Artykuł metodologiczny

Inwazyjna metoda aktywacji zakrętu zębatego myszy poprzez stymulację o wysokiej częstotliwości

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57857

⸱

2 czerwca 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować niezawodną metodę HFS u myszy. Neurony w zakręcie zębatym hipokampa są stymulowane elektrycznie przez HFS bezpośrednio i pośrednio in vivo. Aktywność neuronalną i sygnalizację molekularną bada się odpowiednio za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1; Neurogenezę określa się ilościowo za pomocą testu znakowania bromodeoksyurydyny.

Streszczenie

Elektryczna stymulacja wysokiej częstotliwości (HFS), wykorzystująca wszczepione elektrody skierowane do różnych obszarów mózgu, okazała się skuteczną metodą leczenia różnych zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych. HFS w głębokiej części mózgu, nazywany również głęboką stymulacją mózgu (DBS), staje się coraz ważniejszy w badaniach klinicznych. Niedawny postęp w dziedzinie chirurgii DBS O WYSOKIEJ CZĘSTOTLIWOŚCI (HF-DBS) zaczął rozprzestrzeniać możliwość wykorzystania tej inwazyjnej techniki na inne sytuacje, takie jak leczenie poważnych zaburzeń depresyjnych (MDD), zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych (OCD) i tak dalej.

Pomimo tych rosnących wskazań, mechanizmy leżące u podstaw korzystnych efektów HF-DBS pozostają enigmatyczne. Aby odpowiedzieć na to pytanie, jednym ze sposobów jest użycie wszczepionych elektrod, które w niewielkim stopniu aktywują rozproszone subpopulacje neuronów przez HFS. Doniesiono, że HFS w przednim jądrze wzgórza może być stosowany w leczeniu padaczki opornej na leczenie w klinice. Mechanizmy leżące u podstaw mogą być związane ze zwiększoną neurogenezą i zmienioną aktywnością neuronalną. Dlatego jesteśmy zainteresowani badaniem zmian fizjologicznych poprzez wykrywanie aktywności neuronalnej, a także neurogenezy w mysim zakręcie zębatym (DG) przed i po leczeniu HFS.

W tym manuskrypcie opisujemy metodologie HFS do ukierunkowania aktywacji DG u myszy, bezpośrednio lub pośrednio oraz w sposób ostry lub przewlekły. Ponadto opisujemy szczegółowy protokół przygotowania wycinków mózgu do barwienia immunofluorescencyjnego c-fos i Notch1 w celu monitorowania aktywności neuronalnej i aktywacji sygnalizacji oraz znakowania bromodeoksyurydyny (BrdU) w celu określenia neurogenezy po indukcji HF-DBS. Aktywacja aktywności neuronalnej i neurogenezy po leczeniu HF-DBS dostarcza bezpośrednich dowodów neurobiologicznych i potencjalnych korzyści terapeutycznych. W szczególności metodologia ta może być modyfikowana i stosowana w celu ukierunkowania na inne zainteresowane obszary mózgu, takie jak zwoje podstawy i regiony podwzgórzowe w przypadku określonych zaburzeń mózgu w klinice.

Wprowadzenie

HF-DBS to neurochirurgiczna technologia stymulacji elektrycznej mózgu, rozwijana od 1870 roku1. Pod koniec lat osiemdziesiątych HFS został po raz pierwszy użyty jako potencjalna interwencja terapeutyczna w chorobie Parkinsona i innych zaburzeniach ruchowych2. W ciągu ostatnich kilku dekad HF-DBS jest coraz szerzej stosowany w leczeniu chorób mózgu, które są obecnie nieuleczalne tradycyjną strategią terapeutyczną. W szczególności, ze względu na poprawę dokładności elektrody HFS, wysoce skuteczne wyniki i minimalne skutki uboczne, liczba zaburzeń mózgu leczonych za pomocą HF-DBS znacznie wzrosła w ciągu ostatnich dziesięcioleci3,4,5. Na przykład HF-DBS został zatwierdzony przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia choroby Parkinsona (PD), otępienia typu Alzheimera, drżenia samoistnego i innych rodzajów zaburzeń ruchowych2,6,7. U pacjentów z chorobą Parkinsona lek dopaminergiczny jest zmniejszony do 50% podczas HF-DBS8. Oprócz skutecznego leczenia zaburzeń ruchowych, HF-DBS wykazał również swoje potężne działanie w leczeniu chorób psychicznych w klinice, a także w zakresie wspomagania funkcji poznawczych2,9,10,11. Należy zauważyć, że badania nad HFS w leczeniu innych zaburzeń psychicznych są na różnych etapach, oferując pacjentom wiele nadziei12.

Chociaż wiele badań wykazało, że ogniskowy HFS ma zarówno miejscowe, jak i odległe efekty w całym mózgu13, neurologiczne i molekularne mechanizmy tych efektów pozostają nieuchwytne2,14. W klinice terapeutyczny HF-DBS jest zwykle stosowany w sposób długotrwały w leczeniu choroby Parkinsona i przewlekłego bólu itp. Pojawia się wiele opinii wyjaśniających poprawę wynikającą z leczenia HF-DBS, wśród których jedną jest możliwość, że prąd HFS moduluje aktywność sieci neuronalnej, prawdopodobnie przez powtarzającą się depolaryzację aksonów w pobliżu wszczepionej elektrody HFS. Lub HF-DBS może zmienić szybkość rozładowania neuronów wyjściowych i projektowanych celów. Ponadto HF-DBS może prowadzić do długotrwałych zmian synaptycznych, w tym długotrwałego nasilenia (LTP) i długotrwałej depresji (LTD), co może przyczynić się do poprawy objawowej. Jak dotąd nadal nie jest jasne, czy HFS wpływa na kluczowe zdarzenia molekularne, które regulują procesy komórkowe, takie jak neurogeneza dorosłych in vivo. Kilka linii badań wykazało, że HFS u gryzoni może naśladować podobne reakcje neuronalne klinicznie stosowanych DBS15,16. Aby zrozumieć mechanizmy komórkowe leżące u podstaw HF-DBS, w tym badaniu najpierw opracowaliśmy metodologię HFS in vivo u myszy w sposób ostry (jeden dzień) lub przewlekły (pięć dni). Po drugie, opracowaliśmy metodologię analizy aktywacji, aby określić zmianę aktywności neuronalnej i neurogenezy po dostarczeniu HF-DBS.

Biorąc pod uwagę, że produkcja neuronalna z nerwowych komórek macierzystych jest obfita podczas rozwoju embrionalnego, ale trwa przez całe dorosłe życie, strefa subziarnista hipokampa jest jednym z głównych obszarów, gdzie zachodzi neurogeneza. Na proces neurogenezy wpływa wiele czynników fizjologicznych i patologicznych. W niektórych przypadkach padaczkowych neurogeneza hipokampa jest znacznie zmniejszona17,18. Ponadto pojedyncza terapia elektrowstrząsowa może znacznie zwiększyć produkcję neuronów w zakręcie zębatym19. Obserwacje te sugerują, że aktywność elektrofizjologiczna odgrywa kluczową rolę w regulacji neurogenezy dorosłych i plastyczności synaptycznej w neuronach hipokampa. Dlatego, aby jeszcze bardziej zademonstrować wpływ HF-DBS na aktywność neuronalną i neurogenezę, najpierw przeprowadzamy test barwienia immunologicznego natychmiastowego wczesnego genu (IEG) c-fos, który jest dobrze znanym markerem krótkotrwałej aktywności neuronalnej wynikającej z doświadczenia20. Sygnalizacja Notch1 jest również wykrywana w celu monitorowania aktywacji sygnalizacji po dostarczeniu HFS21,22. Co więcej, wykrywamy również produkcję neuronalną za pomocą analizy znakowania BrdU po indukcji HF-DBS na różne sposoby, chociaż barwienie BrdU może być również markerem glehaju.

W obecnym badaniu, dwie metodologie HFS są dostosowane do bezpośredniego i pośredniego celu aktywacji DG hipokampa. Elektroda jest wszczepiana bezpośrednio do DG lub wszczepiana do przyśrodkowej ścieżki perforacji (PP), która wysyła projekcje w celu aktywacji neuronów DG. Do indukcji HF-DBS prezentowany jest programowalny stymulator do ciągłej stymulacji za pomocą elektrody stałej na głowie myszy. Aby określić wpływ HFS na aktywację neuronów i neurogenezę, wykrywamy ekspresję c-fos i Notch1 za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz liczbę dodatnich neuronów włączonych do BrdU w regionie hipokampa DG, odpowiednio, po leczeniu HFS. W szczególności porównano wpływ HF-DBS na neurogenezę w DG między ostrą i przewlekłą stymulacją lub odpowiednio między bezpośrednim i pośrednim sposobem stymulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne na zwierzętach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi Instytutu Podstawowych Nauk Medycznych w Pekinie (Pekin, Chiny) oraz przepisami chińskiego rządu dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Myszy (dorosły samiec, 26 ~ 30 g) były trzymane w stałej temperaturze 23 °C, z wodą i jedzeniem ad libitum, w 12-godzinnym cyklu światła/12-godzinnym cyklu ciemności (światła włączone o 7:00 rano). Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono podczas cyklu świetlnego.

1. Przygotowanie chirurgiczne

UWAGA: Niestandardowa elektroda została wykonana metodą zmodyfikowaną z raportu Halperna23.

  1. Użyj 2 mikrodrutów miedzianych (o średnicy zewnętrznej 200 μm) jako równoległej elektrody bipolarnej. Owiń elektrody wokół siebie, tworząc cylindryczne elektrody do stymulacji.
    UWAGA: W tym przypadku długość elektrody w PP lub DG była zróżnicowana w zależności od głębokości anatomicznej jądra.
  2. Wysterylizuj elektrody za pomocą szafki do dezynfekcji tlenkiem etylenu. Przenoś i przechowuj domowe 2-kanałowe elektrody mikrodrutowe bez żadnych zanieczyszczeń. Elektrody powinny być ściśle wysterylizowane przed jakąkolwiek implantacją chirurgiczną.
  3. Autoklaw narzędzi chirurgicznych.
  4. Przed zabiegiem należy wstrzyknąć myszu pentobarbital (20 - 50 mg/kg) dootrzewnowo, aby uzyskać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.
  5. Wstrzyknij myszy sterylną zawiesinę prokainy penicyliny G (75 000 j.m.) i środek przeciwbólowy (karprofen, 0,05 - 1 mg/kg, SC), aby zmniejszyć ryzyko infekcji i bólu, odpowiednio24.
  6. Po znieczuleniu zwierzęcym nałóż smar do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Upewnij się, że indukcja sedacji i głębokość znieczulenia są spowodowane odruchami zwierzęcia w odpowiedzi na szczypanie palca u nogi i kontynuuj operację tylko wtedy, gdy nie wystąpi żadna reakcja.
    UWAGA: Maść weterynaryjna to kolejna opcja zapobiegania suchości oczu.
  7. Ogol większość futra na czubku głowy myszy za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów lub żyletki, wysterylizuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami z 70% roztworem alkoholu i betadyny i kontynuuj operację po wyschnięciu betadyny na skórze.

2. Chirurgia stymulacji wysokiej częstotliwości25,26

UWAGA: Na tym etapie, elektroda jest jednostronnie wszczepiana do grzbietowego obszaru DG lub przyśrodkowego PP, części hipokampa odgrywającej kluczową rolę w epizodycznym uczeniu się i pamięci.

  1. Umieść znieczuloną mysz na ramce stereotaktycznej. Aby utrzymać głowę myszy w bezruchu, odpowiednio wyrównaj nauszniki i szybko je zainstaluj. Delikatnie dokręć nauszniki tak, aby podtrzymywały wyśrodkowaną głowę i lekko zabezpieczyły mysz.
  2. Użyj podkładki termostatycznej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 ± 0,5 °C.
  3. Użyj kleszczy, aby chwycić skórę przed uszami myszy i przeciąć ją wysterylizowanymi nożyczkami, aby usunąć około 1cm2 obszaru skóry na czubku czaszki myszy.
    UWAGA: Wzdłuż krawędzi przeciętej skóry można zaobserwować niewielkie krwawienie.
  4. Usuń mięsień i inne przyczepy leżące nad czaszką za pomocą bawełnianego wacika, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Użyj bawełnianego wacika i dłuta preparacyjnego, aby całkowicie oczyścić całą okostną, ścięgna i tkankę łączną z powierzchni czaszki, aby zidentyfikować linie szwów strzałkowych i lambda.
  5. Zidentyfikuj punkt bregma i lambda. Przecięcie szwu koronalnego i szwu strzałkowego w górnej środkowej części kalwarii to miejsce, w którym znajduje się bregma. Przecięcie szwu lambdoidalnego przez szew strzałkowy to miejsce, w którym widoczna jest lambda. Użyj bregmy jako oryginalnego punktu, aby ustawić pozycję drugiego jądra.
  6. Po zidentyfikowaniu pozycji bregmy i lambdy na czaszce, wyreguluj te dwa punkty na poziomie poziomym. Upewnij się, że wysokość tych dwóch punktów jest prawie taka sama w kierunku grzbietowo-brzusznym (wszelkie błędy powinny wynosić < 0,05 mm). Upewnij się również, że czaszka jest wypoziomowana w kierunku przyśrodkowo-bocznym w ten sam sposób26.
  7. W przypadku operacji jednostronnej zamontuj domową 2-kanałową miedzianą elektrodę mikrodrutową w obrotowym uchwycie elektrody na stereotaktycznej ramie operacyjnej.
  8. Najpierw umieść elektrodę pionowo nad punktem bregma i ustaw ją jako oryginalne miejsce. Użyj stereotaktycznej ramy operacyjnej z wyświetlaczem cyfrowym, aby wskazać pozycję przednio-tylną (AP), przyśrodkowo-boczną (ML) i grzbietowo-brzuszną (DV).
    UWAGA: Aby zapobiec wygięciu elektrody, nie dotykaj końcówki elektrody czaszki podczas operacji.
  9. Delikatnie przesuń elektrodę do właściwej pozycji (Rysunek 1A, AP-2.1/ML ± 1.0 dla DG i AP-3.8/ML ± 3.0 dla PP), odpowiednio)27 nad czaszką bez dotykania. Po zidentyfikowaniu żądanego miejsca wprowadzenia elektrody, użyj grzbietowo-brzusznej regulacji stereotaktycznej, aby podnieść uchwyt elektrod i zaznacz pozycję czarnym markerem.
    UWAGA: Dokładna lokalizacja w odniesieniu do współrzędnych stereotaktycznych może się różnić w zależności od wysiłku, wagi i płci myszy. Dorosłe myszy tej samej płci powinny być używane, aby zminimalizować wszelkie różnice w lokalizacji. Jeśli to możliwe, należy wykorzystać przedoperacyjne skany anatomiczne w celu zidentyfikowania lokalizacji na podstawie indywidualnego obiektu27.
  10. Użyj ręcznej wiertarki wspomaganej mikromanipulatorem (rozmiar zadziorów = 0,5 mm), aby precyzyjnie wykonać otwory na zadziory w zaznaczonym miejscu. Przed wierceniem wysterylizuj końcówkę zadziorów 70% etanolem. Przesuń mini wiertło w górę przez czaszkę wzdłuż osi Z 0,8 - 1,0 mm bez zmiany jego położenia X-Y. Użyj sterylnej bawełny, aby zatamować krwawienie podczas operacji.
    UWAGA: Aby uniknąć nadmiernego wiercenia i nadmiernego wytwarzania ciepła podczas wiercenia, upewnij się, że prędkość wiercenia wynosi 15 000 - 18 000 obrotów na minutę (RPM) i często wyjmuj wiertło z otworu w zadziorach co 8 - 10 s.
  11. Kontynuuj wiercenie, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Użyj wygiętej igły, aby usunąć wszelkie skrawki kości, które powstają podczas wiercenia i wykonaj otwór w oponie twardej, nie uszkadzając leżącej pod spodem miękkiej tkanki mózgowej.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej, wygiętą igłę można również zastąpić cienkimi kleszczami.
  12. Aby potwierdzić, że otwory na zadziory zostały prawidłowo wykonane w żądanej pozycji, zmniejsz wysokość elektrody poprzez regulację ramy chirurgicznej stereotaktycznej i upewnij się, że elektroda może być płynnie wprowadzana przez otwór zadziorów bez dotykania jakichkolwiek przeszkód. Jeśli tak, powoli wprowadzić elektrody na głębokość 1,8 mm w przypadku DG (lub 3,0 mm w przypadku PP) od powierzchni czaszki znajdującej się w przyśrodkowej PP do DG (PP-DG).
    UWAGA: Podczas procesu implantacji elektrody należy zetrzeć płyn mózgowo-rdzeniowy lub wypływy krwi z otworów w zadziorach sterylną bawełną.
  13. Po włożeniu elektrody mikrodrutowej do otworu czaszki, przytrzymaj ją na miejscu za pomocą odpowiedniego cementu dentystycznego za pomocą małej szpatułki. Gdy cement zgęstnieje, uformuj go wokół włożonej elektrody i, aby utworzyć ładną, gładką nasadkę. Oczyścić i zdezynfekować brzegi rany.
  14. Odłącz elektrodę od uchwytu elektrody. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w ciepłej klatce.
    UWAGA: Po operacji należy poczekać z powrotem zwierząt do klatek, aż w pełni wyzdrowieją ze znieczulenia z wystarczającą świadomością.
  15. Pozwól myszy poruszać się swobodnie i pozwól jej dojść do siebie przez 2 dni w klatce. Następnie podłącz elektrodę wszczepioną w mózg myszy do programowalnego stymulatora za pomocą przewodów. Skonfiguruj interfejs oprogramowania zgodnie z opisem w Rysunek 2. Ustaw parametry HFS jako 6 serii po 6 ciągów po 6 impulsów przy 400 Hz (Rysunek 1B, 100 ms między ciągami, 20 s między seriami)28. Ustaw intensywność stymulacji na 200 μA.
  16. Dostarczaj HFS przez żądany okres czasu zgodnie z ustawieniami. Dostarczaj stymulację 2x dziennie o 8:00 i o 20:00
    17. .
  17. W przypadku grupy kontrolnej wszczepia się elektrody myszom i nie wykonuje stymulacji.
  18. W przypadku barwienia c-fos należy ostro stymulować myszy eksperymentalne (2 razy dziennie). W celu znakowania BrdU podziel myszy eksperymentalne na grupę ostrej stymulacji (stosowaną 2 razy dziennie) i grupę przewlekłej stymulacji (stosowaną 10 razy w ciągu 5 dni, 2 razy dziennie). W trakcie stymulacji upewnij się, że mysz nie śpi. Pamiętaj, aby upewnić się, że przewody nie są skręcone.
    UWAGA: W ostatnim dniu zabiegu myszy w grupie ostrej stymulacji były stymulowane jednocześnie.
  19. Po zakończeniu stymulacji ostrożnie odłącz sworzeń elektrody od uchwytu elektrody i złącza systemu nagrywającego.

3. Barwienie immunofluorescencyjne i znakowanie bromodeoksyurydyny29

  1. W przypadku barwienia c-fos i Notch1, około 3 godziny po ostatniej stymulacji HF-DBS, znieczulij myszy, wstrzykując pentobarbital (20 - 50 mg / kg, IP) w celu uzyskania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia.
  2. W przypadku znakowania BrdU, około 12 godzin po ostatniej stymulacji HF-DBS, należy podać 6 wstrzyknięć BrdU kontrolnej i stymulowanym myszom w odstępach 2-godzinnych (50 mg / kg w 0,9% soli fizjologicznej, IP). 36 godzin po ostatnim wstrzyknięciu znieczulić myszy, wstrzykując pentobarbital (20 - 50 mg / kg, IP) w celu uzyskania płaszczyzny operacyjnej.
  3. Wykonaj nacięcia za pomocą skalpela przez klatkę piersiową, aby odsłonić serce, a następnie przełóż igłę perfuzyjną o rozmiarze 22 do lewej komory. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Perfuzja przezsercowa z 50 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 50 ml zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS (pH 7,4).
    UWAGA: Przełącz PBS na PFA, gdy krew myszy in vivo zostanie wymieniona, a płyn będzie czysty. Dobrą perfuzję można ocenić na podstawie oczyszczenia wątroby. Perfuzję należy przerwać po zaobserwowaniu drżeń fiksacji30.
  4. Odetnij głowę myszy nożyczkami okulistycznymi, wykonaj nacięcie na skórze i odsłoń czaszkę. Za pomocą kleszczy lekko odetnij czaszkę i ostrożnie wypreparuj cały mózg myszy. Po utrwaleniu mózgu w 4% paraformaldehydzie przez dodatkowe 2 dni i przeniesieniu go do 30% roztworu sacharozy w temperaturze 4 °C na noc.
  5. Za pomocą kriostatu pokrój mózgi na 20-μm odcinki koronalne. Przenieś i zamontuj sekcje na szkiełku za pomocą szczotki i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zwierzęta z nieprawidłowym przemieszczeniem elektrod lub nadmiernymi uszkodzeniami mechanicznymi zostaną wykluczone z dalszej analizy.
  6. Przenieść szkiełka do normalnego PBS (0,1 M, pH 7,4) niezawierającego utrwalacza. Umyj plastry PBS przez 3 - 4x przez 5 minut każdy, aby usunąć nadmiar utrwalacza. W przypadku grupy znakowanej BrdU inkubować skrawki w 2-N HCl przez 30 minut w temperaturze 37 °C i przepłukać je w 0,1-M buforze boranowym (pH 8,4; 10 min). Następnie myj plastry 2x przez 5 min w PBS.
    UWAGA: Następnie przeprowadza się barwienie immunologiczne.
  7. Plastry traktować przez inkubację w roztworze blokującym (1 % normalna surowica kozia, 3 % albuminy surowicy bydlęcej , 0,5 % Triton X-100 i 0,02 % azydek sodu w 1 x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Inkubować plastry z przeciwciałem poliklonalnym anty-c-fos (1:500; królik), przeciwciałem anty-Notch1 (1:50; koza) lub przeciwciałem anty-BrdU (1:800; szczur) w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
  9. Umyj plastry 3x w PBS, a następnie inkubuj je z anty-króliczym przeciwciałem anty-króliczym Alexa Fluor 568 sprzężonym (1:500), Alexa Fluor 488 sprzężonym z kozim, (1:1,000) lub Alexa Fluor 488-sprzężonym z przeciwciałem anty-szczurzym (1:500) przez 1 godzinę w RT.
  10. Próbki przemyć 3x w PBS (za każdym razem 10 min). Przykryj wycinki mózgu znakowane immunologicznie za pomocą odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI. Pozostaw plastry do wyschnięcia na powietrzu i przechowuj je w temperaturze 4 °C przed światłem.
  11. Uzyskuj obrazy obszarów hipokampa ze stymulowanej i niestymulowanej strony mózgu za pomocą wielokanałowego (sekwencyjnego) skaningowego mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości. Ustaw parametry obrazowania spójnie między grupą kontrolną i eksperymentalną.
  12. Wykonaj obrazowanie mozaikowe przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu (obiektyw powietrzny 20X, NA 0,45), aby uzyskać ciągłe obrazy 3D (XYZ) sąsiednich pól widzenia za pomocą zmotoryzowanego stolika i użyj odpowiedniego oprogramowania do zszycia ich ze sobą w celu uzyskania dużych obrazów kompozytowych.
    UWAGA: Funkcje kafelkowania obejmują opcje prawdziwego łączenia i wygładzania, co zapewnia lepsze płynne obrazy. Obrazy kompozytowe można szybko i łatwo przygotować za pomocą funkcji łączenia, aby utworzyć obraz na dużym obszarze.
  13. W przypadku barwienia c-fos i Notch1 należy przeprowadzić dodatnią analizę ilościową jąder gęstości immunofluorescencyjnej21 zszytych obrazów. Losowo wybierz 3 obszary w podregionach DG rostralnego, grzbietowego i brzusznego hipokampa i zmierz gęstość immunofluorescencyjną w sposób podwójnie ślepej próby za pomocą oprogramowania Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. W przypadku etykietowania BrdU przeanalizuj warstwy wokół punktu wiercenia przez grzbietowy hipokamp (-1,7 mm do -2,7 mm w stosunku do bregmy) w sposób podwójnie ślepej.
  15. Policz tylko neurony BrdU-dodatnie w DG. Do zliczania należy włączyć komórki leżące w obrębie 2 średnic komórek ziarnistości.
