Method Article
Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.
Grupa robocza zainicjowana w ramach Francuskiego Towarzystwa Cytometrii (AFC) została opracowana w celu harmonizacji zastosowania wieloparametrowej cytometrii przepływowej (MFC) w diagnostyce chorób szpikowych we Francji. Przedstawiony tu protokół został uzgodniony i był stosowany w okresie od września 2013 r. do listopada 2015 r. w sześciu francuskich laboratoriach diagnostycznych (Szpitale Uniwersyteckie w Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nicei i Lille oraz Institut Paoli-Calmettes w Marsylii) i pozwolił na standaryzację przygotowania próbek szpiku kostnego i pozyskiwania danych. Opracowano trzy bazy danych dojrzewania dla linii neutrofilowych, monocytowych i erytroidalnych ze szpikiem kostnym od "zdrowych" dawców (osób bez objawów choroby układu krwiotwórczego). Solidna metoda analizy dla każdej linii szpikowej powinna być stosowana do rutynowego stosowania diagnostycznego. Nowe przypadki mogą być analizowane w ten sam sposób i porównywane ze zwykłymi bazami danych. W ten sposób można zidentyfikować ilościowe i jakościowe nieprawidłowości fenotypowe, a te powyżej 2SD w porównaniu z danymi z prawidłowych próbek szpiku kostnego należy uznać za wskazujące na patologię. Głównym ograniczeniem jest większa zmienność pomiędzy danymi uzyskanymi za pomocą przeciwciał monoklonalnych uzyskanych metodami opartymi na technologiach hybrydoma i obecnie stosowanych w diagnostyce klinicznej. Ustawienie kryteriów technicznej walidacji uzyskanych danych może pomóc w poprawie użyteczności MFC na potrzeby diagnostyki MDS. Ustalenie tych kryteriów wymaga analizy w oparciu o bazę danych. Istotną zaletą tej metody jest zmniejszenie subiektywizmu badaczy w analizie danych.
Wobec braku markerów fenotypowych specyficznych dla zmian dysplastycznych występujących w komórkach szpikowych podczas inicjacji i progresji MDS, w ostatnich latach zaproponowano nowe podejście oparte na ocenie szlaków dojrzewania (zmieniona ekspresja antygenów szpikowych podczas produkcji dojrzałych komórek szpikowych) lub nieprawidłowego rozmieszczenia różnych typów komórek w przedziałach komórek szpiku kostnego (BM)1,2.
Ten artykuł przedstawia nową metodę standaryzacji stosowania MFC w celu wykrywania zmian dysplastycznych w przedziałach komórek szpikowych BM związanych z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub innymi chorobami hematologicznymi szpiku. Badanie to pokazuje również użyteczność wykorzystania baz danych dojrzewania do analizy danych MFC.
Standaryzacja procedury przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy za pomocą baz danych pozwoliłaby na identyfikację najistotniejszych nieprawidłowości fenotypowych związanych ze zmianami dysplastycznymi w komórkach szpikowych BM. W związku z tym statystycznie wybrane podzbiory oparte na dobrze oznaczonych i dobrze rozpoznanych formatach (diagramy automatycznego separatora populacji (APS), histogramy i wykresy punktowe) są niezbędne do opracowania strategii analizy, którą można wykorzystać w kolejnych rundach analizy. Odkrycie silnych nieprawidłowości fenotypowych w MDS ułatwiłoby diagnozę w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i bez nieprawidłowości cytogenetycznych. Identyfikacja parametrów dyskryminacyjnych pozwalających na zmniejszenie paneli immunofenotypowych może uprościć obecne wyniki2, umożliwiając ich zastosowanie w klinicznych laboratoriach patologicznych.
Ta metoda ogranicza subiektywne interpretacje danych cytometrycznych, jak to zostało zasygnalizowane w diagnozie MDS3. Ten krok jest warunkiem wstępnym do opracowania zautomatyzowanych narzędzi do przetwarzania i analizowania danych przepływu4.
