Method Article

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

DOI:

10.3791/57889

⸱

August 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve University, 2Department of Endocrinology, Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, 3Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University, 4Center for RNA Science and Therapeutics, Case Western Reserve University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alternatywny splicing (AS) występuje w ponad 90% ludzkich genów. Wzorzec ekspresji alternatywnie splicywanego eksonu jest często regulowany w sposób specyficzny dla typu komórki. Wzorce ekspresji AS są zwykle analizowane za pomocą RT-PCR i RNA-seq przy użyciu próbek RNA wyizolowanych z populacji komórek. Badanie in situ wzorców ekspresji AS dla określonej struktury biologicznej można przeprowadzić za pomocą hybrydyzacji RNA in situ (ISH) przy użyciu sond specyficznych dla eksonów. Jednak to konkretne zastosowanie ISH zostało ograniczone, ponieważ alternatywne eksony są na ogół zbyt krótkie, aby zaprojektować sondy specyficzne dla eksonów. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie BaseScope, niedawno opracowanej technologii, która wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne w RNA ISH, do analizy wzorców ekspresji AS w sekcjach mózgu myszy. Ekson 23a nerwiakowłókniakowatości typu 1 (Nf1) jest używany jako przykład ilustrujący, że krótkie sondy ze złączem ekson-ekson wykazują silne sygnały hybrydyzacji o wysokiej swoistości w analizie RNA ISH na odcinkach mózgu myszy. Co ważniejsze, sygnały wykryte za pomocą sond specyficznych dla inkluzji i przeskakiwania eksonów można wykorzystać do wiarygodnego obliczenia procentu splecionych wartości ekspresji eksonu Nf1 23a w różnych obszarach anatomicznych mózgu myszy. Przedstawiono protokół doświadczalny i metodę obliczeniową dla analizy AS. Wyniki wskazują, że BaseScope stanowi nowe, potężne narzędzie do oceny wzorców ekspresji AS in situ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alternatywny splicing (AS) to powszechny proces, który zachodzi podczas dojrzewania pre-mRNA. W tym procesie ekson może być w różny sposób włączony do dojrzałego mRNA. W ten sposób, poprzez AS, jeden gen może generować wiele mRNA, które kodują różne produkty białkowe. Szacuje się, że 92–94% ludzkich genów ulega alternatywnemu splicingowi1,2. Nieprawidłowe alternatywne wzorce splicingu wynikające z mutacji genetycznych zostały powiązane z wieloma chorobami, w tym stwardnieniem zanikowym bocznym, dystrofią miotoniczną i rakiem3,4. W związku z tym kluczowe znaczenie ma zbadanie i lepsze zrozumienie alternatywnych mechanizmów regulacyjnych splicingu w celu znalezienia nowych metod leczenia chorób u ludzi.

AS jest często regulowany w sposób specyficzny dla typu komórki. Ważne jest określenie wzorca ekspresji AS określonego genu w danym systemie biologicznym. Staje się to jednak skomplikowane, gdy bada się złożony narząd, który zawiera wiele różnych typów komórek, taki jak mózg lub serce. W tym przypadku idealnym wyborem systemu testowego jest hybrydyzacja RNA in situ (ISH) przy użyciu skrawków tkanki, dzięki czemu wzorzec ekspresji AS określonego genu może być wykryty w wielu typach komórek jednocześnie. Rzeczywiście, sondy specyficzne dla eksonu zostały użyte do oceny poziomów ekspresji alternatywnego exon5,6,7. Jednak to podejście nie nadaje się do analizy wzorców AS z następujących powodów. Po pierwsze, konwencjonalne metody ISH zwykle używają sond dłuższych niż 300 pz, podczas gdy średnia wielkość wewnętrznych eksonów kręgowców (nie pierwszego lub ostatniego eksonu) wynosi 170 nukleotydów8,9. Po drugie, gdy sonda specyficzna dla eksonu jest używana do zbadania wzoru splicingu wewnętrznego alternatywnego eksonu, jedyną izoformą mRNA wykrytą przez sondę jest ta, która zawiera ekson, podczas gdy izoforma mRNA bez eksonu nie może zostać wykryta. W związku z tym obliczenie wartości procentu splicingu (PSI) dla alternatywnego eksonu jest skomplikowane. Co więcej, konwencjonalne fluorescencyjne ISH często łączą ISH z barwieniem immunologicznym, co zmniejsza skuteczność i odporność wykrywania. Na przykład w badaniu, w którym badano indukowane stresem przełączanie izoform splicingu mRNA acetylocholinoesterazy (AChE), digoksygenina została włączona do sondy ISH i wykryta za pomocą przeciwciała anty-digoksygeninowego. Alternatywnie, sonda znakowana biotyną została wykryta przez koniugat fosfatazy alkalicznej/streptawidyny i substrat dla fosfatazy alkalicznej10. Żadna z metod nie wykorzystuje żadnej strategii amplifikacji w celu zwiększenia czułości wykrywania. W rezultacie trudno jest wykryć transkrypty mRNA, które ulegają ekspresji na niskich poziomach. W związku z tym potrzebny jest prostszy i bardziej niezawodny system oznaczania ISH do analizy wzorców ekspresji AS in situ.