    UWAGA: W tym przypadku liczenie odbywało się za pomocą obiektywu pneumatycznego 40X. Losowo policzono od 3 do 5 sekcji na zwierzę, a liczby zostały uśrednione i wyrażone jako średnie na DG19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po stymulacji HF-DBS bezpośrednio w obrębie podregionu DG hipokampa lub w podregionie PP w celu pośredniej aktywacji DG poprzez po wprowadzeniu elektrod przy użyciu nastaw stereotaktycznych, gryzonie zanieczulono pentobarbitalem i pobrano próbki 3 h po ostatniej stymulacji HF-DBS w celu c-fos oraz immunobarwienie Notch1. W przypadku barwienia BrdU, 36 h po ostatnim wstrzyknięciu BrdU po 1 lub 5 dniach stymulacji HF-DBS, gryzonie zanieczulono pentobarbitalem w celu przygo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika HF-DBS jest szeroko stosowana jako potężne narzędzie w leczeniu wielu zaburzeń neurologicznych od lat 90. Jak dotąd, przełomowa praca HF-DBS dotyczy leczenia choroby Parkinsona i drżenia samoistnego, co przyciągnęło dużą uwagę i zainteresowanie zarówno w środowisku klinicznym, jak i naukowym. Wiele grup prowadzi różnego rodzaju badania nad HF-DBS nad zastosowaniem terapeutycznym HF-DBS w niektórych zaburzeniach neurologicznych i psychiatrycznych32,33. Ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin Granty 31522029, 31770929 i 31371149 (dla Haitao Wu), Program 973 (2014CB542203) z Państwowego Programu Kluczowego Rozwoju Badań Podstawowych Chin (dla Haitao Wu) oraz Grant Z161100000216154 od Miejskiej Komisji Nauki i Technologii w Pekinie (dla Haitao Wu). Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratorium Haitao Wu za zachętę i dyskusje. Autorzy są niezmiernie wdzięczni Zhenwei Liu za jego pomoc w debugowaniu aparatury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stereotaktyczny instrument do stereotaktycznego mózguStoelting51730DStereotaktyczne wszczepienie wewnątrzczaszkowe dla myszy
StymulatorSystemy AMModel 3800MultiStim 8-kanałowy programowalny stymulator
Wiertarka dentystycznaSaeshin Precision Co., LtdSTRONG 90Do wiercenia i krainiotomii 
FrezMeisingerHM1 005#Do wiercenia i krainiotomii 
Digidata 1550 DigitizerUrządzenia molekularneAXON 1550Akwizycja danych w wysokiej rozdzielczości
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSECięcie zamrożonych odcinków próbek
Mikroskop konfokalnyOlympusFV-1200Japonia, z obiektywem 20x (NA 0,45)
Narzędzia do chirurgii myszyNożyczki, kleszcze, obcinacz do kości, uchwyty itp.
Pentobarbital soduR& Systemy D457920-50mg/kg do iniekcji dożylnych
Penicylina G Sigma-AldrichP303275 000 U do iniekcji domięśniowej
KarprofenSigma-AldrichSML17135-10 mg / kg, do wstrzyknięcia s.c.
4% paraformaldehydu (PFA)Beijing Solarbio Sci-Tech Co. P1110roztwór do pończoch do utrwalania tkanek
Bufor fosforanowy (PBS)Invitrogen10010023pH7,4, 500 ml w pończochach
Związek Tissue-Tek OCTSakura4583Preparat rozpuszczalnych w wodzie glikoli i żywic
Przeciwciało anty-BrdUAbcamab6326Rozcieńczenia: 1/800
Przeciwciało anty-c-fosAbcamab209794Rozcieńczenia: 1/500
Kozia IgG Anty-Królicza (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036Rozcieńczenia: 1/500
IgG przeciw szczurom osła (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150Rozcieńczenia: 1/500
Podłoże mocujące zapobiegające blaknięciu z DAPIVector LaboratoriesH-1200Barwienie przeciwdziałające przeciwciałem DAPI
anty-Notch1 (C-20)Santa Cruz Biotechsc-6014Rozcieńczenia: 1/50
IgG przeciw kozom osła (Alexa Fluor 488)Abcamab150073Rozcieńczenia: 1/1000
FST.14084-08,11254-20,16109-14

Bibliografia

  1. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  2. Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
  3. Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214(2014).
  4. Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
  5. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
  6. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
  7. Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
  8. Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
  9. Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
  10. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
  11. Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
  12. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
  13. McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
  14. Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
  15. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
  16. Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457(2015).
  17. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
  18. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
  19. Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
  20. Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35(2010).
  21. Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
  22. Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
  23. Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
  24. Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266(2016).
  25. Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066(2015).
  26. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  27. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6(2007).
  28. McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
  29. Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  31. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220(2014).
  32. Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2(2012).
  33. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
  34. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
  35. Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
  36. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
  37. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37(2014).
  38. Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
  39. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

G boka stymulacja m zguaktywno neuronalnadetekcja neurogenezyprzygotowanie skrawk w m zgubarwienie immunofluorescencyjneznakowanie BrdUchirurgia stereotaktycznaanaliza c fos Notch1

Powiązane artykuły