Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej

16.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57937

⸱

16 lipca 2018

 ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

W tym artykule

Podsumowanie

Proteazy są ściśle regulowanymi enzymami zaangażowanymi w podstawowe procesy biologiczne, a rozregulowana aktywność proteazy napędza postęp złożonych chorób, takich jak rak. Celem tej metody jest stworzenie nanoczujników, które mierzą aktywność proteazy in vivo, wytwarzając sygnał rozszczepienia, który jest wykrywalny w moczu gospodarza i dyskryminuje chorobę.

Streszczenie

Proteazy to wielofunkcyjne enzymy, które specjalizują się w hydrolizie wiązań peptydowych i kontrolują szerokie procesy biologiczne, w tym homeostazę i allostazę. Co więcej, rozregulowana aktywność proteazy napędza patogenezę i jest funkcjonalnym biomarkerem chorób takich jak rak; W związku z tym zdolność do wykrywania aktywności proteazy in vivo może dostarczyć klinicznie istotnych informacji dla diagnostyki biomedycznej. Celem tego protokołu jest stworzenie nanoczujników, które badają aktywność proteazy in vivo, wytwarzając wymierny sygnał w moczu. Te nanoczujniki proteazy składają się z dwóch składników: nanocząstki i substratu. Nanocząstka działa w celu wydłużenia okresu półtrwania krążenia i dostarczania substratu do docelowych miejsc chorobowych. Substratem jest krótka sekwencja peptydowa (6-8 AA), która jest zaprojektowana tak, aby była specyficzna dla docelowej proteazy lub grupy proteaz. Substrat jest sprzężony z powierzchnią nanocząstki i jest zakończony reporterem, takim jak marker fluorescencyjny, w celu wykrycia. Gdy rozregulowane proteazy rozszczepiają substrat peptydowy, reporter jest filtrowany do moczu w celu określenia ilościowego jako biomarker aktywności proteazy. W artykule opisano budowę nanosensora dla metaloproteinazy macierzy 9 (MMP9), która jest związana z progresją guza i przerzutami, do wykrywania raka jelita grubego w modelu mysim.

Wprowadzenie

Proteazy są wielofunkcyjnymi enzymami specjalizującymi się w hydrolizie wiązań peptydowych, które wywierają istotny wpływ na wiele procesów biologicznych, w tym na homeostazę, allostazę oraz rozwój chorób1. Zmieniony stan aktywności proteaz skorelowano z szeregiem schorzeń, w tym z nowotworami i chorobami układu sercowo-naczyniowego, co czyni proteazy atrakcyjnymi kandydatami do opracowania jako biomarkery kliniczne2,3. Ponadto aktywność proteaz jest funkcjonalnie powiązana z odmiennymi patogenezami, wynikami leczenia pacjentów oraz rokowaniem w przebiegu choroby4. W szerokim ujęciu opracowano biosensory do wykrywania różnych zjawisk biologicznych i chorób, takich jak nowotwory, choroby neurodegeneracyjne oraz procesy przeniesienia elektronów5,6,7,8,9. Bardziej szczegółowo, opracowano sensory proteaz oparte na substratach do wykrywania aktywności proteolitycznej, obejmujące sondy fluorogenne do obrazowania diagnostycznego10 oraz izotopowo znakowane substraty peptydowe do detekcji in vitro za pomocą spektrometrii mas1. Dodatkowo opracowano sondy oparte na aktywności, które zawierają regiony przypominające substrat, wiążące lub modyfikujące docelową proteazę12. W tej metodzie docelowa proteaza zostaje nieodwracalnie zahamowana w momencie modyfikacji centrum aktywnego, a analiza wymaga pobrania tkanki, co ogranicza zastosowania in vivo. Niemniej jednak detekcja aktywności proteaz in vivo jest istotna, ponieważ regulacja tej aktywności jest silnie zależna od kontekstu innych procesów biologicznych, takich jak obecność inhibitorów endogennych.

Celem niniejszej pracy jest opis sformułowania aktywnych nanosensorów, które wykrywają aktywność proteaz in vivo poprzez generowanie mierzalnego sygnału w moczu. Platforma ta jest wykorzystywana jako nieinwazyjna metoda diagnostyczna do rozróżniania złożonych schorzeń, takich jak nowotwory, przy wykorzystaniu rozregulowanej aktywności proteaz jako funkcjonalnego biomarkera. Nasza platforma nanosensorowa składa się z nanocząsteczek tlenku żelaza (IONP) skoniugowanych z substratami proteaz. Substraty te kończą się reporterem fluorescencyjnym, który jest uwalniany w momencie, gdy proteazy rozcinają substrat. Te IONP krążą in vivo, lokalizują się w miejscach choroby i wystawiają substraty na działanie aktywnych proteaz związanych z chorobą. Po rozcięciu reportery fluorescencyjne zostają uwolnione i ze względu na swój niewielki rozmiar są filtrowane do moczu, podczas gdy nierozcięte substraty na IONP pozostają w organizmie. W związku z tym wzrost aktywności proteaz in vivo doprowadzi do wyższego stężenia reportera w moczu (Rycina 1). Ponieważ nasza platforma jest testem moczu, nie jest wymagana platforma obrazująca, a sygnały diagnostyczne są wzbogacane w moczu.

Platformę tę można zaprojektować do wykrywania różnych chorób, w tym nowotworów, włóknienia i zakrzepicy13,14. W niniejszej pracy opisujemy konstrukcję nanoczujników służących do wykrywania zwiększonej aktywności metaloproteinazy macierzy 9 (MMP9) jako biomarkera raka jelita grubego. Rak jelita grubego jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu nowotworów w Stanach Zjednoczonych, szacuje się, że tylko w 2014 roku odnotowano 136 80 nowych przypadków i 50 30 zgonów15. Komórki nowotworowe jelita grubego produkują MMP9, o której wykazano, że napędza ona progresję złośliwą, degradację macierzy oraz przerzuty16. Ponadto w literaturze zidentyfikowano odpowiedni substrat peptydowy (PLGVRGK) dla MMP917. Platforma ta może być wykorzystana do wczesnego wykrywania nowotworów oraz niskokosztowej diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care)13,14,18,19,20,21.

Schemat ścieżki proteolizy związanej z chorobą; zastosowanie IONP do filtracji nerkowej i diagnostyki moczu.
Rycina 1: Schemat działania nanoczujnika In vivo. Nanosensory krążą w organizmie i lokalizują się w miejscach występowania choroby. Następnie proteazy związane z chorobą rozszczepiają substraty peptydowe prezentowane przez IONP. Rozmiar odszczepionych fragmentów umożliwia ich wydalanie przez nerki, co prowadzi do ich gromadzenia się w moczu. Po oddaniu moczu przez zwierzę, fragmenty peptydowe te mogą zostać poddane analizie dzięki cząsteczce reporterowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Do przeprowadzenia następujących eksperymentów na zwierzętach wymagana jest zgoda Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w instytucji badacza. Ponadto, do prawidłowej realizacji tych doświadczeń niezbędne są standardowe zapleczowe urządzenia do opieki nad zwierzętami (np. klatki bytowe, sterylne kaptury dla zwierząt, komory z izofluranem do znieczulania oraz komory z CO2 do etycznej eutanazji w punkcie końcowym). Specjalistyczne szkolenie oraz pomoc w obsłudze tych urządzeń mogą być zapewnione przez Laboratorium Badań Fizjologicznych (PRL) w danej instytucji. Wszystkie prace ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez IACUC w Georgia Tech (protokół: A1410).

1. Synteza nanocząsteczek tlenku żelaza (IONP)

UWAGA: Bezpieczeństwo: Cały proces syntezy nanocząsteczek tlenku żelaza powinien być przeprowadzany z użyciem środków ochrony osobistej pod wyciągiem chemicznym.

  1. W probówce stożkowej o pojemności 15 mL schłodzić 1 mL 30% wodorotlenku amonu w pojemniku z lodem przez 30 min.
  2. Przemyj kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml wodą dejonizowaną, a następnie dodaj 10 ml wody podwójnie destylowanej (ddH2O).2O). Zanurzyć zewnętrzną część kolby w łaźni lodowej umieszczonej na mieszadle z podgrzewaczem. Za pomocą plastikowej pipety doprowadzić strumień N2 gaz do ddH2O2O w kolbie. Przebąblać przez 15 minut N22 w celu odtlenienia.
  3. Odważ 224 µmol (4,5 g) dekstranu (masa cząsteczkowa (MW) = 20 kDa) do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Dodać H2Dodać objętość O w taki sposób, aby objętość końcowa mieszaniny, wliczając dekstran, wynosiła 20 ml. Intensywnie wymieszać wortexie, aby rozpuścić dekstran.
  4. Odważony/a 290 µmol (78,5 g) chlorek żelaza(III) sześciowodny należy dodać do roztworu dekstranu i wymieszać w wibratorze (vortexie) do całkowitego rozpuszczenia.
  5. Przefiltruj otrzymany roztwór przez 0.2 µm filtr
  6. Przenieść 1 ml schłodzonego wodorotlenku amonu do 9 ml odtlenowanej wody. Przenieść z powrotem do 4 °C.
  7. Odważyć 367 µmol (73,0 g) tetrahydratu chlorku żelaza(II), rozpuścić w 1 ml beztlenowej wody ddH2O, a następnie przefiltrować przez 0.2 µm filtr
  8. Przenieś roztwór dekstranu i żelaza(III) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml i odgazuj go azotem.2 przez 15 minut na lodzie. Mieszać za pomocą magnetycznego mieszadła wirującego z prędkością 1600 obr./min.
  9. Aby stworzyć jednorodną atmosferę azotową, zamknąć kolbę septem gumowym. Przebić septum igłą o rozmiarze 18 G, aby wprowadzić strumień N22 do kolby. Wprowadź osobną igłę o rozmiarze 18 G jako wylot przepływu.
  10. Dodaj 467 µL roztworu żelaza(II) do roztworu dekstranu-żelaza(III) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego przy 1600 obr./min. Taki stosunek żelaza(II) do żelaza(III) prowadzi do zrównoważonej reakcji, w wyniku której powstanie magnetyt, czyli Fe3O4.
  11. Kroplami dodaj schłodzony rozcieńczony wodorotlenek amonu do roztworu dekstranu żelaza(II)-żelaza(III), aby zainicjować proces nukleacji.21Upewnij się, że każda kropla została dobrze wymieszana przed dodaniem kolejnej. Zakończ reakcję po dodaniu 1–2 ml wodorotlenku amonu.
  12. Zatrzymaj przepływ N22 i usuń gumowy przegrodę. Usuń łaźnię lodową i zastąp ją łaźnią z ciepłą wodą, cały czas mieszając roztwór. Upewnij się, że temperatura roztworu osiągnie 75 °C i inkubować przez 75 minut.
  13. Zdejmij kolbę z mieszadła z podgrzewaniem i przefiltruj roztwór dwukrotnie przez 0.2 µm następnie 0.1 µm filtry do usuwania grubych cząstek.
  14. Wymień bufor cząsteczek na ddH2O2Użyj koncentratorów o progu odcięcia masy cząsteczkowej (m.w.c.o.) 10 kDa, aby usunąć nadmiar dekstranu z roztworu, który powinien być bardzo lepki. Wymień filtry, jeśli przesącz pozostaje ciemny nawet po 2–3 wirowaniach, co może wskazywać na uszkodzenie filtra.
    1. Aby przeprowadzić wymianę buforu za pomocą filtrów wirowych, odwiruj przy 4 °C wirować przy 480 X g przez 15 minut, odrzucić supernatant i dodać nowy bufor do roztworu IONP. Powtórzyć czynność 3–5 razy.
  15. Wyznacz stężenie nanocząstek za pomocą spektrofotometru/czytnika płytek. Wykonaj pomiary absorbancji przy 40 nm i zastosuj współczynnik ekstynkcji molowej IONP dla tej długości fali (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) w celu oznaczenia stężenia cząstek IO.
  16. Resuspender IONP do stężenia 10 mg/ml w wodzie ddH2O (zwykle objętość całkowita wynosi ~3 ml) i należy upewnić się, że w tym kroku zastosowano probówki polipropylenowe ze względu na kompatybilność chemiczną. Dodać 1,6 objętości 5 M NaOH, a następnie 0,65 objętości epichlorohydryny. Energicznie mieszać na wytrząsarce płytkowej w temperaturze pokojowej przez 12 godzin w celu sieciowania dekstranu.
  17. Używając strzykawki o pojemności 20 ml z igłą o rozmiarze 18G, przenieś roztwór IONP do membrany dializacyjnej o progu odcięcia masy cząsteczkowej (m.w.c.o.) 50 kDa. Umieść membranę dializacyjną w 4 l podwójnie destylowanej wody (ddH2O).2O i zastąpienie H2kilka razy (co 2–3 godziny). Inkubować przez noc.
  18. Zmierz stężenie i doprowadź IONP do stężenia 5 mg/ml (patrz krok 1.15). Dodaj wodorotlenek amonu do osiągnięcia stężenia 20% (v/v) i wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez > 12 godzin na aminowanie powierzchni IONP. Wymiana buforu przy użyciu filtrów o progu odcięcia masy cząsteczkowej (m.w.c.o.) 30 kDa (patrz 1.14).
  19. Zredukuj objętość do 2,5–3,5 ml przed końcowym oczyszczaniem za pomocą szybkozmiennej chromatografii cieczowej białek (FPLC; patrz Tabela materiałów do kolumny do filtracji żelowej).
  20. Wykorzystaj dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) do oznaczenia promienia hydrodynamicznego IONP (oczekiwany zakres 10–10 nm, średnia wielkość 40–50 nm). W tym celu przenieś 1 ml próbki IONP rozcieńczonej 10-krotnie do kuwety, umieść ją w urządzeniu i wykonaj pomiar przy użyciu oprogramowania producenta.
    UWAGA: Całkowita populacja IONP będzie wynosić od 10 do 10 nm w pomiarach DLS, jednak większość populacji oscyluje wokół średnicy średniej, która mieści się w zakresie 40–50 nm. W celu ograniczenia zakresu wielkości można dodatkowo zastosować chromatografię wykluczania cząsteczkowego, aby wyizolować frakcje o różnych średnicach. IONP należy przechowywać w 4 °C.

2. Projektowanie peptydów, koniugacja z IONP i walidacja in vitro

  1. Synteza substratu peptydowego (np. (przez jednostkę usługową lub komercyjnie) dla docelowej proteazy z N-końcowym reporterem fluorescencyjnym, takim jak izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), oraz C-końcową resztą cysteiny w celu umożliwienia sprzęgania za pośrednictwem grup tiolowych.
    UWAGA: W przypadku niniejszego badania nad MMP9 zastosowany peptyd to FITC-PLGVRGK-C, gdzie kkot/Km ~ 2,0 x 105 M-1s-1.
  2. Odważ 0,5 mg IONP (stężenie 1 mg/ml) i dokonaj wymiany buforu na bufor sprzęgający (50 mM boranu sodu z 1 mM EDTA, pH = 8,5), używając spin filtra z granicą odcięcia masy cząsteczkowej (m.w.c.o.) 10 kDa (patrz krok 1.14).
  3. Rozpuścić jodooctan succinimidylu (SIA) w dimetyloformamidzie (DMF), aby uzyskać stężenie ok. 30 mg/ml, a następnie dodać SIA do IONP w stosunku molowym 50 SIA:IONP.
    UWAGA: SIA jest heterobifunkcyjnym czynnikiem sieciującym, który pośredniczy w sprzęganiu grup aminowych na powierzchni IONP z grupami sulfhydrylowymi podłoża peptydowego.
  4. Inkubować przez 1–2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności. W przypadku inkubacji przez noc, inkubować w temperaturze 4 °C.
  5. Wymiana buforu za pomocą wirówki kolumnowej z granicą odcięcia masy cząsteczkowej (m.w.c.o.) 10 kDa do buforu sprzęgającego w celu usunięcia niezareagowanego SIA (patrz krok 1.14).
  6. Doprowadzić ostateczny roztwór produktu do stężenia 1 mg/mL (0,5 mL roztworu). Wymieszać wybrany peptyd w stosunku molowym 90:1 (peptyd:IONP) z glikolem polietylenowym (PEG) o masie 20 kDa zakończonym grupą tiolową w stosunku molowym 20:1 (PEG:IONP). Wymieszać ten roztwór peptyd-PEG z IONP.
  7. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na wytrząsaniu z najwyższą prędkością, owijając probówki folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu cząsteczek fluorescencyjnych.
  8. Dodać L-cysteinę w stosunku molowym 50:1 (C:IONP), aby zneutralizować wszelkie niezareagowane cząsteczki SIA. Inkubować przez 1 godzinę w 25 °C na wytrząsarce przy najwyższej prędkości w temperaturze pokojowej.
  9. Oczyścić za pomocą FPLC (patrz 1.1.19). Użyć spektrofotometru do pomiaru absorbancji roztworu próbki i obliczyć stosunek peptyd:IONP zgodnie z poniższym opisem. Po oczyszczeniu przechowywać produkt w stężeniu 1 mg/ml w 4 °C w PBS.
    1. Użyj spektrofotometru do pomiaru absorbancji roztworu próbki przy 40 nm (Apróbka,40) oraz długość fali maksymalnego absorbancji dla użytego fluoroforu, która dla FITC wynosi 48 nm (Apróbka,48). Zmierz absorbancję roztworu zapasu aminowych IONP przy tych samych dwóch długościach fal (400 nm i 48 nm), które są odpowiednio reprezentowane jako ANP-40 oraz ANP,48.
    2. Użyj równań 1 i 2 do obliczenia znormalizowanej wartości A400 oraz A488 wartości.
      Schemat równania stanu równowagi: A<sub>40</sub> = A<sub>NP,40</sub> dla analizy absorpcyjnej.          Równanie 1
      Równanie absorpcji przy 48 nm $A = \frac{A_{NP,40}}{A_{sample,40} - A_{sample,48} - A_{NP,48}}$ dla analizy spektroskopowej.          Równanie 2
    3. A400 oraz A488 przedstawiają znormalizowane wartości próbki. Wartości te należy wykorzystać do obliczenia stosunku peptyd:IONP zgodnie z równaniem 3.
      Formuła peptyd-IONP, równanie do analizy spektroskopowej z wykorzystaniem stosunku absorbancji A48/A40.          Równanie 3
    4. Gdzie Równanie nanocząsteczek jonowych, εIONP, na schemacie badawczym, istotne dla badań z zakresu nanochemii. i Równanie wydajności kwantowej fluorescencji, symbol ε_fluorophore dla analizy spektroskopowej. odpowiednio współczynniki absorpcji molowej IONP oraz fluoroforu. W przypadku tych cząstek Równanie nanocząstek jonowych, εIONP, na schemacie badawczym, istotne dla studiów nad nanochemią. = 2,06 x 106 M-1cm-1 a dla FITC Równanie wydajności kwantowej fluorescencji, symbol ε_fluorophore dla analizy spektroskopowej. = 72 0 M-1cm-1, zatem wartość  Stosunek współczynników ekstynkcji molowej εIONP/εfluoroforu, równanie w analizie spektroskopowej. powinno wynosić 28,75. Typowe stosunki peptyd:IONP powinny mieścić się w zakresie od 20:1 do 50:1.
  10. Zweryfikuj funkcjonalność sond, przeprowadzając in vitro test cięcia białek
    1. Przygotować roztwór z PBS (1% BSA) w formie 18 µL roztwór nanocząstek o stężeniu peptydy 200 nM. Wymieszać z 2 µL proteazy będącej przedmiotem zainteresowania (MMP9; 0,1–1 mg/ml).
    2. Inkubować w czytniku płytek w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wykonując pomiary fluorescencji (przy użyciu odpowiednich długości fali wzbudzenia i emisji, które dla FITC wynoszą odpowiednio 485 nm i 528 nm) co 1–2 minuty w celu monitorowania rozszczepienia.

3. Podawanie nanoczujników i wykrywanie raka w moczu

UWAGA: Więcej szczegółów na temat modelu przykładowego znajduje się w naszym poprzednim raporcie13.

  1. Stwórz klatkę metaboliczną do zbierania moczu, mocując cylindryczną tuleję do górnej części płytki 96-dołkowej. Podczas zbierania moczu umieść mysz wewnątrz tulei i przykryj ją pokrywką od szalki Petriego, aby zapobiec ucieczce zwierzęcia.
  2. Przygotuj roztwór do wstrzyknięcia (200 µL maksymalna objętość) zawierająca nanoczujniki o stężeniu 30 mg/kg (~50 µmol) za pomocą peptydydu w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
  3. U samic 8-tygodniowych myszy nago, z ksenoprzeszczepami guzów jelita grubego LS174T o objętości ok. 10–30 mm³3podaj roztwór nanoczujnika poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, co powinno nastąpić mniej więcej w 10. dniu. Bezpośrednio po wstrzyknięciu umieść myszy w klatkach metabolicznych i odnotuj czas podania preparatu dla każdej myszy.
  4. W czasie od 60 do 90 minut po wstrzyknięciu należy zdjąć tuleję cylindryczną z płytki 96-dołkowej. Unieruchomić mysz i wywrzeć lekki nacisk na pęcherz, aby pobudzić myszy do oddania reszty moczu na płytkę. Zebrać cały mocz (200 - 500 µL).
  5. Należy przeanalizować próbki moczu za pomocą immunoprecypitacji w celu oczyszczenia FITC z moczu i zwiększenia czułości. Należy użyć kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami anty-FITC.
    1. Najpierw przemyć 25 mg kulek magnetycznych 3 razy buforem do powlekania, a następnie doprowadzić objętość końcową do 225 µL.
      UWAGA: Ważne jest, aby bufor do powlekania (0,1 M boran sodu, pH 9,5), bufor blokujący (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) oraz bufor do płukania (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) przygotowywać na świeżo każdego razem; wymagane jest około 20 ml każdego z nich.
    2. Dodaj 200 µL anty-FITC (5 mg/mL) oraz 200 µL siarczanu amonu (3 M). Inkubować przez 16–24 godziny w temperaturze 37°C na rotatorze.
    3. Przenieś roztwór do separatora magnetycznego, usuń nadsącz i zastąp go 625 Równowaga statyczna; równania ΣFx=0; równowaga sił; schemat fizyczny; zastosowanie edukacyjne.bufor blokujący Λ, a następnie inkubować w temperaturze 37°C przez noc. Następnie przemyć 3 razy buforem do płukania i przechowywać w 1,25 ml buforu do płukania.
    4. Inkubować 2 µL moczu z 5 µL kulek magnetycznych (20 mg/ml) i dopełnić do całkowitej objętości do 50 µL w buforze PBS (0,01% Tween 20). Inkubować przez 60 min.
    5. Przemyć dwukrotnie za pomocą 50 µL PBS (0,01% Tween 20), z zastosowaniem separatora magnetycznego do zbierania kulek magnetycznych po każdym przemyciu.
    6. Przemyć dwukrotnie za pomocą 32.5 µL z 5% lodowatego kwasu octowego. Zneutralizować połączone elucjaty (70 µLz 35 µL 2 M Tris, aby uzyskać końcowe pH ok. 7.
    7. Odczytano na czytniku płytek (patrz Tabela materiałów) przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji w celu ilościowego oznaczenia fluorescencji moczu. Obliczyć stężenie reportera fluorescencyjnego, korzystając z krzywej wzorcowej o znanych stężeniach wolnego fluoroforu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Większość populacji IONP ma średnicę oscylującą wokół wartości średniej, która mieści się w zakresie 40 - 50 nm. Po pegylacji cząstki o takim zakresie rozmiarów wykazują okres półtrwania w krążeniu wynoszący około 6 godzin13 in vivo (patrz Rysunek 2a). W celu wyselekcjonowania konkretnego zakresu rozmiarów można zastosować chromatografię wykluczania treści w celu wyizolowania frakcji IONP o różnych średnicach. W obrazowaniu TE...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda ta opisuje rozwój nanoczujników opartych na aktywności, składających się z substratów proteazy sprzężonych z rdzeniem nanocząstki. Zdarzenie rozszczepienia proteolitycznego nazywa się "przełącznikiem farmakokinetycznym", ponieważ rozszczepione produkty peptydowe są mniejsze niż limit filtracji wielkości nerki wynoszący 5 nm23 i przenikają do moczu w celu wytworzenia nieinwazyjnego sygnału. Dlatego ważne jest, aby używać nanocząstek lub nośników o promieniu hydrodynamicznym większym niż 5 nm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Kwong jest współzałożycielem i konsultantem firmy Glympse Bio, która opracowuje produkty związane z badaniami opisanymi w tym artykule. To badanie może mieć wpływ na jego osobisty status finansowy. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Georgia Tech zgodnie z jej polityką przeciwdziałania konfliktom interesów

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Nagrodę Dyrektora NIH dla Nowych Innowatorów (Nagroda No. DP2HD091793). Q.D.M. jest wspierany przez NSF Graduate Research Fellowships Program (Grant No. DGE-1650044). B.A.H jest wspierany przez National Institutes of Health GT BioMAT Training Grant pod numerem nagrody 5T32EB006343, a także stypendium Georgia Tech President's Fellowship. G.A.K. posiada nagrodę Career Award w Scientific Interface przyznawaną przez Burroughs Welcome Fund. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtry strzykawkoweVWR4652
18G igłaVWR89134-024
15 ml stożkoweVWR89039-670
250 ml Kolba ErlenmeyeraVWR89000-362
MieszadłoVWR58949-006
MieszadłoVWR97042-634
Lodowaty kwasoctowyVWR97064-482
Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)Thermo FisherA13100
Sześciowodny chlorek żelaza (III)Sigma236489
Czterowodny chlorek żelaza (II)Sigma44939
EpichlorohydrynaSigma45340-500ML-F
DMFSigmaD4551
Amon WodorotlenekSigma320145-500ML
Granulki wodorotlenku soduSigma221465-500G
EDTASigmaE9884
Boran soduSigmaB9876
L-cysteinaSigma168149-100G
Tris-HClSigmaT5941
Baza TrisSigmaT6066
PBS tabletkiSigmaP4417
DextranPharmacosmos5510 0020 9006
Amicon 15 ml 10k filtry, 24 pkMilliporeUFC901024
Amicon 15 mL 30k filtry, 24 pkMilliporeUFC903024
Amicon 15 mL 100k filtry, 24 pkMilliporeUFC910024
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalNanoZS
Slide-A-LyzerLifeTech66130
Dynabeads MyOne TosylactivatedLifeTech65501
SIALife Tech22349
PEG 20kLaysan BioMPEG-SH-20K-1g
Przeciwciało fluoresceinowe [2A3]GeneTexGTX10257
Hiload 16/600 superdex 200GE Healthcare45-002-490
Czytnik płytekFisherBTCYT5M
BD Strzykawki insulinoweFisherNC0872854
gorące/magnetyczne Kaseta do dializy

Bibliografia

  1. Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
  2. Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
  3. Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
  4. Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
  5. Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140(2013).
  6. Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
  7. Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
  8. Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
  9. Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
  10. Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
  11. Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
  12. Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
  13. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
  14. Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
  15. Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
  16. Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
  17. Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
  18. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  19. Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
  20. Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
  21. Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
  22. Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).
  23. Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  24. Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
  25. Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
  26. Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
  27. Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Detekcja in vivonanocząsteczki tlenku żelazasubstrat peptydowyreporter fluorescencyjnybiomarker w moczumetaloproteinaza macierzy 9rak jelita grubegomodel mysi
Nanoczujniki do wykrywania aktywności proteazy in vivo w diagnostyce nieinwazyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.