Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

DOI:

10.3791/57932

⸱

24 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy and Horticulture and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska-Lincoln, 2USDA-ARS, Wheat, Sorghum and Forage Research Unit, University of Nebraska-Lincoln East Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer

.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania mikrobiomu roślin i gleby stają się coraz ważniejsze dla zrozumienia ról mikroorganizmów w wydajności rolnictwa. Celem tego manuskryptu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat szybkiego pobierania próbek gleby, ryzosfery i endosfery z replikowanych prób terenowych oraz analizowania zmian, które mogą wystąpić w zbiorowiskach drobnoustrojów w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Eksperyment wykorzystany do zademonstrowania tych metod składa się z odtworzonych poletek polowych zawierających dwie czyste trawy o ciepłym sezonie (Panicum virgatum i Andropogon gerardii) oraz mieszankę traw o niskiej różnorodności (A. gerardii, Sorghastrum nutans i Bouteloua curtipendula). Krótko mówiąc, rośliny są wykopywane, różne korzenie są wycinane i umieszczane w buforze fosforanowym, a następnie wstrząsane w celu zebrania ryzosfery. Korzenie są przenoszone do laboratorium na lodzie i sterylizowane powierzchniowo wybielaczem i etanolem (EtOH). Ryzosfera jest filtrowana i zagęszczana przez wirowanie. Wykopaną ziemię z okolic bryły korzeniowej umieszcza się w plastikowych workach i przenosi do laboratorium, gdzie pobierana jest niewielka ilość gleby do ekstrakcji DNA. DNA jest ekstrahowane z korzeni, gleby i ryzosfery, a następnie amplifikowane starterami dla regionu V4 genu 16S rRNA. Amplikony są sekwencjonowane, a następnie analizowane za pomocą narzędzi bioinformatycznych o otwartym dostępie. Metody te pozwalają naukowcom przetestować, w jaki sposób różnorodność i skład zbiorowisk drobnoustrojów zmienia się w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Wykorzystując te metody wraz z modelami statystycznymi, reprezentatywne wyniki pokazują, że istnieją znaczące różnice w zbiorowiskach mikrobiologicznych korzeni, ryzosfery i gleby. Przedstawione tutaj metody zapewniają pełny zestaw kroków do zbierania próbek terenowych, izolowania, ekstrakcji, kwantyfikacji, amplifikacji i sekwencjonowania DNA oraz analizowania różnorodności i składu społeczności drobnoustrojów w replikowanych badaniach terenowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania mikrobiomu mają ważne implikacje dla zrozumienia i manipulowania procesami ekosystemowymi, takimi jak obieg składników odżywczych, obrót materią organiczną oraz rozwój lub hamowanie patogenów glebowych1,2. Ten obszar badań ma również ogromny potencjał w zakresie zrozumienia wpływu mikroorganizmów glebowych na produktywność naturalnych zbiorowisk roślinnych i agroekosystemów. Podczas gdy istnieje wiele badań, które koncentrowały się na mikrobiomie glebowym w naturalnych ekosystemach, mniej skupiało się na mikroorganizmach ryzosfery roślinnej i endosfery w agroekosystemach3. W Nebrasce rolnictwo dominuje w krajobrazie w dużej części stanu, co sprawia, że badania tych gleb, na których uprawia się rośliny ważne dla rolnictwa, są istotnym tematem badań. Celem niniejszej pracy metodologicznej jest dostarczenie naukowcom standardowego zestawu protokołów do opisu drobnoustrojów obecnych w agroekosystemach, określenia, w jaki sposób korzenie roślin modyfikują społeczności drobnoustrojów w ryzosferze i endosferze, a ostatecznie zrozumienia funkcji, jakie te drobnoustroje odgrywają w zdrowiu gleby i produktywności roślin.

Przedstawiona tutaj metoda różni się nieznacznie od metod używanych przez inne4,5 tym, że ten artykuł ma na celu poznanie, które mikroby znajdują się wyłącznie wewnątrz korzenia i czym różnią się od mikrobów znajdujących się bezpośrednio poza korzeniem w ryzosferze. Sekwencjonowanie amplikonów zastosowane w tym badaniu identyfikuje taksony drobnoustrojów znalezione w próbce DNA i pozwala badaczom określić, jak zmieniają się społeczności w zależności od rodzaju próbki lub traktowania. Jedną z kluczowych różnic między tym protokołem a bardzo podobnym protokołem używanym przez Lundberga i wsp.6 jest to, że zamiast sonikacji, ten protokół wykorzystuje sterylizację powierzchni za pomocą wybielacza i etanolu w celu usunięcia ryzosfery z korzeni. Inni również skutecznie stosowali sterylizację powierzchni7,8,9,10. Metody te nie są korzystniejsze niż inne metody, ale nieco inne. Metody te szczególnie dobrze nadają się do dużych eksperymentów terenowych, ponieważ przy wystarczającej liczbie osób możliwe jest przetworzenie ponad 150 poletek polowych dziennie, co daje około 450 próbek po podziale na endosferę, ryzosferę i glebę. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metody stosowane do pobierania próbek w terenie, przetwarzania materiału w laboratorium, ekstrakcji i sekwencjonowania DNA, a także zawiera krótki przegląd kroków do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opis strony pola

  1. Proszę opisać eksperymentalne stanowiska polowe w okresach zbioru. Określ lokalizację pola (szerokość, długość i wysokość) za pomocą GPS.
  2. Opisz głębokość pobierania próbek, czas pobierania próbek i teksturę gleby.
  3. Czynniki środowiskowe odgrywają ważną rolę w kształtowaniu zbiorowisk drobnoustrojów. Rejestruj informacje o klimacie, takie jak średnia roczna temperatura, roczne opady, płodozmian z poprzednich lat, praktyki uprawowe, metoda nawożenia i historia terenu pola. Zautomatyzowane stacje pogodowe lub inne urządzenia są przydatne do rejestrowania dziennych opadów deszczu i temperatury w sezonie wegetacyjnym.

2. Pobieranie i przetwarzanie próbek gleby, ryzosfery i pól korzeniowych

  1. Wykopywanie roślin.
    1. Oznaczyć miskę do mycia i wiadro karteczką samoprzylepną zawierającą informacje o materiale roślinnym, z którego należy pobrać próbki. Uwzględnij informacje, takie jak numer działki, genotyp rośliny i gatunek rośliny. Zanieś oznaczone wiadro na działkę i pozostaw miskę myjącą na ustalonym stanowisku pracy w terenie.
    2. Przebij glebę łopatą na głębokość 30 cm, aby przeciąć dowolny z bocznych korzeni utrzymujących roślinę w glebie. Przybliżona objętość to 18 cm3. Losowo wybierz i zbierz dwie rośliny na działkę z różnych obszarów na działce.
    3. Wykop korzenie rośliny, wykorzystując łopatę i umieść bryłę korzeniową w oznaczonym wiadrze. Przynieś oznaczone etykietą wiadro z wykopaną bryłą korzeniową z powrotem do stanowiska pracy na polu. Odetnij i wyrzuć nadziemną biomasę roślinną.
  2. Usuwanie gleby z korzeni i zbieranie gleby luzem.
    1. Potrząśnij korzeniami, aby ręcznie usunąć ziemię lub użyj łopaty lub ręcznego rumpla, aby usunąć ziemię z korzeni. Potrząsanie korzeniami wystarczy, aby usunąć glebę na glebach bardzo piaszczystych. Załóż rękawice i umieść korzenie w pobliżu stacji przetwarzania.
    2. Po potrząśnięciu korzeniami większość gleby znajdzie się w garnku. Wymieszaj ziemię na patelni myjącej i rozbij wszelkie grudki gleby za pomocą ręcznego glebogryzarki. Umieść próbkę gleby, która jest wolna od zanieczyszczeń, w oznakowanej torbie do przechowywania na suwak o wymiarach 17,7 x 19,5 cm i umieść w chłodnym miejscu lub na lodzie.
  3. Kolekcja korzeni i ryzosfery.
    1. Za pomocą nożyczek do przycinania wysterylizowanych w 70% EtOH wytnij różne korzenie, około 4 do 6 korzeni na roślinę, a każdy korzeń ma około 9 - 12 cm długości. Umieść wycięte korzenie (przycinając w razie potrzeby, aby pasowały) w oznakowanej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 35 ml autoklawowanego buforu fosforanowego (6,33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L Na2HPO4 bezwodnego, pH = 6,5, 200 μl/L środka powierzchniowo czynnego).
      Uwaga: Środek powierzchniowo czynny (patrz Tabela Materiałów) został dodany po autoklawowaniu buforu fosforanowego. Objętość bryły korzeniowej i długość korzeni różnią się w zależności od wieku rośliny i gatunku rośliny.
    2. Potrząsaj rurkami przez 2 minuty, aby uwolnić ryzosferę z powierzchni korzeni. Za pomocą kleszczy wysterylizowanych w 70% EtOH usuń korzenie z probówki, krótko osusz ręczniki papierowe i umieść w nowej, oznaczonej probówce o pojemności 50 ml. Umieść na lodzie zarówno probówkę zawierającą ryzosferę, jak i rurkę zawierającą korzenie.

3. Przetwarzanie próbek terenowych w laboratorium

  1. Sterylizacja powierzchniowa korzeni po zbiorze polowym.
    Uwaga: Sterylizację powierzchni należy przeprowadzić jak najszybciej po powrocie z pola. Jeśli nie jest możliwa sterylizacja powierzchniowa korzeni tego samego dnia, należy przechowywać korzenie w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
    1. Dodaj około 35 ml 50% wybielacza + 0,01% Tween 20 do 50 ml probówek korzeniowych zebranych na polu. Potrząsaj probówkami o pojemności 50 ml przez 30 do 60 sekund. Odlej 50% wybielacza i dodaj 35 ml 70% EtOH. Wstrząsaj przez kolejne 30 do 60 sekund.
    2. Odlej 70% EtOH i dodaj 35 ml sterylnej, ultraczystej wody. Wstrząsaj przez 1 minutę. Powtórz mycie wodą jeszcze dwa razy.
      Uwaga: Aby upewnić się, że nasza sterylizacja powierzchni jest wystarczająca, pobraliśmy próbki wody z ostatniego płukania i nie zaobserwowaliśmy wzrostu bakterii (P. Wang, dane niepublikowane, 2014). Inni badacze przetestowali skuteczność sterylizacji korzeni przy użyciu podobnych metod9,10.
    3. Osusz korzenie na czystych ręcznikach papierowych. Użyj czystego ręcznika papierowego do każdej próbki.
      Uwaga: Ręczniki papierowe można wysterylizować przed użyciem. Nie sterylizujemy naszych ręczników papierowych. Używamy jednak 1 ręcznika papierowego na próbkę i trzymamy ręczniki owinięte do czasu użycia.
    4. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek do przycinania pokrój korzenie na około 5 mm kawałki i umieść pocięte korzenie w czystej, oznakowanej stożkowej tubie o pojemności 15 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich dalszej obróbki.
  2. Przetwarzanie próbek ryzosfery.
    1. Wstrząśnij probówkami o pojemności 50 ml zawierającymi próbki ryzosfery z pola w celu ponownego zawieszenia całej próbki. Za pomocą sterylnego sitka o siatce 100 μm (patrz tabela materiałów) przefiltruj zawieszoną próbkę do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Odwirować probówki o masie 3000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlewać i wyrzucić supernatant.
    3. Umieść granulki ryzosfery w probówkach o pojemności 50 ml na lodzie. Dodaj 1,5 ml sterylnego buforu fosforanowego (bez środka powierzchniowo czynnego) do granulek ryzosfery i wiruj do zawieszenia.
    4. Odpipetuj zawieszoną ciecz do czystej, oznakowanej probówki do mikrofuge o pojemności 2 ml. Wirować probówki o sile 15 871 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlej sklarowany sklarent i opróżnij probówki na czystych ręcznikach papierowych.
    5. Przechowywać granulki w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki.
      Uwaga: Kroki 3.2.2 - 3.2.4 mają na celu zmniejszenie rozmiaru probówki do przechowywania próbki. Przechowywanie mniejszych probówek o pojemności 2 ml jest bardziej efektywne w porównaniu z probówkami o pojemności 50 ml.
  3. Przetwarzanie próbek gleby do ekstrakcji DNA i analizy gleby.
    1. Za pomocą sterylnej metalowej szpatułki napełnij czystą, oznakowaną probówkę o pojemności 2 ml około 3 g gleby do ekstrakcji DNA. Unikaj małych kawałków korzeni i zanieczyszczeń. Przechowuj tę próbkę gleby w temperaturze -20 °C. Przepłucz metalową szpatułkę w 70% EtOH między każdą próbką.
    2. Na czystej patelni opróżnij worek z ziemią do ułożonych w stos sitek (patrz tabela materiałów), większe sito na mniejszym sicie i ręcznie przesiej ziemię przez oba sita. Użyj szczotki, aby dokładnie wyczyścić sita między próbkami.
    3. Odłóż od 100 do 125 g przesianej gleby w torbie zapinanej na zamek błyskawiczny o wymiarach 17,7 x 19,5 cm do przyszłej analizy fizykochemicznej i tekstury gleby. Umieścić worki z ziemią w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania.
  4. Przetwarzanie próbek gleby pod kątem wilgotności gleby.
    1. Wytaruj oznaczoną brązową papierową torbę na wadze. Odmierz od 40 do 45 g przesianej ziemi do brązowej papierowej torby. Zapisać wagę brązowej torby papierowej i zabrudzenia na karcie katalogowej i umieścić torebki w suszarce nastawionej na 55 - 60 °C.
    2. Po 72 godzinach wyjmij torebki z suszarki. Pozwól workom z ziemią ostygnąć przez co najmniej 30 minut, a następnie zważ.
    3. Aby zapisać wagę, wytaruj wagę do zera i umieść brązowe papierowe torby na wadze. Obliczyć procentową zawartość wilgotności gleby dla każdej próbki, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-1
      Uwaga: Metoda wilgotności gleby pochodzi z Kellogg Biological Station Long Term Ecological Research (KBS LTER). KBS LTER udostępnia na swojej stronie internetowej (https://Lter.kbs.msu.edu/) szeroką gamę uznanych protokołów dla badaczy.

4. Przygotowanie przetworzonych próbek korzeni do ekstrakcji DNA.

  1. Zmielić zamrożony materiał korzeniowy tak, aby próbka była jednorodna.
    1. Wlać ciekły azot do plastikowej zlewki z czystymi szpatułkami oraz do czystego moździerza i tłuczka, aby próbki były zamrożone przez cały proces mielenia.
    2. Zamrożoną chusteczkę umieścić w moździerzu i zmielić tłuczkiem na drobny proszek. Stale dodawaj ciekły azot podczas mielenia, aby utrzymać próbki w stanie zamrożonym.
    3. Za pomocą szpatułki umieść zmieloną tkankę w czystej, oznakowanej probówce o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja DNA z próbek gleby i ryzosfery w formacie 96-dołkowym

  1. Ładowanie próbek gleby do płytek 96-dołkowych.
    1. Przetrzyj obszar roboczy 70% EtOH i 1% wybielaczem. Podczas wykonywania tych czynności należy nosić rękawice laboratoryjne. Wyjąć próbki gleby z magazynu w temperaturze -20 °C i pozostawić do rozmrożenia w pojemniku na lód.
    2. Zdejmij pokrywę maty uszczelniającej z 96-dołkowej płytki ekstrakcyjnej, która jest dostarczana z zestawem do ekstrakcji DNA. Umieść pokrywę maty uszczelniającej między 2 chusteczkami papierowymi, aby utrzymać ją w czystości, gdy nie są używane. Aby uniknąć zanieczyszczenia, użyj samoprzylepnych 8-dołkowych pasków PCR, aby przykryć 12 kolumn 96-dołkowej płytki ekstrakcyjnej.
    3. Wytaruj sterylny lejek wagowy (rozmiar SM) na wadze i odważ od 200 do 250 mg gleby.
      Uwaga: Te sterylne lejki są spłaszczone z jednej strony, więc lejek leży płasko na skali. Lejek wypełnia się ziemią i umieszcza bezpośrednio w studni. Technika ta pozwala uniknąć utraty próbek, minimalizuje rozlewanie i zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    4. Aby odsłonić pierwszą studzienkę płytki ekstrakcyjnej, ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny do góry, umieść szyjkę napełnionego lejka wagowego w odpowiednim dołku i delikatnie wprowadź próbkę gleby do odpowiedniego dołka. Wymień pasek samoprzylepny, aby zakryć studnię.
    5. Powtórz ten proces dla każdego dołka płytki, używając nowego, sterylnego lejka dla każdej próbki, aż do napełnienia płytki. Pozostaw jedną studzienkę pustą jako ślepą kontrolę ekstrakcyjną.
      Uwaga: Na każdej płytce ekstrakcyjnej pozostawia się jedną studzienkę, która służy jako kontrola ujemna (ślepa). Kontroluje to zanieczyszczenia, które mogą być obecne w odczynnikach zestawu11.
    6. Założyć pokrywę maty uszczelniającej na płytkę ekstrakcyjną i przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowa do ekstrakcji DNA.
  2. Ładowanie próbek ryzosfery do 96-dołkowych płytek.
    1. Wyjąć próbki ryzosfery z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i pozostawić do rozmrożenia w pojemniku na lód.
    2. Postępuj zgodnie z krokiem 5.1.2 powyżej, aby przygotować płytkę do ekstrakcji DNA.
    3. Umieść czystą chusteczkę papierową na wadze, a następnie wytaruj sterylną metalową szpatułkę na wadze. Za pomocą szpatułki ostrożnie wyjąć część osadu ryzosfery z probówki na próbkę. Włożyć szpatułkę z powrotem do wagi i zważyć od 200 do 250 mg próbki ryzosfery.
    4. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny, aby odsłonić pierwszą studzienkę płytki ekstrakcyjnej, skieruj wypełnioną szpatułkę do dołka i zeskrob materiał ryzosfery do odpowiedniego dołka sterylną wykałaczką.
    5. Opłucz metalową szpatułkę w wodzie, a następnie dodaj 70% EtOH między próbkami. Powtórz ten proces dla każdej studzienki płytki, aż płytka zostanie napełniona, pozostawiając jedną studzienkę pustą jako ślepą próbę ekstrakcyjną.
  3. Ekstrakcja DNA z ryzosfery i próbek gleby w formacie 96-dołkowym.
    1. Ekstrahuj DNA gleby i ryzosfery za pomocą zestawu zoptymalizowanego pod kątem gleby (patrz tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Używamy tego specjalnego zestawu do izolowania DNA gleby i ryzosfery ze względu na zdolność zastrzeżonych odczynników do usuwania kwasu humusowego i innych silnych inhibitorów PCR znajdujących się w glebie.
  4. Kwantyfikacja DNA.
    1. Określ ilościowo 92 próbki i 4 stężenia wzorców za pomocą zestawu (patrz tabela materiałów; normy są dołączone), zgodnie z protokołem producenta.
    2. Określić ilościowo pozostałe 4 próbki, które zostały usunięte z płytki w celu umieszczenia studzienek dla czterech wzorców, za pomocą zestawu (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.

6. Ekstrakcja DNA z próbek korzeniowych w formacie 96-dołkowym.

  1. Ładowanie próbek korzeni do płytek 96-dołkowych.
    1. Przetrzyj obszar roboczy 70% EtOH i 1% wybielaczem. Podczas wykonywania tych czynności noś rękawice.
    2. Zmielone próbki korzeni należy zawsze przechowywać w stanie zamrożonym, umieszczając je w wiadrze z suchym lodem.
    3. Napełnij plastikową zlewkę ciekłym azotem i umieść antystatyczne mikroszpatułki i sterylne lejki wagowe (rozmiar XSM) w plastikowej zlewce, aby ostygły.
    4. Zdejmij pokrywę maty uszczelniającej z 96-dołkowej płytki koralików ekstrakcyjnych, która jest dostarczona z zestawem, i umieść ją między 2 chusteczkami papierowymi, aby utrzymać ją w czystości, gdy nie jest używana.
      Uwaga: Nowsza wersja tego zestawu, wydana po czasie, w którym przeprowadziliśmy te ekstrakcje DNA, wymaga od użytkownika dostarczenia płytek z kulkami ekstrakcyjnymi. W Tabeli materiałów podaliśmy informacje katalogowe dostawcy potrzebne do zamówienia tych przedmiotów.
    5. Aby uniknąć zanieczyszczenia, użyj samoprzylepnych 8-dołkowych pasków PCR, aby przykryć 12 kolumn 96-dołkowej płytki ekstrakcyjnej.
    6. Umieść płytkę koralikową ekstrakcyjną na suchym lodzie, aby próbki w studzienkach były zamrożone.
    7. Ostrożnie podnieś pasek samoprzylepny do góry, aby odsłonić pierwszą studzienkę płytki ekstrakcyjnej, umieść szyjkę napełnionego lejka wagowego w odpowiednim dołku i dodaj 3 miarki szpatułki zmielonej tkanki korzeniowej. Wymień pasek samoprzylepny, aby zakryć studzienkę.
      Uwaga: Gleba i ryzosfera są rozmrażane na lodzie przed ważeniem, podczas gdy materiał roślinny jest ważony w stanie zamrożonym. Zamrożona tkanka roślinna, zwłaszcza w niewielkich ilościach, jest trudna do zważenia na wadze bez rozmrażania. Przeprowadzono testy wagowe na zmielonej tkance korzeniowej, aby określić, ile miarek szpatułkowych jest wystarczających. Należy pamiętać, że producent zestawu nie wymaga dokładnej ilości tkanki, ale zaleca około 50 mg. Różne typy próbek roślin będą się różnić, a użytkownik będzie musiał określić odpowiednią ilość.
    8. Powtarzaj ten proces dla każdej studzienki płytki, aż płytka zostanie napełniona.
    9. Przechowywać płytkę w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będzie gotowa do ekstrakcji DNA.
  2. Ekstrakcja DNA z tkanki korzeniowej.
    1. Ekstrahować DNA za pomocą zestawu zoptymalizowanego dla roślin (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Używamy tego zestawu, który został zaprojektowany specjalnie dla tkanek roślinnych, aby osiągnąć maksymalne plony z próbek korzeniowych. W przeciwieństwie do gleby i ryzosfery, kwas humusowy i inne zanieczyszczenia stanowią mniejszy problem dla tkanki korzeniowej.
  3. Określ ilościowo DNA jak w kroku 5.4.

7. Amplifikacja i sekwencjonowanie wyizolowanego DNA.

  1. Amplifikować region V4 genu 16S za pomocą polimerazy z odczytem próbnym (patrz tabela materiałów), jak opisano w Gohl i wsp.12 próbek kodów kreskowych z różnymi starterami indeksującymi i pulą przed sekwencjonowaniem. Sekwencja przy użyciu metod opisanych przez Gohl et al12 przy użyciu dwuetapowego procesu PCR ze starterami V4 (plik uzupełniający 1).
    Uwaga: Niektóre z metod dla tych kroków są szczegółowo opisane w innym miejscu12,13,14 i dlatego nie zostaną tutaj opisane. Do próbek korzeniowych dodano blokery PNA w celu zmniejszenia ilości plastydowego DNA amplifikowanego z tkanki roślinnej, co wcześniej zostało w pełni opisane15. W sekwencjonowaniu wykorzystano dwie kontrole, kontrolę negatywną, która obejmowała próby ślepej próby płytki ekstrakcyjnej (patrz uwaga po kroku 5.1.5) oraz próbną społeczność znanej populacji bakteryjnego DNA (patrz tabela materiałów), która służyła jako kontrola pozytywna.
    Uwaga: W większości przypadków zestawy odczynników MiSeq v3 są używane w trybie sparowanego końca 2 X 300. W przypadku próbek w tym rękopisie Illumina HiSeq 2500 został użyty w trybie szybkim z trybem 250 Paired-end (2 x 250). Wszystkie próbki zostały zsekwencjonowane na tym samym pasie.
  2. Przetwarzaj dane sekwencjonowania za pomocą potoku do analiz społeczności drobnoustrojów (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 i RStudio v3.4.3 16).
    1. Przygotuj dane sekwencjonowania za pomocą USEARCH17.
      Uwaga: USEARCH jest dostępny online z pełnymi instrukcjami (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. Demultipleksuj dane sekwencjonowania za pomocą odczytów indeksowych lub kodów kreskowych, aby przypisać odczyty Illumina do próbek.
    3. Scal odczyty sparowanych końców, aby uzyskać sekwencje konsensusu. Użyj polecenia: usearch -fastq_mergepairs *R1*.fastq -relabel @ -fastq_maxdiffs 10 -fastq_minmergelen 230 -fastq_maxmergelen 320 -fastq_pctid 80 -fastqout merged.fq.
      Uwaga: Parametry ustawia się poprzez odniesienie do instrukcji obsługi USEARCH.
    4. Usuń startery z danych sekwencjonowania, aby uniknąć podstawień w sekwencjach starterów, które mogą być spowodowane reakcją PCR. Użyj polecenia: usearch -fastx_truncate merge.fq -stripleft 19 -stripright 20 -fastqout stripped.fq.
    5. Filtruj dane sekwencjonowania, aby usunąć odczyty o niskiej jakości i zachować wysoką jakość sekwencji operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU). Użyj polecenia: usearch -fastq_filter stripped.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout filtered.fa.
  3. Generuj OTU w USEARCH.
    1. Wykonaj dereplikację, aby zidentyfikować zestaw unikatowych sekwencji OTU. Użyj polecenia: usearch -fastx_uniques filtered.fa -fastaout uniques.fa -sizeout -relabel Uniq.
    2. Klastruj OTU z 97 – 100% podobieństwem sekwencji, aby wyznaczyć unikalne OTU. Użyj polecenia: usearch -cluster_otus uniques.fa -minsize 2 -otus otus.fa -relabel Otu.
      Uwaga: Ten krok obejmuje również usuwanie singletonów z klastrowych OTU oraz usuwanie chimer z danych sekwencjonowania.
    3. Utwórz tabelę OTU w USEARCH. Użyj polecenia: usearch -usearch_global stripped.fq -db otus.fa -strand plus -id 0.97 -otutabout otutable.txt.
      Uwaga: To polecenie generuje tabelę z liczbą odczytów (zliczeń) wszystkich OTU dla każdej próbki. Tabela OTU jest używana do dalszych etapów, w tym analiz różnicowej liczebności i analiz różnorodności mikrobiologicznej. Przykładowa tabela OTU jest pokazana na rysunku uzupełniającym 2.
    4. Przeprowadź analizę rozrzedzenia w QIIME v1.9.1 18.
      Uwaga: Krzywa rozrzedzenia jest obliczana przy użyciu tabeli OTU w celu określenia, czy głębokość sekwencjonowania prawidłowo próbkuje społeczność drobnoustrojów. Przykłady krzywych rozrzedzania przedstawiono na rysunku uzupełniającym 3.
    5. Przeprowadź analizę różnorodności alfa18. Użyj alpha_rarefaction.py w QIIME v1.9.1, aby obliczyć różnorodność społeczności drobnoustrojów w każdej próbce.
      Uwaga: Ta analiza oblicza wskaźniki różnorodności, takie jak Shannon19, Simpson20 i Chao121.
    6. Przeprowadź analizę różnorodności beta18,22. Użyj skryptu języka Python: beta_diversity_through_plots.py w QIIME v1.9.1 Macierz odmienności Braya-Curtisa.
      Uwaga: W tej analizie porównano skład zbiorowiska drobnoustrojów między próbkami.
    7. Przeprowadzanie analiz statystycznych między grupami. Użyj macierzy odległości obliczonych dla PERMONOVA przy użyciu funkcji adonis i anova w pakiecie wegańskim23 v2.4.5 w RStudio16. Przeprowadź analizę kanoniczną współrzędnych głównych (CAP) za pomocą funkcji capscale w pakiecie wegańskim. Wizualizacja danych przy użyciu ggplot2 package24 v2.2.1 w RStudio.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki przedstawione w tym manuskrypcie pochodzą z terenu założonego w 2012 roku na farmie University of Nebraska-Lincoln Agriculture Research Division w pobliżu Mead, NE. Przed eksperymentem miejsce to było zarządzane jako płodozmian kukurydziano-soi. Stanowisko badawcze znajdowało się na trzech różnych typach gleb, ale dane analizowano tak, jakby wszystkie zmiany w mierzonych właściwościach gleby były spowodowane nałożonymi zabiegami.

Teren pola zawierał dwa, czyste, stanowiska proso rózgowatego (P. virgatum cv Liberty) i dużego bluestem (A. gerardii), a także mieszankę traw o niskiej różnorodności, zawierającą trawę dużą, trawę indyjską (S. nutans) i 'Butte' sideoats grama (B. curtipendula). Trzy poletka trawiaste w ciepłym sezonie były w losowym projekcie kompletnego bloku, który został trzykrotnie powtórzony. Na trzech różnych poletkach trawiastych zagnieżdżono dwa zabiegi nawożenia azotem (N), które wyniosły 56 (N1) i 112 (N2) kg N ha-1 zastosowanego mocznika. W momencie pobierania próbek mikrobiomu pod koniec sezonu wegetacyjnego gleba zawierała 8,0 ± 1,1 (średnio ± SD) ppm azotanów na poletkach nawożonych 112 kg N ha-1 i 6,8 ± 0,7 (średnia + SD) ppm azotanów na poletkach nawożonych 56 kg N ha-1. Poletka były nawożone raz w roku. Jako główne poletka (8000 m2) wyznaczono poletka trawiaste w ciepłym sezonie, a poletka N podzielone (4000 m2). Big bluestem został wysiew w proporcji 50:50 odmian 'Bonanza' i 'Goldmine', a Indiangrass został wysiew w proporcji 50:50 odmian 'Scout' i 'Warrior'. Działki zostały obsadzone w 2012 roku, a pierwsza aplikacja N miała miejsce wiosną 2013 roku.

Pobieranie próbek gleby i korzeni zostało przeprowadzone 15 września 2014 roku. Opisane poniżej prace zostały przeprowadzone na polu, które zostało skonfigurowane jako losowy projekt z podzielonym wykresem z trzema powtórzeniami (Rysunek 1). Średnia głębokość sekwencjonowania wszystkich próbek dla endosfery wynosiła: 4871 ± 5711 (średnia ± SD), ryzosfera: 40726 ± 14684, gleba: 38184 ± 9043. Jednym z największych źródeł zmienności w tych eksperymentach, przy użyciu opisanych metod, jest różnica w zbiorowiskach drobnoustrojów występujących między typami próbek (Rysunek 2). W tym reprezentatywnym zbiorze danych ryzosfera i gleba wydają się być bardziej podobne pod względem składu niż endosfera (Rysunek 2A). Stwierdzono jednak również bardzo istotne (p = 0,001) różnice w składzie zbiorowisk mikroorganizmów między ryzosferą a glebą (Rysunek 2B). Całkowita zmienność uwzględniona w tych eksperymentach analizowanych w zależności od rodzaju próby wyniosła 26%.

Analiza różnorodności alfa wykazała, że społeczności mikroorganizmów w endosferze były mniej zróżnicowane pod względem próbki w porównaniu z glebą i ryzosferą (Rysunek 3). Jedyne znaczące różnice w różnorodności między gatunkami traw w dowolnym przedziale dotyczyły próbek endosfery dużego bluestem i proso rózgowatego, przy czym proso rózgowate miało znacznie wyższą różnorodność gatunków mikrobiologicznych (Rysunek 3). Analiza względnej liczebności (Rysunek 4) podkreśla dominację Proteobacteria, a następnie Actinobacteria we wszystkich typach próbek. Gleba i ryzosfera są również zdominowane przez Acidobacteria i Chloroflexi, podczas gdy endosfera miała większą względną obfitość bakteriodetów.

W tym eksperymencie rośliny były uprawiane z dwiema różnymi ilościami nawozu N i dlatego przeanalizowaliśmy dane, aby ustalić, czy wystąpiły efekty leczenia. Efekty leczenia stanowiły 12% całkowitej zmienności, ale nie różniły się istotnie, chociaż w ordynacji obie terapie wyglądają inaczej (Ryc. 5). Podkreśla to znaczenie analiz statystycznych dla tych zbiorów danych, a nie oględzin lub ocen jakościowych.

Różnice w mikrobiomie tkanek roślinnych i gleby pod wpływem roślin zostały zobrazowane za pomocą metody ograniczonego ordynacji. Różnice statystyczne określono za pomocą analizy PERMANOVA w celu zbadania, czy określone zmienne, takie jak gatunki, skutkują znacząco różnym składem zbiorowisk drobnoustrojów między próbkami. Gdy wszystkie typy próbek zostały przeanalizowane razem, stwierdzono bardzo istotną różnicę w składzie zbiorowiska mikroorganizmów ze względu na gatunki roślin (Rysunek 6). W tym eksperymencie wielkość zmienności uwzględnionej w zależności od gatunku rośliny wyniosła 6,7%. Na koniec każdy typ próbki został przeanalizowany indywidualnie w celu określenia, które z typów próbek mogą napędzać znaczący wpływ na gatunki roślin. Jedynie w endosferze zaobserwowano bardzo istotną różnicę (p = 0,001) między składem zbiorowisk mikrobiologicznych różnych gatunków roślin (Ryc. 7). W innych typach próbek wpływ gatunkowy nie był istotny, gdy analizowano go indywidualnie. W endosferze procentowa zmienność ze względu na gatunki wynosiła 27%, podczas gdy była niższa w ryzosferze (18%) i glebie (15%). To dodatkowo podkreśla, jak ważna jest indywidualna analiza każdego typu tkanki.

figure-results-1
Rysunek 1: Przykład projektu pola doświadczalnego. Eksperymentalny projekt terenowy ilustrujący losowy kompletny projekt blokowy w trzech egzemplarzach terenu znajdującego się w University of Nebraska-Lincoln Eastern Nebraska Research and Extension Center w pobliżu Mead, NE. Pełny opis witryny znajduje się w sekcji Wyniki. N1 to niska (56 kg N ha-1 mocznika), a N2 (112 kg N ha-1 mocznika) to wyższa dawka azotu, która została zastosowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza różnorodności beta porównująca skład mikrobiologiczny w różnych typach próbek, w tym endosferze, ryzosferze i glebie, z próbek wieloletnich traw w 2014 r. Analizę przeprowadzono przy użyciu skryptu Pythona w QIIME1.9.1 w celu wytworzenia macierzy odmienności Braya-Curtisa. Analiza głównych współrzędnych (PCoA) w oparciu o macierz odmienności Braya-Curtisa została zwizualizowana w RStudio. PCoA1 i PCoA2 wskazują pierwszą i drugą co do wielkości wariancję wyjaśnioną przez analizę PCoA. Przeprowadzono analizę statystyczną PERMANOVA w celu określenia istotności między typami próbek, a wartość p jest pokazana w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunkach reprezentuje całą społeczność drobnoustrojów dla każdej próbki. (A) Typy próbek endosfery, ryzosfery i gleby analizowano razem. Wszystkie 87 próbek rozrzedzono do 486 sekwencji na próbkę. (B) Próbki ryzosfery i gleby analizowano razem. Wszystkie 59 próbek rozrzedzono za pomocą 8231 sekwencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza różnorodności alfa z wykorzystaniem indeksu Shannona dla każdego gatunku w endosferze, ryzosferze i glebie. Analiza została przeprowadzona przy użyciu skryptu Python w QIIME1.9.1. Rozrzedzenie przeprowadzono odpowiednio dla typów próbek endosfery, ryzosfery i gleby, z 486, 17154 i 8231 sekwencjami na próbkę. Pola wskazują 25. i 75. percentyl (pierwszy i trzeci kwartyl). Pozioma linia w polu oznacza medianę, a czerwony plus pokazuje średnią. Wąsy pokazują zakres danych z wyłączeniem wartości odstających (które są pokazane jako czarne kropki), które spadły ponad 1,5 raza w stosunku do przedziału międzykwartylowego (n = 6 dla każdej próby, z wyjątkiem mieszanki Sideoats grama, gdzie n = 5). Indeks Shannona wszystkich pięciu gatunków w endosferze był niższy zarówno niż ryzosfera, jak i gleba. Do określenia istotności między gatunkami użyto nieparametrycznego testu sumy rang Wilcoxona, a na wierzchu pól pokazano tylko znaczące różnice między gatunkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Względna liczebność na poziomie gromady w endosferze, ryzosferze i glebie. Próbki analizowano w celu porównania liczebności gromad drobnoustrojów między różnymi typami próbek (n = 29 dla każdego typu próbki). Analizę przeprowadzono przy użyciu skryptu Python w QIIME1.9.1 z tabeli OTU. Różne kolory wewnątrz wykresu kołowego oznaczają typ. Wartość procentowa wskazuje względną liczebność każdej gromady w każdym typie próbki. Informacje o typie zostały oznaczone przy użyciu klasyfikatora projektu bazy danych rybosomalnych (RDP)25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza z zastosowaniem traktowania jako czynnika ograniczającego między wszystkimi typami próbek. Przeprowadzono analizę kanoniczną współrzędnych głównych (CAP) w celu ustalenia, czy występują różnice w składzie społeczności drobnoustrojów między traktowanymi lekami. Dla każdego zabiegu N n = 42 dla N1 (56 kg N ha-1) i n = 45 dla N2 (112 kg N ha-1). Macierz odmienności Braya-Curtisa została wygenerowana przy użyciu skryptu Pythona w QIIME1.9.1. Analizę CAP opartą na macierzy odmienności Braya-Curtisa przeprowadzono poprzez ograniczenie leczenia jako czynnika w RStudio. Analizę PERMANOVA przeprowadzono w celu określenia, czy różnice w leczeniu były istotne, a wartość p jest pokazana w prawym górnym rogu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Analiza z wykorzystaniem gatunków roślin jako czynnika ograniczającego wszystkie typy próbek. Przeprowadzono analizę w celu ustalenia, czy występują różnice w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między gatunkami roślin we wszystkich typach próbek. Uporządkowanie głównych współrzędnych i analiza CAP wszystkich typów próbek (endosfera, ryzosfera i gleba) przeprowadzono przy użyciu macierzy odmienności Braya-Curtisa. Macierz odmienności Braya-Curtisa została wygenerowana przy użyciu skryptu Pythona w QIIME1.9.1. Analizę CAP w oparciu o macierz odmienności Braya-Curtisa przeprowadzono poprzez ograniczenie gatunków roślin jako czynnika w RStudio. Przeprowadzono analizę statystyczną PERMANOVA w celu określenia istotności między gatunkami roślin, a wartość P jest pokazana w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunkach reprezentuje całą społeczność drobnoustrojów dla tej próbki. n = 18 dla każdego gatunku we wszystkich typach próbek, z wyjątkiem n = 15 dla mieszanki Sideoats grama. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przykład analizy CAP z wykorzystaniem gatunków jako czynnika ograniczającego dla każdego rodzaju próbki z osobna. Uporządkowanie głównych współrzędnych i analiza CAP każdego typu próbki (endosfera, ryzosfera i gleba) przy użyciu macierzy odmienności Braya-Curtisa. Każdy typ próbki został rozrzedzony do 486, 17154 i 8231 odczytów na próbkę odpowiednio w endosferze, ryzosferze i glebie. Gatunek został użyty jako czynnik ograniczający święcenia. Przeprowadzono analizę statystyczną PERMANOVA w celu określenia istotności między gatunkami roślin w każdym typie próby, a wartość p jest pokazana w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunku reprezentuje całą społeczność drobnoustrojów dla każdej próbki. Wielkość próby wynosi n = 29 dla każdego rodzaju próbki, n = 6 dla każdego gatunku rośliny w każdym typie próbki, z wyjątkiem mieszanki sideoats grama (n = 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane w tym manuskrypcie powinny umożliwić naukowcom łatwe wejście w dziedzinę metagenomiki gleby i roślin. Z biegiem lat udoskonaliliśmy nasze metody od czasu przeprowadzenia eksperymentu opisanego w tym manuskrypcie. Jedną ze zmian jest to, że teraz wstępnie etykietujemy probówki przed wyjściem w teren w celu pobrania próbek. Nasze laboratorium korzysta z systemu kodów kreskowych oraz drukarki etykiet. Drukarka etykiet nie tylko oszczędza czas podczas etykietowania tubek, ale także ułatwia śledzenie i prawidłową identyfikację próbek bez kaprysów ludzkiego pisma ręcznego. Kolejnym krytycznym punktem jest to, że staramy się przetworzyć materiał po przywiezieniu go z pola tak szybko, jak to możliwe. Naszym celem jest zamrożenie gleby używanej do analizy DNA, sterylizacja i zamrożenie korzeni oraz przefiltrowanie i zamrożenie ryzosfery w ciągu 12 do 36 godzin po powrocie z pola. Procedury ekstrakcji DNA są długotrwałe i składają się z wielu etapów, szczególnie w przypadku gleby i ryzosfery, dlatego zakupiliśmy robota (Kingfisher Flex, ThermoFisher), który minimalizuje czas potrzebny na protokoły ekstrakcji DNA, zmniejsza błąd ludzki, który może zostać wprowadzony, i poprawia spójność w sposobie przetwarzania różnych partii gleby, korzeni lub ryzosfery. Podczas pracy z materiałem roślinnym ważne jest, aby zdecydować się na typ korzenia, który ma być badany, lub pobrać różne typy korzeni, aby uzyskać "reprezentatywną próbkę". Utrzymanie korzeni i liści w stanie zamrożonym podczas przeprowadzania ekstrakcji DNA jest ważne, podobnie jak zapewnienie, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami podczas napełniania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest liczba powtórzeń, które mają być użyte podczas projektowania eksperymentów terenowych i stosowania kompletnego projektu randomizowanego, jeśli to możliwe26. Ze względu na dużą zmienność pola może być konieczne przeprowadzenie dużej liczby powtórzeń w celu wykrycia niewielkich różnic. Wreszcie, z naszego doświadczenia wynika, że ważne jest, aby upewnić się, że gleba nie jest zbyt mokra podczas kopania korzeni. Jeśli gleby są nasycone wodą, praca z nimi jest nie tylko niechlujna, ale także bardzo trudno jest zdefiniować ryzosferę i usunąć glebę z korzeni.

Jedną z modyfikacji, która została wprowadzona na wczesnym etapie opracowywania tych metod, było to, że zamiast ręcznie potrząsać rurkami w celu uwolnienia ryzosfery, zmodernizowaliśmy je do wirów zasilanych generatorem gazu, aby ułatwić pracę w terenie i bardziej ustandaryzować pod względem czasu i sposobu mieszania każdej rurki. Jednym z ograniczeń podejścia opartego na sekwencjonowaniu amplikonów jest to, że rozdzielczość taksonomiczna wyników jest często ograniczona, a wiele OTU jest nieznanych lub znanych tylko na poziomie rodziny lub rodzaju. Ta dziedzina badań szybko się rozwija, dlatego ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z nowych i rozwijających się podejść, szczególnie w przypadku analizy danych, która może poprawić rozdzielczość wyników.

Protokoły te służą wyłącznie do badania bakterii i archeonów, a nie grzybów. Zastosowanie różnych starterów do amplifikacji pozwoli na badanie zbiorowisk grzybów przy użyciu tych samych próbek DNA27,28. Metody te nie wymagają zakupu dużych ilości sprzętu, ponieważ metody można uprościć. Metody, które tutaj opisujemy, służą głównie do określania "kto tam jest", ale dziedzina ta szybko ewoluuje w kierunku zadawania ważnych pytań dotyczących funkcji, na które można odpowiedzieć za pomocą metod sekwencjonowania typu shotgun, izolacji i testowania funkcjonalności drobnoustrojów lub sekwencjonowania całych genomów drobnoustrojów.

Reprezentatywne wyniki podkreślają różnice w zbiorowiskach drobnoustrojów, które można zidentyfikować za pomocą opisanych metod. Stosując podejście oparte na różnorodności beta do analizy danych22, wykazano różnice w składzie między typami prób. Różnice te zostały wyraźnie zaobserwowane w większości innych badań, w których endosfera, ryzosfera i gleba zawierają unikalne zbiorowiska drobnoustrojów3. Wskaźnik różnorodności Shannona został obliczony w celu określenia liczebności i równomierności gatunków drobnoustrojów obecnych w każdym gatunku roślin w endosferze, ryzosferze i glebie. Jak wykazano w tym badaniu i wielu innych, różnorodność alfa jest największa w glebie, nieznacznie maleje w ryzosferze, a następnie znacznie maleje w endosferze 3,5,29. Wyniki te wskazują, że opisane tutaj metody są odpowiednie do identyfikacji zmian składu chemicznego w endosferze, ryzosferze i glebie.

Dominacja Proteobacteria jest częstym odkryciem w badaniach nad endosferą i glebą 30,31,32. Endosfera ma na ogół mniejszą różnorodność gatunków drobnoustrojów z wyższą względną liczebnością Proteobacteria. To ponownie podkreśla, że uzyskane tu wyniki są reprezentatywne dla innych ustaleń w literaturze. Efekty stosowania substancji w tym badaniu nie różniły się znacząco, a dwoma głównymi przyczynami takiego stanu rzeczy może być to, że różnice wynikające z zabiegów nie były wystarczająco duże, aby wygenerować wystarczającą zmienność do wykrycia, oraz fakt, że pobieranie próbek zostało wykonane pod koniec sezonu wegetacyjnego, kiedy pola mogły mieć wystarczająco dużo czasu na pobranie azotu do podobnych poziomów, Czyli tyle, ile zostało zmierzone na koniec sezonu. W innym badaniu, w którym zastosowano podobne dawki nawożenia w dłuższym okresie czasu, zmierzono tylko stosunkowo niewielkie zmiany w składzie mikrobiomu33. Inne badania wykazały zmiany zarówno w zbiorowiskach grzybów, jak i bakterii spowodowane nawozem azotowym34,35.

Wiadomo, że gatunki roślin odgrywają rolę w określaniu ich mikrobiomów 3,32,36, a nawet wykazano niewielkie różnice w zmienności społeczności drobnoustrojów między różnymi genotypami roślin w obrębie jednego gatunku 37. W niniejszej pracy stwierdzono istotną różnicę w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między gatunkami roślin. We wszystkich typach próbek okazało się, że proso rózgowate miało najbardziej wyraźny skład mikrobiologiczny, ale różnice między gatunkami były istotne statystycznie tylko w endosferze. Skład zbiorowiska ryzosfery mógłby stać się znaczący, gdyby dostępnych było więcej powtórzeń do analizy.

Opisane tutaj połączone protokoły terenowe, laboratoryjne i analityczne zapewniają potężną metodę badania, w jaki sposób różne czynniki wpływają na skład zbiorowisk drobnoustrojów w glebach, ryzosferze i endosferze korzeni36. Jest jeszcze wiele do zrobienia w dziedzinie badania mikrobiomów, szczególnie w dziedzinach rolniczych. Ważne pytania dotyczące tego, w jaki sposób mikrobiom glebowy zmienia plony, nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Nawet najbardziej podstawowe pytania dotyczące tego, jak płodozmian wpływa na mikrobiom glebowy, jak czas zmienia mikrobiom, jak stres abiotyczny zmienia mikrobiom, jak rodzaj gleby oddziałuje z tymi czynnikami, aby zmienić mikrobiom i czy w niektórych uprawach lub regionach USA występują uniwersalne drobnoustroje, są pytaniami otwartymi. Metody te będą również przydatne w badaniach epidemiologicznych w celu identyfikacji obecności i trwałości bakterii chorobotwórczych i pożytecznych. Kolejnym horyzontem przyszłości dla tych metod będzie rozpoczęcie integracji opisanych tu metod DNA z danymi dotyczącymi RNA i metabolitów roślin i mikrobów. Dodatkowe ulepszenia i testowanie większej liczby zmiennych będą ważne dla dalszej optymalizacji tych protokołów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój tego manuskryptu jest wspierany przez National Science Foundation EPSCoR Center for Root and Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Gromadzenie danych było wspierane przez fundusze z University of Nebraska-Lincoln, Agricultural Research and Development oraz przez Hatch Grant z USDA. Doceniamy również wsparcie ze strony USDA-ARS oraz wsparcie zostało udzielone przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Konkurencyjny grant nr 2011-68005-30411 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA na ustanowienie i zarządzanie tymi polami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dneasy PowerSoil HTP 96 ZestawQiagen/MoBio12955-4Zestaw ekstrakcyjny do gleby i ryzosfery
Dneasy PowerPlant HTP 96 ZestawQiagen/MoBio13496-4Zestaw do ekstrakcji korzeni
Łopata do kopania z uchwytem D, 101 cm LGlebogryzarka szybka Fiskars9669
, 40 cm LTruper34316
Worki Ziploc, 17,7 cm x 19,5 cmZiplocNA
CoolerDowolnaNA
Patelnia do myciaDowolnaNA
Plastikowe wiadroDowolneNA
Rękawice (robocze i laboratoryjne)DowolnaNA
Średnica 20 cm Sito do gleby #8, 2360 μ m rozmiar oczekDual Manufacturing Co., Chicago ILUS8-8FS
Sito glebowe o średnicy 20 cm #4, 4750 μ m rozmiar oczekDual Manufacturing Co., Chicago ILPrzenośny generator US8-4FS
Marka Honda działa dobrzeNA
Sterylne sitka komórkowe 100 μ m rozmiar oczekFisher Scientific22-363-549
NaH2PO4· H2OVWR0823
Na2HPO4VWR0404
Silwet L-77Lehman SeedsVIS-30powierzchniowo czynnych
Dowolnakuchenka
DowolnaNA
Dowolny
wybielaczCLOROX - siła gospodarstwa domowegoNA
Tween 20DowolnaNA
Ciekły azotDowolnaNA
Granulki suchego loduDowolnaNA
EtanolDowolnaNA
11 cm Precyzyjna pęseta drobno punktowaFisher17456209
18 cm Kleszczyki do próbek prosteVWR82027-436
Nożyczki do przycinania 13,5 cmRurka Fiskars9921
2 mlDowolna
15 ml PPMIDSCIC15B
Rurka stożkowa PP 50 mlMIDSCIC50B
Woda ultraczystaMillipore-sigmaMilli-Q Integral, fluorometr
Qubit 2.0InvitrogenQ32866
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32854Do kwantyfikacji DNA usuniętych próbek
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2670Do kwantyfikacji DNA
96-dołkowy z przezroczystymi płaskimi płytkami dolnymiCorning3631
pPNA PCR BlockerPNA BioPP01-50
mPNA PCR BlockerPNA BioMP01-50
Genomowe DNA z mikrobiologicznej społeczności makiety B (nawet niskie stężenie) v5.1L, do sekwencjonowania genów 16s rRNAZasoby BEIHM782D
Klej 8-dołkowe paski do płytekVWR89134-434
Koraliki ze stali nierdzewnej, średnica 3,2 mm Blok testowyNext AdvanceSSB32
1 ml (płytka do ekstrakcji DNA do Qiagen/MoBio Dneasy Zestaw PowerPlant HTP)CoStar3959
antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar mały do gleby/ryzosferyTWD Tradewinds, INCASWF1SPK
antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar x-mały do korzeni/liściTWD Tradewinds, INCASWFXSCS
Genie 2 Digital VortexScientific IndustriesSI-0236
Adapter Vortex do probówek50 mlScientific IndustriesSI-H506
Moździerz (100 ml) i tłuczekDowolnaNA
Metalowa mikroszpatułkaVWR80071-672
Jednorazowe antystatyczne mikroszpatułkiVWR231-0106
Brązowa torba papierowa 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)Duro18402
5424 Wirówka do probówki 2 mlEppendorf22620461
Wirówka na płytkę 96-dołkowąSigma4-16S81510
Wirnik wirówki do probówek 50 mlSigma4-16S12269 - Biosafe
KAPA HiFi Polimeraza DNAKapa Biosystems
Autoklawy środków do suszenia na NA skala rurka stożkowa NA Q-POD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87(2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688(1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151(2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950(2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915(2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza spo eczno ci mikrobiologicznychpobieranie pr bek mikrobiomu glebowegoizolacja z ryzosferyekstrakcja z endosfery korzeniaprotok ekstrakcji DNAamplifikacja 16S rRNApowt rzenia pr b polowychpor wnanie genotyp w ro linzmienno typ w pr bekanaliza bioinformatyczna

Powiązane artykuły