Artykuł metodologiczny

Szybki test zjadliwości bakterii oparty na obrazie przy użyciu ameby

DOI:

10.3791/57844

⸱

27 czerwca 2018

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru zjadliwości bakterii planktonowych lub przyczepionych powierzchniowo przy użyciu D. discoideum (ameba) jako gospodarza. Wirulencję mierzy się przez okres 1 godziny, a zabijanie gospodarza określa się ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i analizy obrazu. Demonstrujemy ten protokół za pomocą bakterii P. aeruginosa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne testy zjadliwości bakterii polegają na długotrwałym wystawianiu bakterii na komórki gospodarza przez kilka godzin. W tym czasie bakterie mogą ulegać zmianom w fizjologii ze względu na ekspozycję na środowisko wzrostu gospodarza i obecność komórek gospodarza. Opracowaliśmy test do szybkiego pomiaru stanu wirulencji bakterii, który minimalizuje stopień, w jakim bakterie rosną w obecności komórek gospodarza. Bakterie i ameby są mieszane ze sobą i unieruchamiane na jednej płaszczyźnie obrazowania za pomocą podkładki agarowej. Procedura wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych komórek za pomocą estru kalceinowo-acetoksymetylowego (calcein-AM) jako wskaźnika zdrowia komórek gospodarza. Fluorescencję komórek gospodarza analizuje się po 1 godzinie ekspozycji komórek gospodarza na bakterie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Oprogramowanie do analizy obrazu służy do obliczania indeksu zabijania hosta. Metoda ta została wykorzystana do pomiaru zjadliwości w subpopulacjach planktonowych i przyczepionych powierzchniowo Pseudomonas aeruginosa w początkowej fazie tworzenia biofilmu i może być dostosowana do innych bakterii i innych etapów wzrostu biofilmu. Protokół ten zapewnia szybką i solidną metodę pomiaru zjadliwości i pozwala uniknąć wielu zawiłości związanych ze wzrostem i utrzymaniem linii komórkowych ssaków. Fenotypy wirulencji mierzone tutaj za pomocą ameb zostały również potwierdzone przy użyciu makrofagów myszy. W szczególności test ten został wykorzystany do ustalenia, że przyleganie powierzchniowe zwiększa zjadliwość u P. aeruginosa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infekcja bakteryjna jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności u ludzi i zwierząt1,2. Możliwość pomiaru zjadliwości bakterii w kulturach lub biofilmach jest ważna w opiece zdrowotnej i badaniach. W tym miejscu opisujemy wszechstronną, szybką i stosunkowo prostą metodę ilościowego określania zjadliwości bakterii. Organizm eukariotyczny Dictyostelium discoideum (ameba) jest używany jako modelowy organizm gospodarza. D. discoideum został użyty jako gospodarz do identyfikacji czynników wirulencji u Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)3,4,5 i innych bakterii6,7,8 i jest podatny na te same czynniki wirulencji, które zabijają komórki ssaków, w tym wydzielanie typu III9,10. Poprzednie testy wirulencji z użyciem D. discoideum obejmowały długotrwałą ekspozycję bakterii na komórki D. discoideum w ciągu kilku godzin3,4,5. Protokół przedstawia tutaj szybką metodę określania zjadliwości przy użyciu tej ameby. Ten protokół (Rysunek 1) opisuje, jak: (1) hodować ameby aksenicznie (pod nieobecność bakterii), (2) hodować bakterie do testu, (3) przygotowywać bakterie i komórki gospodarza do mikroskopii, (4) wykonywać mikroskopię epifluorescencyjną i (5) analizować fluorescencję ameby.