BaseScope został niedawno opracowany w oparciu o platformę RNAscope, dobrze znanego i szeroko stosowanego systemu testowego ISH. Oba systemy testowe wykorzystują technologię amplifikacji specyficzną dla celu, która zwiększa czułość detekcji11,12. To, co odróżnia jeden od drugiego, to długość sekwencji docelowej, która wynosi zaledwie 50 nukleotydów w przypadku BaseScope i 300–1000 nukleotydów w przypadku RNAscope. W ten sposób możliwe jest zaprojektowanie sond, które celują w złącza ekson-ekson w celu wykrycia określonych alternatywnych izoform mRNA. W obecnym badaniu ustalono procedurę w celu zbadania wzorców ekspresji AS eksonu 23a neurofibromatozy typu 1 (Nf1), alternatywnego eksonu szeroko badanego w tym samym laboratorium13,14,15,16,17, w sekcjach mózgu myszy. Wyniki pokazują, że BaseScope jest idealnym systemem do badania wzorców ekspresji eksonu 23a Nf1 in situ. Ponieważ ten system testowy można dostosować do analizy wzorców ekspresji AS wielu alternatywnych eksonów, stanowi on potężne nowe narzędzie w badaniach AS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Case Western Reserve. Tytuł protokołu 2016-0068 (PI: Hua Lou) brzmi "Rola alternatywnego splicingu pre-mRNA w rozwoju kręgowców".

UWAGA: Informacje o wszystkich urządzeniach, odczynnikach i materiałach użytych w tym protokole są zawarte w Tabeli Materiałów.

1. Przygotuj sekcje z zatopioną parafiną (FFPE) z formaliną

  1. Poddaj eutanazji 1 mysz CD1 i 1 mysz C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Ostrożnie rozetnij czaszkę nożyczkami chirurgicznymi i kleszczami. Usuń mózg za pomocą miarki.
    UWAGA: Użyto 5-miesięcznych samców myszy CD1 i 3-miesięcznych samców myszy C57BL / 6J i wykazano podobne wyniki.
    1. Umyj mózg PBS. Utrwal cały mózg roztworem zawierającym 10% formaliny w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 godzin, umieszczając cały mózg w 50 ml roztworu formaliny.
    2. Zmień roztwór utrwalający na PBS i inkubuj mózg w PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Odwodnić i zanurzyć mózg w ksylenie i parafinie przy użyciu standardowych procedur18.
  2. Za pomocą mikrotomu pociąć osadzoną tkankę na odcinki o wielkości 5 μm. Umieść wstęgę parafinową najpierw w łaźni wodnej RT, a następnie w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C, aby rozprowadzić wstążkę.
    1. Gdy zmarszczki i fałdy wstążki znikną, natychmiast zamontuj sekcje na szkiełkach szkiełkowych. Szkiełka suszyć na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej. Przed użyciem piec szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.

2. Wstępna obróbka próbki

  1. Odparafinować skrawki tkanek. Wykonaj te czynności w dygestorium.
    1. Napełnij dwie naczynia do mycia (Rysunek 1A) 250 ml świeżego ksylenu i dwie 250 ml 100% etanolu. Włóż szkiełka do mycia tkanek do stojaka do mycia (Rysunek 1A) i umieść ruszt do mycia naczyń zgodnie z kolejnością i czasem inkubacji wskazanym w Tabeli 1.
    2. Podczas każdej inkubacji podnoś ruszt do mycia w górę i w dół więcej niż 3 razy w naczyniu do mycia. Po każdej inkubacji szybko przenieś ruszt do mycia do następnego naczynia do mycia, aby zapobiec wysychaniu skrawków tkanki.
    3. Po wykonaniu etapów inkubacji wyjmij z naczynia do mycia ruszt ze szkiełkami. Umieść ruszt w inkubatorze o temperaturze 60 °C na 5 minut lub do momentu, gdy szkiełka całkowicie wyschną.
  2. Narysuj barierę o wymiarach 0,75 x 0,75 cala otaczającą wycinek tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Suszyć barierę na powietrzu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Wstępne traktowanie plasterków
    1. Przygotowanie odczynników i sprzętu
      1. Włącz piec do hybrydyzacji (Rysunek 1B) i ustaw temperaturę na 40 °C na 30 minut przed użyciem.
      2. Całkowicie zwilż papier nawilżający (Rysunek 1E) wodą destylowaną i umieść go na tacy kontroli wilgotności (Rysunek 1D, po lewej). Trzymaj tackę kontrolną wilgotności w piecu do hybrydyzacji.
      3. Przygotuj 700 ml świeżych 1x odczynników do odzyskiwania celu, dodając 630 ml dH2O do 70 ml 10 odczynników do odzyskiwania celu.
    2. Zastosuj nadtlenek wodoru.
      1. Połóż odparafinowane szkiełka na ławce. Dodaj 5-8 kropli nadtlenku wodoru do sekcji, aby całkowicie pokryć tkankę. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Postukaj w szkiełka na kawałku chłonnego papieru, aby usunąć roztwór nadtlenku wodoru, po jednym szkiełku na raz. Natychmiast włóż szkiełko do kosza do mycia i przenieś kosz do naczynia do mycia wypełnionego dH2O.
      3. Umyj szkiełka, przesuwając ruszt w górę iw dół w wodzie destylowanej 3–5 razy. Przenieś kosz do mycia do naczynia do mycia wypełnionego świeżą wodą destylowaną i jeszcze raz umyj szkiełka.
    3. Wykonywanie pobierania celu
      1. Umieść szklaną zlewkę o pojemności 1 000 ml na płycie grzejnej. Dodaj 700 ml świeżych 1x odczynników do odzyskiwania celu do zlewki i przykryj folią. Włóż termometr do zlewki przez foliową pokrywę (Rysunek 1C). Włącz płytę grzejną i ustaw na wysokich obrotach na 10–15 minut.
      2. Gdy temperatura pobieranych odczynników osiągnie 98 °C, przełącz regulator temperatury płyty grzejnej z wysokiej na niską, aby utrzymać łagodne wrzenie. Nie gotować dłużej niż 15 minut.
      3. W międzyczasie ostrożnie otwórz folię i włóż stojak do mycia z plastrami do środka regenta. Ponownie przykryj zlewkę i inkubuj przez 15 minut.
      4. Za pomocą kleszczyków wyjmij ruszt ze zlewki do naczynia do mycia wypełnionego 200 mldH2Oi płucz przez 15 sekund.
      5. Przenieś ruszt do naczynia myjącego zawierającego 100% świeżego etanolu i odstaw na 3 minuty. Wyjmij szkiełka i susz je w inkubatorze o temperaturze 60 °C przez 10 minut.
    4. Zastosuj proteazę III
      1. Umieść szkiełka na stojaku na plamy ( Rysunek 1D, po prawej). Dodaj 5 kropli proteazy III, aby pokryć tkankę. Ostrożnie umieść ruszt na tacy do kontroli wilgotności (Rysunek 1D, po lewej) i włóż tacę do pieca hybrydyzacyjnego o temperaturze 40 °C. Inkubować przez 30 minut.
      2. Wyjmij ruszt przesuwny i włóż blachę z powrotem do piekarnika. Stukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu, po jednym slajdzie na raz. Włóż szkiełko do kosza do mycia i umieść kosz w naczyniu do mycia wypełnionym dH2O. Przesuwaj ruszt w górę i w dół, aby umyć szkiełka 3-5 razy.

3. Test ISH

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Wstępnie podgrzej 50-krotny bufor do płukania w inkubatorze o temperaturze 40 °C przez 20 minut. Wymieszaj 2,94 l dH2O i 60 ml 50 razy buforu do płukania, aby uzyskać 1 x bufor do płukania.
    2. Przygotować 50% roztwór do barwienia hematoksyliny, dodając 100 ml hematoksyliny Gilla I do 100 mldH2O. Przygotować 0,02% (w/v) wody amoniakalnej, dodając 1,43 ml 1 N wodorotlenku amonu do 250 ml dH2O. Dobrze wymieszać w pojemniku.
    3. Umieść sondy i odczynniki AMP 0–6 w temperaturze RT 30 minut przed użyciem. Tackę do kontroli wilgotności należy przechowywać w piecu do hybrydyzacji o temperaturze 40 °C.
  2. Procedura ISH
    UWAGA: Aby zbadać ekspresję izoform splicingu Nf1 i obliczyć wartość procentu splicingu (PSI) dla eksonu 23a, stosuje się trzy różne sondy ISH, które celują w izoformę zawartą w eksonie 23a, izoformę wykluczoną z eksonu 23a lub obie izoformy (Rysunek 2). Sondy stosuje się na przylegających do siebie wycinkach tkanek. Aby zapewnić dokładność obliczeń, bardzo ważne jest, aby trzy sekcje tkanki były traktowane dokładnie tak samo na etapach hybrydyzacji, amplifikacji i wykrywania sygnału.
    1. Hybrydyzacja sondy.
      1. Wyjmij szkiełka z rusztu do mycia i strzepnij nadmiar płynu ze szkiełek. Umieść szkiełka w stojaku na plamy.
      2. Użyj ołówka, aby oznaczyć slajdy nazwą sondy. Umieść trzy przylegające do siebie szkiełka tkanki mózgowej, które mają być hybrydyzowane z trzema różnymi sondami Nf1 (Rysunek 2) razem. Wykonaj kolejne kroki w tej samej kolejności slajdów.
      3. Dodaj 4 krople sondy, aby pokryć tkankę. Rób to po jednym slajdzie na raz, aby zapobiec wysychaniu sekcji. Umieść stojak na plamy na tacy kontroli wilgotności i wstaw go do piekarnika o temperaturze 40 °C na 2 godziny.
      4. Umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym. Przy każdym praniu napełnij naczynie do barwienia 200 ml 1x bufora do mycia i umieść w nim ruszt do mycia. Postukaj nadmiarem płynu w ręcznik papierowy po jednym szkiełku na raz i szybko włóż go do kosza do prania. Przesuwaj ruszt przesuwny w górę iw dół w naczyniu 3–5 razy przez 2 minuty przy temperaturze pokojowej.
      5. Do drugiego prania użyj świeżego bufora do mycia.
    2. Wzmocnienie sygnału.
      1. Postukaj w nadmiar bufora do mycia ze szkiełek i umieść je w stojaku na plamy. Dodaj 4 krople AMP 0, aby pokryć tkankę. Umieść stojak na plamy na tacce kontroli wilgotności i wstaw go do piekarnika na 30 minut w temperaturze 40 °C.
      2. Umyj szkiełka dwukrotnie buforem myjącym, jak opisano powyżej.
      3. Powtórz ten krok z AMP 1–6, postępując zgodnie z kolejnością i warunkiem podanym w tabeli 2. Umyj szkiełka dwukrotnie po każdym etapie hybrydyzacji.
    3. Detekcja sygnału
      1. Postukaj w nadmiar bufora do mycia ze szkiełek i umieść je w stojaku na plamy. Dodać 2 μl Fast Red B do 120 μl Fast Red A (w stosunku 1:60) w probówce do mikrowirówki. Dobrze wymieszaj i dodaj, aby całkowicie pokryć część tkanki.
        UWAGA: Całkowita objętość czerwonej mieszanki A/B zależy od liczby i wielkości skrawków tkanki. W przypadku obszaru o wymiarach 0,75'' x 0,75'' na jedną sekcję wystarczy 120 μl. Użyj mieszanki w ciągu 5 minut i unikaj wystawiania mieszanki na bezpośrednie działanie promieni słonecznych lub promieniowania UV.
      2. Zamknąć tackę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór do pojemnika na odpady i natychmiast włożyć szkiełka do stojaka do mycia i umieścić ruszt w naczyniu do mycia wypełnionym wodą z kranu. Ponownie spłucz świeżą wodą z kranu.
  3. Przeciwbarwienie szkiełek
    1. Wyjmij ruszt do mycia z wody z kranu i szybko postukaj w chłonny papier, aby usunąć nadmiar wody. Włóż stojak do 50% roztworu barwiącego hematoksyliną i natychmiast przesuń stojak kilka razy w górę iw dół. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś ruszt na suwak z powrotem do naczynia na wodę z kranu. Umyj 3-5 razy, przesuwając ruszt w górę iw dół i zmieniając świeżą wodę z kranu, aż szkiełka staną się przezroczyste, podczas gdy tkanki mózgowe pozostaną fioletowe.
    3. Przenieś ruszt do naczynia zawierającego 0,02% wody amoniakalnej. Przesuń stojak w górę i w dół 2-3 razy, aż chusteczki zmienią kolor na niebieski. Umyj szkiełka 3–5 razy świeżą wodą z kranu w naczyniu do barwienia.
  4. Montaż próbek
    1. Przenieść ruszt do szkiełek z naczynia do barwienia do inkubatora o temperaturze 60 °C i inkubować przez co najmniej 15 minut, aż szkiełka całkowicie wyschną.
    2. Umieścić 40 μl podłoża mocującego na szkiełku podstawowym i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 50 mm na wycinek tkanki. Suche zjeżdżalnie na powietrzu przez 30 minut w RT.

