Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

59.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57932

⸱

24 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Agronomy and Horticulture and Center for Plant Science Innovation, University of Nebraska-Lincoln, 2USDA-ARS, Wheat, Sorghum and Forage Research Unit, University of Nebraska-Lincoln East Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer

.

Streszczenie

Badania mikrobiomu roślin i gleby stają się coraz ważniejsze dla zrozumienia ról mikroorganizmów w wydajności rolnictwa. Celem tego manuskryptu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat szybkiego pobierania próbek gleby, ryzosfery i endosfery z replikowanych prób terenowych oraz analizowania zmian, które mogą wystąpić w zbiorowiskach drobnoustrojów w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Eksperyment wykorzystany do zademonstrowania tych metod składa się z odtworzonych poletek polowych zawierających dwie czyste trawy o ciepłym sezonie (Panicum virgatum i Andropogon gerardii) oraz mieszankę traw o niskiej różnorodności (A. gerardii, Sorghastrum nutans i Bouteloua curtipendula). Krótko mówiąc, rośliny są wykopywane, różne korzenie są wycinane i umieszczane w buforze fosforanowym, a następnie wstrząsane w celu zebrania ryzosfery. Korzenie są przenoszone do laboratorium na lodzie i sterylizowane powierzchniowo wybielaczem i etanolem (EtOH). Ryzosfera jest filtrowana i zagęszczana przez wirowanie. Wykopaną ziemię z okolic bryły korzeniowej umieszcza się w plastikowych workach i przenosi do laboratorium, gdzie pobierana jest niewielka ilość gleby do ekstrakcji DNA. DNA jest ekstrahowane z korzeni, gleby i ryzosfery, a następnie amplifikowane starterami dla regionu V4 genu 16S rRNA. Amplikony są sekwencjonowane, a następnie analizowane za pomocą narzędzi bioinformatycznych o otwartym dostępie. Metody te pozwalają naukowcom przetestować, w jaki sposób różnorodność i skład zbiorowisk drobnoustrojów zmienia się w zależności od rodzaju próbki, traktowania i genotypu rośliny. Wykorzystując te metody wraz z modelami statystycznymi, reprezentatywne wyniki pokazują, że istnieją znaczące różnice w zbiorowiskach mikrobiologicznych korzeni, ryzosfery i gleby. Przedstawione tutaj metody zapewniają pełny zestaw kroków do zbierania próbek terenowych, izolowania, ekstrakcji, kwantyfikacji, amplifikacji i sekwencjonowania DNA oraz analizowania różnorodności i składu społeczności drobnoustrojów w replikowanych badaniach terenowych.

Wprowadzenie

Badania mikrobiomu mają ważne implikacje dla zrozumienia i manipulowania procesami ekosystemowymi, takimi jak obieg składników odżywczych, obrót materią organiczną oraz rozwój lub hamowanie patogenów glebowych1,2. Ten obszar badań ma również ogromny potencjał w zakresie zrozumienia wpływu mikroorganizmów glebowych na produktywność naturalnych zbiorowisk roślinnych i agroekosystemów. Podczas gdy istnieje wiele badań, które koncentrowały się na mikrobiomie glebowym w naturalnych ekosystemach, mniej skupiało się na mikroorganizmach ryzosfery roślinnej i endosfery w agroekosystemach3. W Nebrasce rolnictwo dominuje w krajobrazie w dużej części stanu, co sprawia, że badania tych gleb, na których uprawia się rośliny ważne dla rolnictwa, są istotnym tematem badań. Celem niniejszej pracy metodologicznej jest dostarczenie naukowcom standardowego zestawu protokołów do opisu drobnoustrojów obecnych w agroekosystemach, określenia, w jaki sposób korzenie roślin modyfikują społeczności drobnoustrojów w ryzosferze i endosferze, a ostatecznie zrozumienia funkcji, jakie te drobnoustroje odgrywają w zdrowiu gleby i produktywności roślin.

Przedstawiona tutaj metoda różni się nieznacznie od metod używanych przez inne4,5 tym, że ten artykuł ma na celu poznanie, które mikroby znajdują się wyłącznie wewnątrz korzenia i czym różnią się od mikrobów znajdujących się bezpośrednio poza korzeniem w ryzosferze. Sekwencjonowanie amplikonów zastosowane w tym badaniu identyfikuje taksony drobnoustrojów znalezione w próbce DNA i pozwala badaczom określić, jak zmieniają się społeczności w zależności od rodzaju próbki lub traktowania. Jedną z kluczowych różnic między tym protokołem a bardzo podobnym protokołem używanym przez Lundberga i wsp.6 jest to, że zamiast sonikacji, ten protokół wykorzystuje sterylizację powierzchni za pomocą wybielacza i etanolu w celu usunięcia ryzosfery z korzeni. Inni również skutecznie stosowali sterylizację powierzchni7,8,9,10. Metody te nie są korzystniejsze niż inne metody, ale nieco inne. Metody te szczególnie dobrze nadają się do dużych eksperymentów terenowych, ponieważ przy wystarczającej liczbie osób możliwe jest przetworzenie ponad 150 poletek polowych dziennie, co daje około 450 próbek po podziale na endosferę, ryzosferę i glebę. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje metody stosowane do pobierania próbek w terenie, przetwarzania materiału w laboratorium, ekstrakcji i sekwencjonowania DNA, a także zawiera krótki przegląd kroków do analizy uzyskanych danych sekwencjonowania.

Protokół

1. Opis terenu badań

  1. Opisz polowe miejsca badawcze w okresach pobierania próbek. Wyznacz lokalizację pola (szerokość geograficzną, długość geograficzną i wysokość nad poziomem morza) przy użyciu GPS.
  2. Opisz głębokość pobierania próbek, czas poboru oraz teksturę gleby.
  3. Czynniki środowiskowe odgrywają istotną rolę w kształtowaniu społeczności mikrobiologicznych. Zapisz informacje klimatyczne, takie jak średnia roczna temperatura, roczne opady, płodozmian z poprzednich lat, praktyki uprawy roli, metodę nawożenia oraz historię miejsca badawczego. Automatyczne stacje pogodowe lub inne urządzenia są przydatne do rejestrowania dziennych opadów i temperatury w ciągu sezonu wegetacyjnego.

2. Pobieranie i przetwarzanie prób gleby, ryzosfery i korzeni z terenu

  1. Wykopywanie roślin.
    1. Oznacz kuwetę do mycia i wiadro karteczką samoprzylepną zawierającą informacje o pobieranym materiale roślinnym. Uwzględnij takie dane jak numer działki, genotyp rośliny i gatunek rośliny. Zabierz oznakowane wiadro na działkę, a kuwetę do mycia pozostaw w wyznaczonym stanowisku pracy w terenie.
    2. Pr przebij glebę łopatą do głębokości 30 cm, aby przeciąć korzenie boczne utrzymujące roślinę w glebie. Przybliżona objętość wynosi 18 cm3. Losowo wybierz i pobierz dwie rośliny z każdej działki z różnych obszarów w obrębie działki.
    3. Wykop korzenie rośliny, podważając je łopatą, i umieść bryłę korzeniową w oznakowanym wiadrze. Przynieś oznakowane wiadro z wykopaną bryłą korzeniową z powrotem do stanowiska pracy w terenie. Odetnij i wyrzuć nadziemną biomasę rośliny.
  2. Usuwanie gleby z korzeni i pobieranie gleby sypkiej.
    1. Potrząśnij korzeniami, aby ręcznie usunąć glebę, lub użyj szpadla bądź ręcznego spulchnika do usunięcia gleby z korzeni. W przypadku gleb bardzo piaszczystych wstrząśnięcie korzeni jest wystarczające do usunięcia gleby. Załóż rękawiczki i umieść korzenie w pobliżu stacji przetwarzania.
    2. Po wstrząśnięciu korzeni większość gleby znajdzie się w kuwecie do mycia. Wymieszaj glebę w kuwecie i rozbij grudki ziemi za pomocą ręcznego spulchnika. Umieść próbkę gleby wolną od zanieczyszczeń w oznakowanej, ziplockowej torebce do przechowywania o wymiarach 17,7 x 19,5 cm i odstaw w chłodne miejsce lub na lód.
  3. Pobieranie korzeni i ryzosfery.
    1. Używając nożyczek ogrodniczych wysterylizowanych w 70% EtOH, wytnij zestaw korzeni, około 4 do 6 korzeni z rośliny, z których każdy powinien mieć długość około 9 - 12 cm. Umieść wycięte korzenie (docinając je w razie potrzeby, aby zmieściły się w probówce) w oznakowanej probówce 50 mL zawierającej 35 mL autoklawowanego buforu fosforanowego (6,33 g/L NaH2PO4, 8,5 g/L bezwodnego Na2HPO4, pH = 6,5, 200 µl/L surfaktantu).
      Uwaga: Surfaktant (patrz Tabela materiałów) został dodany po autoklawowaniu buforu fosforanowego. Objętość bryły korzeniowej i długość korzeni różnią się w zależności od wieku i gatunku rośliny.
    2. Wstrząsaj probówkami przez 2 min, aby uwolnić ryzosferę z powierzchni korzeni. Za pomocą pęsety wysterylizowanej w 70% EtOH wyjmij korzenie z probówki, delikatnie osusz je ręcznikiem papierowym i umieść w nowej, oznakowanej probówce 50 mL. Umieść zarówno probówkę z ryzosferą, jak i tę z korzeniami na lodzie.

3. Obróbka próbek terenowych w laboratorium

  1. Sterylizacja powierzchniowa korzeni po zbiorze w terenie.
    Uwaga: Sterylizację powierzchniową należy przeprowadzić jak najszybciej po powrocie z terenu. Jeśli sterylizacja powierzchniowa korzeni nie jest możliwa w tym samym dniu, należy przechowywać korzenie w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.
    1. Do probówek o pojemności 50 mL z korzeniami zebranymi w terenie dodać około 35 mL 50% wybielacza + 0,01% Tween 20. Wstrząsać probówki 50 mL przez 30 do 60 sekund. Odlać 50% wybielacz i dodać 35 mL 70% EtOH. Wstrząsać przez kolejne 30 do 60 sekund.
    2. Odlać 70% EtOH i dodać 35 mL sterylnej wody ultrapure. Wstrząsać przez 1 minutę. Płukanie wodą powtórzyć jeszcze dwa razy.
      Uwaga: Aby upewnić się, że zabieg sterylizacji powierzchniowej jest wystarczający, wysiano próbki wody z ostatniego płukania i nie zaobserwowano wzrostu bakterii (P. Wang, niepublikowane dane, 2014). Inni badacze testowali wydajność sterylizacji korzeni, stosując podobne metody9,10.
    3. Osuszyć korzenie, przykładając je do czystych ręczników papierowych. Do każdej próbki należy użyć osobnego czystego ręcznika papierowego.
      Uwaga: Ręczniki papierowe można sterylizować przed użyciem. My nie sterylizujemy ręczników papierowych, jednak używamy jednego ręcznika na próbkę i przechowujemy je w opakowaniach do momentu użycia.
    4. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek do przycinania pociąć korzenie na kawałki o długości około 5 mm i umieścić pocięte korzenie w czystej, opisanej probówce stożkowej 15 mL. Próbki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetworzenia.
  2. Przetwarzanie próbek ryzosfery.
    1. Wstrząsnąć probówki 50 mL zawierające próbki ryzosfery z terenu, aby resuspenderować całą próbkę. Używając sterylnego sita komórkowego o oczkach 100 µm (patrz Tabela materiałów), przefiltrować resuspenderowaną próbkę do nowej probówki 50 mL.
    2. Wirować probówki przy 3000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlać i usunąć nadosad.
    3. Umieścić probówki 50 mL z osadem ryzosferycznym na lodzie. Do osadów ryzosferycznych dodać 1,5 mL sterylnego buforu fosforanowego (bez surfaktantu) i wymieszać za pomocą wiraka w celu zawieszenia.
    4. Przenieść zawiesinę pipetą do czystej, opisanej probówki do mikrowirówki 2 mL. Wirować probówki przy 15 871 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Natychmiast odlać nadosad i odsączyć probówki na czystych ręcznikach papierowych.
    5. Osady przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetworzenia.
      Uwaga: Kroki 3.2.2 – 3.2.4 wykonuje się w celu zmniejszenia objętości probówek z próbkami do przechowywania. Przechowywanie mniejszych probówek 2 mL jest bardziej efektywne pod względem przestrzeni niż przechowywanie probówek 50 mL.
  3. Przetwarzanie próbek gleby do ekstrakcji DNA i analizy gleby.
    1. Za pomocą sterylnej metalowej szpatułki napełnić czystą, opisaną probówkę 2 mL około 3 g gleby do ekstrakcji DNA. Należy unikać małych fragmentów korzeni i zanieczyszczeń. Tę próbkę gleby przechowywać w temperaturze -20 °C. Szpatułkę metalową płukać w 70% EtOH pomiędzy każdą próbką.
    2. W czystej kuwecie płuczącej wysypać glebę z worka do ułożonych jedno na drugim sit (patrz Tabela materiałów), z większym sitem na górze, i ręcznie przesiać glebę przez oba sita. Pomiędzy próbkami należy starannie oczyścić sita za pomocą pędzla.
    3. Odsączyć od 100 do 125 g przesianej gleby do woreczka strunowego o wymiarach 17,7 x 19,5 cm do przyszłych analiz fizykochemicznych i teksturalnych gleby. Woreczki z glebą przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania.
  4. Przetwarzanie próbek gleby w celu oznaczenia wilgotności gleby.
    1. Taryć opisaną brązową papierową torbę na wadze. Odważyć od 40 do 45 g przesianej gleby do brązowej papierowej torby. Zapisać masę papierowej torby i gleby w arkuszu danych i umieścić torby w suszarce ustawionej na 55 - 60 °C.
    2. Po 72 godzinach wyjąć torby z suszarki. Pozostawić torby z glebą do ochłodzenia przez co najmniej 30 min, a następnie zważyć.
    3. Aby zapisać masę, taryć wagę do zera i położyć brązowe papierowe torby na wadze. Obliczyć procentową wilgotność gleby dla każdej próbki, korzystając ze wzoru:
      figure-protocol-1
      Uwaga: Metoda oznaczania wilgotności gleby pochodzi z Kellogg Biological Station Long Term Ecological Research (KBS LTER). KBS LTER udostępnia na swojej stronie internetowej (https://Lter.kbs.msu.edu/) szeroki zakres ugruntowanych protokołów dla badaczy.

4. Przygotowanie przetworzonych próbek korzeni do ekstrakcji DNA.

  1. Rozetrzyj zamrożony materiał korzeniowy, aby próbka była homogenna.
    1. Wlej ciekły azot do plastikowego zlewka ze czystymi szpatułkami oraz do czystego moździerza z tłuczkiem, aby próbki pozostały zamrożone przez cały proces rozcierania.
    2. Umieść zamrożoną tkankę w moździerzu i rozcieraj tłuczkiem na drobny proszek. Podczas rozcierania stale dodawaj ciekły azot, aby utrzymać próbki w stanie zamrożenia.
    3. Za pomocą szpatułki przenieś rozcieraną tkankę do czystej, opisanej probówki o pojemności 2 mL. Przechowuj w temperaturze -80 °C.

5. Ekstrakcja DNA z próbek gleby i ryzosfery w formacie 96-dołkowym

  1. Nakładanie próbek gleby do płytek 96-dołkowych.
    1. Przetrzeć obszar roboczy 70% EtOH i 1% roztworem wybielacza. Podczas tych kroków należy nosić rękawice laboratoryjne. Wyjąć próbki gleby z przechowywania w -20 °C i pozwolić im rozmrozić się w pojemniku z lodem.
    2. Zdjąć matę uszczelniającą z płytki ekstrakcyjnej 96-dołkowej dostarczonej w zestawie do ekstrakcji DNA. Położyć matę uszczelniającą między dwa papierowe ręczniki, aby zachować jej czystość, gdy nie jest używana. Aby uniknąć kontaminacji, należy użyć przylepnych pasków PCR 8-dołkowych do przykrycia 12 kolumn płytki ekstrakcyjnej 96-dołkowej.
    3. Wytarować sterylny lejek wagowy (rozmiar SM) na wadze i odważyć od 200 do 250 mg gleby.
      Uwaga: Lejki sterylne są spłaszczone z jednej strony, dzięki czemu leżą płasko na wadze. Lejek wypełnia się glebą i umieszcza bezpośrednio w dołku. Technika ta zapobiega utracie próbek, minimalizuje rozlewanie i zapobiega kontaminacji krzyżowej.
    4. Aby odsłonić pierwszy dołek płytki ekstrakcyjnej, należy ostrożnie podnieść pasek przylepny, umieścić szyjkę wypełnionego lejka wagowego w odpowiednim dołku i delikatnie wprowadzić próbkę gleby do dołka. Ponownie przyłożyć pasek przylepny, aby przykryć dołek.
    5. Powtórzyć ten proces dla każdego dołka płytki, używając nowego sterylnego lejka dla każdej próbki, aż płytka zostanie wypełniona. Pozostawić jeden dołek pusty jako kontrolę ujemną ekstrakcji (blank).
      Uwaga: Jeden dołek na każdej płytce ekstrakcyjnej pozostawia się pusty, aby służył jako kontrola ujemna (blank). Pozwala to kontrolować obecność zanieczyszczeń, które mogą znajdować się w odczynnikach zestawu11.
    6. Nałożyć matę uszczelniającą na płytkę ekstrakcyjną i przechowywać płytkę w -20 °C do czasu rozpoczęcia ekstrakcji DNA.
  2. Nakładanie próbek ryzosfery do płytek 96-dołkowych.
    1. Wyjąć próbki ryzosfery z przechowywania w -20 °C i pozwolić im rozmrozić się w pojemniku z lodem.
    2. Postępować zgodnie z krokiem 5.1.2 powyżej w celu przygotowania płytki do ekstrakcji DNA.
    3. Położyć czysty papierowy ręcznik na wadze, a następnie wytarować na niej sterylną metalową szpatułkę. Za pomocą szpatułki ostrożnie nabrać część osadu ryzosferycznego z probówki z próbką. Położyć szpatułkę z powrotem na wadze i odważyć od 200 do 250 mg próbki ryzosfery.
    4. Ostrożnie podnieść pasek przylepny, aby odsłonić pierwszy dołek płytki ekstrakcyjnej, skierować wypełnioną szpatułkę do wnętrza dołka i zdrapać materiał ryzosferyczny do odpowiedniego dołka za pomocą sterylnej wykałaczki.
    5. Płukać metalową szpatułkę w wodzie, a następnie w 70% EtOH pomiędzy próbkami. Powtórzyć ten proces dla każdego dołka płytki, aż zostanie ona wypełniona, pozostawiając jeden dołek pusty jako kontrolę ujemną ekstrakcji (blank).
  3. Ekstrakcja DNA z próbek ryzosfery i gleby w formacie 96-dołkowym.
    1. Wyekstrahować DNA z gleby i ryzosfery, używając zestawu zoptymalizowanego dla gleby (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Używamy tego konkretnego zestawu do izolacji DNA z gleby i ryzosfery ze względu na zdolność zastrzeżonych odczynników do usuwania kwasu huminowego i innych silnych inhibitorów PCR występujących w glebie.
  4. Kwantyfikacja DNA.
    1. Kwantyfikować 92 próbki i 4 stężenia standardów za pomocą zestawu (patrz Tabela materiałów; standardy są dołączone), zgodnie z protokołem producenta.
    2. Kwantyfikować pozostałe 4 próbki, które zostały usunięte z płytki, aby zwolnić miejsce na cztery standardy, używając zestawu (patrz Tabela materiałów), zgodnie z protokołem producenta.

