Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABA_A, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Streszczenie

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku protokół badania związków w receptorach kwasu gamma-aminomasłowego typu A (GABA_A) i jego wykorzystanie do identyfikacji nowych cząsteczek aktywnych w testach przedklinicznych od receptora rekombinowanego in vitro do ich efektów farmakologicznych na receptory natywne w wycinkach mózgu gryzoni. W przypadku związków wiążących się w miejscu receptora benzodiazepinowego, pierwszym krokiem jest stworzenie pierwotnego badania przesiewowego, które polega na opracowaniu testów wiązania radioligandów na błonach komórkowych eksprymujących główne podtypy GABA_A. Następnie, wykorzystując heterologiczną ekspresję receptorów GABA_A u gryzoni i ludzi w oocytach Xenopus lub komórkach HEK 293, możliwe jest zbadanie, w testach elektrofizjologicznych, fizjologicznych właściwości różnych podtypów receptorów i właściwości farmakologicznych zidentyfikowanych związków. Przedstawiony zostanie tu układ oocytów Xenopus, począwszy od izolacji oocytów i ich mikroiniekcji różnymi mRNA, aż po charakterystykę farmakologiczną za pomocą dwuelektrodowych zacisków napięciowych. Na koniec opisane zostaną zapisy przeprowadzone w wycinkach mózgu gryzoni, które są wykorzystywane jako wtórny test fizjologiczny do oceny aktywności cząsteczek w ich natywnych receptorach w dobrze zdefiniowanym obwodzie neuronalnym. Wraz z zastosowaniem leku demonstrowane są zapisy zewnątrzkomórkowe wykorzystujące odpowiedzi populacyjne wielu neuronów.

Wprowadzenie

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABA_A, od wiązania do fizjologii i farmakologii. W poszukiwaniu nowych cząsteczek specyficznych dla receptorów GABA_A kluczowe jest jak najdokładniejsze zdefiniowanie podtypu zainteresowania i ocena swoistości nowo zidentyfikowanych związków (np. w celu zapoznania się z przeglądem zob. Rudolph and Knoflach¹lub Sieghart²). Typowa ścieżka odkrywania leków i kroki, które należy wykonać, przedstawiono na rysunku 1.

Testy wiążące były i nadal są powszechnie stosowane jako pierwszy krok w odkrywaniu leków. W przypadku receptorów GABA_A są one zoptymalizowane pod kątem identyfikacji związków, które wiążą się z miejscem wiązania benzodiazepin receptora, gdzie wiążą się użyteczne terapeutycznie i bezpieczne leki. Inne techniki, wykorzystujące czytnik płytek do obrazowania fluorometrycznego (FLIPR) testy oparte na czerwonym barwniku o potencjale błonowym³, wykrywają związki takie jak barbiturany, które wiążą się z dodatkowymi miejscami, które są mniej pożądane ze względu na ich niepożądany profil skutków ubocznych. Ponadto stosowane barwniki mogą bezpośrednio aktywować receptory GABA_A, kwestionując w ten sposób przydatność tych testów do odkrywania leków⁴. Testy wiązania mogą dostarczyć jedynie dowodów na to, że dany związek może wiązać się z określoną klasą receptorów. Testy in vitro z błonami komórkowymi służą do identyfikacji selektywnych ludzkich ligandów receptora GABA_A α5β3γ2. Przejściowo transfekowane komórki HEK293 wyrażające ludzkie receptory GABA_A α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 i α3β3γ2 są wykorzystywane do przygotowania błon do tych testów. Działanie ligandów wykrywa się poprzez pomiar scyntylacji [³H]flumazenilu związanego z receptorami błonowymi (hamowanie wiązania [³H]flumazenilu). Główną zaletą tej techniki jest to, że szybkie i skuteczne określenie powinowactwa do wiązania związku w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania jest zapewnione w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania.

Badania funkcjonalne są niezbędne do oceny funkcjonalnej aktywności związków i zaproponowania fizjologicznego i farmakologicznego wyjaśnienia mechanizmów spowodowanych wiązaniem związków z receptorami. Obecnie powszechnie wiadomo, że funkcjonalne receptory GABA_A powstają w wyniku złożenia pięciu podjednostek wokół osi pseudosymetrii utworzonej przez pory jonowe i wynikają ze złożenia pięciu identycznych podjednostek. Większość receptorów GABA_A składa się z dwóch lub więcej różnych podjednostek. Na przykład główny receptor GABA_A w mózgu składa się z podjednostek α1, β2 i γ2 w stechiometrii odpowiednio 2, 2 i 15^,6. Rekonstytucja w systemie gospodarza, takim jak oocyty Xenopus lub komórki HEK293, daje możliwość szybkiego zbadania właściwości farmakologicznych receptorów.

Właściwości farmakologiczne związków są następnie badane za pomocą zapisów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu⁷. Metoda ta pozwala na zbadanie wpływu związków na przekaźnictwo nerwowe i stanowi skuteczny sposób potwierdzenia funkcjonalnego działania związków oznaczanych w heterologicznych systemach ekspresyjnych na poziomie receptorów natywnych w całym środowisku neuronalnym. Neuroprzekaźnictwo GABA-ergiczne można również ocenić na poziomie molekularnym, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC)⁸. Ale zastosowany tutaj protokół oparty na zapisach klamrów krosowych całych komórek w wycinkach mózgu jest bardziej skomplikowany i zapewnia niższą przepustowość.

Na koniec, mocne i słabe strony kaskady badań przesiewowych in vitro używanej do identyfikacji selektywnych ligandów α5β3γ2 są omawiane w perspektywie różnych technik i ich wewnętrznych ograniczeń. Prace te powinny dostarczyć ekspertom i osobom niebędącym ekspertami w dziedzinie receptorów GABA_A pomocnego przeglądu kombinacji różnych podejść in vitro stosowanych w celu rozwiązania problemu odkrycia nowych modulatorów tych kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

Protokół

Xenopus laevis są trzymane i traktowane zgodnie z wytycznymi dla zwierząt w Kantonie Genewskim.

1. Wiązanie radioligandu

1. Przygotowanie płytki do oznaczania
   1. Przygotować 1,5 l buforu do oznaczania z 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl₂, 1,25 mM MgCl₂, 120 mM NaCl i 15 mM Tris; dostosować pH za pomocą HCl do 7,4.
   2. Przygotować związki do badania w temperaturze 50,76 μM (np. związek o objętości 5 μl w temperaturze 10 μM do buforu do oznaczania o pojemności 980 μl w probówce do mikrowirówki). Dobrze je wymieszaj za pomocą maszyny wirowej z dużą prędkością przez 2–5 sekund.
   3. Przygotować wstępne rozcieńczenie związku odniesienia flumazenilu, odpipetowując 1 μl związku (10 mM) do 1,970 μl buforu do oznaczania. Dobrze je wymieszaj za pomocą maszyny wirowej z dużą prędkością przez 2–5 sekund.
   4. Rozcieńczyć [³H]roztwór podstawowy flumazenilu buforem do oznaczania w temperaturze od 4 °C do 4 nM w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
   5. Odpipetować 50 μl/studzienkę buforu do oznaczania do kolumn 1 i 3–11 96-dołkowej mikropłytki, jak pokazano na układzie płytki przedstawionym na Rysunek 2.
   6. Odpipetować 73,2 μl związków rozcieńczonych w 50,76 μM (patrz krok 1.1.2) do kolumny 12 płytki.
   7. Rozcieńczyć każdy związek, stosując postęp geometryczny w 9 krokach (^1E-10 – ^1E-06 M), o objętości transferowej 23,12 μl i wypełnić kolumny 3–11. Dokładnie wymieszać rozcieńczenie. Wymieniaj końcówkę po każdym rozcieńczeniu.
2. Rozcieńczyć błony komórkowe
   1. Rozmrozić błony komórkowe wcześniej wyizolowane z ludzkiego receptora GABA_A HEK293 z nadekspresją (0,025–0,15 mg/ml) w celu uzyskania 80 ml w temperaturze pokojowej (RT) i przenieść zawiesinę do buforu testowego w temperaturze 4 °C.
   2. Zawiesić roztwór membranowy nadal w temperaturze 4 °C za pomocą homogenizatora tkankowego przez 30–40 s przy 10 000–12 000 obr./min.
3. Rozcieńczyć diazepam w celu kontroli nieswoistego wiązania (NSB)
   1. Rozcieńczyć 4 mM roztwór podstawowy diazepamu buforem do oznaczania do stężenia 40 μM w 5 ml.
4. Rozpocznij reakcję
   1. Pobrać pipetę 50 μl 4 nM [³H]flumazenilu do każdego dołka płytki 96-dołkowej i przechowywać w pojemniku z lodowatą wodą.
   2. Dodać 100 μl preparatu błonowego podtypu receptora_A GABA, aby uzyskać stężenie białka 0,5 mg/ml.
   3. Odpipetować 50 μl 40 μM diazepamu do kolumny 2.
   4. Inkubować płytkę przez 1 godzinę na lodzie.
   5. Dodać 50 μl buforu testowego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki filtracyjnej w celu późniejszego oddzielenia membranowego i pomiaru radioaktywności, a następnie zatrzymać reakcję.
5. Zatrzymaj reakcję
   1. Przygotować bufor do przemywania z 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.
   2. Przefiltruj roztwór za pomocą 96-dołkowego kombajnu komórkowego. Umyj płytkę 3x 300 μl lodowatego buforu myjącego na dołek.
   3. Uszczelnij dno płytki folią z tworzywa sztucznego i dodaj 40 μl koktajlu scyntylacyjnego do liczenia płynów w każdym dołku i przetrzyj go etanolem 70%.
   4. Delikatnie potrząsaj płytką przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Niech stoi przez co najmniej kolejną godzinę w RT.
   5. Zmierz radioaktywność (w CPM), umieszczając płytkę na liczniku scyntylacyjnym. Odczekaj pomiar na 3 minuty na dołek.
6. analiza danych
   1. Oznaczyć średnią dla 8 kontrprób wiązania nieswoistego (NSB) i wiązania całkowitego (TB), jak również dla duplikatów lub potrójnych próbek. Obliczyć % wiązania specyficznego (SB) dla średniej z każdej próbki zgodnie z następującym równaniem:
      
      Tutaj,
      całkowita SB = średnia TB minus średnia NSB.
   2. Wykreślić w odciętych % SB w stosunku do rzędnych stężeń inhibitora. Dopasuj dane za pomocą równania analizy konkurencji w jednym miejscu:
      
      Tutaj,
      y = % SB,
      A = minimum y,
      B = maksimum y,
      C = IC₅₀,
      X = logarytm₁₀ stężenia konkurencyjnego związku,
      D = nachylenie krzywej (współczynnik przechyłu
   ).
   3. Obliczyć powinowactwo wiązania (Ki) przy użyciu połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC₅₀), stałej dysocjacji (Kd) [³H]flumazenilu na odpowiednich błonach⁹ oraz stężenia [³H]flumazenilu w teście zgodnie z następującym równaniem wykorzystującym dane:
      

2. Ekspresja receptorów i zapisy w oocytach Xenopus

1. Pobieranie jajników i przygotowanie komórek jajowych
   1. Przygotować sterylny roztwór Bartha z 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO₃, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO, 4,7H2O, 0,33 mM Ca(NO₃)_2,4H2O i 0,41 mM CaCl_2,6H2O, przypH 7,4, uzupełniony 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B.
   2. Przygotować 1x OR2 pożywka (bez CaCl₂) z 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl 2,6H₂O, przy pH 7,4.
   3. Złożyć samicę Xenopus Laevis w głębokim znieczuleniu przez 20 minut w schłodzonym metanosulfonianu trikainy (w stężeniu 150 mg/l, dostosowanym do pH 7,4) i wodorowęglanie sodu (300 mg/l), a następnie zdekapitacjonować.
   4. Szybko zbierz jajniki czystymi nożyczkami i kleszczami i umieść je na 2 szalkach Petriego (10 cm) wypełnionych 40 ml 1x roztworu Bartha i antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi.
   5. Niezdysocjowane jajniki należy przechowywać do 2 tygodni w roztworze Bartha w temperaturze 4 °C.
   6. W celu dysocjacji należy pociąć jajniki czystą żyletką na małe frakcje (1–2 cm³) i inkubować je w 50 ml pożywki OR2 bez CaCl₂ (OR2-noCaCl₂) zawierającej 0,2% kolagenazy (typ I) w temperaturze 17–19 °C w kolbie o pojemności 100 ml z powolnym mieszaniem przez 4–5 godzin. Sprawdzić, czy pręt magnetyczny jest umieszczony około 3–5 cm nad dnem kolbę obrotową, aby uniknąć zgniecenia oocytów.
   7. Po 4–5 godzinach sprawdź, czy większość oocytów jest wolna od pęcherzyka (tzn. pływają pojedynczo). Umyj je 5x 200 ml OR2 uzupełnionym 1,8 mM CaCl₂.
   8. Przenieść odeblkulowane oocyty na szalki Petriego (10 cm) wypełnione roztworem Bartha i antybiotykami/lekami przeciwgrzybiczymi i przechowywać je co najmniej przez noc w temperaturze 17 °C przed wstrzyknięciem cDNA lub mRNA.
   9. Następnego dnia wybierz pod lornetką zdrowy oocyt przedstawiający wyraźne i wyraźne zwierzę w porównaniu z biegunem roślinnym (ciemnobrązowy dla bieguna zwierzęcego i jasnożółty dla bieguna roślinnego). Używaj czystych pipet Pasteura i umieszczaj oocyty jeden po drugim w sterylnej, stożkowej płytce z 96 iniekcjami.
      UWAGA: Nie jest wymagana szczególna ostrożność przy umieszczaniu oocytów do wstrzyknięć mRNA; natomiast w przypadku wstrzyknięć cDNA niezbędne jest zorientowanie oocytów tak, aby biegun zwierzęcy był skierowany do góry.
2. Automatyczna iniekcja mRNA lub cDNA
   1. Zsyntetyzuj mRNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu, postępując zgodnie z zalecanymi instrukcjami. Wyczyść instrumenty i stół za pomocą RNazy i załóż odpowiednie rękawice ochronne.
      UWAGA: Jakość mRNA jest wyznacznikiem dobrej ekspresji i jest niezbędna, aby zapobiec degradacji mRNA podczas procedury wstrzykiwania.
   2. Przygotuj cDNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu i rozpuść żądaną ilość w wodzie destylowanej o stężeniu 0,2 μg/μL.
   3. Wstrzyknąć 10–50 nL roztworu mRNA o stężeniu 0,2 μg/μl lub 10 nL roztworu cDNA o stężeniu w zakresie 0,02–0,2 μg/μl, najlepiej w partiach po 95 oocytów.
   4. W przypadku białek błonowych wymagających wielu podjednostek (tj. heteromerycznych receptorów α1β2γ2 GABA_A), wymieszaj odpowiednie mRNA lub cDNA w pożądanym stosunku (tj. 1:1:1 lub 1:10:1).
   5. Przechowywać oocyt w temperaturze 17 °C, aby zapobiec ekspresji białek szoku cieplnego przez oocyty; przechowywać mikropłytkę w kontrolowanym termicznie miejscu przechowywania.
   6. Rozpuścić badane związki, które dały wynik dodatni w teście wiązania w OR2 w 0,1–1 000 μM do zapisów elektrofizjologicznych i umieścić je w 96-dołkowej płaskiej płytce polipropylenowej.
3. Plazmidy do ekspresji
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi dostępnych na rynku zestawów do syntezy mRNA z bakteryjnymi promotorami T7 lub T6 i przygotuj 20 μl roztworu o stężeniu 0,2 μg/μl w wodzie wolnej od RNaz.
   2. Przygotować co najmniej 20 μl roztworu zawierającego eukariotowy wektor ekspresyjny do ekspresji cDNA, zwykle w stężeniu 0,2 μg/μl rozpuszczony w wodzie wodorodestylowanej.
4. Mikroiniekcja do komórki jajowej i wizualizacja jej jakości
   1. Wstrzyknąć 10–50 nl roztworu zawierającego plazmid (patrz krok 2.3.1 lub 2.3.2) za pomocą szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki do 100 μm, zamontowanej na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnienia lub w automatyczny system iniekcji.
      UWAGA: W omawianym tutaj przykładzie oocyty są wstrzykiwane partiami po 95 sztuk za pomocą zautomatyzowanego systemu odpowiedniego do stosowania z cDNA lub mRNA.
   2. Napełnij igłę do wstrzykiwań 1 μl barwnika, takiego jak błękit metylenowy o stężeniu 1% i wstrzyknij oocyty zgodnie ze standardową procedurą (w jądrze w przypadku cDNA lub w cytoplazmie w przypadku mRNA).
   3. Wstrzyknięte oocyty należy umieścić na około 1 minutę we wrzącej wodzie. Przeciąć oocyty na pół żyletką pod lornetką.
      UWAGA: Barwnik pozostaje zlokalizowany, jak pokazano w Rysunek 3E, co pozwala na precyzyjną obserwację wstrzyknięcia.
5. Dwuelektrodowe zapisy cęgów napięciowych
   1. Umieść płytkę studzienki zawierającą oocyty w zautomatyzowanym systemie, który wykorzystuje zasadę zilustrowaną na Rysunek 4.
      UWAGA: W przeciwieństwie do systemu zacisków krosowych zilustrowanego na rysunku Rysunek 5, rzeczywisty potencjał błony ogniwa jest odczytywany przez elektrodę napięciową.
   2. Zaprogramuj automatyczny system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach, na przykład ze schematem zilustrowanym na rysunku Rysunek 6 w celu określenia zależności między stężeniem a aktywnością.
6. Dopasowanie krzywej
   1. Przeanalizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania, korzystając z ilustrowanej krzywej aktywacji stężenia, wykreśl amplitudę prądu w funkcji logarytmu stężenia agonisty.
   2. Obserwuj krzywą sigmoidalną, którą można następnie dopasować do empirycznego równania Hilla w postaci:
      