4. Gromadzenie i analiza danych

UWAGA: Użyj skanera slajdów, aby zeskanować obrazy w 40-krotnym powiększeniu.

  1. Kontrole dodatnie i ujemne
    1. Dla każdego eksperymentu uwzględnij kontrole pozytywne i negatywne (Rysunek 3). Jako dobra kontrola pozytywna, sygnał powinien być widoczny jako punktowe kropki w powiększeniu 20-40X.
    2. Użyj myszy (mm)-PPIB-1ZZ jako kontroli pozytywnej. Ta sonda jest ukierunkowana na powszechny gen porządkowy PPIB. W przypadku kontroli ujemnej dopuszczalna jest jedna kropka na każde 20 komórek wykazujących barwienie tła na 20-krotne pole mikroskopu.
    3. Użyj sondy DapB-1ZZ jako kontroli negatywnej. Ta sonda celuje w bakteryjny gen dapB. Te sondy kontrolne były używane w wielu testach ISH19.
  2. Detekcja i analiza sygnałów wzorców ekspresji AS eksonu 23a Nf1
    1. Ponieważ sygnały hybrydyzacji są oznaczone jako kropki punktowe, policz kropki ręcznie. Liczba kropek jest skorelowana z poziomem transkryptów, który jest wykrywany przez określoną sondę. Należy pamiętać, że liczba punktów może być również analizowana przez oprogramowanie ImageJ lub SpotStudio.
    2. Użyj trzech sond, aby zhybrydyzować się z izoformami zawierającymi ekson 23a, eksonem 23a lub całkowitymi transkryptami Nf1 (Rysunek 2). Ponieważ trzy sondy nie mogą być używane jednocześnie, użyj trzech sąsiednich odcinków tkanki mózgowej do hybrydyzacji z każdą sondą.
      1. Aby obliczyć procent splicingu (PSI) dla eksonu 23a, policz liczbę komórek i kropek w kilku regionach mózgu. Dla każdego obszaru zainteresowania policz ponad 400 komórek z kilku podregionów, jak wskazano na Rysunek 4.
      2. Zbierz dane z tych samych podregionów dla każdej z trzech sond. Obliczać PSI jako liczbę kropek na komórkę za pomocą sondy inkluzji eksonu 23a/(liczba kropek na komórkę z sondą inkluzyjną eksonu 23a + liczba kropek na komórkę z sondą pomijającą ekson23a) x 100%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BaseScope ISH został przeprowadzony przy użyciu trzech szczepów myszy: myszy typu dzikiego CD1, myszy typu dzikiego C57BL/6J i myszy z mutacją Nf123aIN/23aIN w tle C57BL/6J, w którym ekson 23a jest zawarty we wszystkich typach komórek w wyniku zmodyfikowanych mutacji miejsca splicingu14,15.