6. Izolacja DNA z próbek korzeni w formacie 96-dołkowym.

  1. Ładowanie próbek korzeni do płytek 96-dołkowych.
    1. Przetrzyj obszar roboczy 70% EtOH i 1% wybielaczem. Podczas tych kroków używaj rękawiczek.
    2. Próbki zmielonych korzeni utrzymuj przez cały czas w stanie zamrożenia, umieszczając je w pojemniku z suchym lodem.
    3. Napełnij plastikowy zlew ciekłym azotem i umieść w nim antystatyczne mikrospatułki oraz sterylne lejki wagowe (rozmiar XSM), aby je schłodzić.
    4. Zdejmij matę uszczelniającą z dołączonej do zestawu 96-dołkowej płytki z kuletkami do ekstrakcji i połóż ją między dwa papierowe ręczniki, aby utrzymać czystość, gdy nie jest używana.
      Uwaga: Nowsza wersja tego zestawu, wydana po czasie, w którym przeprowadzaliśmy te ekstrakcje DNA, wymaga od użytkownika dostarczenia płytek z kuletkami do ekstrakcji. W Tabeli Materiałów wymieniliśmy informacje katalogowe dostawcy niezbędne do zamówienia tych elementów.
    5. Aby uniknąć kontaminacji, użyj klejących 8-dołkowych pasków PCR do przykrycia 12 kolumn 96-dołkowej płytki do ekstrakcji.
    6. Umieść płytkę z kuletkami do ekstrakcji na suchym lodzie, aby utrzymać próbki w dołkach w stanie zamrożenia.
    7. Ostrożnie podnieś pasek klejący, aby odsłonić pierwszy dołek płytki do ekstrakcji, umieść szyjkę napełnionego lejka wagowego w odpowiednim dołku i dodaj 3 porcje zmielonej tkanki korzenia nabranej spatułką. Ponownie nałóż pasek klejący, aby przykryć dołek.
      Uwaga: Glebę i ryzosferę rozmraża się na lodzie przed ważeniem, natomiast materiał roślinny odważa się w stanie zamrożenia. Zamrożona tkanka roślinna, zwłaszcza w małych ilościach, jest trudna do odważenia na wadze bez rozmrażania. Przeprowadzono testy ważenia zmielonej tkanki korzenia, aby ustalić, ile porcji ze spatułki jest wystarczających. Należy zauważyć, że producent zestawu nie wymaga dokładnej ilości tkanki, lecz zaleca około 50 mg. Różne typy próbek roślin będą się różnić i użytkownik będzie musiał ustalić odpowiednią ilość.
    8. Powtarzaj ten proces dla każdego dołka płytki, aż zostanie ona całkowicie wypełniona.
    9. Przechowuj płytkę w temperaturze -20 °C do momentu rozpoczęcia ekstrakcji DNA.
  2. Ekstrakcja DNA z tkanki korzenia.
    1. Wyekstrahuj DNA, używając zestawu zoptymalizowanego dla roślin (patrz Tabela Materiałów), zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Używamy tego zestawu, zaprojektowanego specjalnie dla tkanki roślinnej, aby uzyskać maksymalną wydajność z próbek korzeni. W przeciwieństwie do gleby i ryzosfery, kwas huminowy i inne zanieczyszczenia stanowią mniejszy problem w przypadku tkanki korzenia.
  3. Oznacz ilość DNA zgodnie z krokiem 5.4.

7. Amplifikacja i sekwencjonowanie wyizolowanego DNA.

  1. Amplifikuj region V4 genu 16S za pomocą polimerazy z funkcją korekty (patrz Tabela materiałów), zgodnie z opisem Gohl et al.12 Nadaj próbkom kody kreskowe za pomocą różnych primerów indeksujących i połącz je przed sekwencjonowaniem. Sekwencjonowanie przeprowadź metodami opisanymi przez Gohl et al12, stosując dwuetapowy proces PCR z primerami V4 (Plik uzupełniający 1).
    Uwaga: Niektóre z metod dla tych etapów zostały szczegółowo opisane w innych publikacjach12,13,14 i dlatego nie będą tutaj opisane. W przypadku próbek korzenia dodano blokery PNA, aby zmniejszyć ilość amplifikowanego DNA plastydów z tkanki roślinnej, co zostało wcześniej w pełni opisane15. W sekwencjonowaniu zastosowano dwie kontrole: kontrolę negatywną, obejmującą puste kontrole płytki do ekstrakcji (patrz uwaga po kroku 5.1.5), oraz sztuczną społeczność o znanej populacji bakteryjnego DNA (patrz Tabela materiałów), która służyła jako kontrola pozytywna.
    Uwaga: W większości przypadków zestawy MiSeq Reagent Kits v3 są używane w trybie 2 X 300 par zasad (paired-end). Dla próbek w niniejszym manuskrypcie użyto Illumina HiSeq 2500 w trybie rapid z konfiguracją 250 Paired-end (2 x 250). Wszystkie próbki zostały zsekwencjonowane w tym samym kanale.
  2. Przetwórz dane sekwencyjne za pomocą potoku do analiz społeczności mikrobiologicznych (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 oraz RStudio v3.4.3 16).
    1. Przygotuj dane sekwencyjne za pomocą USEARCH17.
      Uwaga: USEARCH jest dostępny online wraz z pełną instrukcją (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. Przeprowadź demultipleksowanie danych sekwencyjnych, używając odczytów indeksujących lub kodów kreskowych, aby przypisać odczyty Illumina do próbek.
    3. Połącz odczyty parzyste (paired-end), aby uzyskać sekwencje konsensusowe. Użyj polecenia: usearch -fastq_mergepairs *R1*.fastq -relabel @ -fastq_maxdiffs 10 -fastq_minmergelen 230 -fastq_maxmergelen 320 -fastq_pctid 80 -fastqout merged.fq.
      Uwaga: Parametry zostały ustawione w oparciu o instrukcję obsługi USEARCH.
    4. Usuń primery z danych sekwencyjnych, aby uniknąć substytucji w sekwencjach primerów, które mogą być spowodowane reakcją PCR. Użyj polecenia: usearch -fastx_truncate merge.fq -stripleft 19 -stripright 20 -fastqout stripped.fq.
    5. Przefiltruj dane sekwencyjne, aby usunąć odczyty o niskiej jakości i zachować wysokiej jakości sekwencje jednostek taksonomicznych operacyjnych (OTU). Użyj polecenia: usearch -fastq_filter stripped.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout filtered.fa.
  3. Wygeneruj OTU w USEARCH.
    1. Przeprowadź dereplikację w celu zidentyfikowania zestawu unikalnych sekwencji OTU. Użyj polecenia: usearch -fastx_uniques filtered.fa -fastaout uniques.fa -sizeout -relabel Uniq.
    2. Pogrupuj OTU z podobieństwem sekwencji 97 – 100%, aby wyznaczyć unikalne OTU. Użyj polecenia: usearch -cluster_otus uniques.fa -minsize 2 -otus otus.fa -relabel Otu.
      Uwaga: Ten krok obejmuje również usuwanie singletonów z pogrupowanych OTU oraz usuwanie chimer z danych sekwencyjnych.
    3. Utwórz tabelę OTU w USEARCH. Użyj polecenia: usearch -usearch_global stripped.fq -db otus.fa -strand plus -id 0.97 -otutabout otutable.txt.
      Uwaga: To polecenie generuje tabelę z liczbą odczytów (liczbami) wszystkich OTU dla każdej próbki. Tabela OTU jest wykorzystywana w kolejnych krokach, w tym w analizach różnicowej liczności i analizach różnorodności mikrobiologicznej. Przykład tabeli OTU przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2.
    4. Przeprowadź analizę rzadkości (rarefaction) w QIIME v1.9.1 18.
      Uwaga: Krzywa rzadkości jest obliczana na podstawie tabeli OTU, aby określić, czy głębokość sekwencjonowania odpowiednio reprezentuje społeczność mikrobiologiczną. Przykłady krzywych rzadkości przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 3.
    5. Przeprowadź analizę różnorodności alfa18. Użyj skryptu alpha_rarefaction.py w QIIME v1.9.1, aby obliczyć różnorodność społeczności mikrobiologicznej w każdej próbce.
      Uwaga: Ta analiza oblicza indeksy różnorodności, takie jak Shannon19, Simpson20 i Chao121.
    6. Przeprowadź analizę różnorodności beta18,22. Użyj skryptu Python: beta_diversity_through_plots.py w QIIME v1.9.1 i macierzy niezawisłości Braya-Curtisa.
      Uwaga: Ta analiza porównuje skład społeczności mikrobiologicznej pomiędzy próbkami.
    7. Przeprowadź analizy statystyczne między grupami. Użyj macierzy odległości obliczonych dla PERMONOVA z wykorzystaniem funkcji adonis i anova w pakiecie vegan23 v2.4.5 w RStudio16. Przeprowadź kanoniczną analizę głównych współrzędnych (CAP) za pomocą funkcji capscale w pakiecie vegan. Wizualizuj dane za pomocą pakietu ggplot224 v2.2.1 w RStudio.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszym manuskrypcie pochodzą z obszaru badawczego ustanowionego w 2012 roku na farmie University of Nebraska-Lincoln Agriculture Research Division w pobliżu Mead, NE. Przed rozpoczęciem eksperymentu teren ten był zarządzany w systemie płodozmianu kukurydza-soja. Obszar badań obejmował trzy różne typy gleb, jednak dane analizowano przy założeniu, że wszystkie zmiany w zmierzonych właściwościach gleby wynikały z zastosowanych zabiegów.

Teren badawczy obejmował dwa czyste drzewostany rozsadnika (P. virgatum cv Liberty) i trzęślicy wielkiej (A. gerardii), a także mieszankę traw o niskiej różnorodności, zawierającą trzęślicę wielką, trawę indyjską (S. nutans) oraz trawę sideoats grama 'Butte' (B. curtipendula). Trzy działki traw ciepłosezonowych zostały rozmieszczone w zrandomizowanym schemacie bloków zupełnych z trzykrotnymi powtórzeniami. W obrębie trzech różnych działek traw zastosowano dwie warianty nawożenia azotowego (N), polegające na podaniu 56 (N1) i 112 (N2) kg N ha-1 w postaci mocznika. W momencie pobierania próbek mikrobiomu na koniec sezonu wegetacyjnego gleba zawierała 8,0 ± 1,1 (średnia ± SD) ppm azotanów w działkach nawożonych dawką 112 kg N ha-1 oraz 6,8 ± 0,7 (średnia + SD) ppm azotanów w działkach nawożonych dawką 56 kg N ha-1. Działki były nawożone raz w roku. Działki traw ciepłosezonowych wyznaczono jako działki główne (8000 m2), a warianty N jako pod-działki (4000 m2). Trzęślica wielka została wysiana jako mieszanka 'Bonanza' i 'Goldmine' w stosunku 50:50, a trawa indyjska jako mieszanka 'Scout' i 'Warrior' w stosunku 50:50. Działki zostały obsiane w 2012 roku, a pierwsza aplikacja azotu N miała miejsce wiosną 2013 roku.

Pobieranie próbek gleby i korzeni przeprowadzono 15 września 2014 roku. Prace opisane poniżej wykonano na polu, na którym zastosowano randomizowany układ dzielonych poletek z trzema powtórzeniami (Rysunek 1). Średnia głębokość sekwencjonowania wszystkich próbek dla endosfery wynosiła: 4871 ± 5711 (średnia ± SD), dla ryzosfery: 40726 ± 14684, dla gleby: 38184 ± 9043. Jednym z największych źródeł zmienności w tych eksperymentach, przy zastosowaniu opisanych metod, jest różnica w społecznościach mikrobiologicznych występujących pomiędzy typami próbek (Rysunek 2). W tym reprezentatywnym zbiorze danych ryzosfera i gleba wydają się być bardziej podobne pod względem składu do siebie nawzajem niż do endosfery (Rysunek 2A). Jednakże odnotowano również wysoce istotne (p = 0,001) różnice w składzie społeczności mikrobiologicznych pomiędzy ryzosferą a glebą (Rysunek 2B). Całkowita zmienność uwzględniona w tych eksperymentach analizowanych według typu próbki wyniosła 26%.

Analiza różnorodności alfa wykazała, że społeczności mikrobiologiczne w endosferze charakteryzowały się niższą różnorodnością próbek w porównaniu z glebą i ryzosferą (Rysunek 3). Jedyne istotne różnice w różnorodności między gatunkami traw w dowolnym przedziale wystąpiły pomiędzy próbkami endosfery rozsadnicy wielkiej i trawy preriowej, przy czym trawa preriowa wykazywała istotnie wyższą różnorodność gatunkową mikroorganizmów (Rysunek 3). Analiza względnej liczebności (Rysunek 4) wskazuje na dominację Proteobacteria, a następnie Actinobacteria we wszystkich typach próbek. Gleba i ryzosfera są również zdominowane przez Acidobacteria i Chloroflexi, podczas gdy w endosferze odnotowano większą względną liczebność Bacteriodetes.

W tym eksperymencie rośliny hodowano przy zastosowaniu dwóch różnych dawek nawozu azotowego (N), w związku z czym przeanalizowano dane w celu ustalenia, czy wystąpiły efekty zabiegowe. Efekty zabiegowe odpowiadały za 12% całkowitej zmienności, jednak nie były one istotnie różne, mimo że w ordynacji oba zabiegi wyglądają odmiennie (Rysunek 5). Podkreśla to znaczenie analiz statystycznych dla tego typu zbiorów danych w przeciwieństwie do inspekcji wizualnej lub ocen jakościowych.

Różnice w mikrobiomie tkanek roślinnych i gleby pod wpływem roślin zostały zwizualizowane przy użyciu ograniczonej metody ordynacji. Różnice statystyczne określono za pomocą analizy PERMANOVA, aby sprawdzić, czy konkretne zmienne, takie jak gatunek, prowadzą do istotnych różnic w składzie społeczności mikrobiologicznych pomiędzy próbkami. Gdy wszystkie typy próbek analizowano wspólnie, stwierdzono wysoce istotną różnicę w składzie społeczności mikrobiologicznych wynikającą z gatunku rośliny (Rycina 6). W tym eksperymencie stopień zmienności wyjaśniony przez gatunek rośliny wyniósł 6,7%. Na koniec każdy typ próbki analizowano indywidualnie, aby ustalić, który z nich może odpowiadać za istotny wpływ gatunku rośliny. Wyłącznie w endosferze odnotowano wysoce istotną różnicę (p = 0,001) między składem społeczności mikrobiologicznych różnych gatunków roślin (Rycina 7). W pozostałych typach próbek wpływ gatunku nie był istotny podczas analizy indywidualnej. W endosferze procent zmienności wynikający z gatunku wyniósł 27%, podczas gdy w ryzosferze (18%) i glebie (15%) był on niższy. Podkreśla to dodatkowo znaczenie indywidualnej analizy każdego typu tkanki.

figure-results-1
Rycina 1: Przykład projektu pola doświadczalnego. Projekt pola doświadczalnego ilustrujący randomizowany układ bloków kompletnych w trzech powtórzeniach na stanowisku badawczym zlokalizowanym w University of Nebraska-Lincoln Eastern Nebraska Research and Extension Center w pobliżu Mead, NE. Pełny opis stanowiska znajduje się w sekcji Wyniki. N1 oznacza niską dawkę azotu (56 kg N ha-1 mocznika), a N2 (112 kg N ha-1 mocznika) wyższą dawkę azotu, które zostały zastosowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza beta-różnorodności porównująca skład mikrobiologiczny w różnych typach próbek, w tym endosfery, ryzosfery i gleby, pobranych z traw wieloletnich w 2014 roku. Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w QIIME1.9.1 w celu utworzenia macierzy dystansu Bray-Curtis. Analiza głównych współrzędnych (PCoA) oparta na macierzy dystansu Bray-Curtis została zwizualizowana w programie RStudio. PCoA1 i PCoA2 wskazują odpowiednio pierwszą i drugą największą wariancję wyjaśnioną przez analizę PCoA. Przeprowadzono statystyczną analizę PERMANOVA w celu określenia istotności różnic między typami próbek; wartość p jest wyświetlana w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunkach reprezentuje całą społeczność mikrobiologiczną dla danej próbki. (A) Typy próbek z endosfery, ryzosfery i gleby zostały przeanalizowane wspólnie. Wszystkie 87 próbek zostało zrzadkowanych do 486 sekwencji na próbkę. (B) Próbki z ryzosfery i gleby zostały przeanalizowane wspólnie. Wszystkie 59 próbek zostało zrzadkowanych do 8231 sekwencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza różnorodności alfa z wykorzystaniem indeksu Shannona dla każdego gatunku w endosferze, ryzosferze i glebie. Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1. Rzadkość (rarefakcję) wykonano odpowiednio dla próbek z endosfery, ryzosfery i gleby przy 486, 17154 i 8231 sekwencjach na próbkę. Prostokąty reprezentują 25. i 75. percentyl (pierwszy i trzeci kwartyl). Pozioma linia wewnątrz prostokąta oznacza medianę, a czerwony plus wskazuje średnią. Wąsy pokazują zakres danych z wyłączeniem wartości odstających (przedstawionych jako czarne kropki), które wykraczały poza 1,5-krotność rozstępu międzykwartylowego (n = 6 dla każdej próbki, z wyjątkiem mieszanki sideoats grama, gdzie n = 5). Indeks Shannona dla wszystkich pięciu gatunków w endosferze był niższy niż w ryzosferze i glebie. Do określenia istotności różnic między gatunkami zastosowano nieparametryczny test suma rang Wilcoxona; nad prostokątami zaznaczono jedynie różnice istotne statystycznie między gatunkami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Względna liczebność na poziomie typu w endosferze, ryzosferze i glebie. Przebadano próbki w celu porównania liczebności typów mikroorganizmów w różnych rodzajach próbek (n = 29 dla każdego rodzaju próbki). Analizę przeprowadzono za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1 na podstawie tabeli OTU. Różne kolory na wykresie kołowym oznaczają typy. Procent wskazuje względną liczebność każdego typu w każdym rodzaju próbki. Informacje o typach zostały przypisane przy użyciu klasyfikatora Ribosomal Database Project (RDP)25. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza z zastosowaniem traktowania jako czynnika ograniczającego pomiędzy wszystkimi typami próbek. Przeprowadzono kanoniczną analizę głównych współrzędnych (CAP), aby ustalić, czy występują różnice w składzie społeczności drobnoustrojów pomiędzy wariantami traktowania. Dla każdego traktowania azotem (N), n = 42 dla N1 (56 kg N ha-1) oraz n = 45 dla N2 (112 kg N ha-1). Macierz niezależności Braya-Curtisa wygenerowano za pomocą skryptu python w QIIME1.9.1. Analizę CAP opartą na macierzy niezależności Braya-Curtisa wykonano w RStudio, przyjmując traktowanie jako czynnik ograniczający. Przeprowadzono analizę PERMANOVA, aby określić, czy różnice między wariantami traktowania były istotne; wartość p przedstawiono w prawym górnym rogu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Analiza z gatunkiem rośliny jako czynnikiem ograniczającym pomiędzy wszystkimi typami próbek. Przeprowadzono analizę w celu ustalenia, czy występują różnice w składzie społeczności drobnoustrojów pomiędzy gatunkami roślin we wszystkich typach próbek. Ordynacja głównych współrzędnych oraz analiza CAP dla wszystkich typów próbek (endosfera, ryzosfera i gleba) zostały wykonane przy użyciu macierzy niepodobieństwa Bray-Curtis. Macierz niepodobieństwa Bray-Curtis została wygenerowana za pomocą skryptu Python w programie QIIME1.9.1. Analizę CAP opartą na macierzy niepodobieństwa Bray-Curtis przeprowadzono w programie RStudio, przyjmując gatunek rośliny jako czynnik ograniczający. Przeprowadzono statystyczną analizę PERMANOVA w celu określenia istotności różnic pomiędzy gatunkami roślin; wartość P jest przedstawiona w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rycinach reprezentuje całą społeczność drobnoustrojów dla danej próbki. n = 18 dla każdego gatunku we wszystkich typach próbek, z wyjątkiem n = 15 dla mieszanki sideoats grama. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Przykład analizy CAP z wykorzystaniem gatunków jako czynnika ograniczającego dla każdego typu próbki z osobna. Ordynacja głównych współrzędnych i analiza CAP dla każdego typu próbki (endosfera, ryzosfera i gleba) z wykorzystaniem macierzy niezróżnicowania Bray-Curtis. Każdy typ próbki został poddany rzedukcji (rarefakcji) do odpowiednio 486, 17154 i 8231 odczytów na próbkę w endosferze, ryzosferze i glebie. Jako czynnik ograniczający ordynację wykorzystano gatunki. Przeprowadzono analizę statystyczną PERMANOVA w celu określenia istotności różnic między gatunkami roślin w każdym typie próbki, a wartość p przedstawiono w prawym górnym rogu. Każdy symbol na rysunku reprezentuje całą społeczność mikrobiologiczną dla danej próbki. Wielkość próby wynosi n = 29 dla każdego typu próbki, n = 6 dla każdego gatunku rośliny w każdym typie próbki, z wyjątkiem mieszanki sideoats grama (n = 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Metody opisane w tym manuskrypcie powinny umożliwić naukowcom łatwe wejście w dziedzinę metagenomiki gleby i roślin. Z biegiem lat udoskonaliliśmy nasze metody od czasu przeprowadzenia eksperymentu opisanego w tym manuskrypcie. Jedną ze zmian jest to, że teraz wstępnie etykietujemy probówki przed wyjściem w teren w celu pobrania próbek. Nasze laboratorium korzysta z systemu kodów kreskowych oraz drukarki etykiet. Drukarka etykiet nie tylko oszczędza czas podczas etykietowania tubek, ale także ułatwia śledzenie i prawidłową identyfikację próbek bez kaprysów ludzkiego pisma ręcznego. Kolejnym krytycznym punktem jest to, że staramy się przetworzyć materiał po przywiezieniu go z pola tak szybko, jak to możliwe. Naszym celem jest zamrożenie gleby używanej do analizy DNA, sterylizacja i zamrożenie korzeni oraz przefiltrowanie i zamrożenie ryzosfery w ciągu 12 do 36 godzin po powrocie z pola. Procedury ekstrakcji DNA są długotrwałe i składają się z wielu etapów, szczególnie w przypadku gleby i ryzosfery, dlatego zakupiliśmy robota (Kingfisher Flex, ThermoFisher), który minimalizuje czas potrzebny na protokoły ekstrakcji DNA, zmniejsza błąd ludzki, który może zostać wprowadzony, i poprawia spójność w sposobie przetwarzania różnych partii gleby, korzeni lub ryzosfery. Podczas pracy z materiałem roślinnym ważne jest, aby zdecydować się na typ korzenia, który ma być badany, lub pobrać różne typy korzeni, aby uzyskać "reprezentatywną próbkę". Utrzymanie korzeni i liści w stanie zamrożonym podczas przeprowadzania ekstrakcji DNA jest ważne, podobnie jak zapewnienie, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego między próbkami podczas napełniania 96-dołkowych płytek do ekstrakcji DNA. Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest liczba powtórzeń, które mają być użyte podczas projektowania eksperymentów terenowych i stosowania kompletnego projektu randomizowanego, jeśli to możliwe26. Ze względu na dużą zmienność pola może być konieczne przeprowadzenie dużej liczby powtórzeń w celu wykrycia niewielkich różnic. Wreszcie, z naszego doświadczenia wynika, że ważne jest, aby upewnić się, że gleba nie jest zbyt mokra podczas kopania korzeni. Jeśli gleby są nasycone wodą, praca z nimi jest nie tylko niechlujna, ale także bardzo trudno jest zdefiniować ryzosferę i usunąć glebę z korzeni.

