Artykuł metodologiczny

Ocena stanu zdrowia dzikich ryb na podstawie sekcji zwłok

18.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57946

⸱

11 września 2018

 ,  ,  , 
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center, U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources, West Virginia University

W tym artykule

Podsumowanie

Zdrowie dzikich ryb może być używane jako wskaźnik zdrowia ekosystemu wodnego. Oceny stanu zdrowia ryb oparte na sekcji zwłok dostarczają dokumentacji widocznych zmian lub nieprawidłowości, danych wykorzystywanych do obliczania wskaźników stanu, a także możliwości pobrania tkanek do oceny mikroskopowej, ekspresji genów i innych bardziej szczegółowych analiz.

Streszczenie

Antropogeniczne wpływy, od zwiększonej ilości składników odżywczych i zanieczyszczeń chemicznych, po zmiany siedlisk i zmiany klimatu, mogą mieć znaczący wpływ na populacje ryb. Monitorowanie działań niepożądanych, wykorzystujące biomarkery od poziomu organizmu do poziomu molekularnego, można wykorzystać do oceny skumulowanego wpływu na ryby i inne organizmy. Zdrowie ryb jest wykorzystywane na całym świecie jako wskaźnik zdrowia ekosystemów wodnych. Ocena stanu zdrowia ryb oparta na sekcji zwłok dostarcza danych na temat widocznych nieprawidłowości i zmian chorobowych, pasożytów, stanu i wskaźników organosomatycznych. Można je porównywać według miejsca, pory roku i płci, a także czasowo, aby udokumentować zmiany w czasie. Oceny dotkliwości można przypisać do różnych obserwacji w celu obliczenia wskaźnika zdrowia ryb w celu bardziej ilościowej oceny. Wadą oceny opartej na sekcji zwłok jest to, że opiera się ona na obserwacjach wizualnych i czynnikach warunkowych, które nie są tak czułe jak biomarkery tkankowe i subkomórkowe dla skutków subletalnych. Dodatkowo rzadko udaje się zidentyfikować przyczyny lub czynniki ryzyka związane z obserwowanymi nieprawidłowościami. Tak więc, na przykład, wypukła zmiana lub "guz" na płetwach, wargach lub powierzchni ciała może być nowotworem. Jednak może to być również odpowiedź na pasożyta, przewlekłe zapalenie lub przerost normalnych komórek w odpowiedzi na czynnik drażniący. I odwrotnie, nowotwory, niektóre pasożyty, inne czynniki zakaźne i wiele zmian w tkankach nie są widoczne, a więc mogą być niedoceniane. Jednak podczas oceny opartej na sekcji zwłok można pobrać krew (osocze), tkanki do histopatologii (patologia mikroskopowa), genomika i inne analizy molekularne oraz otolity do starzenia. Te dalsze analizy, wraz z analizami geoprzestrzennymi, ocenami siedlisk, analizami jakości wody i zanieczyszczeń, mogą być ważne w kompleksowych ocenach ekosystemów.

Wprowadzenie

Działalność człowieka ma wiele negatywnych skutków dla środowiska wodnego. Ryby zamieszkują różne zbiorniki wodne, w których ludzka populacja odtwarza i często wykorzystuje jako źródło wody pitnej, a zatem są ważnymi wskaźnikami zdrowia środowiska wodnego. Dzikie ryby, które żyją i rozmnażają się w określonym środowisku, są narażone przez całe życie na różne czynniki stresogenne, w tym patogeny, pasożyty, złą jakość wody i zanieczyszczenia chemiczne. Tysiące chemikaliów dostaje się do naszych dróg wodnych przez ścieki przemysłowe i ludzkie, podmiejskie/miejskie wody burzowe i spływy rolnicze. Te złożone mieszaniny substancji chemicznych mogą mieć addytywny, synergistyczny lub antagonistyczny wpływ na narażone organizmy1,2,3. Ponadto inne stresory środowiskowe, takie jak podwyższony poziom składników odżywczych, podwyższona temperatura, niski poziom rozpuszczonego tlenu lub wahania pH, mogą nasilać skutki zanieczyszczeń chemicznych4,5. Stresory środowiskowe mogą również bezpośrednio wpływać na wyniki chorób zakaźnych poprzez zwiększanie liczby czynników zakaźnych6, zwiększając zjadliwość patogenów oportunistycznych7 lub tłumiąc odpowiedź immunologiczną i odporność na choroby gospodarza8,9,10. Z tych powodów rośnie zainteresowanie monitorowaniem skutków biologicznych lub negatywnych11,12,13,14, wykorzystując ryby i inne organizmy wodne do identyfikacji zagrożonych populacji i ekosystemów.

Monitorowanie negatywnych skutków wykorzystuje biomarkery na różnych poziomach organizacji, od organizmu do subkomórkowego lub molekularnego, do identyfikacji efektów subletalnych, które mogą wpływać na populacje i wskazywać na narażenie na różne stresory. Wskaźnikami na poziomie organizmu są widoczne nieprawidłowości i stany. Wskaźniki kondycji oparte na długości i wadze są obliczane w celu oceny dobrostanu lub sprawności populacji ryb. Najczęstszym z nich są współczynniki warunku Fultona (K) = (waga/długość3) 15. Innym wskaźnikiem jest obecność widocznych nieprawidłowości. W indywidualnych badaniach i programach monitorujących zastosowano różne metody w celu oceny, udokumentowania i oceny widocznych nieprawidłowości. Ocena oparta wyłącznie na nieprawidłowościach zewnętrznych, tj. odsetku osób z chorobami, uszkodzeniami płetw, guzami i anomaliami szkieletowymi, jest jednym z wskaźników wskaźnika integralności biotycznej (IBI), który ocenia zdrowie społeczności16. Podobna ocena określana jako DELT (deformacje, nadżerki, zmiany chorobowe, nowotwory) została również wykorzystana do oceny zdrowia społeczności ryb17. Jednak metody te oceniają tylko zewnętrzne nieprawidłowości wizualne, a nie zmiany wewnętrzne lub wczesne wskaźniki subletalne.

Oceny oparte na sekcji zwłok obejmują obserwacje zewnętrzne i wewnętrzne oraz pozwalają na pomiar dodatkowych wskaźników stanu. Indeks hepatosomatyczny (masa wątroby/całkowita masa ciała) był również używany jako wskaźnik kondycji lub rezerw energetycznych15, dla którego wyższa wartość indeksu oznacza zdrowsze ryby. Jednak wiele badań wykazało, że przerost lub wzrost rozmiaru wątroby występuje z powodu narażenia na różne zanieczyszczenia metabolizowane przez wątrobę18,19,20. W tym przypadku wyższy wskaźnik wskazywałby na narażenie na niektóre klasy chemiczne. Indeks gonadosomatyczny (masa gonad/całkowita masa ciała) to kolejny wskaźnik chorób ukierunkowany na zdrowie reprodukcyjne21. Obserwacje poczynione podczas oceny opartej na sekcji zwłok można wykorzystać do porównania częstości występowania poszczególnych typów zmian chorobowych lub odsetka osób zdrowych. Można je jednak również wykorzystać w bardziej ilościowej ocenie stanu zdrowia22,23.

Opisana tutaj standaryzowana ocena oparta na sekcji zwłok może być użyta do rozszerzenia rażąco widocznej oceny na wiele sposobów, w zależności od pytania, na które należy odpowiedzieć, wiedzy specjalistycznej i innych dostępnych zasobów. Nasze rutynowe podejście polega na zbieraniu danych biometrycznych (długość, waga, masa wątroby, masa gonad), krwi do analiz osocza/surowicy, dokumentowaniu widocznych nieprawidłowości zewnętrznych i wewnętrznych, zabezpieczaniu fragmentów narządów do analiz mikroskopowych i zbieraniu otolitów do analiz wieku. Ocena oparta na sekcji zwłok oraz analiza wieku i histopatologii różnych narządów pozwala na obliczenie i porównanie różnych wskaźników stanu, częstości występowania widocznych nieprawidłowości, a także mikroskopijnych zmian tkankowych, w zależności od płci, wieku, miejsca i okresu pobierania próbek. Dodatkowe kolekcje tkanek mogą być wykonane do wielu innych analiz, w tym mikroskopii elektronowej, bakteriologii, wirusologii, parazytologii i stężeń chemicznych. Metody te mogą być również częścią bardziej szczegółowych analiz wykorzystywanych do diagnozowania przyczyn śmierci ryb24 lub śmiertelności ryb żyjących w niewoli25. Przedstawiono metody pobierania tkanek do dwóch dodatkowych analiz, ekspresji genów i funkcjonalnych analiz immunologicznych.

Protokół

Opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Leetown Science Center.

