforu do lizy NL uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,1 M ditiotreitolem (DTT), kilkakrotnie pipetując granulki komórek w górę iw dół.
    2. Dodać 25 μl roztworu detergentu NP do zawiesiny komórek i wirować przez 10 s z maksymalną prędkością.
    3. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Zebrać sklarowany nad osadem (ekstrakty cytoplazmatyczne), podatkować 50 μl supernatantu do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. Zawiesić osad zawierający jądra komórkowe w 500 μl buforu do lizy NL uzupełnionego 1x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,1 M DTT poprzez wirowanie przez 5 s z maksymalną prędkością.
    6. Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zachować pastylkę jądrową.
    7. Zawiesić pastylkę jądrową w 50 μl buforu ekstrakcyjnego NX1 uzupełnionego koktajlem 1x inhibitora proteazy, kilkakrotnie pipetując osad w górę iw dół.
    8. Inkubować przez 30 minut na lodzie, wirując przez 10 s co 5 minut z maksymalną prędkością.
    9. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odsolić ekstrakty jądrowe.
    1. Zebrać supernatant z kroku 2.5.9 i przenieść do miniurządzeń do dializy o maksymalnej objętości 100 μl na jednostkę.
    2. Zakryj mini urządzenia do dializy i umieść je w urządzeniu do flotacji.
    3. Umieścić urządzenie flotacyjne w zlewce zawierającej 500 ml wstępnie schłodzonego buforu do dializy (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% glicerolu, 100 mM chlorku potasu (KCl), 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) i 0,5 mM DTT) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
      Uwaga: PMSF jest niebezpieczny. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą lub wdychania.
    4. Pobrać próbki z rogu mini urządzeń do dializy i przenieść do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    5. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, podatkować 25 μl każdego supernatantu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Ocena leczenia niedotlenienia poprzez wykrycie ekspresji białka i subkomórkowej lokalizacji HIF-1α

  1. Określić stężenie białka w całej komórce lub ekstraktach jądrowych/cytoplazmatycznych za pomocą testu mikropłytki zestawu do oznaczania białek z kwasem bicinchoninowym (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta18.
  2. Rozcieńczyć lizaty komórkowe w 1x bufor do próbek Laemmli zawierający 5% 2-merkaptoetanolu i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min.
    Uwaga: Nie dotykaj powierzchni bloku grzewczego, ponieważ może to spowodować oparzenia.
  3. Oddzielić białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE).
    1. Załaduj równe ilości białka (25 μg) do każdej studzienki prefabrykowanych żeli gradientowych SDS-PAGE (4–20%) wraz z 3 μl markera masy cząsteczkowej.
    2. Uruchom żel w buforze roboczym zawierającym 2,5 mM Tris, 19,2 mM glicyny, 0,01% SDS, PH8,3 przez 30 minut przy 200 V.
  4. Przenieś białka z żelu do błony nitrocelulozowej.
    1. Zmontuj kanapkę transferową (bibuła filtracyjna-żel-membrana-bibuła filtracyjna) z żelem po stronie anody i membraną po stronie katody kasety.
    2. Umieść kasetę w zbiorniku transferowym wypełnionym buforem transferowym zawierającym 2.5 mM trisaminometan (Tris), 19.2 mM glicynę i 20% metanolu.
      UWAGA: Metanol jest łatwopalny i powinien być przechowywany w szafie do przechowywania cieczy łatwopalnych.
    3. Przenoszenie należy przeprowadzać przez 1 godzinę przy napięciu 100 V w chłodni.
  5. Zablokować blot w 10 ml buforze blokującym zawierającym 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 i 5% mleka beztłuszczowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na shakerze.
  6. Inkubować blot z przeciwciałem anty-HIF-1α (rozcieńczenie 1/500) w tym samym buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Umyj blot 3 razy przez 5 minut za każdym razem 50 ml TBS-T.
  8. Inkubować blot z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1/1 000) w 10 ml TBS-T zawierającego 5% odtłuszczonego mleka w proszku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj blot 3 razy przez 5 minut za każdym razem 50 ml TBS-T.
  10. Wymieszać po 500 μl odczynników A i B o zwiększonej chemiluminescencji (ECL) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i krótko przemieszać.
  11. Nanieść substrat ECL na blot i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  12. Przechwytywanie sygnałów chemiluminescencyjnych za pomocą systemu obrazowania opartego na kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD).
    1. Nadmiar podłoża ECL należy odsączyć, dotykając krawędzi membrany bibułką i umieścić membranę w osłonie arkusza.
    2. Umieść membranę na tacy na próbkę systemu obrazowania opartego na kamerze CCD.
    3. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazu (patrz Spis materiałów) i przechwyć obrazy z następującymi ustawieniami: Plik → Nowy protokół → Konfiguracja protokołu jednokanałowego → → Obrazowanie żelowe (Zastosowanie: Chemi; Obszar obrazowania: żel Bio-Rad Ready; Obrazowanie Ekspozycja: Oprogramowanie automatycznie zoptymalizuje czas ekspozycji dla intensywnych pasm) → Uruchom protokół
      UWAGA: Czas naświetlania można ustawić ręcznie, aby uzyskać optymalne obrazy.

4. Immunoprecypitacja i wykrywanie białek immunoprecypitowanych

  1. Przemyć 50 μl kulek białka A/G sefarozy w 500 μl buforu TBS w 1,5 ml probówek do mikrowirówek i granulować kulki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki w 100 μl buforu TBS.
  3. Dodać 2 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-ARNT (1,4 mg/ml) lub mysiej immunoglobuliny G (IgG) (1,4 mg/ml), która została przygotowana przez rozpuszczenie 0,7 mg mysiej IgG w 500 μl buforu TBS.
  4. Umieścić probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierające kulki w rotatorze probówek i inkubować przez 2 godziny z prędkością 10 obr./min w chłodni.
    UWAGA: Z rurkami należy obchodzić się delikatnie i utrzymywać zawiesinę zawierającą koraliki na dnie tubki.
    5. Granulki osadzać
  5. przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatanty.
  6. Rozcieńczyć 200 μg jądrowego lizatu białkowego otrzymanego w kroku 2.6.5 w 800 μl buforu IP składającego się z 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glicerolu, 0,2% NP-40 i 1x koktajlu inhibitorów proteazy. Inkubować lizat z kulkami sprzężonymi z przeciwciałami, otrzymanymi w kroku 4.5, przez noc w temperaturze 4 °C.
    7. Granulki osadzać
  7. przez odwirowanie w stężeniu 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatanty i przemyć kulki 3 razy 1 ml lodowatego TBS zawierającego 0,2% NP-40.
  8. Gotować kulki w 50 μl buforu do próbek Laemmli w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  9. Odwirować kulki w temperaturze 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, zebrać supernatant i wyrzucić kulki.
    UWAGA: Supernatant może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub -20 °C przez długi czas.
  10. Wykryj obecność HIF-1α w immunoprecypitowanych kompleksach białkowych za pomocą western blot, jak opisano wcześniej w kroku 3.3 i następnych.
    UWAGA: Na tym etapie nie jest wymagane oznaczanie ilościowe białka. Załadować pełną objętość (50 μl) supernatantu z każdej próbki do każdego dołka prefabrykowanych żeli gradientowych SDS-PAGE (4–20%)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić odpowiedź komórkową na niedotlenienie, zbadano poziomy ekspresji i subkomórkową lokalizację składników kompleksu HIF-1 po leczeniu niedotlenienia. HEK293A komórki hodowano w warunkach niedotlenienia przez 4 godziny lub utrzymywano w normoksji jako kontrolę. Poziomy białka HIF-1α i ARNT badano w ekstraktach całokomórkowych lub jądrowych/cytoplazmatycznych za pomocą western blot. Zgodnie z oczekiwaniami, całkowite poziomy HIF-1α były regulowane w górę przez niedotlenienie, podcza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleks HIF-1 jest głównym regulatorem homeostazy tlenu komórkowego i reguluje mnóstwo genów zaangażowanych w różne komórkowe reakcje adaptacyjne na niedotlenienie. Identyfikacja nowych białek oddziałujących z HIF-1 jest ważna dla zrozumienia hipoksyjnej transdukcji sygnału. Eksperymenty z koimmunoprecypitacją są powszechnie stosowane w badaniach IPP w celu wyznaczenia szlaków transdukcji sygnału komórkowego. Jednak nadekspresja białek jest nadal szeroko stosowana, co może prowadzić do eksperymentalnych artefaktów. Pona...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy prof. Sin Tiong za korzystanie ze stacji roboczej do hipoksji. Prace te były wspierane przez: Ministerstwo Edukacji Singapuru, MOE 1T1-02/04 i MOE2015-T2-2-087 (do Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, M4230003 grantu na start na Uniwersytecie Technologicznym Nanyang (dla P.O.B.), Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych, Fundacja Rodziny Erling-Persson, Fundacja Novo Nordisk, Fundacja Stichting af Jochnick, Szwedzkie Stowarzyszenie Diabetologiczne, Scandia Insurance Company, Diabetes Research and Wellness Foundation, Fundacja Bertha von Kantzowa, Strategiczny Program Badawczy w Cukrzycy w Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage oraz Fundacja Knuta i Alice Wallenbergów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