MDS to heterogeniczna grupa zaburzeń klonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), w których mutacje spliceosomów współpracują ze specyficznymi modyfikatorami epigenetycznymi, aby uzyskać fenotyp MDS. Obecnie wiadomo, że wraz z mutacjami HSC w patofizjologii MDS zaangażowane są inne mechanizmy, takie jak nieprawidłowy stan zapalny o podłożu immunologicznym i interakcje między złośliwymi HSC a mikrośrodowiskiem zrębu BM. Mechanizmy te pozostają jednak słabo poznane. Duża heterogeniczność kliniczna i biologiczna MDS sprawia, że diagnoza i dobór optymalnej terapii jest wyzwaniem. W ciągu ostatniej dekady liczne badania wykazały, że MFC jest często bardziej czuły w wykrywaniu dysplazji2 niż morfologii, ale ograniczenia techniczne i ekonomiczne sprawiają, że technika ta jest trudna do standaryzacji, a wyniki często zależą od doświadczenia tłumacza3. Ponadto nie jest jasne, w jaki sposób MFC może przechylić szalę w kierunku MDS w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i przy braku anomalii cytogenetycznych, lub w przypadkach granicznych, takich jak hipokomórkowy MDS, z niską liczbą blastów, z innych nieklonalnych zaburzeń BM, takich jak niewydolność szpiku kostnego (tj. niedokrwistość aplastyczna). Trudno jest również odróżnić graniczne przypadki MDS z nadmiarem blastów z ostrej białaczki szpikowej (AML). Z tych wszystkich powodów wytyczne kliniczne nie uwzględniają badania MFC w ostatecznej diagnozie MDS. W 2011 roku amerykańska National Comprehensive Cancer Network (NCCN) zaleciła MFC do oszacowania odsetka komórek CD34 +, wykrywania napadowych nocnych klonów hemoglobinurii oraz obecności cytotoksycznych klonów komórek T w hipokomórkowym MDS5. Te dwie ostatnie sytuacje również wiążą się z celem terapeutycznym, ponieważ dane kliniczne wykazały dobrą odpowiedź tych pacjentów na terapię immunosupresyjną6. Wytyczne NCCN z 2017 r., powołując się na zalecenia Międzynarodowej Grupy Roboczej (IWG), wymieniły nieprawidłowe wykrywanie immunofenotypowania przez MFC wśród współkryteriów diagnozy MDS, ale bez żadnych specyfikacji6. Ponadto niedawno opublikowana klasyfikacja WHO stanowi, że same wyniki MFC nie są wystarczające do ustalenia pierwotnego rozpoznania MDS w przypadku braku rozstrzygających danych morfologicznych i/lub cytogenetycznych7. Jednak MFC może być stosowany jako dodatkowy test pokazujący rozregulowanie wzorców dojrzewania komórek szpikowych i określający ilościowo "odległość od normy" dla pacjenta w określonym momencie przebiegu choroby.
Ta metoda ma zastosowanie w laboratoriach klinicznych zainteresowanych oceną dysplazji w komórkach szpikowych BM za pomocą immunofenotypowania MFC, w celu doprecyzowania diagnozy w MDS lub innych zaburzeniach szpikowych z nieprawidłowościami dysplastycznymi.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Protokół wymieniony poniżej został zatwierdzony przez "Comité de Protection des Personnes" (Niezależny Komitet Etyczny) Sud-Est 1 ze Szpitala Uniwersyteckiego Saint-Etienne, Francja.
1. Ustawienia cytometru
UWAGA: Ustawienia cytometru zostały wykonane zgodnie z zaleceniami France Flow, zgodnie z procedurą EuroFlow "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) for Instrument Setup and Compensation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
2. Przygotowanie próbki BM
UWAGA: Wykonaj protokół płukania komórek tuż przed procedurą barwienia.
3. Akwizycja danych
4. Analiza danych
UWAGA: Do skonstruowania normalnych baz danych BM użyto plików od zdrowych dawców i od osób bez żadnych dowodów na chorobę krwiotwórczą w następujący sposób: 11 z 18 plików dla bazy danych Neutrophils_NM, 10 z 18 plików dla Monocytes_NM bazy danych i 14 z 18 plików dla NRC_NM bazy danych. Odrzucone pliki wykazywały różne problemy techniczne, jak przedstawiono w sekcji Reprezentatywne wyniki. Pliki zostały indywidualnie przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Infinicyt (Tabela Materiałów), zgodnie z różnymi strategiami przedstawionymi na Rysunek 1A(1-3) dla linii neutrofili (Profil Neutrophils_Maturation.inp), Rysunek 2A dla linii monocytów (Profil Monocytes_Maturation.inp) i Rysunek 3A(1-2) dla linii komórek erytroidalnych (profil NRC_Maturation.inp).
