Artykuł metodologiczny
Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.
Ta metoda zapewnia szybkie podejście do określenia podziału błony plazmatycznej dowolnego fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo za pomocą profili intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej. Zmierzone profile fluorescencji są dopasowywane za pomocą modelu rozkładu fluorescencji błonowej i cytoplazmy wzdłuż linii nałożonej prostopadle do obwodu komórki. Model ten jest zbudowany z wartości intensywności fluorescencji w komórkach referencyjnych wyrażających znakowany fluorescencyjnie marker cytoplazmy i błonie plazmatycznej znakowanej FM 4-64. Metoda może być stosowana do różnych typów komórek i organizmów; Jednak tylko błony plazmatyczne komórek niesąsiadujących ze sobą mogą być oceniane. Ta szybka metoda oparta na mikroskopii nadaje się do eksperymentów, w których oczekuje się subtelnych i dynamicznych zmian markerów związanych z błoną plazmatyczną i należy je określić ilościowo, np. w analizie zmutowanych wersji białek, leczeniu inhibitorami i obserwacjach transdukcji sygnału. Metoda jest zaimplementowana w wieloplatformowym pakiecie R, który jest sprzężony z makrem ImageJ, które służy jako przyjazny dla użytkownika interfejs.
Białka błony plazmatycznej związane z obwodami są kluczowymi składnikami szlaków sygnalizacji komórkowej. Jedną z ich podstawowych ról jest przejściowa asocjacja i dysocjacja błony plazmatycznej, co jest ważne dla transdukcji sygnału między błoną plazmatyczną a cytoplazmą. Białka błony plazmatycznej związane z obwodem mogą być przyłączone do błony plazmatycznej za pomocą kotwic lipidowych (N-mirystoylacja, S-acylacja lub prenylacja) lub przez domeny wiążące lipidy (oddziałujące z fosforanami fosfatydyloinozytolu, kwasem fosfatydowym itp.).
Właściwości tych białek do wiązania błony plazmatycznej mogą być badane in vivo, np. gdy białko znakowane fluorescencyjnie jest modyfikowane przez mutagenezę kluczowych aminokwasów skierowaną do miejsca, lub gdy jest traktowane różnymi inhibitorami wpływającymi na sygnalizację lipidową. Rozkłady białek błony komórkowej obwodowej są w większości oceniane jakościowo, zwłaszcza w przypadkach, gdy redystrybucja białek jest oczywista. Przedstawiona metoda jest optymalna w sytuacjach, gdy redystrybucja białek jest tylko częściowa i konieczna jest ocena ilościowa. Często stosowane podejście, gdy asocjacja błony plazmatycznej jest szacowana na podstawie obrazów z konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej jako stosunek intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej i w cytoplazmie1,2, jest proste, ale nie dokładne. Intensywności fluorescencji na błonie plazmatycznej odzwierciedlają superpozycję sygnału błony plazmatycznej i cytoplazmy spowodowaną dyfrakcją światła charakterystyczną dla danej techniki mikroskopii fluorescencyjnej i zastosowanych elementów optycznych3. W związku z tym sygnał cytoplazmatyczny jest również zawarty w obszarze błony. Z tego powodu wzór barwienia FM 4-64 nie może być używany jako maska do wyboru sygnału membranowego4. Co więcej, proste pomiary sygnału błonowego w pozycji zdefiniowanej przez maksimum barwienia FM 4-64 zawsze systematycznie zawyżają rzeczywisty sygnał plazmato-błonowy obwodowo związanego białka błony plazmatycznej z powodu superpozycji błony i związku cytoplazmatycznego. Maksimum obserwowanych sygnałów dla znakowanych fluorescencyjnie białek związanych obwodowo również nie kolokalizuje się z maksimum markera błony plazmatycznej (tj. barwnika styrylowego FM 4-64), ale jest przesunięte w kierunku cytoplazmy. Kolejne ograniczenie opiera się na fakcie, że pik emisji FM 4-64 jest szerszy w porównaniu z pikami emisji dla białek zielonej fluorescencji, takich jak GFP, ze względu na zależność dyfrakcji światła od długości fali3.
W opisanej tutaj metodzie, sygnał oznaczonego białka jest wyposażony w dwie empiryczne funkcje opisujące hipotetyczny rozkład odpowiednio błony plazmatycznej i sygnału cytoplazmy. Ta dekompozycja sygnału jest stosowana do liniowych profili fluorescencji, które są nakładane na powierzchnię komórki prostopadle do błony plazmatycznej na obrazach źródłowych, które są regularnymi, dwukanałowymi konfokalnymi sekcjami komórek eksprymujących białka znakowane fluorescencyjnie znakowane barwnikiem FM 4-64.
Pierwsza funkcja używana do dopasowania opisuje dyfrakcję sygnału cytoplazmy na krawędzi komórki. Uzyskuje się go z wcześniej nabytych profili fluorescencyjnych, które mierzono w komórkach wyrażających marker białka cytoplazmy znakowany tym samym chromoforem, co białko związane obwodowo z błoną plazmatyczną. Druga funkcja opisująca dyfrakcję sygnału błony plazmatycznej wywodzi się z fluorescencji FM 4-64. Sygnał ten jest najpierw aproksymowany przez funkcję Gaussa, która jest używana do przybliżonego modelowania dyfrakcji światła źródła punktowego. Po drugie, model ten, ważny dla czerwonej emisji FM 4-64, jest matematycznie przekształcany do postaci, która jest istotna dla długości fali emisji chromoforu używanego do znakowania obwodowo związanych białek będących przedmiotem zainteresowania na błonie plazmatycznej. Obie funkcje są znormalizowane przez maksymalne natężenie i średnią od 10% najwyższych wartości odpowiednio dla sygnału FM 4-64 i sygnału białka cytoplazmatycznego. Dzięki tej dekompozycji sygnału (nieliniowej metodzie dopasowania metodą najmniejszych kwadratów) można łatwo i dokładnie oszacować stosunek błony plazmatycznej do frakcji cytoplazmy badanego białka. Rzeczywisty wymiar fizyczny obliczonego współczynnika podziału mieści się w zakresie mikrometrów, ponieważ stężenie objętościowe cytoplazmy jest porównywane ze stężeniem powierzchniowym na błonie plazmatycznej. Określa odległość od błony plazmatycznej do cytoplazmy, w obrębie której zlokalizowana jest taka sama ilość białek, jak w sąsiednim obszarze błony plazmatycznej. Wartość ta jest równoważna współczynnikowi podziału K2 wprowadzonemu wcześniej5. Metoda jest bardzo szybka, wymaga jedynie pojedynczych odcinków konfokalnych uzyskanych za pomocą rutynowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego i nie jest wymagająca obliczeniowo. Rdzeń analizy został zaimplementowany w przenośnym pakiecie R, a dodatkowe makro ImageJ zostało napisane w celu zapewnienia graficznego interfejsu użytkownika do uruchamiania analizy z intuicyjnych okien dialogowych. Oprogramowanie i bardziej szczegółowy opis metody (opublikowany wcześniej6) można znaleźć na stronie http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
Metoda jest odpowiednia dla izolowanych komórek, protoplastów i tkanek, gdzie błona plazmatyczna poszczególnych komórek jest wyraźnie rozróżnialna, wyrażając fluorescencyjnie oznakowany konstrukt badanego białka związanego obwodowo. Należy użyć chromoforu kompatybilnego z barwieniem FM 4-64. FM 4-64 emituje czerwoną fluorescencję; W związku z tym badane białko może być znakowane białkiem fluorescencyjnym o emisji niebieskiej, zielonej lub żółtej (np. GFP, CFP, YFP). Stabilna transformacja materiału biologicznego jest zalecana, ponieważ umożliwia mniej sztuczne i bardziej powtarzalne obserwacje rozmieszczenia białek. Konieczne jest, aby badane białko miało w miarę jednorodny rozkład cytoplazmatyczny. Lokalizacja białka w retikulum endoplazmatycznym lub innym przedziale błony wewnątrzkomórkowej może dawać sztuczne wyniki.
Dodatkowo, do porównania należy użyć tego samego materiału biologicznego, który wyraża marker cytoplazmatyczny. Komórki mogą być przekształcane przez wolny homofor (ten sam, który jest używany do znakowania białek obwodowych, np. wolnego GFP) lub przez znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania ze zniesioną zdolnością wiązania błony. Zdolność wiązania błony można znieść, na przykład poprzez odcięcie domeny wiążącej błonę lub przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce kluczowych pozostałości aminokwasów (np. miejsc N-mirystoylacji, S-acylacji lub prenylacji itp.).
Dla konfokalnej mikroskopii skaningowej, komórki muszą być oznaczone markerem błonowym, takim jak barwnik FM 4-64. Jeśli barwienie FM 4-64 nie jest odpowiednie dla badanego materiału (ze względu na interferencyjną autofluorescencję, słabą penetrację barwnika itp.), błonę plazmatyczną można znakować np. integralnym białkiem błony plazmatycznej oznaczonym odpowiednim chomoforem (mCherry, RFP itp.). Istotne jest, aby marker miał znikomą lokalizację w przedziałach błony wewnątrzkomórkowej (endomembranach).
Jeśli pracujesz z ustalonymi próbkami i przeciwciałami, można użyć naprawialnego analogu FM 4-64FX lub znakowania błony plazmatycznej przeciwciałem przeciwko odpowiedniemu celowi. W takim przypadku konieczna jest bardzo dokładna ocena wyników, ponieważ procedury utrwalania mogą prowadzić do selektywnej utraty białek zarówno z cytoplazmy, jak i błony komórkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie materiału biologicznego
2. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa
3. Wymagana instalacja oprogramowania
4. Analiza obrazu na Fidżi
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
DREPP10 to specyficzne dla roślin obwodowo związane białko błony plazmatycznej, które jest związane z błoną plazmatyczną poprzez N-mirystoylację i oddziaływanie elektrostatyczne z fosforanami fosfatydyloinozytolu11,12. DREPP został opisany jako składnik maszynerii sygnalizacji wapniowej w komórce roślinnej, a także oddziałuje z cytoszkieletem13,14. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisana tutaj metoda generuje dokładniejsze oszacowanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo w porównaniu z innymi podejściami opartymi na pomiarze intensywności fluorescencji5. Głównym ulepszeniem tej metody jest to, że uwzględnia ona dyfrakcję światła i superpozycję błony plazmatycznej oraz sygnały cytoplazmatyczne. Chociaż wyniki tej metody są skorelowane z wynikami prostej metody opartej na porównaniu intensywności fluorescencji w pozycji błony ze średnim sygnałem...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ten projekt był wspierany przez NPU I, LO1417 (Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Barwnik błonowy do plazmy |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Rozpuszczalnik barwnikowy |
| Zwykły sprzęt (szkiełka mikroskopowe, pipety, końcówki, probówki) | Sprzęt do znakowania komórek i mikroskopii | ||
| Konfokalny laserowy mikroskop | |||
| Zwykły komputer |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenieAn erratum was issued for: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University