Pierwszym krokiem było przetestowanie systemu testowego ISH p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy komunikat informuje o użyciu BaseScope RNA ISH do badania wzorców ekspresji AS w sekcjach mózgu myszy. Wykazano, że antysensowne sondy złączowe egzon-ekson krótszy niż 50 nukleotydów mogą celować w inkluzję eksonu i pomijanie izoform w sposób solidny i specyficzny. Co więcej, uzyskane sygnały można wykorzystać do obliczenia PSI alternatywnego eksonu.

W procedurze przetestowano kilka wariantów. Na przykład przetestowano zamrożone skrawki tkanek wygenerowane przez cięcie kriostatu i wy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B to H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 to Z.W.], National Institutes of Health [Office of Research Infrastructure Shared Instrumentation Grant S10RR031845 dla Light Microscopy Imaging Facility na Case Western Reserve University] oraz China Scholarship Council [dla X.G.].
Autorzy dziękują Richardowi Lee z Light Microscopy Imaging Core za jego pomoc w skanowaniu preparatów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Hybrid OvenZaawansowana diagnostyka komórek241000ACD
Taca do kontroli wilgotności (z pokrywką)Zaawansowana diagnostyka komórek310012
Płyta grzejnaFisher Scientific1160049SH
Inkubator ogólnego przeznaczenia Imperial IIILab-Line302
Skaner slajdówLeicaSCN400
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
< strong>Zestaw do leczenia wstępnegoAdvanced Cell Diagnostics322381
HydrogenPeroxide Cell Diagnostics2000899
Protease III*Zaawansowana diagnostyka komórkowa2000901
10x Target RetrievalZaawansowana diagnostyka komórek2002555
BaseScope Detection RelingKitZaawansowana diagnostyka komórek332910
AMP 0Zaawansowana diagnostyka komórek2001814
AMP 1Zaawansowana diagnostyka komórek2001815
AMP 2Zaawansowana diagnostyka komórek2001816
AMP 3Zaawansowana diagnostyka komórek2001817
AMP 4Zaawansowana diagnostyka komórek16229B
AMP 5-CZERWONYZaawansowana diagnostyka komórkowa16229C
AMP 6-REDZaawansowana diagnostyka komórek2001820
zaawansowana diagnostyka komórekRED-A2001821
zaawansowana diagnostyka komórekRED-B16230F
50x Bufor do płukaniaZaawansowana diagnostyka komórek310091
Sonda kontroli ujemnej - mysz DapB-1ZZZaawansowana diagnostyka komórkowa701021
Sonda kontroli pozytywnej - Mysz (mm)-PPIB-1ZZZaawansowana diagnostyka komórkowa701081
kontrola myszy ślizgowej Granulka komórek 3T3Zaawansowana diagnostyka komórek310045
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Inne materiały
Papier nawilżającyZaawansowana diagnostyka komórek310015
Stojak do myciaMaster Tech Scientific9837976
Mycie naczyńAmerican Master Tech ScientificLWS20WH
Hydrofobowy długopis barierowyVector LaboratoryH-4000
Szkiełka szklaneFisher Scientific12-550-15
Szkło nakrywkowe, 24 mm x 50 mmFisher Scientific12--545-F
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
Wodorotlenek amonuFisher Scientific002689
100% etanol (EtOH)Decon Labs2805
roztwór formaldeFisher ScientificSF94-4
Hematoksylina IAmerican Master Tech Scientific17012359
Medium montażoweVector LabsH-5000
KsylenFisher Scientific173942
Stain Rack Zaawansowana diagnostyka komórek 310017 Szybka Szybka American

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
  3. Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
  4. Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806(2015).
  5. Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
  6. Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
  7. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114(2014).
  8. Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
  9. Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
  10. Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
  11. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  12. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  13. Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
  14. Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
  15. Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
  16. Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
  17. Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
  18. Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  19. Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  20. Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alternative Splicing AnalysisRNA In Situ HybridizationBaseScope TechnologyExon Inclusion DetectionExon Skipping DetectionPercent Spliced In CalculationMouse Brain SectionsNF1 Exon 23aProbe HybridizationSignal Amplification

Related Articles