Amoeby są początkowo wyjmowane z zamrożonych zapasów i hodowane na trawniku Escherichia coli (E. coli), gdzie ameby produkują zarodniki. Zarodniki te są zbierane i zaszczepiane we wzbogaconym pożywce w celu wzrostu aksenowego. Ameby są utrzymywane przez wzrost akseniczny w warunkach bogatych w składniki odżywcze, dopóki nie będą gotowe do zmieszania z bakteriami w celu oceny zjadliwości bakteryjnej. Przeżycie lub śmierć ameb określa się ilościowo, mierząc fluorescencję kalceiny-acetoksymetylu (kalceiny-AM), która jest rozszczepiana przez wewnątrzkomórkowe esterazy i w ten sposób aktywowana do fluorescencji11,12. Żywe ameby wykazują niewielką lub żadną fluorescencję, podczas gdy zestresowane i umierające komórki intensywnie fluoryzują. Wynik ten wynika z niewielkiego lub żadnego włączenia kalceiny-AM do zdrowych ameb oraz włączenia i rozszczepienia substratu w zestresowanych amebach13. To zachowanie wyraźnie różni się od fluorescencji kalceiny-AM w komórkach ssaków11,14,15,16.

Bakterie, które będą oceniane pod kątem zjadliwości, są hodowane oddzielnie. W tym miejscu opisujemy, jak zmierzyć zjadliwość oportunistycznego patogenu P. aeruginosa i szczegółowo opisano, jak określić ilościowo zjadliwość subpopulacji planktonowych (pływających) i przyczepionych do powierzchni. Protokół ten może być dostosowany do badania zjadliwości innych bakterii. W sekcji Reprezentatywne wyniki pokazujemy, że wirulencja jest aktywowana w komórkach przyczepionych powierzchniowo i jest niska w komórkach planktonowych, co zostało zgłoszone wcześniej13. Aktywowany przez zjadliwość P. aeruginosa zabija ameby, podczas gdy niezjadliwe komórki planktonowe są konsumowane przez ameby. Jeśli zjadliwość bakterii planktonowych jest wyłącznie badana, bakterie można hodować w zwykłych probówkach hodowlanych, a nie na szalkach Petriego, jak opisano w protokole.

Wzrost kultur ameb i P. aeruginosa musi być skoordynowany tak, aby kultury P. aeruginosa osiągnęły zamierzoną fazę wzrostu, podczas gdy ameby rosną w stanie stabilnym w warunkach bogatych w składniki odżywcze. Ten stan zazwyczaj wymaga, aby kultury ameb były rozcieńczone co najmniej 1 dzień przed zmieszaniem ich z bakteriami. Ameby i bakterie są unieruchamiane za pomocą podkładek agarowych, są wspólnie inkubowane przez 1 godzinę i obrazowane za pomocą obiektywu o niskiej rozdzielczości (10X, apertura numeryczna 0,3), filtrów białka zielonej fluorescencji (GFP) i kamery obrazującej. Analizę można przeprowadzić za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ lub niestandardowego oprogramowania do analizy obrazu. Nasza analiza została przeprowadzona przy użyciu naszego autorskiego oprogramowania napisanego przy użyciu pakietu do analizy naukowej13. Oprogramowanie powinno utworzyć maskę przy użyciu obrazu kontrastu fazowego i wyodrębnić wartości fluorescencji z zamaskowanych obszarów na obrazie fluorescencyjnym. Wartości fluorescencji są uśredniane dla co najmniej 100 komórek, co daje liczbowy wskaźnik zabijania gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