1,0 M Bufor Tris-HCl, pH 7,4 1st BASE1415
Białko A/G Koraliki sefarozyAbcamab193262
Naturalne białko IgG myszyAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli Bufor do próbekBio-Rad1610737
2-merkaptoetanolBio-Rad1610710
Nitroceluloza Membrana    Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404Odtłuszczone mleko w proszku do zastosowań western blotting
10x Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS)Bio-Rad1706435
10% Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad1610732
10x Tris/Glycine Buffer Bio-Rad1610771
Precision Plus Dwukolorowe standardy białkoweBio-Rad1610374
IgG przeciw królictwom, Przeciwciało sprzężone z HRPSygnalizacja komórkowa7074
Przeciwciało przeciw myszy, Przeciwciało sprzężone z HRP Sygnalizacja komórkowa7076
Odczynnik SignalFire ECLSygnalizacja komórkowa6883
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoCorning21-030-CV
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Przeciwciało Merck Millipore52332
ARNT/HIF-1 beta Novus BiologicalsNB100-124 Stężenie: 1,4 mg/ml
Przeciwciało alfa HIF-1Novus BiologicalsNB100-479Stężenie: 1,0 mg / ml
YY1Przeciwciało Novus BiologicalsNBP1-46218Stężenie: 0,2 mg / ml
Qproteome Nuclear Protein KitQiagen37582Bufor do lizy NL i bufor ekstrakcyjny NX1 są dostarczane w zestawie
GAPDH PrzeciwciałoSanta Cruzsc-47724Stężenie: 0,2 mg / ml
Glicerol (≥ 99%)SigmaG5516
Chlorek potasuSigmaP9541
Bufor RIPASigmaR0278
Chlorek sodu (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM, 4,5 g/L glukozy)Thermo Fisher Scientific11995065
Ditiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific10270106
HEK293A linia komórkowaThermo Fisher ScientificR70507
Metanol Thermo Fisher Scientific67-56-1
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122
Tabletki z inhibitorem proteazy Pierce Thermo Fisher Scientific88660
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
QSP końcówka ładująca żel Thermo Fisher ScientificQSP#010-R204-Q-PK1-200 uL
Sprzęt/Instrument
Bibuła filtracyjna o grubej plamie, wstępnie przycięta, 7,5 x 10 cmBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN  Pionowa komórka elektroforetyczna Tetra do mini żeli prefabrykowanych, z Mini Trans-Blot  Moduł i zasilacz PowerPac BasicBio-Rad1658034
4– 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGXBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS+ SystemBio-Rad1708265
RękawicaBioSpherix
Synergy HTX Multi-Mode Czytnik mikropłytek PipetyBTS1LFTA
Costar 5 mlCorning4487
Costar 10 ml Pipety serologiczne pasiasteCorning4488
Costar 25 ml pipety serologiczneCorning4251
Corning 96-dołkowe przezroczyste dno czarne mikropłytki polistyrenoweCorning3631
15 ml wysokie Stożkowe probówki wirówkowe Clarity PPCorning352095
Skrobak do małych komórekCorning3010
Gilson  Zestaw 4 pipet Pipetman L GilsonF167370P2, P20, P200, P1000 i akcesoria
1,5 ml polipropylenowe probówki wirówkoweGreiner Bio-One 
PIPETBOY acu 2 PipetorINTEGRA Biosciences155 000 
Justrite Szafy do przechowywania płynów łatwopalnychJustrite Manufacturing Co.896000
Mieszalnik wirowyLabnetS0200
Inkubator CO2NuAireNU-5820
Wytrząsarki orbitalneStuartSSL1
Rotator rurowy SB3StuartSB3
MicroCL 21RThermo Fisher Scientific75002470
Wirówka Sorvall ST 16 Thermo Fisher Scientific75004240
Naczynia do hodowli tkankowych (100 mm)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer MINI urządzenie do dializyThermo Fisher Scientific6958010K MWCO, boje pływakowe 0,1 ml
do 0,1 ml Slide-A-Lyzer MINI Urządzenia do dializyThermo Fisher Scientific69588
LSE Cyfrowe podgrzewacze do suchej kąpieliThermo Fisher Naukowy1168H25
Thermo Naukowy  Seria 1300 A2 klasa II, typ A2 Szafy bezpieczeństwa biologicznegoThermo Fisher Scientific13-261-308
Software
Image Lab OprogramowanieBio-Rad1709691
serologiczne BioTek 616201 Mikrowirówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819(2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HIF 1 alfabia ko ARNTzestaw do ekstrakcji j drowejkulki Protein AG Sepharosemysi przeciwcia o monoklonalnebufor do immunoprecypitacjibufor do pr bek Laemmli

Powiązane artykuły