Jedną z modyfikacji, która została wprowadzona na wczesnym etapie opracowywania tych metod, było to, że zamiast ręcznie potrząsać rurkami w celu uwolnienia ryzosfery, zmodernizowaliśmy je do wirów zasilanych generatorem gazu, aby ułatwić pracę w terenie i bardziej ustandaryzować pod względem czasu i sposobu mieszania każdej rurki. Jednym z ograniczeń podejścia opartego na sekwencjonowaniu amplikonów jest to, że rozdzielczość taksonomiczna wyników jest często ograniczona, a wiele OTU jest nieznanych lub znanych tylko na poziomie rodziny lub rodzaju. Ta dziedzina badań szybko się rozwija, dlatego ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z nowych i rozwijających się podejść, szczególnie w przypadku analizy danych, która może poprawić rozdzielczość wyników.

Protokoły te służą wyłącznie do badania bakterii i archeonów, a nie grzybów. Zastosowanie różnych starterów do amplifikacji pozwoli na badanie zbiorowisk grzybów przy użyciu tych samych próbek DNA27,28. Metody te nie wymagają zakupu dużych ilości sprzętu, ponieważ metody można uprościć. Metody, które tutaj opisujemy, służą głównie do określania "kto tam jest", ale dziedzina ta szybko ewoluuje w kierunku zadawania ważnych pytań dotyczących funkcji, na które można odpowiedzieć za pomocą metod sekwencjonowania typu shotgun, izolacji i testowania funkcjonalności drobnoustrojów lub sekwencjonowania całych genomów drobnoustrojów.

Reprezentatywne wyniki podkreślają różnice w zbiorowiskach drobnoustrojów, które można zidentyfikować za pomocą opisanych metod. Stosując podejście oparte na różnorodności beta do analizy danych22, wykazano różnice w składzie między typami prób. Różnice te zostały wyraźnie zaobserwowane w większości innych badań, w których endosfera, ryzosfera i gleba zawierają unikalne zbiorowiska drobnoustrojów3. Wskaźnik różnorodności Shannona został obliczony w celu określenia liczebności i równomierności gatunków drobnoustrojów obecnych w każdym gatunku roślin w endosferze, ryzosferze i glebie. Jak wykazano w tym badaniu i wielu innych, różnorodność alfa jest największa w glebie, nieznacznie maleje w ryzosferze, a następnie znacznie maleje w endosferze 3,5,29. Wyniki te wskazują, że opisane tutaj metody są odpowiednie do identyfikacji zmian składu chemicznego w endosferze, ryzosferze i glebie.

Dominacja Proteobacteria jest częstym odkryciem w badaniach nad endosferą i glebą 30,31,32. Endosfera ma na ogół mniejszą różnorodność gatunków drobnoustrojów z wyższą względną liczebnością Proteobacteria. To ponownie podkreśla, że uzyskane tu wyniki są reprezentatywne dla innych ustaleń w literaturze. Efekty stosowania substancji w tym badaniu nie różniły się znacząco, a dwoma głównymi przyczynami takiego stanu rzeczy może być to, że różnice wynikające z zabiegów nie były wystarczająco duże, aby wygenerować wystarczającą zmienność do wykrycia, oraz fakt, że pobieranie próbek zostało wykonane pod koniec sezonu wegetacyjnego, kiedy pola mogły mieć wystarczająco dużo czasu na pobranie azotu do podobnych poziomów, Czyli tyle, ile zostało zmierzone na koniec sezonu. W innym badaniu, w którym zastosowano podobne dawki nawożenia w dłuższym okresie czasu, zmierzono tylko stosunkowo niewielkie zmiany w składzie mikrobiomu33. Inne badania wykazały zmiany zarówno w zbiorowiskach grzybów, jak i bakterii spowodowane nawozem azotowym34,35.

Wiadomo, że gatunki roślin odgrywają rolę w określaniu ich mikrobiomów 3,32,36, a nawet wykazano niewielkie różnice w zmienności społeczności drobnoustrojów między różnymi genotypami roślin w obrębie jednego gatunku 37. W niniejszej pracy stwierdzono istotną różnicę w składzie zbiorowisk mikrobiologicznych między gatunkami roślin. We wszystkich typach próbek okazało się, że proso rózgowate miało najbardziej wyraźny skład mikrobiologiczny, ale różnice między gatunkami były istotne statystycznie tylko w endosferze. Skład zbiorowiska ryzosfery mógłby stać się znaczący, gdyby dostępnych było więcej powtórzeń do analizy.

Opisane tutaj połączone protokoły terenowe, laboratoryjne i analityczne zapewniają potężną metodę badania, w jaki sposób różne czynniki wpływają na skład zbiorowisk drobnoustrojów w glebach, ryzosferze i endosferze korzeni36. Jest jeszcze wiele do zrobienia w dziedzinie badania mikrobiomów, szczególnie w dziedzinach rolniczych. Ważne pytania dotyczące tego, w jaki sposób mikrobiom glebowy zmienia plony, nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Nawet najbardziej podstawowe pytania dotyczące tego, jak płodozmian wpływa na mikrobiom glebowy, jak czas zmienia mikrobiom, jak stres abiotyczny zmienia mikrobiom, jak rodzaj gleby oddziałuje z tymi czynnikami, aby zmienić mikrobiom i czy w niektórych uprawach lub regionach USA występują uniwersalne drobnoustroje, są pytaniami otwartymi. Metody te będą również przydatne w badaniach epidemiologicznych w celu identyfikacji obecności i trwałości bakterii chorobotwórczych i pożytecznych. Kolejnym horyzontem przyszłości dla tych metod będzie rozpoczęcie integracji opisanych tu metod DNA z danymi dotyczącymi RNA i metabolitów roślin i mikrobów. Dodatkowe ulepszenia i testowanie większej liczby zmiennych będą ważne dla dalszej optymalizacji tych protokołów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Rozwój tego manuskryptu jest wspierany przez National Science Foundation EPSCoR Center for Root and Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Gromadzenie danych było wspierane przez fundusze z University of Nebraska-Lincoln, Agricultural Research and Development oraz przez Hatch Grant z USDA. Doceniamy również wsparcie ze strony USDA-ARS oraz wsparcie zostało udzielone przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Konkurencyjny grant nr 2011-68005-30411 z Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA na ustanowienie i zarządzanie tymi polami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dneasy PowerSoil HTP 96 ZestawQiagen/MoBio12955-4Zestaw ekstrakcyjny do gleby i ryzosfery
Dneasy PowerPlant HTP 96 ZestawQiagen/MoBio13496-4Zestaw do ekstrakcji korzeni
Łopata do kopania z uchwytem D, 101 cm LGlebogryzarka szybka Fiskars9669
, 40 cm LTruper34316
Worki Ziploc, 17,7 cm x 19,5 cmZiplocNA
CoolerDowolnaNA
Patelnia do myciaDowolnaNA
Plastikowe wiadroDowolneNA
Rękawice (robocze i laboratoryjne)DowolnaNA
Średnica 20 cm Sito do gleby #8, 2360 μ m rozmiar oczekDual Manufacturing Co., Chicago ILUS8-8FS
Sito glebowe o średnicy 20 cm #4, 4750 μ m rozmiar oczekDual Manufacturing Co., Chicago ILPrzenośny generator US8-4FS
Marka Honda działa dobrzeNA
Sterylne sitka komórkowe 100 μ m rozmiar oczekFisher Scientific22-363-549
NaH2PO4· H2OVWR0823
Na2HPO4VWR0404
Silwet L-77Lehman SeedsVIS-30powierzchniowo czynnych
Dowolnakuchenka
DowolnaNA
Dowolny
wybielaczCLOROX - siła gospodarstwa domowegoNA
Tween 20DowolnaNA
Ciekły azotDowolnaNA
Granulki suchego loduDowolnaNA
EtanolDowolnaNA
11 cm Precyzyjna pęseta drobno punktowaFisher17456209
18 cm Kleszczyki do próbek prosteVWR82027-436
Nożyczki do przycinania 13,5 cmRurka Fiskars9921
2 mlDowolna
15 ml PPMIDSCIC15B
Rurka stożkowa PP 50 mlMIDSCIC50B
Woda ultraczystaMillipore-sigmaMilli-Q Integral, fluorometr
Qubit 2.0InvitrogenQ32866
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32854Do kwantyfikacji DNA usuniętych próbek
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2670Do kwantyfikacji DNA
96-dołkowy z przezroczystymi płaskimi płytkami dolnymiCorning3631
pPNA PCR BlockerPNA BioPP01-50
mPNA PCR BlockerPNA BioMP01-50
Genomowe DNA z mikrobiologicznej społeczności makiety B (nawet niskie stężenie) v5.1L, do sekwencjonowania genów 16s rRNAZasoby BEIHM782D
Klej 8-dołkowe paski do płytekVWR89134-434
Koraliki ze stali nierdzewnej, średnica 3,2 mm Blok testowyNext AdvanceSSB32
1 ml (płytka do ekstrakcji DNA do Qiagen/MoBio Dneasy Zestaw PowerPlant HTP)CoStar3959
antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar mały do gleby/ryzosferyTWD Tradewinds, INCASWF1SPK
antystatyczny lejek wagowy PP, rozmiar x-mały do korzeni/liściTWD Tradewinds, INCASWFXSCS
Genie 2 Digital VortexScientific IndustriesSI-0236
Adapter Vortex do probówek50 mlScientific IndustriesSI-H506
Moździerz (100 ml) i tłuczekDowolnaNA
Metalowa mikroszpatułkaVWR80071-672
Jednorazowe antystatyczne mikroszpatułkiVWR231-0106
Brązowa torba papierowa 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)Duro18402
5424 Wirówka do probówki 2 mlEppendorf22620461
Wirówka na płytkę 96-dołkowąSigma4-16S81510
Wirnik wirówki do probówek 50 mlSigma4-16S12269 - Biosafe
KAPA HiFi Polimeraza DNAKapa Biosystems
Autoklawy środków do suszenia na NA skala rurka stożkowa NA Q-POD

Bibliografia

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15 (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7 (1), 15019(2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7 (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47 (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77 (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87(2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34 (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. , Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10 (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688(1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1 (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151(2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71 (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84 (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349 (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950(2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115 (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91 (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5 (7), e11915(2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza spo eczno ci mikrobiologicznychpobieranie pr bek mikrobiomu glebowegoizolacja z ryzosferyekstrakcja z endosfery korzeniaprotok ekstrakcji DNAamplifikacja 16S rRNApowt rzenia pr b polowychpor wnanie genotyp w ro linzmienno typ w pr bekanaliza bioinformatyczna
Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.