      Tutaj,
      Y = ułamek prądu wywołanego,
      EC₅₀ = stężenie dla 50% aktywacji,
      x = stężenie związku,
      n_H = współczynnik Hilla lub pozorna kooperatywność.
   3. Znormalizuj prądy do jedności, dzieląc amplitudę każdej odpowiedzi w stosunku do wartości zarejestrowanej przy najwyższym stężeniu, aby przeanalizować dane uzyskane z serii komórek.
   4. Określ błąd średni i standardowy oraz zrealizuj dopasowanie krzywej za pomocą standardowo dostępnego oprogramowania.

3. Zapisy elektrofizjologiczne w wycinkach mózgu

UWAGA: Plastry szczurów z hipokampa są przygotowywane zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi.

1. Przygotowanie plastrów hipokampa
   1. Przygotować preparację sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (dACSF) ze 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO 4,7H 2 O, 2,5 mM CaCl ₂ 2H₂O, 26 mM NaHCO₃, 10 mM glukozy i 4 mM sacharozy gazowanej w butelce z mieszaniną 95% O₂ i 5% CO_{2 .}
   2. Przygotować zapis sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (rACSF) ze 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH₂PO₄, 2 mM MgSO, 4,7H2 O, 2,5 mM CaCl₂ 2H ₂O,25 mM_NaHCO3 i 10 mM glukozy gazowanej w butelce mieszaniną 95%_O2 i 5% CO_{2 .}
   3. Znieczulij szczury za pomocą mieszaniny 2,5% izofluranu i czystego tlenu i odetnij im głowy.
   4. Odetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej cienkimi nożyczkami. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej, nie uszkadzając leżącej pod spodem tkanki. Usuń czaszkę pęsetą i użyj cienkiej szpatułki, aby zgarnąć mózg.
   5. Umieść mózg w zagazowanym roztworze dACSF w temperaturze pokojowej i wypreparuj lewą formację hipokampa drobną szpatułką.
   6. Wytnij poprzeczne plastry (o grubości 400 μm) ze środkowej części hipokampa za pomocą rozdrabniacza do tkanek i przenieś je do komory nagraniowej za pomocą pędzla malarskiego. Utrzymuj plastry w temperaturze RT przez 45 minut.
   7. Perfuzjować plastry gazowanym rACSF w temperaturze 35 °C i z szybkością 1,5 ml/min. Roztwór rozprowadzić mieszaniną 95%_O2 i 5% CO₂,
      UWAGA: Po tym kroku plastry są gotowe do eksperymentów elektrofizjologicznych.
2. Rejestrowanie pojedynczego wzrostu populacji
   1. Umieść wycinek mózgu w komorze zamontowanej pod mikroskopem.
   2. Perfuzjuj plasterek z szybkością 3 ml/min za pomocą rACSF.
   3. Wyciągnąć mikropipetę ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do pipet o rezystancji ~2 MΩ,
      UWAGA: Ta mikropipeta służy jako elektroda rejestrująca i jest elektrycznie podłączona do amplifier.
   4. Napełnij mikropipetę roztworem zawierającym 2 M NaCl i umieść ją w uchwycie na pipety amplifier.
   5. Umieścić mikropipetę rejestrującą w warstwie piramidalnej w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą prawego mikromanipulatora.
      UWAGA: Lokalizacja jest schematycznie przedstawiona w Rysunek 7.
   6. Umieść izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie na lewym mikromanipulatorze.
      UWAGA: Ta elektroda jest używana jako elektroda stymulująca i jest elektrycznie połączona z generatorem bodźców.
   7. Umieść elektrodę stymulacyjnej w osłonach Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa za pomocą prawego mikromanipulatora.
      UWAGA: Lokalizacja jest schematycznie przedstawiona w Rysunek 7.
   8. Dostarczaj impuls prądu do elektrody stymulacyjnej za pomocą generatora bodźców co 30 s (czas trwania 100 μs, zaczynając od 10 μA) i stopniowo zwiększaj siłę stymulacji, aż pojawi się skok populacji (PS).
   9. Dostosuj siłę bodźca, aby wywołać PS odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy, jaką można uzyskać. PS są filtrowane z częstotliwością 2,4 kHz i digitalizowane z częstotliwością 20 kHz za pomocą wzmacniacza sygnału.
3. Hamowanie sparowanych impulsów
   1. Przygotuj plastry mózgu (krok 3.1) i postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 3.2.1–3.2.7).
   2. Dostarczaj dwa impulsy prądowe (czas trwania 100 μs w odstępie 20 ms) do elektrody stymulacyjnej co 30 s za pomocą generatora bodźców. Ustaw siłę bodźca tak, aby wywoływała PS odpowiadającą 45% maksymalnej amplitudy.
4. Testowanie związków chemicznych
   1. Rozcieńczyć badane związki w gazowanym ACSF, tak aby końcowe stężenie DMSO nie było wyższe niż 0,1%.
   2. Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w tym samym stężeniu, co w roztworze złożonym.
   3. Rejestruj pojedynczy (krok 3.2) lub sparowany impuls (krok 3.3) PS wywoływany przez stymulacje poboczne Schaffera co 30 s przez co najmniej 30 minut. Kształt PS powinien być stabilny w tym okresie bazowym.
   4. Przygotować zlewkę z zagazowanym rACSF zawierającym stałe stężenie badanego związku.
   5. Wykonaj perfuzję wycinka hipokampa tym roztworem, nadal rejestrując pojedynczy lub sparowany impuls PS.
   6. Oceń odzysk po efekcie związku, perfundując plasterek za pomocą zagazowanego rACSF bez związku.
      UWAGA: W celu uzyskania efektów odwracalnych, PS powraca do swojego początkowego kształtu obserwowanego w okresie wyjściowym przed zastosowaniem związku.
5. analiza danych
   1. Uśrednij ślady PS zarejestrowane podczas eksperymentu w blokach po 4 za pomocą oprogramowania do analizy danych.
   2. Zmierzyć amplitudy PS uśrednionych ścieżek.
   3. Znormalizuj amplitudy jako procent wartości podstawowych zarejestrowanych 10 minut przed perfuzją związku.
   4. Wyraź dane jako średnią ± SEM.

Wyniki

Wiążący:
Test in vitro z błonami komórkowymi służy do identyfikacji selektywnych ludzkich ligandów receptora GABA_A α5β3γ2 wiążących się w miejscu allosterycznym BZD receptorów zawierających γ2. Przejściowo transfekowane komórki HEK293 wyrażające ludzkie receptory GABA_A α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 i α3β3γ2 i α3β3γ2 są wykorzystywane do przygotowania błon do tego testu. Wpływ potencjalnych ligandów wykrywa się poprzez pomiar scyntylacji [³H]flumazenilu związanego z receptorami błonowymi (hamowanie wiązania [³H]flumazenilu). Następnie generowane są krzywe wiązania przemieszczenia w celu oceny selektywności związków dla określonego receptora GABA_A, jak w przykładzie z RO4938581 (Rysunek 8). Rysunek 9 podsumowuje profil kilku związków referencyjnych, w tym selektywnego modulatora allosterycznego receptora GABA_A α5, RO4938581⁹, które zostały wygenerowane za pomocą testu wiązania.

Zapisy w oocytach Xenopus:
Ekspresja receptorów GABA_A, takich jak heteromer α5β3γ2, wytwarza silne prądy w odpowiedzi na ekspozycję na GABA. Typowe zapisy cęgów napięciowych uzyskane w oocycie wykazującym ekspresję ludzkiego α5β3γ2 w odpowiedzi na krótkie impulsy GABA (30 s) w zakresie do 300 μM pokazano w Rysunek 6. W tym eksperymencie różne stężenia GABA zostały umieszczone w 96-dołkowej płytce, a reakcje wywołano poprzez przemieszczenie komórki w określonej studzience. GABA został dokładnie przepłukany przez powrót komórki do centralnej komory perfuzyjnej i zastosowanie perfuzji roztworu kontrolnego poprzez aktywację odpowiedniej pompy perystaltycznej. Sekwencja programu używana do wyznaczania krzywej aktywacji stężenia jest zilustrowana na Rysunek 6A. Dane te, przeprowadzone w pełni automatycznie, obrazują zarówno jakość zapisów, jakie można uzyskać w oocytach Xenopus, jak i wysoki poziom ekspresji receptora uzyskany kilka dni po wstrzyknięciu mRNA. Eksperymenty, przeprowadzone przy różnych kombinacjach receptorów, dają serię EC₅₀s, czyli stężenie GABA niezbędne do aktywacji połowy receptorów. Wykres wartości EC₅₀ na wykresie pająka, taki jak pokazany na rysunku Rysunek 10, zapewnia szybkie porównanie właściwości receptora i wpływu składu podjednostek.

Aby zbadać efekt negatywnego lub dodatniego modulatora allosterycznego (NAM lub PAM), konieczne jest porównanie odpowiedzi wywołanej przez impuls testowy agonisty (GABA), najpierw w kontroli, a następnie w obecności modulatora. Skuteczny protokół eksperymentalny do przeprowadzenia takiego eksperymentu jest zilustrowany w Rysunek 11. Najpierw określa się odpowiedź komórki na referencyjne stężenie GABA, a sekwencję powtarza się przez zastosowanie tego samego stężenia GABA, a następnie przez jednoczesne zastosowanie GABA i modulatora. Wykres dwóch nałożonych na siebie odpowiedzi ujawnia w tym przykładzie wyraźne hamowanie spowodowane obecnością modulatora. Kwantyfikacja efektu modulatora jest łatwa do uzyskania, obliczając stosunek odpowiedzi wywołanej w obecności modulatora w stosunku do kontroli, a wyniki można wykreślić w postaci wykresu cieplnego. Dane pokazane w Rysunek 12 ilustrują wykres cieplny odpowiadający zapisom trzech zestawów danych uzyskanych dla 96 związków.

Po zidentyfikowaniu związków, które są wystarczająco aktywne, często niezbędne jest sprawdzenie, czy te cząsteczki są aktywne w innych kombinacjach receptorów. W przypadku receptora GABA_A zidentyfikowano 19 genów kodujących różne podjednostki i wiadomo, że funkcjonalny receptor może wynikać z multimerycznego zestawu różnych podjednostek (zobacz Knoflach, Hernandez i Bertrand¹⁰ w celu przeglądu). Chociaż wiele podjednostek i kombinacji daje ogromny repertuar podtypów receptorów, które mogą wymagać przeprowadzenia dużej liczby badań przesiewowych, często można najpierw skupić się na najliczniejszym podtypie, którym w przypadku receptorów GABA_A jest skład α1β2γ2. Eksperymenty przeprowadzone w z ekspresją np. α5β3γ2 i α1β2γ2 w tej samej partii oocytów dają dobre porównanie odpowiednich efektów działania danej cząsteczki. Typowe wyniki uzyskane w trzech komórkach dla α5β3γ2 i α1β2γ2 są pokazane w Rysunek 13, który ilustruje preferencyjną dodatnią modulację jednej cząsteczki przy α5β3γ2.

Protokół eksperymentalny zilustrowany w Rysunek 11 dobrze nadaje się do scharakteryzowania aktywności PAM. W tym protokole badany związek jest stosowany jednocześnie z agonistą w stopniowo rosnących stężeniach. Aby uniknąć możliwych skumulowanych skutków spowodowanych przez wiele aplikacji na tej samej komórce, dla każdego punktu danych mierzona jest nowa i naiwna komórka. Pomiar amplitudy odpowiedzi zarejestrowanej za pomocą samego agonisty, a następnie podczas aplikacji związku, daje stosunek, który określa ilościowo efekt PAM lub NAM. Typowe wyniki uzyskane przy α1β2γ2 i α5β3γ2 dla diazepamu są pokazane w Rycina 14, ujawniając pozorną czułość α5β3γ2, która jest około 10-krotnie wyższa w tej kombinacji receptorów. Te wartości są dobrze skorelowane z opublikowanymi danymi¹¹. Ponieważ uważa się, że miejsce benzodiazepiny jest utworzone przez granicę faz między γ2 a przyległą α podjednostką^12,13,14, czułość α5β3γ2 sugeruje preferencyjne powinowactwo diazepamu do γ2-α5 w porównaniu z γ2-α1. Możliwość ekspresji różnych kombinacji receptorów w połączeniu z efektywną charakterystyką funkcjonalną otwiera wiele sposobów badania determinantów właściwości PAM i ich wpływu na efekty fizjologiczne i farmakologiczne.

Hipokampowe wycinki mózgu:
Eksperymenty z wycinkami mózgu hipokampa szczura są prowadzone w celu walidacji profilu farmakologicznego związków zidentyfikowanych w testach in vitro w natywnym modelu receptorowym. Dominujące podtypy_receptora GABA A ulegające ekspresji w komórkach piramidowych hipokampa to α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 i α5β2/3γ2, które są modulowane przez benzodiazepiny (BDZs)¹⁵. Hamowanie impulsów sparowanych to paradygmat, który może ujawnić pobudliwość obwodu hipokampa, testując zmianę odpowiedzi drugiego z dwóch sparowanych bodźców elektrycznych dostarczanych w odstępie 20 ms. Zmiana drugiej odpowiedzi jest spowodowana GABA-ergicznym sprzężeniem zwrotnym przez interneurony unerwiające warstwę komórek piramidowych^16,17,18. Jak pokazano w Rysunek 7, w sytuacji kontrolnej, druga reakcja dwóch sparowanych bodźców jest hamowana z powodu hamowania GABA-ergicznego. Kiedy to hamowanie jest zmniejszone przez perfuzję wycinka za pomocą β-CCM, nieselektywnego NAM, druga odpowiedź dwóch sparowanych bodźców jest hamowana w znacznie mniejszym stopniu. Ten eksperymentalny paradygmat jest wrażliwy na związki selektywne dla receptora GABA_A zawierającego podjednostkę α5.

Rysunek 1: Strategia selekcji. Typowa ścieżka badań przesiewowych leków rozpoczyna się od wysokoprzepustowych badań przesiewowych, w których duże biblioteki związków są badane pod kątem określonego celu. Po zidentyfikowaniu głównego kandydata rozpoczynają się prace z zakresu chemii medycznej. Podczas tej fazy chemicy będą badać i udoskonalać cząsteczki, przeprowadzając modyfikację strukturalną, aby spełnić pożądane kryteria, takie jak selektywność docelowa, penetracja mózgu, stabilność, degradacja itp. Podczas tej kluczowej fazy konieczne jest ocena, czy modyfikacje chemiczne nie zmieniły właściwości cząsteczki i udoskonalenie w celu wyłonienia najlepszego kandydata. Następnym krokiem jest zidentyfikowanie kilku obiecujących związków i doprowadzenie ich do kolejnych kroków, które obejmują bezpieczeństwo, tolerancję itp. Należy zauważyć, że elektrofizjologia jest wskazana jako test funkcjonalny, ale inne metody, w tym testy fluorescencji wapnia lub barwniki wrażliwe na napięcie, mogą być stosowane jako alternatywy. Te ostatnie metody są również stosowane w testach wysokoprzepustowych jako substytut testów wiążących. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Układ 96-dołkowej powłoki wykorzystywanej do eksperymentów z wiązaniem. Kolumna 1 służy do całkowitych pomiarów wiązania, a kolumna 2 do niespecyficznych pomiarów wiązania. Rzędy A–H są wypełnione 4 różnymi związkami w rosnących stężeniach (kolumny 3–12), każdy związek w duplikatach (tj. Związek 1 w wierszach A i E, Związek 2 w wierszach B i F itd.) reprezentowanych w układzie o różnych kolorach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Mikroiniekcja za pomocą zautomatyzowanego systemu. (A) Precyzyjny system XYZ, w którym szklana igła iniekcyjna wypełniona płynem zawierającym interesujący nas plazmid, jest automatycznie wprowadzana do oocytów. (B) Ten panel pokazuje 96-dołkową płytkę o stożkowym dnie, do której (C) oocyty są automatycznie wstrzykiwane. (D) Panel ten ilustruje zasadę wtrysku. W przypadku wstrzyknięcia jądra igła wnika do oocytu nieco głębiej niż jądro, jak pokazano w panelu B. Następnie igła jest pobierana z jądra (patrz panel C) przed wstrzyknięciem (patrz panel D). (E) Aby ocenić jakość wstrzyknięcia, igłę można wypełnić barwnikiem, a "ugotowane" oocyty można przeciąć na pół. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zautomatyzowana zasada dwóch elektrod zaciskowych napięcie. Zasada opiera się na przenoszeniu preparatu między studzienkami, a nie na nakładaniu cieczy w perfuzji. (A) Lewa strona panelu przedstawia układ umożliwiający zapis w oocycie Xenopus z dwiema elektrodami i małym koszyczkiem, który będzie utrzymywał kroplę cieczy wokół preparatu podczas przemieszczania się z jednej próbki do drugiej. Zdjęcie oocytu umieszczonego w koszu z dwiema elektrodami pokazane jest po prawej stronie. (B) Panel ten pokazuje schematyczną reprezentację zasady zapisu elektrofizjologii "do góry nogami". (C) Ten panel pokazuje rozmieszczenie oocytu, płytki złożonej i stacji mycia na stole do nagrywania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Dwuelektrodowe nagrywanie cęgów napięciowych kontra krosowniki. Typowy dwuelektrodowy zapis napięcia zaciskowego dla oocytów (lewy panel) jest porównywany z konfiguracją patch clamp używaną dla linii komórkowej (prawy panel). Zwróć uwagę na różnicę w wielkości między oocytami, które mają około 1 mm średnicy, a komórkami, które mają około 20 μm. W dwuelektrodowym zacisku napięciowym potencjał błonowy oocytu jest porównywany z pożądanym napięciem utrzymywania, a różnica sygnału jest wstrzykiwana do elektrody prądowej. W nagraniu patch clamp zakłada się, że rezystancja elektrody patch clamp jest znikoma w porównaniu z rezystancją membrany, a zatem, że napięcie narzucone przez wzmacniacz jest wiernie podawane do błony komórkowej¹⁹. Rysunek ilustruje perfuzję ciekłego włókna, w której dwa kanały rurki theta () są wypełnione z jednej strony roztworem kontrolnym, a z drugiej strony roztworem zawierającym lek^20,21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Zależność aktywacji stężenia w ludzkich receptorach α5β3γ2. (A) Sekwencja kontrolująca zautomatyzowany system składa się z serii ikon i ustala protokół eksperymentalny do określenia zależności aktywacji stężenia. W krokach 1–3, jak pokazano w tym panelu, system ładuje oocyt z płytki do koszyka pomiarowego. Prąd upływowy jest mierzony w kroku 2 i jeśli wartość ta przekroczy żądane kryteria, ogniwo jest automatycznie zmieniane (krok 3). Po okresie stabilizacji (krok 4) mierzy się odpowiedź oocytów na referencyjne stężenie GABA (kroki 5 - 8). Oocyty wykazujące prądy większe niż 1 μA są przechowywane do późniejszego pomiaru. W krokach 11-13 komórka jest prowokowana przez różne stężenia GABA_A, a proces powtarza się dla pożądanej liczby stężeń (krok 14) i komórek (krok 15). (B) Ten panel pokazuje typowe prądy wywołane przez serię krótkich aplikacji GABA (30 s) stosowanych w kolejności rosnącej. Czas aplikacji związku jest wskazywany przez paski. (C) Wykres szczytowego prądu wewnętrznego w funkcji logarytmu stężenia GABA daje krzywą aktywacji stężenia, którą można łatwo dopasować za pomocą empirycznego równania Hilla, z krzywą ciągłą, EC₅₀ przy około 11 μM i współczynnikiem Hilla wynoszącym 1,3. Prądy zarejestrowane w 8 komórkach zostały znormalizowane do jedności w celu uzyskania maksymalnej wywołanej odpowiedzi. Słupki wskazują błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: β-CCM, GABA_A NAM zmniejsza hamowanie parowanych impulsów w wycinkach hipokampa. (A) Ten panel pokazuje schematyczną reprezentację wycinka hipokampa szczura. Zabezpieczenia Schaffera (Sch C) pochodzące z aksonów komórek piramidowych CA3 projektują arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych CA1. Mikropipety umieszczono w warstwie piramidalnej (str pyramidale) w celu zarejestrowania skoków populacji (PS) oraz w warstwie radiatum (str radiatum) w celu dendrytycznych zapisów pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola (epsp). Elektroda stymulująca została umieszczona w zabezpieczeniach Schaffera. (B) Ten panel pokazuje PS wywołane przez sparowane bodźce zastosowane przez tę samą elektrodę stymulującą w odstępie 20 ms. Reakcja populacji na drugi bodziec (PS2) ma mniejszą amplitudę niż odpowiedź na pierwszy bodziec (PS1). (C) PS zarejestrowano przy braku (pasek) i obecności β-CCM, nieselektywnego receptora GABA_A NAM (zielony pasek). β-CCM zwiększył amplitudę drugiego PS2 poprzez częściowe zablokowanie jakiegokolwiek hamowania GABA-ergicznego sprzężenia zwrotnego. Słupki wskazują błąd standardowy średniej i ***, że dane są bardzo istotne z p <0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Typowe wyniki wiązania uzyskane w teście konkurencyjnym (inhibicja lub przemieszczenie). Generowane są krzywe wiązania przemieszczenia, na podstawie których można wyznaczyć IC₅₀ i Ki. IC₅₀ to stężenie konkurującego liganda, które wypiera 50% specyficznego wiązania radioligandu, a Ki (stała inhibicji dla leku) to stężenie konkurującego liganda, które zajmowałoby 50% receptorów, gdyby nie było radioligandu. Ki oblicza się z IC₅₀ przy użyciu równania Cheng-Prusoffa:

Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Wiązanie konkurencyjnego przemieszczenia zostało przeprowadzone z wiązaniem ligandów w głównych podtypach receptora GABA_A. Powinowactwo (nM) mierzono za pomocą testu wiązania flumazenilu [³H] i błon komórek HEK293 przejściowo transfekowanych różnymi kombinacjami podjednostek ludzkiego receptora GABA_A. Reprezentacja histogramu wyraźnie ilustruje różnicową czułość obserwowaną dla RO493851 związku o najniższym Ki w receptorach α5β3γ2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Zróżnicowana wrażliwość receptorów na GABA. Wykres receptora GABA EC₅₀ na wykresie pająka i reprezentacja przypuszczalnego składu podjednostek zapewniają skuteczne sposoby porównania roli różnych podjednostek. Należy zauważyć, że wprowadzenie podjednostek γ2 wiąże się ze zmniejszeniem wrażliwości receptora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Badanie efektu modulatora. (A) Ten panel ilustruje sekwencję ikon używanych do sterowania automatycznym systemem. Zwróć uwagę, że dwie ikony (A/D) odpowiadają nagraniu w elemencie sterującym (zielona) i podczas ekspozycji modulatora (czerwona). (B) Panel ten pokazuje typowe prądy rejestrowane w komórce wyrażającej receptor GABA_A podczas takiej sekwencji. Aby ocenić działanie modulatora, przeprowadzono sekwencję pomiaru najpierw reakcji wywołanej ekspozycją na stałe stężenie GABA (zielony ślad), a następnie ekspozycji najpierw na GABA, a następnie na GABA plus modulator (czerwony ślad). Położenie kursorów krzyżyka (niebieskozielony i niebieski) wyznacza wymiary, a niebieski krzyżyk wskazuje maksymalną różnicę między dwoma warunkami nagrywania. Stosunek między stanem sterowania a stanem modulatora jest automatycznie obliczany w oprogramowaniu analitycznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Wykres cieplny z trzema powtórzeniami. Panel ten przedstawia wykres cieplny odpowiadający trzem powtórzeniom efektów modulatora uzyskanych dla 96 związków w ludzkich receptorach α5β3γ2 GABA_A. Stosunki odpowiedzi testowej w stosunku do kontroli w zakresie od 0,5 do 1,2 uznano za nieróżniące się istotnie od kontroli i są reprezentowane przez zieloną kropkę. Współczynniki poniżej 0,5 zostały uznane za reprezentujące efekt hamujący i są reprezentowane przez niebieskie kropki. Współczynniki powyżej 1,2 uznano za wzmacniające odpowiedź i są one reprezentowane przez czerwone kropki. Zwróćcie uwagę na podobieństwo we wzorze między trzema niezależnymi nagraniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Przegląd licznika w α1β2γ2. (A) Ten panel pokazuje reprezentację przypuszczalnej organizacji podjednostek. Poniższe panele pokazują (B-D) ocenę wpływu dodatniego modulatora allosterycznego na ludzki α5β3γ2 i (F-H) na α1β2γ2, przy użyciu porównywalnych stężeń GABA i podobnych stężeń (100 μM) modulatora, które podkreślają specyficzność związku badanego w tych eksperymentach. (E) Ten panel pokazuje również reprezentację przypuszczalnej organizacji podjednostki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Czułość PAM i skład receptora. Określenie skutków szeregu stężeń efektów diazepamu (A-D) w receptorach α1β2γ2 i (E-H) α5β3γ2 ujawnia prawie 10-krotną różnicę w pozornym powinowactwie. Należy również zwrócić uwagę na wpływ składu podjednostek na przebieg czasu odpowiedzi z szybszą desensytyzacją na receptory α1β2γ2 (patrz np. panele D i H). Należy zauważyć, że ponieważ receptory α1β2γ2 i α5β3γ2 wykazują różne powinowactwa do GABA (patrz również Rysunek 10), stężenie agonisty zostało dostosowane między dwoma receptorami, aby mieściło się w porównywalnym zakresie aktywacji. (I) Ten panel przedstawia wykres wzrostu krotności amplitudy prądu znormalizowanej do jedności w funkcji warunku kontrolnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Plazmid ekspresji, w tym promotor T7 i CMV. Panele te pokazują plazmid do ekspresji w oocycie Xenopus (prawy górny panel) i w linii komórkowej. Prawy dolny panel ilustruje typową komórkę HEK-293 transfekowaną plazmidem zawierającym również gen białka zielonej fluorescencji (GFP) z elektrodą rejestrującą z zaciskiem krosowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opracowanie nowych związków aktywnych w kanale jonowym bramkowanym ligandem, takich jak receptory GABA_A , wymaga zastosowania wielu podejść. Zazwyczaj pierwszy etap jest często przeprowadzany przy użyciu testów wiążących; Pomiary te są jednak niewystarczające do scharakteryzowania fizjologicznej aktywności związku lub jego precyzyjnej farmakologii. W szczególności związek, który wiąże się z receptorem, może wzmacniać lub hamować jego funkcję, a nawet nie wywoływać żadnego efektu funkcjonalnego (być cichym) (tj. wiązać się z receptorem bez modyfikowania jego funkcji). W związku z tym do pełnej charakterystyki związku wymagany jest test funkcjonalny.

Testy wiążące:
Główną zaletą testu wiązania jest to, że można go skutecznie przeprowadzić na dużej liczbie próbek, sięgającej kilku tysięcy, oraz że zapewnia powinowactwo do wiązania cząsteczek aktywnych. Jak opisano w niniejszym dokumencie, pierwszy krok polega na ustaleniu metody oceny pożądanych podtypów receptorów. Mianowicie, podczas gdy wiązanie może być prowadzone na receptorach natywnych z frakcji lub całych mózgów, taka metoda uniemożliwi określenie powinowactwa do określonych podtypów receptorów. W związku z tym konieczne jest stosowanie układów rekombinowanych do badania przesiewowego cząsteczek w pożądanym celu. Obecnie przejściowa lub stabilna transfekcja pożądanych podjednostek receptorowych cDNA w liniach komórkowych oferuje wydajną i niezawodną metodę ekspresji podtypów receptorów będących przedmiotem zainteresowania (np. GABA_A α5β3γ2). Tradycyjne testy wiązania wykorzystują radioligandy, ale obecnie dostępne są techniki, które pozwalają uniknąć niedogodności związanych z obchodzeniem się z radioaktywnością (np. ilościowe wiązanie ligandów na podstawie fluorescencji).

Wyrażenie funkcyjne w systemie hosta:
Aby uzyskać ekspresję genów w systemie gospodarza, sekwencja kodująca, która jest przedmiotem zainteresowania, musi zostać wprowadzona do plazmidu, który zawiera odpowiednie promotory. Zazwyczaj do syntezy mRNA in vitro stosuje się bakteryjne promotory T7 lub T6. W przypadku ekspresji cDNA transkrypcja genu będącego przedmiotem zainteresowania musi być regulowana przez promotor eukariontowy, taki jak CMV (wirus cytomegalii) lub równoważny. Obecnie dostępnych jest kilka plazmidów, w tym dwa promotory (tj. pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV / T7, pCI-neo, pcDNA), umożliwiające syntezę mRNA in vitro lub ekspresję cDNA, jak pokazano na rysunku 15. Ekspresję receptorów GABA_A można wiernie uzyskać zarówno w liniach komórkowych, jak i w oocytach Xenopus . Głównymi zaletami tych ostatnich są brak endogennej ekspresji receptora, prostota manipulacji oraz dostępność zautomatyzowanego systemu do mikroiniekcji i zapisów. Procedury opisane w tym protokole obrazują skuteczność zautomatyzowanego systemu, który pozwala na wstrzyknięcie 96 komórek jajowych w ciągu około 7 minut i nie wymaga umiejętności mikromanipulacji. Biorąc pod uwagę, że pojedynczy jajnik z Xenopus zawiera od 10 000 do 30 000 oocytów, jasne jest, że na jednym preparacie można przeprowadzić dużą liczbę pomiarów komórek. Ponadto, ponieważ ekspresję można przeprowadzić za pomocą iniekcji cDNA, te same plazmidy zawierające interesujące geny, które są opracowywane do eksperymentów wiązania, mogą być wykorzystane do charakterystyki funkcjonalnej bez potrzeby dalszych manipulacji biologii molekularnej.

Biorąc pod uwagę jego duży rozmiar i wysoką ekspresję powierzchniową, pojedynczy oocyt wytwarza liczbę receptorów, która jest w przybliżeniu równoważna zbiegającym się komórkom na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Jednak przygotowanie i wstrzyknięcie oocytów stanowi ułamek kosztu linii komórkowej, ponieważ eksperymenty nie wymagają specjalnej pożywki hodowlanej i sterylnych manipulacji. Aktywacja pojedynczego kanału GABA_A daje kilka pikoamperów (^10-12), a prądy sięgające nawet kilkudziesięciu mikroamperów (^10-6) są łatwo rejestrowane w pojedynczym oocycie, co potwierdza jednoczesną aktywność kilku milionów receptorów podczas jednej odpowiedzi.

Pierwszym krokiem w charakterystyce kanałów jonowych bramkowanych ligandem jest często określenie pozornego powinowactwa receptorów. Eksperymenty, które należy przeprowadzić, polegają na zastosowaniu serii krótkich impulsów testowych agonistów i wykreśleniu amplitudy wywołanego prądu lub, w niektórych przypadkach, pola pod krzywą (AUC) w funkcji logarytmu stężenia agonisty. Ponieważ łatwo jest mikrowstrzykiwać plazmidy o różnych stężeniach i proporcjach w tej samej partii oocytów, ten system ekspresji jest szczególnie odpowiedni dla takiej charakterystyki. Co więcej, porównanie poszczególnych partii wykazało wysoki stopień stabilności dla różnych EC₅₀s. Wpływ składu podjednostki na pozorne powinowactwo receptora można łatwo zobrazować za pomocą wykresu pająka, jak pokazano na rycinie 10.

Wyniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego uzyskane w oocytach Xenopus są często porównywane z zapisami wykonanymi przy użyciu elektrod patch clamp. Jakkolwiek szczegółowe porównanie tych dwóch systemów wykraczałoby poza zakres niniejszej pracy, można poruszyć kilka kwestii. Podczas gdy klamra punktowa w komórkach oferuje korzyści w charakterystyce biofizycznej z szybkim zastosowaniem leku, jego wymagania są bardziej złożone niż w przypadku zapisów dwuelektrodowych w oocytach Xenopus . Pierwszą i istotną trudnością jest ekspresja danego białka z koniecznością hodowli komórkowej, transfekcji przejściowej lub stabilnej oraz identyfikacja komórek, które wyrażają pożądany konstrukt. Ponadto niezbędne jest zbadanie możliwego udziału ekspresji endogennej w rozważanej komórce. Co więcej, zapis za pomocą zacisku krosowego wymaga wykwalifikowanej osoby przeprowadzenia mikromanipulacji pod mikroskopem o dużym powiększeniu, przy czym osoba ta musi również przeprowadzić odpowiednią analizę podczas eksperymentu, aby ocenić np. jakość uszczelki, opór dostępu itp. Natomiast zapis cęgowy napięciowy z dwiema elektrodami, zwłaszcza przy użyciu zautomatyzowanego systemu elektrofizjologicznego, Nie wymaga żadnych szczególnych umiejętności i może być przeprowadzana przez techników laboratoryjnych.

Przy zakupie zestawu elektrofizjologicznego rozważenie kosztów jest z pewnością ważnym czynnikiem, który należy dokładnie przeanalizować. Na przykład, podczas gdy koszt zautomatyzowanego systemu jest stosunkowo wysoki, bliższe porównanie pokazuje, że instalacja kompletnego zestawu elektrofizjologicznego obejmuje zakup sprzętu, takiego jak dobre mikromanipulatory, soczewka lornetkowa, wzmacniacz, system perfuzyjny i stół antywibracyjny, a także pozyskiwanie danych i przeprowadzanie analizy. Porównanie kosztów między konfiguracją cęgów napięciowych z dwiema elektrodami a konfiguracją z zaciskiem krosowym ujawnia jeszcze dalsze rozbieżności. Co więcej, zautomatyzowany system ma tę zaletę, że jest w pełni zautomatyzowanym sprzętem i działa bez nadzoru w dzień iw nocy.

Właściwości farmakologiczne związku zależą od jego sposobu działania na receptor. Na przykład inhibitory kompetycyjne to cząsteczki, które mogą dostać się do tej samej kieszeni wiążącej lub miejsca ortosterycznego, ponieważ sam agonista powoduje konkurencję. Inhibitory niekonkurencyjne to związki, które hamują receptory poprzez interakcję w innym miejscu, a w przypadku kanału jonowego bramkowanego ligandem, które mogą na przykład wnikać i blokować pory jonowe. Zbadanie różnych mechanizmów interakcji wykraczałoby poza zakres tej pracy, ale dalsze informacje można uzyskać z podręcznika farmakologicznego i/lub z innych prac, takich jak²² Bertranda i Bertranda.

W przypadku modulatorów allosterycznych związek wiąże się w miejscu, które jest odrębne od miejsca ortosterycznego, ale obecność cząsteczki modyfikuje barierę energetyczną między stanem aktywnym a innymi stanami. Dodatnie modulatory allosteryczne (PAM) to związki, które zmniejszają barierę energetyczną ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, a tym samym wzmacniają działanie agonisty. Aby scharakteryzować możliwe efekty PAM, konieczne jest zatem określenie, czy narażenie na ten związek wzmacnia odpowiedź na agonistę, a jeśli tak, to w jakim stężeniu. Eksperymenty przedstawione na rycinach 11 i 14 ilustrują protokoły, które mogą być z powodzeniem stosowane do charakterystyki PAM w receptorach GABA_A .

W niektórych przypadkach sama ekspozycja na PAM może być wystarczająca do aktywacji receptorów. Taką aktywność można określić poprzez nieznaczną modyfikację przedstawionego tu protokołu eksperymentalnego. Mianowicie, zamiast stosować jednoczesne stosowanie modulatora podczas ekspozycji na GABA, protokół może być zmodyfikowany pod kątem zastosowania najpierw samego związku, a następnie w obecności GABA. Charakterystyka bezpośredniej aktywności agonistycznej zostanie dokonana poprzez określenie amplitudy odpowiedzi wywołanej przez sam związek i porównanie z prądem wywołanym przez GABA.

Eksperymenty przeprowadzone na wycinkach mózgu, takie jak zilustrowane na rycinie 7, są wykorzystywane do potwierdzenia aktywności związku w natywnych receptorach w określonym obwodzie hamującym, zanim przejdą dalej w modelach zwierzęcych i na ścieżce do badań klinicznych. Stosunkowo prosty protokół rejestracji i analizy danych pozwala na klasyfikację wielu związków poprzez ocenę ich różnicowego wpływu modulacyjnego na amplitudę PS. Niespecyficzne działanie związków, które nie są związane z układem GABA, może być również wykrywane (np. gdy obserwuje się zmiany w kształcie PS). Bezpośrednie, GABA-ergiczne neuroprzekaźnictwo można ocenić w tych przypadkach, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC) przy użyciu techniki całokomórkowego patch clamp⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
General equipment
96 kombajn komórkowy -(Filtermate 196)	Packard		Do filtracji membran ze związanym radioligandem
Płytka mikromiareczkowa Licznik scyntylacyjny cieczy (Top Count NXT)	Licznik scyntylacji i luminescencji mikropłytek	Packard
Licznik scyntylacyjny cieczy (Beta-Couter 2500 TR)	Fiolka Packard		Licznik scyntylacji i luminescencji
Ciecz  handler (Biomek 2000)	Redlica		BeckmanDo przygotowania rozcieńczeń złożonych
Vortex (Vortex Genie 2)	Scientific industries Inc.		Do mieszania złożonych roztworów podstawowych
Homogenizator tkankowy (Polytron PT1200E)	Kinematica AG		Do ponownego zawieszenia preparatów membranowych
Oprogramowanie XLfit5	Microsoft Excel   Dodatek przez IDBS		Oprogramowanie do dopasowywania krzywych
Smart Pull	UniPix-Electrode		Puller
RoboInject	MultiChannel Systems-Automated		Injection (Xenopus Oocytes)
HiClamp	MultiChannel	Systems-Automated	Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMining	MultiChannel	Systems-Data	Oprogramowanie analityczne
DataMerger	MultiChannel	Systems-Oprogramowanie	do przetwarzania danych
Digidata 1550	Molecular Devices		System akwizycji danych o niskim poziomie szumów
CyberAmp 380 lub równoważny	Axon Instruments		Programowalny kondycjoner sygnału
Pakiet programów pClamp	Urządzenia		Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych oprogramowanie
Stół antywibracyjny	TMC		Aby uniknąć wibracji mikroelektrod
Mikromanipulatory Patchstar	Scientifica	Do precyzyjnego pozycjonowania mikroelektrod w wycinkach mózgu
	Sutter Instruments		Do izolowania nagrań od hałasu
McIlwain Tissue Chopper	Campden Instruments LTD		Do przygotowania plastrów mózgu mikropipeta
ze szkła borokrzemianowego	Warner Instruments	GC150TF-10	Do rejestrowania potencjałów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu
Skrętka, elektroda stymulacyjna z drutów platynowo-irydowych	World Precision Instruments		Do stymulacji wycinków mózgu prądem
Generator bodźców do stymulacji sterowanej prądem i napięciem	Systemy wielokanałowe	STG4000	Dostarcza prąd do elektrody
stymulującejPlasticwarePłytka
mikromiareczkowania z okrągłym dnem	Corning	#3365	Używana do oznaczania wiązania
GF / C z filtrem z włókna szklanego 96-dołkowa mikropłytka z 1,2 i mikro; m Poresize, do testów pobierania komórek za pomocą filtra próżniowego z kolektorem dolewkowym	Packard	#6005174	używany do testu wiązania
50 ml probówki	Falcon	#352070	używane do testu wiążącego
Probówki Safe-lock 1,5 ml	Eppendorf	#0030 120086	używane do testu wiązania
Probówki Safe-lock 2 mL	Eppendorf	#0030 120094	używane do testu wiążącego
Probówki transportowe 180 mL	Semadeni Europe AG	#3722	używany do testu wiązania
Fiolka z kucykiem Polietylen 6 mL	Perkin Elmer	#6013329	używany do testu wiązania
Top Seal	Perkin Elmer	#60051859	używany do oznaczania wiązania
Kolba obrotowa	Bellco	BELLCO # 1965-00100	Kolba obrotowa
96  Płytka studzienkowa (stożkowa)	Thermo Scientific Milian	56368	Płytka iniekcyjna do oocytów
96  Płytka studzienkowa (płaskie dno)	Corning (Vitaris, Szwajcaria)	3364-cor	Płytka złożona do szklanej kapilary HiClamp
Glass	Hilgenberg (Niemcy)	-	szkło borokrzemianowe 1,2 Średnica zewnętrzna 0,76 ID z preparatem filament
RNA
Ambion mMessage mMachine	Thermo Fisher Scientific		do syntezy in vitro
Chemikalia
Bufor do oznaczania: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH dostosuj z HCl do 7,4; przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.			Używany do oznaczania wiązania
Bufor do mycia: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; przechowywać w temperaturze 4 °C.			Używany do oznaczania wiązania
Roztwór podstawowy badanych związków 10 mM w DMSO			Używany do oznaczania wiązania
Flumazenil (RO0151788) 10 mM w DMSO			Używany do oznaczania wiązania
Diazepam 4 mM w DMSO			Używany do oznaczania wiązania
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol w etanolu; przechowywać w temperaturze -20 ° C			Służy do oznaczania wiązania
Microscint 40	Packard	#6013641	Służy do wiązania
testu Ultima Gold	Perkin Elmer	#6013329	Służy do oznaczania wiązania
MS-222	Sigma	Sigma # A5040	MS-222
AB/AM	Sigma	Sigma # A5955	antybiotyki / leki przeciwgrzybicze
Kolagenaza	Sigma	Sigma # C1030	Kolagenaza typu I
Rnaza	Sigma	Sigma # R2020-250 mL	RNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi Kit	Qiagen	Qiagen # 12362
Sole do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (NaCl, KCl itp.)	Sigma
Membranes
Mrożone preparaty błonowe z przejściowych lub stabilnie transfekowanych HEK293 z nadekspresją różnych ludzkich podtypów receptorów GABAA: &alfa; 1β 3γ 2, &alfa; 2β 3γ 2, &alfa; 3β 3γ 2, &alfa; 5β 3γ2. Zobacz Ballard et al. 2009, aby zapoznać się ze szczegółowymi metodami.			Służy do oznaczania wiązania