1. i roztwory

  1. Przygotuj bulion lizogeniczny (LB) w szklanej butelce o pojemności 1 l, dodając 25 g mieszanki LB-Miller w 1 l podwójnie destylowanej wody (ddH2O). W przypadku szalek Petriego dodaj dodatkowe 20 g agaru. Autoklaw do sterylizacji. Wlej 25 ml stopionego podłoża agarowego do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozostaw do zestalenia się w temperaturze pokojowej. Przechowywać płynne podłoża w temperaturze pokojowej, a płytki agarowe w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj płytki z peptonem drożdżowym glukozy (GYP) w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 1 g D-glukozy, 2 g peptonu, 0,25 g ekstraktu drożdżowego, 4,2 g KH2PO4, 5,1 g Na2HPO47H2O i 25 g agaru w 1 l ddH2O. Autoklaw do sterylizacji. Wlej 25 ml stopionego agaru do szalek Petriego o średnicy 10 cm i pozostaw do zestalenia się w temperaturze pokojowej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj pożywkę z peptonem S (PS) w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 10 g peptonu, 7 g ekstraktu drożdżowego, 15 g D-glukozy, 0,12 g Na2HPO47H2O, 1,4 g KH2PO4, 40 μg witaminy B12 i 80 μg kwasu foliowego w 800 ml ddH2O. Skalibruj elektroniczny pH-metr za pomocą pH 4 i pH 7 standardy, jeśli pH-metr nie był używany w ciągu jednego dnia.
    1. Zmierz pH pożywki PS za pomocą pH-metru. Dodać 5 M KOH lub 5 M H3PO4, aby dostosować pH do 6,5. Dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ddH2O. Filtr wysterylizować za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Postępuj ostrożnie z regulacją pH, nosząc sprzęt ochronny, w tym rękawice, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy.
  4. Przygotować 10x bufor Development Buffer Prime (DB') w szklanej butelce o pojemności 1 l, dodając 3,4 g KH2PO4, 13,4 g Na2HPO4 7H2O i ddH2O do całkowitej objętości 800 ml. Skalibruj elektroniczny pH-metr przy użyciu wzorców pH 4 i pH 7, jeśli pH-metr nie był używany w ciągu jednego dnia.
    1. Zmierzyć pH buforu za pomocą elektronicznego pH-metru. Dostosuj pH do 6,5, delikatnie dodając 5 M KOH lub 5 M H3PO4 w zależności od potrzeb. Dostosować końcową objętość do 1 l za pomocą ddH2O i sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Postępuj ostrożnie z regulacją pH, nosząc sprzęt ochronny, w tym rękawice, odzież ochronną, ochronę oczu i ochronę twarzy.
  5. Wykonać 1x Bufor rozwojowy (DB) mieszając 100 ml buforu 10x DB' z 1 ml sterylizowanego 2 M MgCl2 i 1 ml sterylizowanego 1 M CaCl2. Dostosować końcową objętość do 1 l w szklanej butelce o pojemności 1 litra za pomocą autoklawowanego, sterylizowanego ddH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować pożywkę PS:DB w szklanej butelce o pojemności 1 l, mieszając 100 ml wysterylizowanej pożywki PS, 100 ml wysterylizowanego buforu 10x DB' i wysterylizowanego ddH2O do całkowitej objętości 1 l. Uzupełnij 1 ml wysterylizowanego 2 M MgCl2 i 1 ml wysterylizowanego 1 M CaCl2. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować roztwór podstawowy kalceiny-AM, dodając 50 μl DMSO do 50 μg kalceiny-AM w plastikowym pojemniku dostarczonym przez producenta. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Wzrost i utrzymanie ameb

  1. Uprawiaj szczep E. coli B/r17 jako źródło pożywienia dla ameb w początkowym okresie wzrostu. Smugi E. coli B/r z zamrożonego bulionu przechowywanego w temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
  2. Zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli B/r w 2 ml pożywki LB i inkubować w bębnie rolkowym lub wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Doprowadź nocną kulturę E. coli do temperatury pokojowej. Za pomocą drewnianego patyczka zaszczepić ameby z zamrożonego wywaru przechowywanego w temperaturze -80 °C do 750 μl nocnej kultury.
    UWAGA: Użyj szczepu D. discoideum AX3, który jest zdolny do aksenicznego wzrostu18. Ten krok nie wymaga wzrostu aksonicznego, ale kolejne kroki będą miały jego wymóg.
  4. Natychmiast dodaj 700 μl mieszaniny ameby i E. coli na płytkę z peptonem glukozowo-drożdżowym (GYP). Rozprowadź kulturę równomiernie na powierzchni płytki, przechylając ją w przód iw tył oraz na boki w razie potrzeby. Unikaj używania rozsiewacza.
  5. Umieść płytkę GYP z agarem skierowanym do góry w pudełku o wysokiej wilgotności. Użyj dwóch jednorazowych plastikowych pojemników (183 cm x 183 cm x 91 cm) ułożonych jeden na drugim. Napełnij dolny pojemnik około 25 ml wody i umieść górny pojemnik z kilkoma otworami o średnicy 0.5 cm wywierconymi w podłodze pojemnika, aby umożliwić przepływ wilgoci ze zbiornika na wodę do górnego pojemnika.
  6. Inkubować płytkę i pudełko GYP w temperaturze 22 °C przez 4 - 5 dni, aż zaobserwuje się, że zarodniki ameba rosną w pobliżu powierzchni płytki (Rysunek 2). Do inkubacji płytek należy używać inkubatora z chłodzeniem, a nie inkubacji w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Po wyrośnięciu zarodników pozostają one żywotne na płytkach przez kilka tygodni, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Przechowuj płytki stroną agarową skierowaną do góry. Po 3 - 4 dniach inkubacji można zaobserwować strefy oczyszczania w obrębie trawnika bakteryjnego, które wskazują na początek zarodnikowania ameby.
    1. Obserwuj małe zarodniki ameb nad powierzchnią płytki po 4 - 5 dniach inkubacji (Rysunek 2).
      UWAGA: Nie hoduj ameb dłużej niż tydzień, ponieważ jakość zarodników spada po upływie tego okresu.
  7. Zbierz zarodniki ameb, aby przygotować się do aksonicznego wzrostu ameb, przesuwając sterylną końcówkę pipety o pojemności 1 ml równolegle do powierzchni płytki. Zbierz zarodniki z połowy 10-centymetrowej szalki Petriego.
    UWAGA: Unikaj dotykania końcówki do powierzchni płytki agarowej, ponieważ ten ruch spowoduje zebranie dużej ilości E. coli.
  8. Ponownie zawiesić amebę na końcówce pipety, zanurzając końcówkę w 1 ml pożywki PS i delikatnie pipetując w górę iw dół.
  9. Przenieść zaszczepioną mieszaninę do kolby o pojemności 250 ml zawierającej 25 ml pożywki PS uzupełnionej roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym o stężeniu 0,25x.
    UWAGA: Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy należy przechowywać w postaci 250 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Należy unikać powtarzających się cykli rozmrażania i zamrażania tego roztworu, ponieważ może to zmniejszyć jego skuteczność.
  10. Hoduj ameby osiowo w temperaturze 22 °C w obrotowej wytrząsarce z prędkością 100 obr./min. W przypadku testu wirulencji w kroku 5 hoduj komórki do gęstości optycznej mierzonej przy 600 nm (OD600) wynoszącej od 0,2 do 0,5,
    UWAGA: Ten krok wymaga 3 - 4 dni wzrostu od momentu inokulacji (krok 2.7). Jeśli komórki urosły do większej gęstości, rozcieńczyć kulturę z powrotem w pożywce PS do OD600 0,05 lub mniej i odrosnąć z powrotem do OD600 0,2 do 0,5.

3. Wzrost P. aeruginosa

  1. Wybierz pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki LB, zaszczep ją w kulturze 2 ml PS:DB i hoduj przez noc w temperaturze 37 °C do nasycenia.
    UWAGA: Nie dodawaj roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego do podłoża PS:DB.
  2. Rozcieńczyć kulturę na noc w stosunku 1:100 lub 1:1 000 na szalce Petriego o średnicy 6 cm za pomocą PS:DB. Jeśli badana jest wyłącznie zjadliwość komórek planktonowych, zamiast tego hoduj kultury przy użyciu konwencjonalnych probówek hodowlanych. Wstrząsnąć kulturą na rotatorze stołowym ustawionym na 100 obr./min w temperaturze 37 °C.
  3. Zbieraj kultury w określonych punktach czasowych, aby zapewnić odtwarzalność. W ciągu 30 minut do 1 godziny przed oceną zwilżenia przygotować podkładkę agarową zgodnie z opisem w sekcji 4.
    UWAGA: Wirulencja P. aeruginosa jest indukowana przez około 8 godzin wzrostu na powierzchniach.
  4. W celu wyizolowania komórek przyczepionych powierzchniowo, należy usunąć płynną pożywkę z szalki Petriego, natychmiast przemyć 1 ml buforu DB w celu usunięcia komórek planktonowych i natychmiast przejść do kroku 5.1.
    UWAGA: Nie myj dłużej niż 30 sekund, ponieważ spowoduje to zakłócenia i oderwanie komórek przyczepionych do powierzchni i może wpłynąć na pomiar zjadliwości.
  5. W celu wyizolowania komórek planktonu należy przenieść 10 μl kultury z płytki Petriego na czystą płytkę Petriego i natychmiast przejść do kroku 5.1.

4. Mikroskopia - Przygotowanie podkładki agarowej

  1. Przygotuj podkładki agarowe około 30 minut do 1 godziny, zanim ameby będą gotowe do zmieszania z P. aeruginosa.
  2. Mikrofalowo 50 ml 1% (w/v) agaru w buforze DB w kolbie o pojemności 250 ml. Mieszaj co 20 s, aż znikną grudki agaru.
  3. Schłodzić stopiony agar, umieszczając go w podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 15 minut.
  4. Dodać 15 μl roztworu podstawowego kalceiny-AM do 15 ml stopionego agaru w stożkowej probówce. Wymieszaj, delikatnie odwracając rurkę 4 - 5 razy i natychmiast przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Wykonaj ten krok w polipropylenowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Nie używaj grubego szklanego pojemnika, ponieważ spowoduje to zbyt szybkie zestalenie się agaru.
  5. Wlej stopioną mieszaninę agaru na szklaną płytkę o wymiarach 12 cm x 10 cm i pozwól agarowi zestalić się przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pokrój zestaloną podkładkę agarową na mniejsze odcinki o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm, umieszczając szklaną płytkę na wydrukowanej siatce i przecinając wzdłuż siatki za pomocą metalowej linijki.
  6. Przechowuj żel nawodniony w wilgotnym pudełku, aż będzie gotowy do użycia.

5. Mikroskopia - Przygotowanie próbki bakterii i ameby do obrazowania

  1. Aby oznaczyć zjadliwość komórek bakteryjnych przyczepionych powierzchniowo, dodaj 10 μl komórek ameba z kroku 2.10 do bakterii przyczepionych powierzchniowo z kroku 3.4.
    UWAGA: Ten krok opisuje mieszanie ameb z bakteriami.
  2. Aby oznaczyć zjadliwość komórek planktonowych, zmieszaj 10 μl komórek ameba z kroku 2.10 z 10 μl bakterii planktonowych z kroku 3.5.
    UWAGA: Nie myj osiowo wyhodowanych komórek ameby (przy OD600 od 0,2 do 0,5) przed zmieszaniem z bakteriami. Nie zaobserwuje się wzrostu E. coli w kulturze ameby ze względu na stosowanie roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
  3. Natychmiast umieść podkładkę agarową o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm calceiny-AM z kroku 4.5 na wierzchu mieszaniny bakterii i ameby na powierzchni szalki Petriego.
    UWAGA: Umieść podkładkę agarową na wierzchu mieszanki, wykonując szybkie, płynne ruchy. Nie opuszczaj wkładki powoli na mieszankę, ponieważ ruch ten ma tendencję do wypychania komórek w kierunku obwodu i od spodu podkładki. Ten krok zapewni, że bakterie i ameby zostaną równomiernie wymieszane, unieruchomione i że oba typy komórek będą ograniczone do tej samej płaszczyzny.
  4. Usuń nadmiar płynu, delikatnie odpipetowując pozostały płyn otaczający wacik agarowy. Pozostaw szalkę Petriego do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przykryć szalką Petriego z pokrywką i inkubować unieruchomioną mieszaninę ameba i bakterii w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 40 minut. Przejść do kroku 6.1.
    UWAGA: Ważne jest, aby inkubować wszystkie próbki przez ten sam czas, ponieważ fluorescencja tła wzrasta z czasem. Zalecany czas inkubacji wynosi 1 godzinę. Inkubacja trwająca dłużej niż 1 godzinę jest mniej powtarzalna, ponieważ komórki amebi mogą zacząć pękać.

6. Mikroskopia - Akwizycja obrazu

  1. Obrazowanie ameb za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zdolnego do pozyskiwania obrazów jasnego pola i zielonej fluorescencji. W przypadku zielonej fluorescencji należy użyć filtrów białka zielonej fluorescencji (GFP) o długości fali 474/27 nm i 525/45 nm odpowiednio do wzbudzenia i emisji. Użyj obiektywu o aperturze 10X (≥0,3 apertury), aby sfotografować ameby.
    UWAGA: Kalceina-AM w agarze spowoduje fluorescencję umierających ameb w zielonym kanale fluorescencyjnym. Poza tym zdrowe ameby nie są fluorescencyjne.
  2. Dostosuj czasy akwizycji dla kontrastu fazowego, kanałów GFP, aby ograniczyć fototoksyczność i zoptymalizować zakres dynamiczny intensywności obrazu. W razie potrzeby zastąp kontrast fazowy kontrastu interferencji różnicowej (DIC).
    UWAGA: Jeśli to możliwe, używaj ekspozycji 100 - 200 ms dla kontrastu fazowego i fluorescencji GFP. Utrzymuj ustawienia ekspozycji i instrumentu bez zmian przez cały czas trwania eksperymentu. Ma to kluczowe znaczenie dla obliczenia indeksu zabijania hosta.
  3. Uzyskaj obrazy dla co najmniej 100 komórek ameby, aby uzyskać dobre statystyki do obliczenia wskaźnika zabijania gospodarza.

7. Analiza obrazu i indeks zabijania gospodarzy

  1. Wykonaj analizę obrazu za pomocą ImageJ.
  2. Otwórz plik obrazu kontrastu fazowego w ImageJ, klikając Plik | Otwórz i wybierz obraz. Dostosuj próg, klikając Obraz | Analiza | Próg. Dostosuj dolny i górny próg, aby wybrać tylko szczyt intensywności (Rysunek 3A).
  3. Przekonwertuj obraz na binarny, klikając przycisk Proces | Binarny | Utwórz plik binarny. Wypełnij otwory, wybierając punkt menu Process | Binarny | Wypełnij otwory.
    UWAGA: Używając obrazu w Rysunek 1 jako źródło, kroki 7.1 - 7.2 stworzą obraz, na którym ameby i bakterie przyczepione do powierzchni pojawiają się jako ciemne obszary (Rysunek 3B).
  4. Upewnij się, że pola Obszar i Średnia wartość szarości są zaznaczone w obszarze Analizuj | Ustaw wymiary. Zmierz przybliżony rozmiar ameby, wybierając narzędzie owalu na głównym pasku narzędzi. Kliknij pozycję Analizuj | Zmierz i zanotuj powierzchnię reprezentatywnych ameb.
  5. Utwórz maski dla ameb, klikając Analizuj | Analizuj cząstki. W polu rozmiaru wprowadź obszar, który będzie zawierał ameby, ale nie będzie zawierał bakterii. Wybierz Maski na pasku menu rozwijanego dla opcji Pokaż. Upewnij się, że pole Dodaj do menedżera jest zaznaczone.
  6. Kliknij OK, a pojawi się obraz przedstawiający tylko ameby i okno dialogowe Menedżera ROI (Rysunek 3C).
  7. Otwórz obraz fluorescencyjny za pomocą punktu menu Plik | Otwórz i wybierz odpowiedni plik. Wybierz wszystkie regiony w Menedżerze ROI, przytrzymując Shift i klikając każdy region na liście (Rysunek 3D).
  8. Kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji. Spowoduje to otwarcie okna wyników wyświetlającego średnią wartość intensywności każdej ameby.
  9. Skopiuj wartości fluorescencji dla każdej ameby do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz wskaźnik zabijania żywiciela, biorąc średnią ze wszystkich wartości fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyhodowaliśmy dziki szczep P. aeruginosa PA1419 lub szczep ΔlasR class20 na tym samym tle PA14 na szalkach Petriego o średnicy 6 cm i przetestowaliśmy zjadliwość komórek planktonowych i przyczepionych powierzchniowo. Kultury inokulowano z pojedynczych kolonii do kultur PS:DB, hodowano przez noc w probówkach hodowlanych w bębnie rolkowym w temperaturze 37 °C do nasycenia, rozcieńczono w stosunku 1:100 do PS:DB, hodowano prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje szybką i ilościową metodę oznaczania zjadliwości P. aeruginosa. Protokół ten może być testowany z innymi bakteriami. Należy jednak pamiętać, że podłoże powinno być zgodne z warunkami wzrostu ameby. W szczególności zoptymalizowaliśmy protokół, wykorzystując PS:DB jako pożywkę do hodowli bakterii. Jeżeli stosowane są inne pożywki, konieczne może być przeprowadzenie kontroli z użyciem samych pożywek wzrostowych, w których nie ma komórek bakteryjnych, w celu sprawdzenia, czy pożywka jest kompaty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KP i AS napisali i poprawili rękopis. KP przeprowadził eksperymenty i analizę. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816) dla AS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Bacto agar, odwodnionyBD Difco214010
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Life Technologies15240062Aliquot < 1 ml i przechowywać w temperaturze -20 ° C
Ester kalceinowo-acetoksymetylowy (calceina-AM)Life TechnologiesC34852Calcein Acetoxymethyl (AM)
Chlorek wapnia, bezwodnySigma-AldrichC1016
D-GlucoseFisher ChemicalD16500Dekstroza
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD5879
Kwas foliowySigma-AldrichF8758
LB-MillerBD Difco244620
Chlorek magnezuSigma-AldrichM8266
Ekstrakt drożdżowyOxoidLP0021
Specjalny peptonOxoidLP0072
Tlenek potasuFisher ChemicalP250
Fosforan potasu jednozasadowy Sigma-AldrichP0662
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnyFisher ChemicalS373
Witamina B12Sigma-AldrichV2876
szczepy
Dictyostelium discoideumSiryaporn labSzczep AX318
Escherichia coliSiryaporn labSzczep B/r17
Pseudomonas aeruginosaSiryaporn labPA14szczep19
Pseudomonas aeruginosa Δ lasRSiryaporn labAFS20.1Szczep pochodzący z PA1420
>Supplies
0,22 µ Filtr M MilliporeSCGPT01REDo sterylizacji filtra Rurka
stożkowa, 15 mlCorning352097
Szklane butelki do przechowywaniaPyrex13951L250 mL, 500 mL, 1000 mL
szalka Petriego, średnica 6 cmCorning351007Płytki styropianowe 60 x 15 mm
szalka Petriego, średnica 10 cmFisherFB0875712Płytki styropianowe 100 x 15 mm
Pojemniki plastikowe z pokrywkąZiploc2.57E+09Kwadratowe pojemniki na 3 filiżanki
Talerze szklaneBio-Rad1653308Do przygotowania wacików agarowych. Możliwe jest zastosowanie innych płyt szklanych o podobnych wymiarach.
Patyczki drewnianeFisher23-400-102 
Sprzęt
Mikroskop Eclipse Ti-E NikonMEA53100Konfiguracja mikroskopu
10X Plan Fluor Ph1 obiektyw  0.3 NANikonMRH20101Konfiguracja mikroskopu
Źródło wzbudzenia fluorescencjiSilnik świetlny LumencorSolaKonfiguracja mikroskopu
Zestaw filtrów fluorescencyjnychSemrockLED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 Konfiguracja mikroskopu
Orca Flash 4.0 V2 KameraHamamatsu77054098Konfiguracja mikroskopu
ImageJNIHv. 1.49Oprogramowanie do analizy obrazu
MATLABMathworksR2013Oprogramowanie do analizy obrazu
Inkubator z wytrząsarką orbitalnąVWR89032-092Do wzrostu bakterii w temperaturze 37 stopni; C
Wytrząsarka platformowaFisher13-687-700Do wzrostu ameb w temperaturze 22 & stopni; C
SpektrofotometrBiochromUltrospec 10
Podblatowy inkubator z chłodzeniemFisher97990EDo wzrostu ameb w temperaturze 22 & stopni; C
Kąpiel wodna Isotemp Fisher15-462-21QDo mediów chłodzących do 55 & deg; Z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
  3. Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
  4. Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
  5. Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
  6. Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
  7. Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
  8. Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
  9. Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
  10. Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
  11. Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58(1990).
  12. Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
  13. Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
  14. Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
  15. Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
  16. Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
  17. Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
  18. Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
  19. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  20. O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki gospodarza z amebfluorescencja kalceiny AManaliza obrazowaPseudomonas aeruginosabakterie przytwierdzone do powierzchnikom rki planktoniczneindeks zabijania gospodarzamikroskopia epifluorescencyjnaunieruchomienie na podk adkach agarowych

Powiązane artykuły