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
54 próbki BM pobrane w antykoagulancie K-EDTA zostały włączone do badania. Dane MFC analizowano przy braku jakichkolwiek informacji o pacjentach. Badanie retrospektywne wykazało, że próbki BM pochodziły od 7 zdrowych dawców (5 mężczyzn i 2 kobiety o medianie wieku 47,4 [35-48], 11 osób bez objawów choroby układu krwiotwórczego (8 mężczyzn i 3 kobiety o medianie wieku 57,9 [35-72]) oraz 36 przypadków z różnymi stanami patologicznymi: 1 przypadek z niedokrwistością i niskim poziomem kreatyn...
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Jakość aspiratu BM może mieć wpływ na końcowe wyniki. Hemodylucja aspiratu BM może zniekształcić rozmieszczenie komórek na różnych etapach dojrzewania z powodu braku komórek progenitorowych lub prekursorowych. Prawdopodobnie zastosowanie metody lizy masowej może pomóc w normalizacji aspiratów BM do hemodylucji w analizach cytometrii przepływowej. Ponadto krytycznymi etapami oceny dysplazji szpikowej BM za pomocą cytometrii przepływowej są przetwarzanie i barwienie próbki, gromadzenie danych i interpretacja
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Zakład Cytometrii Przepływowej, Laboratorium Hematologii Szpitala Uniwersyteckiego w Saint-Etienne jest członkiem Konsorcjum EuroFlow.
Przeciwciała użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez BD Biosciences. Autorzy chcieliby podziękować swojej koleżance, dr Pascale Flandrin-Gresta z Wydziału Biologii Molekularnej, laboratorium hematologicznego Szpitala Uniwersyteckiego Saint-Etienne we Francji, która dostarczyła wiedzę specjalistyczną w celu interpretacji danych NGS dla drugiego przypadku MDS. Autorzy są wdzięczni hematologom klinicystom za zainteresowanie i zaangażowanie w to badanie, a także pacjentom i zdrowym dawcom za zgodę na udział w tym badaniu. Autorzy pragną również podziękować Fundacji "Les Amis de Rémi" za wsparcie finansowe publikacji.
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Cytometr przepływowy BD FACSCanto II | BD Biosciences, CA, USA | SN: | 3-laserowy V33896301336, konfiguracja 4-2-2, Szczegóły filtrów i luster: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Wirówka Awel C48-R | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model nr: 320002001 | wirówki wolnoobrotowe; pojemność 60 probówek FACS |
| Pipety 10 i mikro; L oraz 200&mikro; L | |||
| Pipety Pasteura | |||
| 15 ml probówki Falcon rurka | |||
| polipropylenowa do myszy FACS | |||
| Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | klon L243 Mysz BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mysz Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 klon myszy HI30 IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) | |
| Mysz Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | klon CLB/fcGran1 Mysz BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mysz Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | klon L138 Mysz BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mysz Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | klon 8G12 Mysz BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mysz Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | klon 104D2 Mysz BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mysz anty-ludzka CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | klon myszy D12 BALB/c IgG2a, κ D12, fluorochrom APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mysz anty-ludzka CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | klon HI10A Mysz BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mysz Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | klon E11 Mysz IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mysz Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | klon 10.1 Mysz BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mysz Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | UP-H2 Mysz BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mysz Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | klon MoP9 Mysz BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mysz Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | klon CLB-IVC7 Mysz IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mysz Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | klon 266 Mysz BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mysz Anti-Human CD33 | 345800 | klon P67.6 Mysz BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) | |
| Mysz Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | klon M-A712 Mysz BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Roztwór do lizy 10x Koncentrat (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Scover Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS& Koraliki T IVD | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| TĘCZOWE CZĄSTKI KALIBRACYJNE, 8 PIKÓW | Cytognos, Salamanka, Hiszpania | SPH-RCP-30-5A | dużo EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Cząstki kompensacyjne Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Oprogramowanie Diva w wersjach 6.1.2 i 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami | R& D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Albumina surowicy bydlęcej ( BSA) | Sigma-Aldrich, Francja | A9647 | |
| Azydek sodu 99% | Sigma-Aldrich, Francja | 199931 | |
| Wersja oprogramowania Infinicyt 1.8.0.e | Cytognos, Salamanka, Hiszpania |
Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission