Method Article

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

DOI:

10.3791/57867

⸱

November 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, University Hospital of Saint-Etienne, 2Department of Immunology, University Hospital of Grenoble-Alpes, 3Department Hematology, University Hospital of Clermont-Ferrand, 4Department of Immunology, University Hospital of Nice, 5Department of Biopathology, Institute Paoli-Calmettes, 6Department of Hematology, University Hospital of Lille

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grupa robocza zainicjowana w ramach Francuskiego Towarzystwa Cytometrii (AFC) została opracowana w celu harmonizacji zastosowania wieloparametrowej cytometrii przepływowej (MFC) w diagnostyce chorób szpikowych we Francji. Przedstawiony tu protokół został uzgodniony i był stosowany w okresie od września 2013 r. do listopada 2015 r. w sześciu francuskich laboratoriach diagnostycznych (Szpitale Uniwersyteckie w Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nicei i Lille oraz Institut Paoli-Calmettes w Marsylii) i pozwolił na standaryzację przygotowania próbek szpiku kostnego i pozyskiwania danych. Opracowano trzy bazy danych dojrzewania dla linii neutrofilowych, monocytowych i erytroidalnych ze szpikiem kostnym od "zdrowych" dawców (osób bez objawów choroby układu krwiotwórczego). Solidna metoda analizy dla każdej linii szpikowej powinna być stosowana do rutynowego stosowania diagnostycznego. Nowe przypadki mogą być analizowane w ten sam sposób i porównywane ze zwykłymi bazami danych. W ten sposób można zidentyfikować ilościowe i jakościowe nieprawidłowości fenotypowe, a te powyżej 2SD w porównaniu z danymi z prawidłowych próbek szpiku kostnego należy uznać za wskazujące na patologię. Głównym ograniczeniem jest większa zmienność pomiędzy danymi uzyskanymi za pomocą przeciwciał monoklonalnych uzyskanych metodami opartymi na technologiach hybrydoma i obecnie stosowanych w diagnostyce klinicznej. Ustawienie kryteriów technicznej walidacji uzyskanych danych może pomóc w poprawie użyteczności MFC na potrzeby diagnostyki MDS. Ustalenie tych kryteriów wymaga analizy w oparciu o bazę danych. Istotną zaletą tej metody jest zmniejszenie subiektywizmu badaczy w analizie danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wobec braku markerów fenotypowych specyficznych dla zmian dysplastycznych występujących w komórkach szpikowych podczas inicjacji i progresji MDS, w ostatnich latach zaproponowano nowe podejście oparte na ocenie szlaków dojrzewania (zmieniona ekspresja antygenów szpikowych podczas produkcji dojrzałych komórek szpikowych) lub nieprawidłowego rozmieszczenia różnych typów komórek w przedziałach komórek szpiku kostnego (BM)1,2.

Ten artykuł przedstawia nową metodę standaryzacji stosowania MFC w celu wykrywania zmian dysplastycznych w przedziałach komórek szpikowych BM związanych z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub innymi chorobami hematologicznymi szpiku. Badanie to pokazuje również użyteczność wykorzystania baz danych dojrzewania do analizy danych MFC.

Standaryzacja procedury przygotowania próbek, pozyskiwania danych i analizy za pomocą baz danych pozwoliłaby na identyfikację najistotniejszych nieprawidłowości fenotypowych związanych ze zmianami dysplastycznymi w komórkach szpikowych BM. W związku z tym statystycznie wybrane podzbiory oparte na dobrze oznaczonych i dobrze rozpoznanych formatach (diagramy automatycznego separatora populacji (APS), histogramy i wykresy punktowe) są niezbędne do opracowania strategii analizy, którą można wykorzystać w kolejnych rundach analizy. Odkrycie silnych nieprawidłowości fenotypowych w MDS ułatwiłoby diagnozę w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i bez nieprawidłowości cytogenetycznych. Identyfikacja parametrów dyskryminacyjnych pozwalających na zmniejszenie paneli immunofenotypowych może uprościć obecne wyniki2, umożliwiając ich zastosowanie w klinicznych laboratoriach patologicznych.

Ta metoda ogranicza subiektywne interpretacje danych cytometrycznych, jak to zostało zasygnalizowane w diagnozie MDS3. Ten krok jest warunkiem wstępnym do opracowania zautomatyzowanych narzędzi do przetwarzania i analizowania danych przepływu4.

MDS to heterogeniczna grupa zaburzeń klonalnych hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), w których mutacje spliceosomów współpracują ze specyficznymi modyfikatorami epigenetycznymi, aby uzyskać fenotyp MDS. Obecnie wiadomo, że wraz z mutacjami HSC w patofizjologii MDS zaangażowane są inne mechanizmy, takie jak nieprawidłowy stan zapalny o podłożu immunologicznym i interakcje między złośliwymi HSC a mikrośrodowiskiem zrębu BM. Mechanizmy te pozostają jednak słabo poznane. Duża heterogeniczność kliniczna i biologiczna MDS sprawia, że diagnoza i dobór optymalnej terapii jest wyzwaniem. W ciągu ostatniej dekady liczne badania wykazały, że MFC jest często bardziej czuły w wykrywaniu dysplazji2 niż morfologii, ale ograniczenia techniczne i ekonomiczne sprawiają, że technika ta jest trudna do standaryzacji, a wyniki często zależą od doświadczenia tłumacza3. Ponadto nie jest jasne, w jaki sposób MFC może przechylić szalę w kierunku MDS w przypadkach z lub bez minimalnej dysplazji morfologicznej i przy braku anomalii cytogenetycznych, lub w przypadkach granicznych, takich jak hipokomórkowy MDS, z niską liczbą blastów, z innych nieklonalnych zaburzeń BM, takich jak niewydolność szpiku kostnego (tj. niedokrwistość aplastyczna). Trudno jest również odróżnić graniczne przypadki MDS z nadmiarem blastów z ostrej białaczki szpikowej (AML). Z tych wszystkich powodów wytyczne kliniczne nie uwzględniają badania MFC w ostatecznej diagnozie MDS. W 2011 roku amerykańska National Comprehensive Cancer Network (NCCN) zaleciła MFC do oszacowania odsetka komórek CD34 +, wykrywania napadowych nocnych klonów hemoglobinurii oraz obecności cytotoksycznych klonów komórek T w hipokomórkowym MDS5. Te dwie ostatnie sytuacje również wiążą się z celem terapeutycznym, ponieważ dane kliniczne wykazały dobrą odpowiedź tych pacjentów na terapię immunosupresyjną6. Wytyczne NCCN z 2017 r., powołując się na zalecenia Międzynarodowej Grupy Roboczej (IWG), wymieniły nieprawidłowe wykrywanie immunofenotypowania przez MFC wśród współkryteriów diagnozy MDS, ale bez żadnych specyfikacji6. Ponadto niedawno opublikowana klasyfikacja WHO stanowi, że same wyniki MFC nie są wystarczające do ustalenia pierwotnego rozpoznania MDS w przypadku braku rozstrzygających danych morfologicznych i/lub cytogenetycznych7. Jednak MFC może być stosowany jako dodatkowy test pokazujący rozregulowanie wzorców dojrzewania komórek szpikowych i określający ilościowo "odległość od normy" dla pacjenta w określonym momencie przebiegu choroby.

Ta metoda ma zastosowanie w laboratoriach klinicznych zainteresowanych oceną dysplazji w komórkach szpikowych BM za pomocą immunofenotypowania MFC, w celu doprecyzowania diagnozy w MDS lub innych zaburzeniach szpikowych z nieprawidłowościami dysplastycznymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wymieniony poniżej został zatwierdzony przez "Comité de Protection des Personnes" (Niezależny Komitet Etyczny) Sud-Est 1 ze Szpitala Uniwersyteckiego Saint-Etienne, Francja.

1. Ustawienia cytometru

UWAGA: Ustawienia cytometru zostały wykonane zgodnie z zaleceniami France Flow, zgodnie z procedurą EuroFlow "EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) for Instrument Setup and Compensation (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

  1. Miesięczna konfiguracja instrumentu
    1. Włącz cytometr. Upewnij się, że wszystkie poziomy płynów są odpowiednie i otwórz Diva 6.1.3. Uruchom Fluidics: na pasku menu wybierz "Cytometr | Uruchomienie Fluidics". Kliknij "OK", gdy zostaniesz o to poproszony. Pozwól cytometrowi rozgrzać się przez co najmniej 30 minut.
    2. Kontrola wydajności - CST beads
      UWAGA: Na tym etapie przygotuj 12 rurek polistyrenowych o średnicy 75 mm, kulki CST i płyn do osłonek (patrz tabela materiałów).
      1. Oznacz rurkę z polistyrenu o wymiarach 12 x 75 mm2 "CST". Wymieszaj dołączoną fiolkę z kulkami przez delikatne odwrócenie lub bardzo delikatne wirowanie. Dodaj do oznaczonej probówki: 0,35 ml płynu do osłonek i 1 kroplę kulek CST. Delikatnie przekręć rurkę i przystąp do akwizycji. Przechowuj probówkę do 8 godzin w temperaturze 2-25 °C w ciemności, jeśli nie otrzymasz od razu.
      2. Wykonaj kontrolę wydajności: na pasku menu wybierz "Cytometr | CST".
      3. W zakładce 'Setup' modułu CST: potwierdź Canto II jak w domyślnej konfiguracji 4-2H-2V, a także potwierdź, że dla tej konfiguracji istnieje linia bazowa utworzona przy użyciu bieżącej partii koralików CST. Jeśli linia bazowa nie istnieje, zapoznaj się z instrukcją CST Beads. Upewnij się, że ta linia bazowa nie wygasła: w sekcji "Kontrola konfiguracji" wybierz "Sprawdź wydajność" z menu rozwijanego.
      4. Zaznacz opcję "Załaduj rurę ręcznie" i kliknij "Uruchom". Potwierdź wyświetlony numer partii. Delikatnie zmieszaj rozcieńczone kulki przygotowane powyżej, a gdy zostaniesz o to poproszony, załaduj rozcieńczone kulki i kliknij "OK".
      5. Po zakończeniu sprawdzania wydajności sprawdź, czy wydajność cytometru zakończyła się pomyślnie. Kliknij "Wyświetl raport". Uruchom ponownie test wydajności, jeśli wyniki nie zakończyły się pomyślnie. Zapisz raport w formacie PDF z datą raportu śledzenia wydajności.
    3. Dostosuj "Napięcia fluorescencyjne PMT" za pomocą tęczowych koralików (tabela materiałów).
      UWAGA: Wartości docelowe są określone w Standardowej Procedurze Operacyjnej Euroflow (SOP) zatytułowanej "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Niniejszy SOP jest dostępny na stronie Euroflow (www.euroflow.org; w strefie publicznej; Protokoły).
      1. Utwórz nowy eksperyment za pomocą opcji "Miesięczna data konfiguracji urządzenia | Wzór".
      2. ', wybierz parametry optyczne i fluorochromy odpowiadające danym lampom (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) i sprawdź żądane parametry akwizycji (Log, A, H i / lub W). Zastosuj bieżące ustawienia CST (kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru" eksperymentu). Ustaw próg dla parametru FSC na 10 000.
      3. Na cytometrze wyłącz kompensację, jednocześnie ustawiając napięcia PMT fluorescencji dla ustawienia Target MFI; w tym celu przejdź do zakładki 'Inspector', przejdź do zakładki 'Compensation'. Wyłącz kompensację, odznaczając opcję 'Włącz kompensację'.
      4. Utwórz arkusz roboczy "Docelowy MIF" ze wszystkimi niezbędnymi wykresami kropkowymi (n = 2; FSC w porównaniu z SSC, FITC w porównaniu z PE), histogramy (n = 8; jeden histogram dla każdego detektora fluorescencji) oraz statystyki przedstawiające referencyjne wartości pików (MFI i CV) dla każdego kanału fluorescencji.
      5. Rozcieńczyć 1 kroplę 8-szczytowych cząstek kalibracyjnych kulek tęczy w 1 ml wody destylowanej i odwirować przed użyciem. Pozyskaj bez rejestrowania 8-szczytowego roztworu tęczowych kulek przy "NISKIM" natężeniu przepływu. Przechowuj probówkę do 8 godzin w temperaturze 2-25 °C w ciemności, jeśli nie otrzymasz od razu.
      6. Koraliki singletowe bramki "Populacja P1" na dwuwymiarowym wykresie kropkowym FSC kontra SSC oraz 8. lub 7. pik na dwuwymiarowym wykresie kropkowym FITC kontra PE (najjaśniejszy szczyt lub następny pik skierowany w dół, jak określono w dokumencie Euroflow zatytułowanym "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") i nazwij tę bramkę Populacja P2.
      7. Kontynuacja akwizycji 8-pikowego zawieszenia kulek tęczowych i dostosowanie napięć PMT we wszystkich kanałach fluorescencyjnych, aby osiągnąć docelowe wartości MFI zgodnie z dokumentem Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. Po osiągnięciu wartości docelowej MIF dla 8. lub 7. szczytu należy zarejestrować osiągniętą docelową MIF i odpowiadające jej końcowe wartości PMT. Zbierz 5 000 zdarzeń i zapisz dane.
        UWAGA: Wartości PMT muszą być użyte poniżej w kroku 1.2.3 (Kontrola wydajności - Potwierdzenie wartości PMT za pomocą tęczowych koralików).
      9. Zapisz te wartości, tworząc zrzut ekranu z arkuszem roboczym "Target MFI" i ustawieniami instrumentu, a następnie zapisz jako .jpg picture.
        UWAGA: Po utworzeniu "nowej" rurki czasami wartości PMT nieoczekiwanie się zmieniają. W tym celu niezbędna jest podwójna kontrola PMT. Za każdym razem, gdy porównuj wartości PMT ze swoimi notatkami, sprawdź dwukrotnie, czy wartości "Target MFI" i PMT są poprawne!
      10. Zapisz "Ustawienia aplikacji". W przeglądarce kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru". Z menu rozwijanego wybierz "Ustawienia aplikacji" i zapisz. Kliknij "OK". Jeśli zostanie wyświetlony monit, kliknij przycisk Tak, aby zachować wartości progowe.
        UWAGA: Zapisz ustawienia aplikacji przy użyciu nazwy domyślnej. NIE zmieniaj nazw ustawień.
    4. Wyreguluj napięcia "FCS" i "SSC" za pomocą lizowanej przemytej krwi (LWB).
      UWAGA: Na tym etapie potrzebne jest 50 μl próbki krwi obwodowej (PB) od zdrowego ochotnika, roztwór lizujący (tabela materiałów) i bufor do mycia.
      1. Pipety 50 μl PB do probówki. Dodać 2 ml świeżo rozcieńczonego roztworu lizy. Delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Wirować przez 5 minut przy 540 x g.
      3. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, pozostawiając w probówce około 50 μl pozostałej objętości. Delikatnie wymieszaj i dodaj 2 ml przefiltrowanego roztworu myjącego.
      4. Wirować przez 5 minut przy 540 x g.
      5. Powtórz jeszcze raz kroki 1.1.4.3–1.1.4.4.
      6. Dodać 250 μl przefiltrowanego buforu myjącego i delikatnie wymieszać.
      7. W eksperymencie stworzonym w celu zdobycia tęczowych koralików stwórz nowy "Specimen | Nowy arkusz roboczy": narysuj dwuparametryczny wykres SSC-A / FSC-A.
      8. Pozyskaj komórki, zabramuj limfocyty na dwuwymiarowym wykresie kropkowym FSC i SSC i dostosuj napięcia FSC i SSC, aby osiągnąć następujące średnie wartości docelowe dla populacji bramkowanych limfocytów: FSC: 55 000 (zakres 50 000–60 000) i SSC: 13 000 (zakres 11 000 –15 000).
      9. Zbieraj i rejestruj dane z około 10 000 zdarzeń. Sprawdź średnie wartości docelowe FSC i SSC dla bramkowanych limfocytów. W razie potrzeby wyreguluj napięcie FSC i SSC.
      10. Wydruk ekranu i zapisz wydruk uzyskanych wartości kanału docelowego.
    5. Ustawienia kompensacji fluorescencji.
      UWAGA: Elementy sterujące kompensacją z pojedynczym zabarwieniem należy ustawić po ustanowieniu ustawień Target MFI i ustawień FSC/SSC. Na tym etapie potrzebny jest PB od zdrowego ochotnika, cząstki kompensacyjne (tabela materiałów), roztwór lizujący i bufor do mycia. Wykaz odczynników przeciwciał sprzężonych z fluorochromem stosowanych do wyznaczania matryc kompensacji fluorescencji i ich populacji referencyjnych przedstawiono w tabeli 1.
      1. Oznaczyć jedną probówkę na odczynnik, który ma być użyty do ustawienia kompensacji fluorescencji (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 i APC-H7 - CD71) oraz "czystą/niebarwioną" probówkę.
      2. Odpipetować 50 μl PB do każdej probówki lub 1 kroplę "ujemnych" cząstek kompensacyjnych + 1 kroplę "dodatnich" cząstek kompensacyjnych w probówkach kompensacyjnych wskazanych powyżej w tabeli 1.
      3. Dodać odpowiednią ilość odczynnika przeciwciała do probówki. Dodaj przefiltrowany bufor do mycia, aby osiągnąć końcową objętość 100 μl na probówkę i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
      4. Dodać 2 ml świeżo rozcieńczonego roztworu lizy tylko do probówek z komórkami i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
      5. Wirować przez 5 minut przy 540 x g.
      6. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, pozostawiając około 50 μl resztkowej objętości w każdej probówce. Delikatnie wymieszaj. Dodać 2 ml przefiltrowanego buforu do mycia.
      7. Wirować 5 min przy 540 x g.
      8. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego, pozostawiając około 50 μl resztkowej objętości w każdej probówce. Dodać przefiltrowany bufor do płukania, aby osiągnąć końcową objętość 250 μl na probówkę i delikatnie wymieszać.
      9. Tworzenie formantów wynagrodzenia.
        1. Na pasku menu wybierz pozycję Eksperyment utworzony na potrzeby pozyskiwania Rainbow Beads. Utwórz nowy 'Specimen | Konfiguracja wynagrodzeń | Utwórz mechanizmy kontroli wynagrodzeń".
        2. W wyświetlonym oknie dialogowym zaznacz pole wyboru "Dołącz oddzielną niezabarwioną rurkę/studzienkę kontrolną". Utwórz ogólne (nie specyficzne dla etykiety) kontrolki kompensacji dla FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Utwórz specyficzne dla etykiety elementy sterujące kompensacją dla PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 i APC-H7 - CD71. Kliknij "OK".
        3. W nowym arkuszu utwórz dwuparametryczny wykres SSC-A / FSC-A i narysuj bramkę na limfocytach (P1) oraz histogram odpowiadający fluorochromowi, który zostanie wykryty w każdej probówce, i narysuj bramkę P2 dla piku dodatniego. Wyświetl hierarchię (kliknij prawym przyciskiem myszy na wykresie i wybierz "Pokaż hierarchię populacji"), aby wyświetlić liczbę zdarzeń w P2, z wyjątkiem probówki Niezabarwionej Kontroli.
        4. W przeglądarce rozwiń wzór Kontrolki kompensacji.
        5. Wiruj niebarwione komórki, przygotowane powyżej, przez 3–5 s. Zainstaluj przygotowane niebarwione komórki na cytometrze. Dostosuj natężenie przepływu na "Średnie" i kliknij "Uzyskaj dane". Na wykresie kropkowym FSC-A vs SSC-A dostosuj bramkę P1, aby w pełni objąć populację limfocytów. Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1. Wybierz opcję "Zastosuj do wszystkich kontrolek wynagrodzeń".
        6. Na pulpicie nawigacyjnym "Akwizycja" kliknij "Nagraj dane", aby pobrać 5 000 zdarzeń. W przypadku wszystkich jednokolorowych barwionych komórek kontrolnych sprawdź, czy bramka interwału P2 obejmuje populację dodatnią.
        7. W przypadku lamp PE-Cy7 i APCH7 dodaj bramkę interwałową P3 do histogramu i upewnij się, że obejmuje ona populację ujemną, a P2 obejmuje populację dodatnią.
        8. Oblicz odszkodowanie. Na pasku menu wybierz "Eksperyment | Konfiguracja wynagrodzeń | Oblicz odszkodowanie". Nazwij macierz wynagrodzeń: "Data wypłaty odszkodowań". Wybierz opcję "Połącz i zapisz".
        9. Zapisz matrycę kompensacji w ustawieniach aplikacji katalogu: kliknij "Ustawienia cytometru | Ustawienia aplikacji | Zapisz", wpisz macierz wynagrodzeń "Data rekompensaty" i kliknij "OK".
        10. W przeglądarce kliknij "Ustawienia cytometru". W Inspektorze przejdź do zakładki "Kompensacja". Kliknij Drukuj w prawym dolnym rogu.
          UWAGA: Informacje te można również pobrać z katalogu.
        11. Sterowanie matrycą wynagrodzeń.
          1. Wymieszaj w jednej tubie wszystkie pojedyncze poplamione probówki (APCH7 do wyboru).
          2. Utwórz nowy eksperyment o nazwie "Data weryfikacji kompensacji", dodaj nową próbkę, kliknij prawym przyciskiem myszy na "Ustawienia cytometru" tego eksperymentu i wybierz "Link | Odłączanie | Ustawienia aplikacji" zapisany w kroku 1.1.3.10. Uzyskaj 50 000 zdarzeń z tej tuby, korzystając z nowych ustawień.
          3. Zastosuj nowy arkusz globalny. Utwórz 1 wykres punktowy FSC-A/SSC-A i narysuj bramkę, aby uwidocznić limfocyty i n x (n-1)/ / 2 inne wykresy skoncentrowane na bramce limfocytów, aby zwizualizować parametry dwa na dwa.
  2. Codzienna konfiguracja instrumentu
    1. Włącz cytometr. Upewnij się, że wszystkie poziomy płynów są odpowiednie i otwórz Diva 6.1.3. Uruchom Fluidics: na pasku menu wybierz "Cytometr | Uruchomienie Fluidics". Kliknij "OK", gdy zostaniesz o to poproszony. Pozwól cytometrowi rozgrzać się przez co najmniej 30 minut.
    2. Kontrola wydajności - Koraliki CST: powtórz kroki 1.1.2.1–1.1.2.5.
    3. Kontrola wydajności - potwierdzenie wartości PMT za pomocą tęczowych kulek.
      1. Oznacz rurkę z polistyrenu jako "Rainbow Beads" i sprawdź, czy numer partii jest tym, który jest używany. Dokładnie wymieszać fiolkę z Rainbow Bead. Przygotuj Rainbow Bead, dodaj 1 kroplę Rainbow Beads do 1 ml wody dejonizowanej lub destylowanej. Chronić przed światłem.
        UWAGA: Przystąp do pobierania lub przechowywania probówki w temperaturze 2-8 °C do momentu nabycia.
      2. Utwórz nowy eksperyment: "Data tęczowych koralików".
      3. Połącz kompensacje: kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru", wybierz "Ustawienia łącza", wybierz odpowiednią matrycę kompensacji utworzoną w kroku 1.1.5.9.9 i wybierz "Zastąp
        4. ".
      4. Odłącz kompensację: kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru", wybierz "Odłącz od poprzednio połączonej konfiguracji" i kliknij "OK".
      5. Zastosuj "Ustawienia aplikacji": kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru", wybierz "Ustawienia aplikacji", zastosuj ustawienie utworzone w kroku 1.1.3.10 podczas konfiguracji miesięcznej i wybierz "Zachowaj wartość kompensacji".
      6. Usuń zaznaczenie opcji "Włącz kompensację".
      7. Utwórz nowy okaz w szablonie arkusza eksperymentu dla tęczowych koralików. Zdobądź tubę w akwizycji "LOW".
      8. Podczas pozyskiwania koralików dostosuj bramkę P1 tak, aby uwzględniała tylko populację koralików singletowych. Dostosuj bramkę P2 na wykresie punktowym FITC-A / PE-A, aby uwzględnić tylko populację ściegów singletowych. Rekord 10 000 wydarzeń.
      9. Sprawdzić, czy wartości MIF i CV uzyskane dla populacji P2 mieszczą się we wstępnie zdefiniowanych celach protokołu. W przeciwnym razie umyj cytometr i ponownie rozpocznij operację. Zapisz raport w formacie PDF.

2. Przygotowanie próbki BM

UWAGA: Wykonaj protokół płukania komórek tuż przed procedurą barwienia.

  1. Pobrać pipetę z 600 μl próbki pierwotnej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  2. Dodać 10 ml buforu płuczącego (PBS + 0,5% BSA [>98% czystego BSA] + 0,09% przefiltrowanego roztworu NaN3, pH 7,4). Dobrze wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety.
  3. Wirować przez 5 minut przy 540 x g (przepłukanie 1). Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego.
  4. Powtórz kroki 2.2–2.3 (umycie 2).
  5. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu do płukania.
  6. Barwienie markerów kręgosłupa. Przenieś całą objętość przeciwciał szkieletowych do rurki polipropylenowej w celu analizy FACS, zidentyfikowanej na podstawie danych pacjenta i "szkieletu". Dodać 350 μl umytej próbki (objętość umytej próbki wymagana do napełnienia wszystkich probówek na panelu). Dobrze wymieszać za pomocą pipety.
    UWAGA: Obliczyć całkowitą objętość przeciwciał szkieletowych do barwienia błony powierzchniowej (jak pokazano w Tabeli 2).
  7. Odpipetować równe ilości mieszanki próbka-szkielet do 3 probówek polipropylenowych do analizy FACS, oznaczonych danymi pacjenta i "probówka numer 1" do "probówki numer 3". W razie potrzeby użyj buforu do mycia, aby osiągnąć końcową objętość 200 μl na probówkę.
    UWAGA: Uważaj, aby nie pozostawić żadnych śladów próbki na ściankach probówek; W przeciwnym razie komórki te nie zostaną poplamione. W razie potrzeby odwiruj komórki i odwiruj probówkę.
  8. Do każdej probówki dodać odpowiednią objętość przeciwciał skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym komórki (z wyjątkiem markerów szkieletowych), jak określono w tabeli 2. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  9. Dodać 2 ml roztworu lizy. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  10. Wirować przez 5 minut przy 540 x g. Odrzucić sklarowany osad bez naruszania osadu komórkowego, pozostawiając około 50 μl pozostałej objętości w każdej probówce. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety.
  11. Dodaj 2 ml buforu płuczącego do osadu komórkowego. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety.
  12. Powtórz kroki 2.10–2.11 (umyć 2).
  13. Wirować przez 5 minut przy 540 x g. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl PBS. Dobrze wymieszaj za pomocą pipety.
  14. Komórki należy pozyskać, najlepiej natychmiast po barwieniu lub przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, nie dłużej niż 1 godzinę do czasu zmierzenia w cytometrze przepływowym.

3. Akwizycja danych

  1. Otwórz nowy eksperyment w oprogramowaniu Diva i zmień jego nazwę zgodnie z nazwą, typem próbki i datą.
  2. Utwórz nowy próbnik zawierający 3 probówki. Określ w układzie eksperymentu przeciwciała użyte w każdej probówce.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy "Ustawienia cytometru", wybierz "Ustawienia aplikacji" i zastosuj wartości uzyskane w konfiguracji miesięcznej (krok 1.1.3.10).
  4. Otwórz nowy arkusz globalny i utwórz wykresy punktowe: SSC-A/ FSC-A, SSC-A/ CD45-HV500-A, SSC-A/ FITC-A, SSC-A/ PE-A, SSC-A/ CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A/ CD117-PECy7-A, SSC-A/ APC-A, SSC-A/ APCH7-A, SSC-A/ HLA-DR-HV450-A. Na wykresie kropkowym SSC-A/FSC-A utwórz bramkę, aby wybrać komórki singletowe. Na wykresie punktowym SSC-A/CD45-BV500-A utwórz bramki, aby wybrać 4 populacje: granulocyty, monocyty, blasty i limfocyty. Rzutuj te populacje na utworzonych wcześniej wykresach kropkowych.
  5. Utwórz nowy globalny arkusz do kontroli wynagrodzeń zgodnie z opisem w kroku 1.1.5.9.11.3.
  6. Zdobądź tubę w akwizycji "MEDIUM" i nagraj 500 000 zdarzeń na lampę. Po walidacji technicznej (ocena kompensacji i prawidłowego barwienia) należy wyeksportować dane jako pliki FCS3.0.

4. Analiza danych

UWAGA: Do skonstruowania normalnych baz danych BM użyto plików od zdrowych dawców i od osób bez żadnych dowodów na chorobę krwiotwórczą w następujący sposób: 11 z 18 plików dla bazy danych Neutrophils_NM, 10 z 18 plików dla Monocytes_NM bazy danych i 14 z 18 plików dla NRC_NM bazy danych. Odrzucone pliki wykazywały różne problemy techniczne, jak przedstawiono w sekcji Reprezentatywne wyniki. Pliki zostały indywidualnie przeanalizowane przy użyciu oprogramowania Infinicyt (Tabela Materiałów), zgodnie z różnymi strategiami przedstawionymi na Rysunek 1A(1-3) dla linii neutrofili (Profil Neutrophils_Maturation.inp), Rysunek 2A dla linii monocytów (Profil Monocytes_Maturation.inp) i Rysunek 3A(1-2) dla linii komórek erytroidalnych (profil NRC_Maturation.inp).

  1. Strategia analizy neutrofili - budowa bazy danych Neutrophils_NM
    1. Zidentyfikuj wybuchy neutrofili CD34+ za pomocą przecięcia siedmiu bramek, co pozwala na wybór zdarzeń CD34+ CD117+ HLADR+low CD10- CD13+ CD11b- (Rysunek 1A.1). Przypisz te zdarzenia do zakładki "Neutrofile" w drzewie hierarchii populacji, a następnie odznacz tę zakładkę, aby usunąć te komórki (przedstawione na niebiesko) z wyświetlania pozostałych zdarzeń (kolor szary).
    2. Wyizoluj prekursory CD117+ CD34- CD13+ CD11b- HLADR+low neutrophil prekursory, korzystając z przecięcia sześciu bramek, jak pokazano w Rysunek 1A(2) i przypisz je do zakładki 'Neutrophil'.
    3. Zidentyfikuj bardziej dojrzałe neutrofile za pomocą przecięcia czterech bramek, co pozwala na rozróżnienie komórek CD45dim SSCint-hi CD117-HLADR i przypisanie ich do zakładki "Neutrofile".
    4. Odznacz pozostałe zdarzenia, pozostawiając widoczne tylko neutrofile, a następnie wyeksportuj tę populację, klikając "Plik | Eksport" i sprawdzenie, czy wszystkie wymagane parametry zostały sprawdzone i zapisanie danych jako plików FCS.
    5. W scalonym pliku składającym się ze wszystkich wyeksportowanych plików FCS należy przeprowadzić kontrolę jakości, oceniając intensywność wyrażania znaczników dla każdej subpopulacji. Korzystając z wykresów APS z medianami dla każdego pliku i krzywymi SD dla każdej pokazanej subpopulacji, usuń przypadki spoza krzywych 2SD (patrz szczegóły w sekcji Reprezentatywne wyniki) (Rysunek 1B).
    6. W powstałym pliku złożonym z widocznymi "Neutrofilami" narysuj ścieżkę dojrzewania na diagramie APS ( Rysunek 1C po lewej) i zapisz jako plik .cyt.
      UWAGA: Diagram dojrzewania porównawczego umożliwia wizualizację wszystkich parametrów ze wszystkich plików zawartych w bazie danych Neutrophils_NM reprezentowanej w stosunku do znormalizowanej bazy danych. Diagram przedstawiony w Rysunek 2C, po prawej stronie, pokazuje, że wszystkie pliki zawarte w bazie danych Neutrophils_NM (n=11) mieszczą się w 2 SD w porównaniu z medianą grupy.
  2. Strategia analizy dla monocytów - budowa bazy danych Monocytes_NM
    1. Zidentyfikuj komórki linii monocytowej (CD117 + / - CD64 + hi HLADR + hi) za pomocą przecięcia czterech bramek (Rysunek 2A). Przypisz te zdarzenia do zakładki "Monocytyczny" w drzewie hierarchii populacji.
    2. Odznacz pozostałe zdarzenia, pozostawiając widoczne tylko komórki monocytowe, a następnie wyeksportuj tę populację, klikając "Plik | Eksport" i sprawdzenie, czy wszystkie wymagane parametry zostały sprawdzone i zapisanie danych jako plików FCS.
    3. W scalonym pliku składającym się ze wszystkich wyeksportowanych plików FCS przeprowadź kontrolę jakości, oceniając intensywność ekspresji markerów dla każdej subpopulacji, a następnie usuń obserwacje poza krzywymi 2SD (szczegóły w sekcji Reprezentatywne wyniki) (Rysunek 2B).
    4. W wynikowym pliku z widocznymi komórkami "monocytowymi" narysuj ścieżkę dojrzewania na diagramie APS ( Rysunek 2C po lewej) i zapisz to jako plik .cyt.
      UWAGA: Diagram dojrzewania porównawczego umożliwia wizualizację wszystkich parametrów ze wszystkich plików zawartych w bazie danych Monocytes_NM reprezentowanych w stosunku do znormalizowanej bazy danych. Diagram przedstawiony w Rysunek 2C, po prawej stronie, pokazuje, że wszystkie pliki zawarte w bazie danych Monocytes_NM (n=10) mieszczą się w 2 SD w porównaniu z medianą grupy.
  3. Strategia analizy jądrzastych krwinek czerwonych (NRC) - budowa bazy danych NRC_NM
    1. Zidentyfikuj wybuchy erytroidalne CD34 + za pomocą skrzyżowania siedmiu bramek, które pozwalają na wybór zdarzeń CD34 + CD117 + HLADR + low CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + (Rysunek 3A(1)). Przypisz te zdarzenia do zakładki "NRC" w drzewie hierarchii populacji, a następnie odznacz tę zakładkę, aby usunąć te komórki (przedstawione na czerwono) z wyświetlania pozostałych zdarzeń (kolor szary).
    2. Zidentyfikuj bardziej dojrzałe NRC za pomocą przecięcia czterech bramek, które umożliwiają dyskryminację komórek CD45-/+dim SSClow CD36+hi CD71+hi CD105+/-. Przypisz te zdarzenia do zakładki "NRC" (Rysunek 3A(2)). Płytki krwi (komórki CD36 + hi SSClow) muszą zostać usunięte z populacji NRC (Rysunek 3A(2)).
    3. Odznacz pozostałe zdarzenia, pozostawiając widoczne tylko komórki NRC, a następnie wyeksportuj tę populację, klikając "Plik | Eksport" i sprawdzenie, czy wszystkie wymagane parametry zostały sprawdzone i zapisanie danych jako plików FCS.
    4. W scalonym pliku składającym się ze wszystkich wyeksportowanych plików FCS przeprowadź kontrolę jakości, oceniając intensywność ekspresji markerów dla każdej subpopulacji, a następnie usuń przypadki spoza krzywych 2SD (patrz szczegóły w sekcji Reprezentatywne wyniki) (Rysunek 3B).
    5. W pliku wynikowym z widocznymi komórkami "NRC" narysuj ścieżkę dojrzewania na diagramie APS ( Rysunek 3C, po lewej) i zapisz go jako plik .cyt.
      UWAGA: Diagram dojrzewania porównawczego umożliwia wizualizację wszystkich parametrów ze wszystkich plików zawartych w bazie danych NRC_NM reprezentowanych w stosunku do znormalizowanej bazy danych. Diagram przedstawiony w Rysunek 3C, po prawej stronie, pokazuje, że wszystkie pliki zawarte w bazie danych NRC_NM (n = 14) mieszczą się w 2 SD w porównaniu z medianą grupy.
  4. Ocena dojrzewania w przedziałach szpikowych BM z wykorzystaniem baz danych dojrzewania
    1. Otwórz plik .cyt odpowiadający interesującej nas linii (tj. Neutrophils_NM_GMFF.cyt dla linii neutrofili, Monocytes_NM_GMFF.cyt dla linii monocytowej i NRCs_NM_GMFF.cyt dla linii erytroidalnej).
    2. Kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę "Dojrzewanie" poniżej zakładki odpowiadającej interesującemu pochodzeniu ("Neutrofile | Monocytyczny| NRC") i zapisać bazę danych od dojrzewania do dojrzałości.
    3. Otwórz nowy plik FCS i przeprowadź analizę, jak wyjaśniono wcześniej (kroki 4.1.1–4.1.3 dla neutrofili, krok 4.2.1 dla komórek monocytowych i krok 4.3.1–4.3.2 dla NRC).
    4. Narysuj ścieżkę dojrzewania dla populacji będącej przedmiotem zainteresowania.
    5. Otwórz odpowiednią bazę danych w zakładce "Narzędzia" (Analiza bazy danych) i porównaj populację, która ma być analizowana, z odpowiednią bazą danych dojrzewania. Sprawdź dane pod kątem kompatybilności z dostępną bazą danych: pełna kompatybilność (zielony trójkąt); częściowa zgodność, w większości przypadków rozbieżności w nazwie parametrów (żółty trójkąt); i niekompatybilność (czerwony trójkąt).
    6. Jeśli dane są zgodne lub częściowo zgodne, oprogramowanie tworzy diagram "Znormalizowane różnice dojrzewania". Aby zobrazować "Różnice w dojrzewaniu pasma parametrów", otwórz nowy diagram w zakładce "Diagram", kliknij "Dojrzewanie" i wybierz, ile parametrów ma być wyświetlanych, kliknij "OK", a pojawi się diagram. Za pomocą prawego przycisku myszy na schemacie; zmiany można wprowadzać w Wizualizacji Danych, Wizualizacji Baza Danych i Wizualizacji Diagramu Dojrzewania.
    7. Aby zobrazować znaczenie różnic między nowym plikiem a danymi zawartymi w bazie danych, skonfiguruj powiększenie (kliknij prawym przyciskiem myszy na "Znormalizowane różnice dojrzewania" i zastosuj "Zoom").

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

54 próbki BM pobrane w antykoagulancie K-EDTA zostały włączone do badania. Dane MFC analizowano przy braku jakichkolwiek informacji o pacjentach. Badanie retrospektywne wykazało, że próbki BM pochodziły od 7 zdrowych dawców (5 mężczyzn i 2 kobiety o medianie wieku 47,4 [35-48], 11 osób bez objawów choroby układu krwiotwórczego (8 mężczyzn i 3 kobiety o medianie wieku 57,9 [35-72]) oraz 36 przypadków z różnymi stanami patologicznymi: 1 przypadek z niedokrwistością i niskim poziomem kreatyn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jakość aspiratu BM może mieć wpływ na końcowe wyniki. Hemodylucja aspiratu BM może zniekształcić rozmieszczenie komórek na różnych etapach dojrzewania z powodu braku komórek progenitorowych lub prekursorowych. Prawdopodobnie zastosowanie metody lizy masowej może pomóc w normalizacji aspiratów BM do hemodylucji w analizach cytometrii przepływowej. Ponadto krytycznymi etapami oceny dysplazji szpikowej BM za pomocą cytometrii przepływowej są przetwarzanie i barwienie próbki, gromadzenie danych i interpretacja

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Zakład Cytometrii Przepływowej, Laboratorium Hematologii Szpitala Uniwersyteckiego w Saint-Etienne jest członkiem Konsorcjum EuroFlow.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała użyte w tym badaniu zostały dostarczone przez BD Biosciences. Autorzy chcieliby podziękować swojej koleżance, dr Pascale Flandrin-Gresta z Wydziału Biologii Molekularnej, laboratorium hematologicznego Szpitala Uniwersyteckiego Saint-Etienne we Francji, która dostarczyła wiedzę specjalistyczną w celu interpretacji danych NGS dla drugiego przypadku MDS. Autorzy są wdzięczni hematologom klinicystom za zainteresowanie i zaangażowanie w to badanie, a także pacjentom i zdrowym dawcom za zgodę na udział w tym badaniu. Autorzy pragną również podziękować Fundacji "Les Amis de Rémi" za wsparcie finansowe publikacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytometr przepływowy BD FACSCanto IIBD Biosciences, CA, USASN:3-laserowy V33896301336, konfiguracja 4-2-2, Szczegóły filtrów i luster: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Wirówka Awel C48-RAWEL Industries, FRSN: 910120016; Model nr: 320002001wirówki wolnoobrotowe; pojemność 60 probówek FACS
Pipety 10 i mikro; L oraz 200&mikro; L
Pipety Pasteura
15 ml probówki Falcon rurka
polipropylenowa do myszy FACS
Anti-Human HLA-DRBD Biosciences, CA, USA655874klon L243
Mysz BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome Horizon V450
(Ex max 404 nm/
Em max 448 nm)
Mysz Anti-Human CD45BD Biosciences, CA, USA560777 klon myszy HI30
IgG1, κ
Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/
Em max 500 nm)
Mysz Anti-Human CD16BD Biosciences, CA, USA656146klon CLB/fcGran1 Mysz BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mysz Anti-Human CD13BD Biosciences, CA, USA347406klon L138
Mysz BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mysz Anti-Human CD34BD Biosciences, CA, USA347222klon 8G12
Mysz BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PerCP-Cy5.5
(Ex max 482 nm/
Em max 678 nm)
Mysz Anti-Human CD117BD Biosciences, CA, USA339217klon 104D2
Mysz BALB/c IgG1
Fluorochrome PE-Cy7
(Ex max 496 nm/
Em max 785 nm)
Mysz anty-ludzka CD11bBD Biosciences, CA, USA333143klon myszy D12
BALB/c IgG2a, κ
D12, fluorochrom APC
(Ex max 650 nm/
Em max 660nm
Mysz anty-ludzka CD10BD Biosciences, CA, USA646783klon HI10A
Mysz BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mysz Anti-Human CD35BD Biosciences, CA, USA555452klon E11
Mysz IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mysz Anti-Human CD64BD Biosciences, CA, USA644385klon 10.1
Mysz BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mysz Anti-Human CD300eImmunostepIREM2A-T100UP-H2
Mysz BALB/c IgG1, k
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mysz Anti-Human CD14BD Biosciences, CA, USA641394klon MoP9
Mysz BALB/c IgG2b, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mysz Anti-Human CD36BD Biosciences, CA, USA656151klon CLB-IVC7
Mysz IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mysz Anti-Human CD105BD Biosciences, CA, USA560839klon 266
Mysz BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mysz Anti-Human CD33345800klon P67.6
Mysz BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mysz Anti-Human CD71BD Biosciences, CA, USA655408klon M-A712
Mysz BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Roztwór do lizy 10x Koncentrat (IVD)BD Biosciences, CA, USA349202
FACSFlow Scover FluidBD Biosciences, CA, USA342003
FACSDiva CS& Koraliki T IVDBD Biosciences, CA, USA656046
TĘCZOWE CZĄSTKI KALIBRACYJNE, 8 PIKÓWCytognos, Salamanka, HiszpaniaSPH-RCP-30-5Adużo EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Cząstki kompensacyjne Multicolor CompBeads(CE/IVD)BD Biosciences, CA, USAref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Oprogramowanie Diva w wersjach 6.1.2 i 6.1.3BD Biosciences, CA, USA
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanamiR& D Systems, Minneapolis, USA5564
Albumina surowicy bydlęcej ( BSA)Sigma-Aldrich, FrancjaA9647
Azydek sodu 99%Sigma-Aldrich, Francja199931
Wersja oprogramowania Infinicyt 1.8.0.eCytognos, Salamanka, Hiszpania
klon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
  2. Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
  3. Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
  4. Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
  5. Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
  6. Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
  7. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
  8. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
  9. Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
  10. EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
  12. http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
  13. van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
  14. Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
  15. Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
  16. Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryBone MarrowMyeloid Cell MaturationMultiparameter Flow CytometryMyeloid Disease DiagnosisSample PreparationData AcquisitionMaturation DatabaseNeutrophil LineageMonocytic Lineage

Related Articles