Artykuł metodologiczny

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

14.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57842

⸱

16 sierpnia 2018

 ,  , 
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Streszczenie

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku protokół badania związków w receptorach kwasu gamma-aminomasłowego typu A (GABAA) i jego wykorzystanie do identyfikacji nowych cząsteczek aktywnych w testach przedklinicznych od receptora rekombinowanego in vitro do ich efektów farmakologicznych na receptory natywne w wycinkach mózgu gryzoni. W przypadku związków wiążących się w miejscu receptora benzodiazepinowego, pierwszym krokiem jest stworzenie pierwotnego badania przesiewowego, które polega na opracowaniu testów wiązania radioligandów na błonach komórkowych eksprymujących główne podtypy GABAA. Następnie, wykorzystując heterologiczną ekspresję receptorów GABAA u gryzoni i ludzi w oocytach Xenopus lub komórkach HEK 293, możliwe jest zbadanie, w testach elektrofizjologicznych, fizjologicznych właściwości różnych podtypów receptorów i właściwości farmakologicznych zidentyfikowanych związków. Przedstawiony zostanie tu układ oocytów Xenopus, począwszy od izolacji oocytów i ich mikroiniekcji różnymi mRNA, aż po charakterystykę farmakologiczną za pomocą dwuelektrodowych zacisków napięciowych. Na koniec opisane zostaną zapisy przeprowadzone w wycinkach mózgu gryzoni, które są wykorzystywane jako wtórny test fizjologiczny do oceny aktywności cząsteczek w ich natywnych receptorach w dobrze zdefiniowanym obwodzie neuronalnym. Wraz z zastosowaniem leku demonstrowane są zapisy zewnątrzkomórkowe wykorzystujące odpowiedzi populacyjne wielu neuronów.

Wprowadzenie

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania do fizjologii i farmakologii. W poszukiwaniu nowych cząsteczek specyficznych dla receptorów GABAA kluczowe jest jak najdokładniejsze zdefiniowanie podtypu zainteresowania i ocena swoistości nowo zidentyfikowanych związków (np. w celu zapoznania się z przeglądem zob. Rudolph and Knoflach1lub Sieghart2). Typowa ścieżka odkrywania leków i kroki, które należy wykonać, przedstawiono na rysunku 1.

Testy wiążące były i nadal są powszechnie stosowane jako pierwszy krok w odkrywaniu leków. W przypadku receptorów GABAA są one zoptymalizowane pod kątem identyfikacji związków, które wiążą się z miejscem wiązania benzodiazepin receptora, gdzie wiążą się użyteczne terapeutycznie i bezpieczne leki. Inne techniki, wykorzystujące czytnik płytek do obrazowania fluorometrycznego (FLIPR) testy oparte na czerwonym barwniku o potencjale błonowym3, wykrywają związki takie jak barbiturany, które wiążą się z dodatkowymi miejscami, które są mniej pożądane ze względu na ich niepożądany profil skutków ubocznych. Ponadto stosowane barwniki mogą bezpośrednio aktywować receptory GABAA, kwestionując w ten sposób przydatność tych testów do odkrywania leków4. Testy wiązania mogą dostarczyć jedynie dowodów na to, że dany związek może wiązać się z określoną klasą receptorów. Testy in vitro z błonami komórkowymi służą do identyfikacji selektywnych ludzkich ligandów receptora GABAA α5β3γ2. Przejściowo transfekowane komórki HEK293 wyrażające ludzkie receptory GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 i α3β3γ2 są wykorzystywane do przygotowania błon do tych testów. Działanie ligandów wykrywa się poprzez pomiar scyntylacji [3H]flumazenilu związanego z receptorami błonowymi (hamowanie wiązania [3H]flumazenilu). Główną zaletą tej techniki jest to, że szybkie i skuteczne określenie powinowactwa do wiązania związku w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania jest zapewnione w receptorze będącym przedmiotem zainteresowania.

Badania funkcjonalne są niezbędne do oceny funkcjonalnej aktywności związków i zaproponowania fizjologicznego i farmakologicznego wyjaśnienia mechanizmów spowodowanych wiązaniem związków z receptorami. Obecnie powszechnie wiadomo, że funkcjonalne receptory GABAA powstają w wyniku złożenia pięciu podjednostek wokół osi pseudosymetrii utworzonej przez pory jonowe i wynikają ze złożenia pięciu identycznych podjednostek. Większość receptorów GABAA składa się z dwóch lub więcej różnych podjednostek. Na przykład główny receptor GABAA w mózgu składa się z podjednostek α1, β2 i γ2 w stechiometrii odpowiednio 2, 2 i 15,6. Rekonstytucja w systemie gospodarza, takim jak oocyty Xenopus lub komórki HEK293, daje możliwość szybkiego zbadania właściwości farmakologicznych receptorów.

Właściwości farmakologiczne związków są następnie badane za pomocą zapisów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu7. Metoda ta pozwala na zbadanie wpływu związków na przekaźnictwo nerwowe i stanowi skuteczny sposób potwierdzenia funkcjonalnego działania związków oznaczanych w heterologicznych systemach ekspresyjnych na poziomie receptorów natywnych w całym środowisku neuronalnym. Neuroprzekaźnictwo GABA-ergiczne można również ocenić na poziomie molekularnym, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC)8. Ale zastosowany tutaj protokół oparty na zapisach klamrów krosowych całych komórek w wycinkach mózgu jest bardziej skomplikowany i zapewnia niższą przepustowość.

Na koniec, mocne i słabe strony kaskady badań przesiewowych in vitro używanej do identyfikacji selektywnych ligandów α5β3γ2 są omawiane w perspektywie różnych technik i ich wewnętrznych ograniczeń. Prace te powinny dostarczyć ekspertom i osobom niebędącym ekspertami w dziedzinie receptorów GABAA pomocnego przeglądu kombinacji różnych podejść in vitro stosowanych w celu rozwiązania problemu odkrycia nowych modulatorów tych kanałów jonowych bramkowanych ligandem.

Protokół

Xenopus laevis są utrzymywane i obchodzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zwierząt kantonu Genewa.

1. Wiązanie radioliganda

  1. Przygotowanie płytki do analizy
    1. Przygotować 1,5 l buforu do analizy zawierającego 5 mM KCl i 1,25 mM CaCl22, 1,25 mM MgCl22, 120 mM NaCl i 15 mM Tris; pH należy dostosować do wartości 7,4 za pomocą HCl.
    2. Przygotować związki do przebadania w stężeniu 50.76 µM (np., a 5 µL związek w stężeniu 10 mM do 980 µL bufor do testu w probówce do mikrocentryfugi). Wymieszać dokładnie za pomocą wstrząsarki typu vortex z dużą prędkością przez 2–5 s.
    3. Przygotuj wstępne rozcieńczenie związku referencyjnego flumazenilu poprzez pipetowanie 1 µL związku (10 mM) do 1,970 µL buforu do analizy. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa przy wysokiej prędkości przez 2–5 s.
    4. Rozcieńczyć [3roztwór zapasowy flumazenilu z buforem do analizy w stosunku 4 °C do 4 nM w 50 ml polipropylenowej probówce.
    5. Pipeta 50 µL/well buforu do analizy do kolumn 1 i 3–11 mikropłytki 96-dołkowej, zgodnie z układem płyty przedstawionym w Rysunek 2.
    6. Pipeta 73.2 µL związków rozcieńczonych w stężeniu 50.76 µM (patrz krok 1.1.2) do kolumny 12 płytki.
    7. Rozcieńcz każdy związek, stosując progresję geometryczną w 9 krokach (1E-10 – 1E-06 M), z 23.12 µL odmień odpowiednią objętość i napełnij kolumny 3–11. Dokładnie wymieszaj rozcieńczenie. Zmieniaj końcówkę po każdym rozcieńczeniu.
  2. Rozcieńć błony komórkowe
    1. Rozmrozić błony komórkowe wcześniej wyizolowane z komórek HEK293 nadekspresujących ludzki GABAA receptora (0,025–0,15 mg/ml), aby otrzymać 80 ml w temperaturze pokojowej (RT), a następnie przenieść zawiesinę do buforu do analizy w 4 °C.
    2. Ponownie zawiesić roztwór błon, nadal przy 4 °C za pomocą homogenizatora do tkanek przez 30–40 s przy 10 000–12 000 obr./min.
  3. Rozcień diazepam do kontroli nieswoistego wiązania (NSB)
    1. Rozcieńczyć roztwór zapasowy diazepamu o stężeniu 4 mM buforem do analizy do stężenia 40 µM w 5 ml.
  4. Rozpocznij reakcję
    1. Pipeta 50 µL o stężeniu 4 nM [3Wprowadzić flumazenil do każdej studzienki płytki 96-dołkowej i przechowywać ją w pojemniku z wodą z lodem.
    2. Dodaj 100 µL GABAA przygotowanie membran podtypów receptorów o stężeniu białka 0,5 mg/ml.
    3. Pipeta 50 µL z 40 µM diazepam do kolumny 2.
    4. Inkubować płytkę przez 1 h na lodzie.
    5. Dodaj 50 µL buforu do analizy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki filtrującej w celu późniejszej separacji membranowej i pomiaru radioaktywności, a następnie zatrzymania reakcji.
  5. Zatrzymać reakcję
    1. Przygotować bufor płuczący zawierający 50 mM Tris-HCl o pH 7,4.
    2. Przefiltruj roztwór, używając zbiornika do zbierania komórek z 96 dołkami. Przemyj płytkę 3 razy za pomocą 300 µL lodowatego buforu do płukania na każdą dołkę.
    3. Uszczelnij dno płytki folią plastikową i dodaj 40 µL koktajlu scyntylacyjnego do pomiaru w metodzie ciekłoscyntylacyjnej w każdej studzience, a następnie przemyć ją 70% etanolem.
    4. Delikatnie wstrząsaj płytką przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej. Pozostaw ją na co najmniej kolejną godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Zmierzć radioaktywność (w CPM), umieszczając płytkę w liczniku scyntylacyjnym. Czas pomiaru dla każdej studzienki powinien wynosić 3 min.
  6. Analiza danych
    1. Oblicz średnią dla 8 powtórzeń wiązania nieswoistego (NSB) i wiązania całkowitego (TB), a także dla powtórzeń (dubletów lub tripletów) próbek. Oblicz procent wiązania swoistego (% SB) dla średniej z każdej próbki zgodnie z następującym równaniem:
      Wzór na równowagę statyczną, obliczanie %SB; analiza równań dla badań naukowych i interpretacji danych.
      Tutaj,
      całkowite SB = średnia TB minus średnie NSB.
    2. Nanieś na oś odciętych wartość % SB kontra Uporządkuj stężenia inhibitora. Dopasuj dane, stosując równanie analizy konkurencji w jednym miejscu wiązania:
      Równanie wzrostu logistycznego, y = A+(B–A)/(1+(X/C)^D), formuła do modelowania i analizy danych.
      Tutaj,
      y = % SB,
      A = minimum z y,
      B maksimum z y,
      C = IC50,
      X dziennik wpisów10 stężenia związku konkurującego,
      D = nachylenie krzywej (współczynnik Hilla).
    3. Oblicz powinowactwo wiązania (Ki), wykorzystując połowiczną maksymalną stężenie hamujące (IC50)50), stała dysocjacji (Kd) [3flumazenil na odpowiednich membranach9, a także stężenie [3H] flumazenil w teście zgodnie z następującym równaniem danych:
      Równanie powinowactwa wiązania Ki=IC50/(1+radioligand/Kd); wzór do analizy farmakologicznej.

2. Ekspresja receptorów i rejestracje w oocytach Xenopus

  1. Pobieranie jajników i przygotowanie oocytów
    1. Przygotować sterylny roztwór Bartha zawierający 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO33, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO44.7H2O, 0,33 mM Ca(NO3)2.4H2O oraz 0,41 mM CaCl22.6H2O, przy pH 7,4, z dodatkiem 100 j./ml penicyliny, 100 µg/mL streptomycyna i 0.25 µg/mL amfoterycyny B.
    2. Przygotuj pożywkę OR2 1x (bez CaCl2)2) z 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, przy pH 7,4.
    3. Uśmierć Xenopus laevis samicę poddano głębokiej anestezji przez 20 min w schłodzonym metansulfonian trikainy (w stężeniu 150 mg/L, z pH dostosowanym do 7,4) i wodorowęglanie sodu (300 mg/L), a następnie wykonano dekapitację.
    4. Szybko pobierz jajniki za pomocą czystych nożyczek i pęsety, a następnie umieść je w 2 szalkach Petriego (10 cm) wypełnionych 40 ml 1x roztworu Bartha oraz antybiotykami/lekiem przeciwgrzybiczym.
    5. Przechowywać niedysocjowane jajniki do 2 tygodni w roztworze Bartha w temperaturze 4 °C.
    6. W celu dysocjacji, należy pociąć jajniki czystą żyletką na małe fragmenty (1–2 cm).3) i inkubować je w 50 ml pożywki OR2 bez CaCl22 (OR2-bez CaCl2)2) zawierający 0,2% kolagenazy (typu I) w temperaturze 17–19 °C w kolbie z mieszadłem o pojemności 100 mL przy wolnym mieszaniu przez 4–5 h. Należy upewnić się, że mieszadło magnetyczne znajduje się około 3–5 cm nad dnem kolby, aby uniknąć zmiażdżenia oocytów.
    7. Po 4–5 h należy sprawdzić, czy większość oocytów została uwolniona z mieszków (t. j., pływają one pojedynczo). Przemyć je 5 razy 200 ml pożywki OR2 uzupełnionej o 1,8 mM CaCl22.
    8. Przenieść odfolikulowane oocyty do płytek Petriego (10 cm) wypełnionych roztworem Bartha oraz antybiotykami/antybiotykami przeciwgrzybiczymi i przechowywać je przez co najmniej jedną noc w temperaturze 17 °C przed iniekcją cDNA lub mRNA.
    9. Następnego dnia pod stereomikroskopem wybrać zdrowy oocyt z wyraźnym i odrębnym biegunem zwierzęcym kontra biegun wegetatywny (ciemnobrązowy dla bieguna zwierzęcego) kontra jasnożółty dla bieguna wegetatywnego). Używając czystych pipet Pasteura, przenosić oocyty pojedynczo do sterylnego stożkowego 96-dołkowego podłoża do mikroiniekcji.
      UWAGA: Przy wstrzykiwaniu mRNA nie jest wymagane szczególne rozmieszczenie oocytów; natomiast w przypadku wstrzykiwania cDNA niezbędne jest zorientowanie oocytów tak, aby biegun zwierzęcy był skierowany do góry.
  2. Automatyczna iniekcja mRNA lub cDNA
    1. Zsyntetyzować mRNA, używając dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z zalecanymi instrukcjami. Oczyścić instrumenty i stół preparacyjny środkiem usuwającym RNazy oraz założyć odpowiednie rękawice ochronne.
      UWAGA: Jakość mRNA ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej ekspresji; niezbędne jest zapobieganie degradacji mRNA podczas procedury wtryskiwania.
    2. Przygotować cDNA przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu i rozpuścić wymaganą ilość w wodzie bidestylowanej do stężenia 0.2 µg/µL.
    3. Wstrzyknąć 10–50 nL roztworu mRNA o stężeniu 0.2 µg/µLlub 10 nL roztworu cDNA o stężeniu w zakresie 0,02–0.2 µg/µLnajlepiej w partiach po 95 oocytów.
    4. W przypadku białek błonowych wymagających wielu podjednostek (tj., heteromeryczny receptor GABA $\alpha1\beta2\gamma2$A receptory), zmieszaj odpowiednie mRNA lub cDNA w pożądanym stosunku (t. j., 1:1:1 lub 1:10:1).
    5. Utrzymać oocyt w temperaturze 17 °C aby zapobiec ekspresji białek szoku termicznego przez oocyty, przechowywać płytkę mikrotitracyjną w obszarze magazynowym z kontrolą temperatury.
    6. Rozpuścić związki testowe, które dały wynik dodatni w teście wiązania z OR2, w stężeniu 0,1–1,000 µM do rejestracji elektrofizjologicznej, a następnie umieść je w 96-dołkowej polipropylenowej płytce z płaskim dnem.
  3. Plazmidy do ekspresji
    1. Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi komercyjnie dostępnych zestawów do syntezy mRNA z bakteryjnymi promotorami T7 lub T6 i przygotuj 20 µL roztworu w 0.2 µg/µL w wodzie wolnej od RNaz.
    2. Przygotuj co najmniej 20 µL roztworu zawierającego wektor ekspresyjny eukariotyczny dla ekspresji cDNA, zazwyczaj w stężeniu 0.2 µg/µL rozpuszczone w wodzie bidestylowanej.
  4. Mikroiniekcja do oocytu i wizualizacja jego jakości
    1. Wstrzyknąć 10–50 nL roztworu zawierającego plazmid (patrz krok 2.3.1 lub 2.3.2), używając szklanej igły do mikroiniekcji o średnicy końcówki wynoszącej do 100 µm zamontowany na mikromanipulatorze wyposażonym w system wyrzutu ciśnieniowego lub w zautomatyzowany system iniekcyjny.
      UWAGA: W omawianym tutaj przykładzie oocyty są wstrzykiwane w partiach po 95 sztuk za pomocą zautomatyzowanego systemu odpowiedniego do pracy z cDNA lub mRNA.
    2. Napełnij igłę wstrzykującą preparatem 1 µL barwnika, takiego jak błękit metylenowy w stężeniu 1%, i wstrzyknąć go do oocytów zgodnie ze standardową procedurą (do jądra w przypadku cDNA lub do cytoplazmy w przypadku mRNA).
    3. Poddać wstrzyknięte oocyty działaniu wrzącej wody przez około 1 minutę. Przeciąć oocyty na pół za pomocą żyletki pod mikroskopem stereoskopowym.
      UWAGA: Barwnik pozostaje zlokalizowany, jak pokazano w Rycina 3Eco pozwala na precyzyjną obserwację wstrzyknięcia.
  5. Rejestracje metodą clampy napięciowej z użyciem dwóch elektrod
    1. Umieść płytkę wielodołkową zawierającą oocyty w systemie zautomatyzowanym, który wykorzystuje zasadę przedstawioną w Rycina 4.
      UWAGA: W przeciwieństwie do systemu patch clamp przedstawionego w Rycina 5elektroda napięciowa odczytuje rzeczywisty potencjał błonowy komórki.
    2. Zaprogramuj zautomatyzowany system rejestracji za pomocą interfejsu opartego na ikonach, stosując na przykład schemat przedstawiony w Rysunek 6 do wyznaczenia zależności między stężeniem a aktywnością.
  6. Dopasowanie krzywej
    1. Przeanalizuj wyniki przy użyciu odpowiedniego oprogramowania; wykorzystując przedstawioną krzywą aktywacji stężeń, wykreśl amplitudę prądu jako funkcję logarytmu stężenia agonisty.
    2. Obserwuj krzywą sigmoidalną, którą można następnie dopasować do empirycznego równania Hilla w formie:
      Wzór równania Hilla; Y=1/(1+(EC50/x)^nH) do analizy zależności dawka-odpowiedź w farmakologii.
      Tutaj,
      Y= ułamek prądu wywołanego,
      EC50 stężenie powodujące 50% aktywację,
      Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. = stężenie związku,
      nH = współczynnik Hilla lub pozorna kooperatywność.
    3. Znormalizuj prądy do jedności, dzieląc amplitudę każdej odpowiedzi kontra wartość odnotowana przy najwyższym stężeniu w celu analizy danych uzyskanych z serii komórek.
    4. Oblicz średnie oraz błędy standardowe, a następnie wykonaj dopasowanie krzywej przy użyciu standardowo dostępnego oprogramowania.

3. Rejestracje elektrofizjologiczne w skrawkach mózgu

UWAGA: Przekroje hipokampa szczura są przygotowywane zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi.

  1. Przygotowanie skrawków hipokampa
    1. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do sekcji (dACSF) zawierający 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukozy oraz 4 mM sacharozy, napowietrzony w butelce mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.
    2. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy do rejestracji (rACSF) zawierający 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2H2O, 25 mM NaHCO3 oraz 10 mM glukozy, napowietrzony w butelce mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.
    3. Zanestetyzować szczury, stosując mieszaninę 2,5% izofluranu i czystego tlenu, a następnie przeprowadzić dekapitację.
    4. Naciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej za pomocą precyzyjnych nożyczek. Przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, nie uszkadzając tkanki podległej. Usunąć czaszkę pęsetą i za pomocą cienkiej szpatułki delikatnie wydobyć mózg.
    5. Umieścić mózg w napowietrzonym roztworze dACSF w temperaturze pokojowej (RT) i wypreparować lewą formację hipokampa za pomocą cienkiej szpatułki.
    6. Za pomocą krojarki do tkanek (tissue chopper) wyciąć skrawki poprzeczne (o grubości 400 µm) z części środkowej hipokampa i przenieść je do komory rejestracyjnej za pomocą pędzla. Przechowywać skrawki w temperaturze pokojowej przez 45 min.
    7. Perfundować skrawki napowietrzonym rACSF w temperaturze 35 °C z prędkością 1,5 mL/min. Napowietrzać roztwór mieszaniną 95% O2 i 5% CO2.
      UWAGA: Po tym kroku skrawki są gotowe do eksperymentów elektrofizjologicznych.
  2. Rejestracja pojedynczego potencjału populacyjnego
    1. Umieścić skrawka mózgu w komorze zamontowanej na mikroskopie.
    2. Perfundować skrawek rACSF z prędkością 3 mL/min.
    3. Wytвориć borokrzemową mikropipetę szklaną za pomocą wypalarki do pipet, tak aby oporność wynosiła ~2 MΩ.
      UWAGA: Mikropipeta ta służy jako elektroda rejestrująca i jest podłączona elektrycznie do wzmacniacza.
    4. Napełnić mikropipetę roztworem zawierającym 2 M NaCl i umieścić ją w uchwycie pipety wzmacniacza.
    5. Za pomocą prawego mikromanipulatora ustawić mikropipetę rejestrującą w stratum pyramidale w obszarze CA1 skrawka hipokampa.
      UWAGA: Lokalizacja jest przedstawiona schematycznie na Rysunku 7.
    6. Umieścić izolowaną bipolarną elektrodę platynowo-irydową w uchwycie lewego mikromanipulatora.
      UWAGA: Elektroda ta służy jako elektroda stymulująca i jest podłączona elektrycznie do generatora impulsów.
    7. Za pomocą prawego mikromanipulatora ustawić elektrodę stymulującą w obrębie kolaterali Schaffera w obszarze CA1 skrawka hipokampa.
      UWAGA: Lokalizacja jest przedstawiona schematycznie na Rysunku 7.
    8. Za pomocą generatora impulsów dostarczać impuls prądu do elektrody stymulującej co 30 s (czas trwania 100 µs, zaczynając od 10 µA) i stopniowo zwiększać natężenie stymulacji, aż do pojawienia się potencjału populacyjnego (PS).
    9. Dostosować natężenie bodźca tak, aby wywołać PS odpowiadający 45% maksymalnej możliwej amplitudy. Sygnały PS są filtrowane przy 2,4 KHz i digitalizowane przy 20 KHz przy użyciu wzmacniacza sygnału.
  3. Hamowanie parzystych impulsów
    1. Przygotować skrawki mózgu (krok 3.1) i postępować zgodnie z opisem powyżej (kroki 3.2.1–3.2.7).
    2. Za pomocą generatora impulsów dostarczać co 30 s dwa impulsy prądu (czas trwania 100 µs w odstępie 20 ms) do elektrody stymulującej. Ustawić natężenie bodźca tak, aby wywołać PS odpowiadający 45% maksymalnej amplitudy.
  4. Testowanie związków
    1. Przygotować rozcieńczenia badanych związków w napowietrzonym ACSF w taki sposób, aby końcowe stężenie DMSO nie przekraczało 0,1%.
    2. Dodać DMSO do roztworu kontrolnego w takim samym stężeniu, jak w roztworze związku.
    3. Rejestrować pojedynczy (krok 3.2) lub parzysty (krok 3.3) PS wywołany stymulacją kolaterali Schaffera co 30 s przez co najmniej 30 min. Kształt PS powinien być stabilny podczas tego okresu bazowego.
    4. Przygotować zlewkę z napowietrzonym rACSF zawierającym określone stężenie badanego związku.
    5. Perfundować skrawek hipokampa tym roztworem, kontynuując rejestrację pojedynczego lub parzystego PS.
    6. Ocenić powrót do stanu wyjściowego po działaniu związku poprzez perfuzję skrawka napowietrzonym rACSF bez związku.
      UWAGA: W przypadku efektów odwracalnych, PS powraca do pierwotnego kształtu zaobserwowanego w okresie bazowym przed aplikacją związku.
  5. Analiza danych
    1. Uśrednić zapisy PS zarejestrowane podczas eksperymentu w blokach po 4 przy użyciu oprogramowania do analizy danych.
    2. Zmierzyć amplitudy PS uśrednionych zapisów.
    3. Znormalizować amplitudy jako procent wartości bazowych zarejestrowanych 10 min przed perfuzją związku.
    4. Przedstawić dane jako średnia ± SEM.

Wyniki

Wiązanie:
Test in vitro z użyciem błon komórkowych służy do identyfikacji selektywnych ligandów ludzkich receptorów GABAA α5β3γ2 wiążących się w allosterycznym miejscu BZD receptorów zawierających podjednostkę γ2. Do przygotowania błon do tego testu wykorzystuje się przejściowo transfektowane komórki HEK293 wykazujące ekspresję ludzkich receptorów GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 oraz α3β3γ2. Efekt potencjalnych ligandów jest wykrywany poprzez pomiar scyntylacji [3H]flumazenilu związanego z receptorami błonowymi (inhibicja wiązania [3H]flumazenilu). Następnie generowane są krzywe wypierania, aby ocenić selektywność związków względem konkretnego receptora GABAA, jak w przykładzie z RO4938581 (Rycina 8). Rycina 9 podsumowuje profile kilku związków referencyjnych, w tym α5 selektywnego negatywnego modulatora allosterycznego receptora GABAA, RO49385819, które zostały opracowane przy użyciu testu wiązania.

Pomiary w Xenopus oocytach:
Ekspresja receptorów GABAA, takich jak heteromer α5β3γ2, generuje silne prądy w odpowiedzi na ekspozycję na GABA. Typowe zapisy metodą voltage clamp, uzyskane w oocycie exprimującym ludzkie białka α5β3γ2 w odpowiedzi na krótkie impulsy GABA (30 s) o stężeniach do 300 µM, przedstawiono na Ryc. 6. W tym eksperymencie różne stężenia GABA rozmieszczono na płytce 96-dołkowej, a odpowiedzi wywoływano poprzez przenoszenie komórki do odpowiedniego dołka. GABA dokładnie wypłukiwano, przywracając komórkę do centralnej komory perfuzyjnej i aplikując roztwór kontrolny poprzez aktywację odpowiedniej pompy perystaltycznej. Sekwencja programu użyta do wyznaczenia krzywej aktywacji stężeń zilustrowana jest na Ryc. 6A. Dane te, uzyskane w pełni automatycznie, obrazują zarówno jakość zapisów możliwych do uzyskania w oocytach Xenopus, jak i wysoki poziom ekspresji receptorów osiągany kilka dni po iniekcji mRNA. Eksperymenty przeprowadzone dla różnych kombinacji receptorów pozwalają wyznaczyć szereg wartości EC50, czyli stężeń GABA niezbędnych do aktywacji połowy receptorów. Przedstawienie wartości EC50 na wykresie radarowym, jak pokazano na Ryc. 10, umożliwia szybkie porównanie właściwości receptorów oraz wpływu składu podjednostek.

Aby zbadać wpływ negatywnego lub pozytywnego modulatora allosterycznego (NAM lub PAM), konieczne jest porównanie odpowiedzi wywołanej impulsem testowym agonisty (GABA), najpierw w warunkach kontrolnych, a następnie w obecności modulatora. Wydajny protokół eksperymentalny do przeprowadzenia takiego doświadczenia przedstawiono na Rysunku 11. W pierwszej kolejności określa się odpowiedź komórki na referencyjne stężenie GABA, a następnie sekwencję powtarza się, aplikując to samo stężenie GABA, a następnie współaplikując GABA wraz z modulatorem. Wykres dwóch nałożonych na siebie odpowiedzi wykazuje w tym przykładzie wyraźne hamowanie spowodowane obecnością modulatora. Ilościowe określenie efektu modulatora można łatwo uzyskać, obliczając stosunek odpowiedzi wywołanej w obecności modulatora do odpowiedzi kontrolnej, a wyniki można przedstawić w formie mapy ciepła (heat plot). Dane przedstawione na Rysunku 12 ilustrują mapę ciepła odpowiadającą pomiarom trzech zestawów danych uzyskanych dla 96 związków.

Po zidentyfikowaniu związków o wystarczającej aktywności, często niezbędne jest sprawdzenie, czy cząsteczki te są aktywne w odniesieniu do innych kombinacji receptorów. W przypadku receptora GABAA zidentyfikowano 19 genów kodujących różne podjednostki i wiadomo, że funkcjonalny receptor może powstać z multimerycznego kompleksu różnych podjednostek (przegląd w Knoflach, Hernandez i Bertrand10). Chociaż wielość podjednostek i ich kombinacji daje ogromny repertuar podtypów receptorów, co mogłoby wymagać przeprowadzenia licznych badań przesiewowych w celu wykluczenia niepożądanej aktywności, często możliwe jest skupienie się w pierwszej kolejności na najpowszechniejszym podtypie, którym w przypadku receptorów GABAA jest skład α1β2γ2. Eksperymenty prowadzone równolegle z ekspresją na przykład α5β3γ2 i α1β2γ2 w tej samej partii oocytów pozwalają na rzetelne porównanie efektów danej cząsteczki. Typowe wyniki uzyskane z trzech komórek dla α5β3γ2 i α1β2γ2 przedstawiono na Rysunku 13, który ilustruje preferencyjną pozytywną modulację jednej z cząsteczek w obrębie α5β3γ2.

Protokół eksperymentalny przedstawiony na Rysunku 11 jest odpowiedni do charakteryzacji aktywności PAM. W tym protokole testowany związek jest aplikowany wspólnie z agonistą w stopniowo zwiększających się stężeniach. Aby uniknąć możliwych efektów kumulatywnych spowodowanych wielokrotną aplikacją do tej samej komórki, dla każdego punktu danych pomiar jest wykonywany na nowej, naiwnej komórce. Pomiar amplitudy odpowiedzi rejestrowanej z samym agonistą, a następnie podczas aplikacji związku, pozwala wyznaczyć stosunek ilościowy określający efekt PAM lub NAM. Typowe wyniki uzyskane dla diazepamu przy receptorach α1β2γ2 oraz α5β3γ2 przedstawiono na Rysunku 14, co wykazuje pozorną wrażliwość α5β3γ2, która w tej kombinacji receptorowej jest około 10-krotnie wyższa. Wartości te są dobrze skorelowane z opublikowanymi danymi11. Ponieważ uważa się, że miejsce wiązania benzodiazepin tworzy interfejs między podjednostką γ2 a przyległą do niej podjednostką α12,13,14, wrażliwość α5β3γ2 sugeruje preferencyjne powinowactwo diazepamu do γ2-α5 nad γ2-α1. Możliwość ekspresji różnych kombinacji receptorowych w połączeniu z efektywną charakteryzacją funkcjonalną otwiera wiele dróg badania determinantów właściwości PAM oraz ich wpływu na efekty fizjologiczne i farmakologiczne.

Przekroje mózgu z obszaru hipokampa:
Doświadczenia z wykorzystaniem przekrojów mózgu szczura z obszaru hipokampa prowadzi się w celu walidacji profilu farmakologicznego związków zidentyfikowanych w badaniach in vitro w natywnym modelu receptorowym. Przeważającymi podtypami receptorów GABAA wyrazzanymi w komórkach piramidowych hipokampa są α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 oraz α5β2/3γ2, które wszystkie są modulowane przez benzodiazepiny (BDZs)15. Hamowanie wywołane podwójnym impulsem (paired-pulse inhibition) to paradygmat, który pozwala określić pobudliwość obwodów hipokampa poprzez badanie zmiany odpowiedzi na drugi z dwóch sparowanych bodźców elektrycznych dostarczonych w odstępie 20 ms. Zmiana drugiej odpowiedzi wynika z feedbacku GABAergicznego realizowanego przez interneurony unerwiające warstwę komórek piramidowych16,17,18. Jak pokazano na Rysunku 7, w warunkach kontrolnych druga odpowiedź z dwóch sparowanych bodźców jest hamowana ze względu na inhibicję GABAergiczną. Gdy inhibicja ta zostanie zredukowana poprzez perfuzję przekroju β-CCM, nieselektywnym NAM, druga odpowiedź z dwóch sparowanych bodźców jest hamowana w znacznie mniejszym stopniu. Ten paradygmat doświadczalny jest czuły na związki selektywne wobec receptora GABAA zawierającego podjednostkę α5.

Schemat procesu odkrywania leków; od wysokoprzepustowych przesiewów do badań klinicznych.
Rysunek 1Strategia przesiewowa. Typowy proces przesiewania leków rozpoczyna się od wysokoprzepustowych badań przesiewowych, w których duże biblioteki związków są analizowane pod kątem konkretnego celu. Po zidentyfikowaniu kandydata wiodącego rozpoczynają się prace z zakresu chemii medycznej. W tej fazie chemicy badają i udoskonalają cząsteczki, wprowadzając modyfikacje strukturalne w celu spełnienia pożądanych kryteriów, takich jak selektywność wobec celu, przenikalność do mózgu, stabilność oraz degradacja. itd. W tej kluczowej fazie niezbędne jest ocenie, czy modyfikacje chemiczne nie zmieniły właściwości cząsteczki, oraz wyłonienie najlepszego kandydata. Kolejnym krokiem jest zidentyfikowanie kilku obiecujących związków i przekazanie ich do następnych etapów, które obejmują badanie bezpieczeństwa oraz tolerancji, itd. Należy zauważyć, że jako test funkcjonalny wskazana jest elektrofizjologia, jednak alternatywnie można zastosować inne metody, w tym testy fluorescencji wapnia lub barwniki wrażliwe na napięcie. Te ostatnie metody są również stosowane w badaniach wysokoprzepustowych jako zamiennik testów wiązania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat wyników analizy na płytce; analiza wiązania związków z danymi zakodowanymi kolorami.
Rycina 2: Układ płytki 96-dołkowej wykorzystywanej w eksperymentach z wiązaniem. Kolumna 1 służy do pomiarów całkowitego wiązania, a kolumna 2 do pomiarów wiązania nieswoistego. Wiersze A–H wypełniono 4 różnymi związkami w rosnących stężeniach (kolumny 3–12), każdy związek w duplikacie (tj. związek 1 w wierszach A i E, związek 2 w wierszach B i F, itp.), co zostało przedstawione na schemacie za pomocą różnych kolorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat systemu mikroprzepływowego; obejmuje konfigurację i wyniki generowania oraz analizy kropli.
Rycina 3: Mikrowstrzykiwanie z użyciem systemu zautomatyzowanego. (A) Precyzyjny system XYZ, w którym szklana igła do iniekcji wypełniona cieczą zawierającą interesujący plazmid jest automatycznie wprowadzana do oocytów. (B) Ten panel przedstawia 96-dołkową płytkę ze stożkowym dnem, w której (C) oocyty są automatycznie poddawane iniekcji. (D) Ten panel ilustruje zasadę iniekcji. W przypadku iniekcji jądrowej igła wnika w oocyt nieco głębiej niż jądro komórkowe, jak pokazano na panelu B. Następnie igła jest wycofana z jądra (patrz panel C) przed dokonaniem iniekcji (patrz panel D). (E) Aby ocenić jakość iniekcji, igłę można wypełnić barwnikiem, a „przetworzone” oocyty można przeciąć na pół. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Automatyczny układ rejestracji oocytów, schemat i diagram przedstawiający rozmieszczenie elektrod oraz płytek z substancjami.
Rycina 4: Zasada działania zautomatyzowanej metody z dwiema elektrodami w układzie clamp napięciowym. Zasada ta opiera się na przenoszeniu preparatu między dołkami, zamiast aplikacji cieczy w układzie perfuzyjnym. (A) Lewa strona panelu przedstawia układ umożliwiający rejestrację w oocycie Xenopus z dwiema elektrodami i małym koszyczkiem, który utrzymuje kroplę cieczy wokół preparatu podczas przenoszenia z jednej próbki do drugiej. Po prawej stronie pokazano zdjęcie oocytu umieszczonego w koszyczku z dwiema elektrodami. (B) Ten panel przedstawia schematyczną reprezentację zasady rejestracji elektrofizjologicznej w układzie „odwróconym”. (C) Ten panel pokazuje rozmieszczenie oocytu, płytki z substancjami oraz stacji płukania na stole rejestracyjnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat metod clampowania napięcia z elektrodami w oocytach; patch-clamp w neuronach do badań jonowych.
Rycina 5: Rejestracja metodą dwuelektrodowego clampowania napięcia w porównaniu do metody patch-clamp. Typowa rejestracja metodą dwuelektrodowego clampowania napięcia dla oocytów (panel lewy) zestawiona z konfiguracją patch-clamp stosowaną dla linii komórkowej (panel prawy). Należy zwrócić uwagę na różnicę wielkości między oocytami, które mają średnicę około 1 mm, a komórkami o średnicy około 20 µm. W dwuelektrodowym clampowaniu napięcia potencjał błonowy oocytu jest porównywany z pożądanym napięciem podtrzymującym, a różnica sygnału jest wstrzykiwana do elektrody prądowej. W rejestracji patch-clamp przyjmuje się, że rezystancja elektrody patch-clamp jest pomijalna wobec rezystancji błonowej i w związku z tym napięcie narzucone przez wzmacniacz jest wiernie przekazywane na błonę komórkową19. Ilustracja przedstawia perfuzję za pomocą filamenciecie cieczy, w której dwa kanały rurki theta () wypełnione są z jednej strony roztworem kontrolnym, a z drugiej roztworem zawierającym lek20,21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy odpowiedzi na GABA: panel A ustawienie, panel B zapis prądu, panel C krzywa zależność dawka-odpowiedź.
Rycina 6: Zależność aktywacji od stężenia w ludzkich receptorach α5β3γ2. (A) Sekwencja sterująca systemem zautomatyzowanym składa się z serii ikon i określa protokół eksperymentalny do wyznaczania zależności aktywacji od stężenia. W krokach 1–3, jak pokazano na tym panelu, system przenosi oocyt z płytki do koszyka pomiarowego. W kroku 2 mierzony jest prąd upływu i w przypadku przekroczenia pożądanych kryteriów, komórka jest automatycznie wymieniana (krok 3). Po okresie stabilizacji (krok 4) mierzy się odpowiedź oocytu na referencyjne stężenie GABA (kroki 5 - 8). Do dalszych pomiarów kwalifikowane są oocyty wykazujące prądy większe niż 1 µA. W krokach 11–13 komórka jest poddawana działaniu różnych stężeń GABAA, a proces powtarza się dla pożądanej liczby stężeń (krok 14) i komórek (krok 15). (B) Ten panel przedstawia typowe prądy wywołane serią krótkich aplikacji GABA (30 s) stosowanych w kolejności rosnącej. Czas aplikacji związku zaznaczono paskami. (C) Wykres szczytowego prądu dośrodkowego jako funkcji logarytmu stężenia GABA daje krzywą aktywacji stężeniowej, którą można łatwo dopasować do empirycznego równania Hilla, z krzywą ciągłą, EC50 na poziomie około 11 µM i współczynnikiem Hilla wynoszącym 1,3. Prądy zarejestrowane w 8 komórkach zostały znormalizowane do jedności dla maksymalnej wywołanej odpowiedzi. Paski wskazują standardowy błąd średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat rejestracji i stymulacji neuronalnej z wynikami w postaci przebiegów falowych i wykresu słupkowego; analiza odpowiedzi synaptycznej.
Rycina 7: β-CCM, NAM receptora GABAA, redukuje hamowanie podwójnym impulsem w skrawkach hipokampa. (A) Ten panel przedstawia schematyczny przekrój skrawka hipokampa szczura. Kolaterale Schaffera (Sch C), wywodzące się z aksonów komórek piramidowych obszaru CA3, rzutują na arboryzację dendrytyczną neuronów piramidowych obszaru CA1. Mikropipety umieszczono w warstwie piramidowej (stratum pyramidale) w celu rejestracji potencjałów populacyjnych (PS) oraz w warstwie promienistej (stratum radiatum) do dendrytycznej rejestracji polowych potencjałów pobudzeniowych postsynaptycznych (epsp). Elektrodę stymulującą umieszczono w obrębie kolateral Schaffera. (B) Ten panel pokazuje PS wywołane przez podwójne bodźce przyłożone za pomocą tej samej elektrody stymulującej w odstępie 20 ms. Odpowiedź populacyjna na drugi bodziec (PS2) ma mniejszą amplitudę niż odpowiedź na pierwszy bodziec (PS1). (C) PS rejestrowano w obecności (czarny słupek) i przy braku (zielony słupek) β-CCM, nieselektywnego NAM receptora GABAA. β-CCM zwiększył amplitudę drugiego PS2, częściowo blokując hamowanie GABAergiczne typu feed-forward. Słupki wskazują standardowy błąd średniej, a symbol *** oznacza, że dane są wysoce istotne przy p <0.01. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres powinowactwa wiązania, % wiązania swoistego vs. Log[RO4938581] dla wielu podtypów receptorów.
Rycina 8: Typowe wyniki wiązania uzyskane w teście konkurencyjnym (hamowania lub wypierania). Na podstawie generowanych krzywych wypierania wiązania można wyznaczyć IC50 oraz Ki. IC50 to stężenie ligandu konkurencyjnego, który wypiera 50% swoistego wiązania radioliganda, a Ki (stała inhibicji leku) to stężenie ligandu konkurencyjnego, który zająłby 50% receptorów w przypadku braku radioliganda. Wartość Ki oblicza się z IC50 przy użyciu równania Chenga-Prusoffa:
Równanie obliczania Ki; Wiązanie konkurencyjne; Formuła dla potencji inhibitora; Analiza farmakologiczna.
Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy wartości Ki (nM) dla związków S-8510, AC3933, L-792,782, RO493851 w zależności od typu receptora.
Rycina 9: Przeprowadzono konkurencyjne badania wypierania ligandów wiążących się z głównymi podtypami receptorów GABAA. Powinowactwa (nM) zmierzono przy użyciu testu wiązania [3H]flumazenilu oraz membran z komórek HEK293 przejściowo transfektowanych różnymi kombinacjami podjednostek ludzkiego receptora GABAA. Przedstawienie w formie histogramu wyraźnie ilustruje różnicową wrażliwość zaobserwowaną dla związku RO493851, który wykazał najniższą wartość Ki dla receptorów α5β3γ2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wykres radarowy równowagi statycznej z EC50 μM; diagram konfiguracji podjednostek molekularnych.
Rysunek 10: Różnicowa wrażliwość receptorów na GABA. Wykres EC50 receptora dla GABA w formie wykresu radarowego oraz przedstawienie domniemanego składu podjednostek stanowią efektywne sposoby porównania roli różnych podjednostek. Należy zauważyć, że wprowadzenie podjednostek γ2 wiąże się ze zmniejszeniem wrażliwości receptora. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat eksperymentu na oocytach i wykres przedstawiający dane elektrofizjologiczne z testowania związku.
Rysunek 11: Badanie wpływu modulatora. (A) Ten panel przedstawia sekwencję ikon używanych do sterowania zautomatyzowanym systemem. Należy zauważyć, że dwie ikony (A/D) odpowiadają pomiarowi w grupie kontrolnej (zielony) oraz podczas ekspozycji na modulator (czerwony). (B) Ten panel przedstawia typowe prądy zarejestrowane w komórce wykazującej ekspresję receptora GABAA podczas takiej sekwencji. Aby ocenić działanie modulatora, przeprowadzono sekwencję pomiarów, w której najpierw mierzono odpowiedź wywołaną ekspozycją na stałe stężenie GABA (ślad zielony), a następnie ekspozycję najpierw na GABA, a potem na GABA wraz z modulatorem (ślad czerwony). Ustawienie kursorów w kształcie krzyżyka (cyjanowy i niebieski) wyznacza zakres pomiarów, a niebieski krzyżyk wskazuje maksymalną różnicę między dwoma warunkami pomiaru. Stosunek między warunkiem kontrolnym a warunkiem z modulatorem jest automatycznie obliczany przez oprogramowanie analityczne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Diagram mapy ciepła przedstawiający efekty leków; potencjację, inhibicję, brak efektu w trzech powtórzeniach.
Rycina 12: Mapa ciepła dla trzech powtórzeń. Ten panel przedstawia mapę ciepła odpowiadającą trzem powtórzeniom efektów modulatorów uzyskanych dla 96 związków w przypadku ludzkich receptorów α5β3γ2 GABAA. Stosunki odpowiedzi testowej do kontrolnej mieszczące się w przedziale od 0,5 do 1,2 uznano za nieistotnie różniące się od kontroli i zostały one przedstawione za pomocą zielonych kropek. Stosunki poniżej 0,5 uznano za reprezentujące efekt inhibicyjny i zostały one przedstawione za pomocą niebieskich kropek. Stosunki powyżej 1,2 uznano za wzmacniające odpowiedź i zostały one przedstawione za pomocą czerwonych kropek. Należy zwrócić uwagę na podobieństwo wzorca pomiędzy trzema niezależnymi pomiarami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy podjednostek białkowych z wynikami wykresów patch-clamp; analiza przewodności synaptycznej.
Rycina 13: Przesiewy przeciwstawne dla α1β2γ2. (A) Ten panel przedstawia reprezentację domniemanej organizacji podjednostek. Kolejne panele pokazują (B-D) ocenę efektów dodatniego modulatora allosterycznego dla ludzkich receptorów α5β3γ2 oraz (F-H) dla α1β2γ2, przy zastosowaniu porównywalnych stężeń GABA i podobnych stężeń (100 µM) modulatora, co podkreśla specyficzność związku testowanego w tych eksperymentach. (E) Ten panel również przedstawia reprezentację domniemanej organizacji podjednostek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Odpowiedź prądowa kanałów jonowych, α1β2γ2, α5β3γ2; efekt diazepamu; diagramy GABA, analiza farmakologiczna.
Rycina 14: Wrażliwość na PAM i skład receptorów. Wyznaczenie efektów serii stężeń diazepamu (A-D) dla receptorów α1β2γ2 oraz (E-H) α5β3γ2 wykazuje niemal 10-krotną różnicę w powinowactwie pozornym. Należy również zwrócić uwagę na wpływ składu podjednostek na przebieg czasowy odpowiedzi, z szybszą desensytyzacją w przypadku receptorów α1β2γ2 (patrz np. panele D i H). Zauważmy, że ponieważ receptory α1β2γ2 i α5β3γ2 wykazują różne powinowactwa do GABA (patrz również Rycina 10), stężenie agonisty zostało dostosowane pomiędzy tymi dwoma receptorami, aby znajdowało się w porównywalnym zakresie aktywacji. (I) Ten panel przedstawia wykres krotności wzrostu amplitudy prądu znormalizowanej do jedności w stosunku do warunków kontrolnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces ekspresji genu z plazmidu; schemat z oocytami Xenopus i komórkami ssaków; badania biologiczne.
Rycina 15: Plazmid ekspresyjny zawierający promotory T7 i CMV. Te panele przedstawiają plazmid do ekspresji w oocycie Xenopus (prawy górny panel) oraz w linii komórkowej. Prawy dolny panel ilustruje typową komórkę HEK-293 przetransfekowaną plazmidem zawierającym również gen zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) wraz z elektrodą do rejestracji metodą patch-clamp. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Dyskusja

Opracowanie nowych związków aktywnych w kanale jonowym bramkowanym ligandem, takich jak receptory GABAA , wymaga zastosowania wielu podejść. Zazwyczaj pierwszy etap jest często przeprowadzany przy użyciu testów wiążących; Pomiary te są jednak niewystarczające do scharakteryzowania fizjologicznej aktywności związku lub jego precyzyjnej farmakologii. W szczególności związek, który wiąże się z receptorem, może wzmacniać lub hamować jego funkcję, a nawet nie wywoływać żadnego efektu funkcjonalnego (być cichym) (tj. wiązać się z receptorem bez modyfikowania jego funkcji). W związku z tym do pełnej charakterystyki związku wymagany jest test funkcjonalny.

Testy wiążące:
Główną zaletą testu wiązania jest to, że można go skutecznie przeprowadzić na dużej liczbie próbek, sięgającej kilku tysięcy, oraz że zapewnia powinowactwo do wiązania cząsteczek aktywnych. Jak opisano w niniejszym dokumencie, pierwszy krok polega na ustaleniu metody oceny pożądanych podtypów receptorów. Mianowicie, podczas gdy wiązanie może być prowadzone na receptorach natywnych z frakcji lub całych mózgów, taka metoda uniemożliwi określenie powinowactwa do określonych podtypów receptorów. W związku z tym konieczne jest stosowanie układów rekombinowanych do badania przesiewowego cząsteczek w pożądanym celu. Obecnie przejściowa lub stabilna transfekcja pożądanych podjednostek receptorowych cDNA w liniach komórkowych oferuje wydajną i niezawodną metodę ekspresji podtypów receptorów będących przedmiotem zainteresowania (np. GABAA α5β3γ2). Tradycyjne testy wiązania wykorzystują radioligandy, ale obecnie dostępne są techniki, które pozwalają uniknąć niedogodności związanych z obchodzeniem się z radioaktywnością (np. ilościowe wiązanie ligandów na podstawie fluorescencji).

Wyrażenie funkcyjne w systemie hosta:
Aby uzyskać ekspresję genów w systemie gospodarza, sekwencja kodująca, która jest przedmiotem zainteresowania, musi zostać wprowadzona do plazmidu, który zawiera odpowiednie promotory. Zazwyczaj do syntezy mRNA in vitro stosuje się bakteryjne promotory T7 lub T6. W przypadku ekspresji cDNA transkrypcja genu będącego przedmiotem zainteresowania musi być regulowana przez promotor eukariontowy, taki jak CMV (wirus cytomegalii) lub równoważny. Obecnie dostępnych jest kilka plazmidów, w tym dwa promotory (tj. pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV / T7, pCI-neo, pcDNA), umożliwiające syntezę mRNA in vitro lub ekspresję cDNA, jak pokazano na rysunku 15. Ekspresję receptorów GABAA można wiernie uzyskać zarówno w liniach komórkowych, jak i w oocytach Xenopus . Głównymi zaletami tych ostatnich są brak endogennej ekspresji receptora, prostota manipulacji oraz dostępność zautomatyzowanego systemu do mikroiniekcji i zapisów. Procedury opisane w tym protokole obrazują skuteczność zautomatyzowanego systemu, który pozwala na wstrzyknięcie 96 komórek jajowych w ciągu około 7 minut i nie wymaga umiejętności mikromanipulacji. Biorąc pod uwagę, że pojedynczy jajnik z Xenopus zawiera od 10 000 do 30 000 oocytów, jasne jest, że na jednym preparacie można przeprowadzić dużą liczbę pomiarów komórek. Ponadto, ponieważ ekspresję można przeprowadzić za pomocą iniekcji cDNA, te same plazmidy zawierające interesujące geny, które są opracowywane do eksperymentów wiązania, mogą być wykorzystane do charakterystyki funkcjonalnej bez potrzeby dalszych manipulacji biologii molekularnej.

Biorąc pod uwagę jego duży rozmiar i wysoką ekspresję powierzchniową, pojedynczy oocyt wytwarza liczbę receptorów, która jest w przybliżeniu równoważna zbiegającym się komórkom na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Jednak przygotowanie i wstrzyknięcie oocytów stanowi ułamek kosztu linii komórkowej, ponieważ eksperymenty nie wymagają specjalnej pożywki hodowlanej i sterylnych manipulacji. Aktywacja pojedynczego kanału GABAA daje kilka pikoamperów (10-12), a prądy sięgające nawet kilkudziesięciu mikroamperów (10-6) są łatwo rejestrowane w pojedynczym oocycie, co potwierdza jednoczesną aktywność kilku milionów receptorów podczas jednej odpowiedzi.

Pierwszym krokiem w charakterystyce kanałów jonowych bramkowanych ligandem jest często określenie pozornego powinowactwa receptorów. Eksperymenty, które należy przeprowadzić, polegają na zastosowaniu serii krótkich impulsów testowych agonistów i wykreśleniu amplitudy wywołanego prądu lub, w niektórych przypadkach, pola pod krzywą (AUC) w funkcji logarytmu stężenia agonisty. Ponieważ łatwo jest mikrowstrzykiwać plazmidy o różnych stężeniach i proporcjach w tej samej partii oocytów, ten system ekspresji jest szczególnie odpowiedni dla takiej charakterystyki. Co więcej, porównanie poszczególnych partii wykazało wysoki stopień stabilności dla różnych EC50s. Wpływ składu podjednostki na pozorne powinowactwo receptora można łatwo zobrazować za pomocą wykresu pająka, jak pokazano na rycinie 10.

Wyniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego uzyskane w oocytach Xenopus są często porównywane z zapisami wykonanymi przy użyciu elektrod patch clamp. Jakkolwiek szczegółowe porównanie tych dwóch systemów wykraczałoby poza zakres niniejszej pracy, można poruszyć kilka kwestii. Podczas gdy klamra punktowa w komórkach oferuje korzyści w charakterystyce biofizycznej z szybkim zastosowaniem leku, jego wymagania są bardziej złożone niż w przypadku zapisów dwuelektrodowych w oocytach Xenopus . Pierwszą i istotną trudnością jest ekspresja danego białka z koniecznością hodowli komórkowej, transfekcji przejściowej lub stabilnej oraz identyfikacja komórek, które wyrażają pożądany konstrukt. Ponadto niezbędne jest zbadanie możliwego udziału ekspresji endogennej w rozważanej komórce. Co więcej, zapis za pomocą zacisku krosowego wymaga wykwalifikowanej osoby przeprowadzenia mikromanipulacji pod mikroskopem o dużym powiększeniu, przy czym osoba ta musi również przeprowadzić odpowiednią analizę podczas eksperymentu, aby ocenić np. jakość uszczelki, opór dostępu itp. Natomiast zapis cęgowy napięciowy z dwiema elektrodami, zwłaszcza przy użyciu zautomatyzowanego systemu elektrofizjologicznego, Nie wymaga żadnych szczególnych umiejętności i może być przeprowadzana przez techników laboratoryjnych.

Przy zakupie zestawu elektrofizjologicznego rozważenie kosztów jest z pewnością ważnym czynnikiem, który należy dokładnie przeanalizować. Na przykład, podczas gdy koszt zautomatyzowanego systemu jest stosunkowo wysoki, bliższe porównanie pokazuje, że instalacja kompletnego zestawu elektrofizjologicznego obejmuje zakup sprzętu, takiego jak dobre mikromanipulatory, soczewka lornetkowa, wzmacniacz, system perfuzyjny i stół antywibracyjny, a także pozyskiwanie danych i przeprowadzanie analizy. Porównanie kosztów między konfiguracją cęgów napięciowych z dwiema elektrodami a konfiguracją z zaciskiem krosowym ujawnia jeszcze dalsze rozbieżności. Co więcej, zautomatyzowany system ma tę zaletę, że jest w pełni zautomatyzowanym sprzętem i działa bez nadzoru w dzień iw nocy.

Właściwości farmakologiczne związku zależą od jego sposobu działania na receptor. Na przykład inhibitory kompetycyjne to cząsteczki, które mogą dostać się do tej samej kieszeni wiążącej lub miejsca ortosterycznego, ponieważ sam agonista powoduje konkurencję. Inhibitory niekonkurencyjne to związki, które hamują receptory poprzez interakcję w innym miejscu, a w przypadku kanału jonowego bramkowanego ligandem, które mogą na przykład wnikać i blokować pory jonowe. Zbadanie różnych mechanizmów interakcji wykraczałoby poza zakres tej pracy, ale dalsze informacje można uzyskać z podręcznika farmakologicznego i/lub z innych prac, takich jak22 Bertranda i Bertranda.

W przypadku modulatorów allosterycznych związek wiąże się w miejscu, które jest odrębne od miejsca ortosterycznego, ale obecność cząsteczki modyfikuje barierę energetyczną między stanem aktywnym a innymi stanami. Dodatnie modulatory allosteryczne (PAM) to związki, które zmniejszają barierę energetyczną ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, a tym samym wzmacniają działanie agonisty. Aby scharakteryzować możliwe efekty PAM, konieczne jest zatem określenie, czy narażenie na ten związek wzmacnia odpowiedź na agonistę, a jeśli tak, to w jakim stężeniu. Eksperymenty przedstawione na rycinach 11 i 14 ilustrują protokoły, które mogą być z powodzeniem stosowane do charakterystyki PAM w receptorach GABAA .

W niektórych przypadkach sama ekspozycja na PAM może być wystarczająca do aktywacji receptorów. Taką aktywność można określić poprzez nieznaczną modyfikację przedstawionego tu protokołu eksperymentalnego. Mianowicie, zamiast stosować jednoczesne stosowanie modulatora podczas ekspozycji na GABA, protokół może być zmodyfikowany pod kątem zastosowania najpierw samego związku, a następnie w obecności GABA. Charakterystyka bezpośredniej aktywności agonistycznej zostanie dokonana poprzez określenie amplitudy odpowiedzi wywołanej przez sam związek i porównanie z prądem wywołanym przez GABA.

Eksperymenty przeprowadzone na wycinkach mózgu, takie jak zilustrowane na rycinie 7, są wykorzystywane do potwierdzenia aktywności związku w natywnych receptorach w określonym obwodzie hamującym, zanim przejdą dalej w modelach zwierzęcych i na ścieżce do badań klinicznych. Stosunkowo prosty protokół rejestracji i analizy danych pozwala na klasyfikację wielu związków poprzez ocenę ich różnicowego wpływu modulacyjnego na amplitudę PS. Niespecyficzne działanie związków, które nie są związane z układem GABA, może być również wykrywane (np. gdy obserwuje się zmiany w kształcie PS). Bezpośrednie, GABA-ergiczne neuroprzekaźnictwo można ocenić w tych przypadkach, mierząc wpływ związków na hamujące prądy postsynaptyczne (IPSC) przy użyciu techniki całokomórkowego patch clamp8.

Oświadczenia

Autorzy, Frédéric Knoflach i Maria-Clemencia Hernandez, są pracownikami firmy farmaceutycznej F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Bazylea, Szwajcaria. Autor Daniel Bertrand jest pracownikiem HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genewa, Szwajcaria, dostarczającym zaplecze do badań przesiewowych firmom farmaceutycznym.

Podziękowania

Autorzy dziękują Judith Lengyel, Marii Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab i Marie Claire Pflimlin z Roche oraz Tifany Schaer i Deborah Paolucci z HiQScreen za doskonałą pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
General equipment
96 kombajn komórkowy -(Filtermate 196) PackardDo filtracji membran ze związanym radioligandem
Płytka mikromiareczkowa Licznik scyntylacyjny cieczy (Top Count NXT)Licznik scyntylacji i luminescencji mikropłytekPackard
Licznik scyntylacyjny cieczy (Beta-Couter 2500 TR)Fiolka PackardLicznik scyntylacji i luminescencji
Ciecz  handler (Biomek 2000)RedlicaBeckmanDo przygotowania rozcieńczeń złożonych
Vortex (Vortex Genie 2)Scientific industries Inc.Do mieszania złożonych roztworów podstawowych
Homogenizator tkankowy (Polytron PT1200E)Kinematica AGDo ponownego zawieszenia preparatów membranowych
Oprogramowanie XLfit5Microsoft Excel
  Dodatek przez IDBS		Oprogramowanie do dopasowywania krzywych
Smart PullUniPix-ElectrodePuller
RoboInjectMultiChannel Systems-AutomatedInjection (Xenopus Oocytes)
HiClampMultiChannelSystems-AutomatedVoltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMiningMultiChannelSystems-Data Oprogramowanie analityczne
DataMergerMultiChannelSystems-Oprogramowaniedo przetwarzania danych
Digidata 1550Molecular DevicesSystem akwizycji danych o niskim poziomie szumów
CyberAmp 380 lub równoważnyAxon InstrumentsProgramowalny kondycjoner sygnału
Pakiet programów pClampUrządzeniaOprogramowanie do akwizycji i analizy danych oprogramowanie
Stół antywibracyjny TMCAby uniknąć wibracji mikroelektrod 
Mikromanipulatory PatchstarScientificaDo precyzyjnego pozycjonowania mikroelektrod w wycinkach mózgu
 Sutter InstrumentsDo izolowania nagrań od hałasu
McIlwain Tissue ChopperCampden Instruments LTD Do przygotowania plastrów mózgu mikropipeta
ze szkła borokrzemianowego Warner InstrumentsGC150TF-10Do rejestrowania potencjałów zewnątrzkomórkowych w wycinkach mózgu
Skrętka, elektroda stymulacyjna z drutów platynowo-irydowychWorld Precision InstrumentsDo stymulacji wycinków mózgu prądem
Generator bodźców do stymulacji sterowanej prądem i napięciemSystemy wielokanałoweSTG4000Dostarcza prąd do elektrody
stymulującejPlasticwarePłytka
mikromiareczkowania z okrągłym dnemCorning#3365Używana do oznaczania wiązania
GF / C z filtrem z włókna szklanego 96-dołkowa mikropłytka z 1,2 i mikro; m Poresize, do testów pobierania komórek za pomocą filtra próżniowego z kolektorem dolewkowym Packard #6005174używany do testu wiązania
50 ml probówkiFalcon #352070używane do testu wiążącego
Probówki Safe-lock 1,5 mlEppendorf#0030 120086używane do testu wiązania
Probówki Safe-lock 2 mLEppendorf#0030 120094używane do testu wiążącego
Probówki transportowe 180 mL Semadeni Europe AG #3722używany do testu wiązania
Fiolka z kucykiem Polietylen 6 mL Perkin Elmer #6013329używany do testu wiązania
Top Seal Perkin Elmer #60051859używany do oznaczania wiązania
Kolba obrotowaBellcoBELLCO # 1965-00100Kolba obrotowa
96  Płytka studzienkowa (stożkowa)Thermo Scientific Milian56368Płytka iniekcyjna do oocytów
96  Płytka studzienkowa (płaskie dno)Corning (Vitaris, Szwajcaria)3364-corPłytka złożona do szklanej kapilary HiClamp
Glass Hilgenberg (Niemcy)-szkło borokrzemianowe 1,2 Średnica zewnętrzna 0,76 ID z preparatem filament
RNA
Ambion mMessage mMachineThermo Fisher Scientificdo syntezy in vitro
Chemikalia
Bufor do oznaczania: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH dostosuj z HCl do 7,4; przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Używany do oznaczania wiązania
Bufor do mycia: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; przechowywać w temperaturze 4 °C.Używany do oznaczania wiązania
Roztwór podstawowy badanych związków 10 mM w DMSOUżywany do oznaczania wiązania
Flumazenil (RO0151788) 10 mM w DMSOUżywany do oznaczania wiązania
Diazepam 4 mM w DMSOUżywany do oznaczania wiązania
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol w etanolu; przechowywać w temperaturze -20 ° CSłuży do oznaczania wiązania
Microscint 40 Packard #6013641Służy do wiązania
testu Ultima Gold Perkin Elmer #6013329Służy do oznaczania wiązania
MS-222SigmaSigma # A5040MS-222
AB/AMSigmaSigma # A5955antybiotyki / leki przeciwgrzybicze
KolagenazaSigmaSigma # C1030Kolagenaza typu I
RnazaSigmaSigma # R2020-250 mLRNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi KitQiagenQiagen # 12362
Sole do sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (NaCl, KCl itp.)Sigma
Membranes
Mrożone preparaty błonowe z przejściowych lub stabilnie transfekowanych HEK293 z nadekspresją różnych ludzkich podtypów receptorów GABAA: &alfa; 1β 3γ 2, &alfa; 2β 3γ 2, &alfa; 3β 3γ 2, &alfa; 5β 3γ2. Zobacz Ballard et al. 2009, aby zapoznać się ze szczegółowymi metodami.Służy do oznaczania wiązania
molekularne Klatka Faradaya do

Bibliografia

  1. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
  2. Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
  3. Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
  4. Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
  5. Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
  6. Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
  7. Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
  8. Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
  9. Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
  10. Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
  11. Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
  12. Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323(2013).
  13. Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
  14. Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
  15. Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
  16. Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
  17. Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
  18. Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
  19. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
  20. Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
  21. Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
  22. Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17(2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Receptor GABA-Aanaliza wiązania radioligandaoocyty Xenopusdwuelektrodowa metoda clampowania napięciaskrawki mózgu gryzonirejestracja potencjałów populacyjnychkaskada przesiewania związkówrejestracja elektrofizjologicznaanaliza podtypów receptorówcharakterystyka farmakologiczna
Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.