1. Zbieranie ryb

  1. Odłów żywe ryby, minimalizując poziom stresu. Wykorzystaj elektrolów z łodzi lub plecakowy, wędki lub sieci.
  2. Przechowuj ryby w zbiornikach z dopływem wody lub napowietrzanych pojemnikach do momentu pobrania próbek.
    UWAGA: American Fisheries Society opublikowało szereg przewodników dotyczących odłowu, obchodzenia się z rybami oraz znieczulania/eutanazji26,27,28. Podczas pracy z rybami należy nosić rękawiczki.

2. Nekropsja ryb

  1. Uśmierć rybę.
    1. Umieść ryby w środku anestetykującym, aż ruchy pokryw skrzelowych ustaną, a ryby stracą równowagę. Po kolejnych 2–10 min ryby zostaną poddane eutanazji, jednak czas ten może różnić się w zależności od gatunku.
      UWAGA: Ryby można uśmiercić przy użyciu szeregu środków znieczulających (patrz Tabela materiałów (dla najczęściej stosowanych). Metoda eutanazji będzie zależeć od pomiarów laboratoryjnych, które zostaną przeprowadzone na pobranych tkankach29.
  2. Pomiar cech biometrycznych.
    1. Zważ rybę z dokładnością do jednego grama.
    2. Zmierz długość ryby z dokładnością do jednego milimetra.
      1. Zmierz całkowitą długość od czubka pyska przy zamkniętych ustach do końca ogona, ściśniętego w linii prostej.
      2. Zmierz długość widlicową od widlicy ogona do czubka ryjca oraz długość standardową od czubka ryjca do końca ciała (początku ogona).
    3. Oblicz współczynnik kondycji, korzystając z następującego wzoru:
      Wskaźnik kondycji = (całkowita masa ciała - masa gonad)/całkowita długość3.
      Uwaga: Masę gonad odejmuje się od całkowitej masy ciała, ponieważ gonady mogą znacząco wpływać na całkowitą masę ciała, szczególnie u samic ryb w okresie przedtarłowym.
  3. Pobrać próbkę krwi.
    UWAGA: Krew pobiera się najczęściej z żyły ogonowej, lecz można ją również pobrać z aorty grzbietowej lub poprzez punkcję serca30.
    1. Pobrać próbkę krwi obwodowej z żyły ogonowej za pomocą igły 22 lub 23 G zamocowanej do strzykawki o pojemności od 1 do 5 ml, w zależności od wielkości ryby. Wprowadzić igłę przednio-ogonowo, poniżej linii bocznej (Rycina 1A i 1B). Kieruj igłę ku górze, aż napotka kręgosłup, a następnie lekko ją wycofaj. Żyła znajduje się brzusznie względem nadlegającego kręgosłupa.
      UWAGA: Jeśli planowane jest wykonanie rozmazów krwi lub wymagane jest serum, nie stosuje się przeciwkrzepliwa. W większości przypadków pobierana jest osocze, w związku z czym do powlekania igły i strzykawki oraz do probówki do pobierania krwi stosuje się przeciwkrzepliwa, takie jak heparyna sodowa, EDTA lub lit.np., probówka próżniowa).
    2. Usuń igłę i umieść ją w pojemniku na odpady ostre przed przelaniem krwi do probówki do pobierania.
      UWAGA: Krew można przechowywać w lodzie, jednak w zależności od dalszych analiz należy ją odwirować tak szybko, jak to możliwe30.
    3. Jeśli planowana jest ocena nieprawidłowości jąder komórkowych lub różnicowe morfologiczne badanie krwi, należy niezwłocznie nanieść kroplę krwi na dwie czyste szklane laminki. Drugą laminkę należy podłożyć pod 45° pod kątem do kropli, którą następnie rozciąga się po powierzchni dzięki działaniu kapilarnemu. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu31.
    4. Wirować krew przy 1500–2500 x g g przez 15 min w celu sedymentacji komórek. Usunąć osocze/surowicę za pomocą sterylnej pipety transferowej, rozdzielić na alykwooty do fiolek kriogenicznych i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Procedura pobierania krwi z ryby; ekstrakcja strzykawką, badania biologiczne, pobieranie próbek.
Rycina 1: Pobieranie próbki krwi z ryby. (A) Niedawno uśmiercona ryba zostaje ułożona na boku i lokalizowana jest linia boczna. (B) Igłę wprowadza się brzusznie w stosunku do linii bocznej (strzałka), kierując ją ku górze, aż dotknie kręgosłupa. Następnie igłę lekko wycofuje się i rozpoczyna zasysanie w celu pobrania krwi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przeprowadź ocenę stanu zdrowia każdej ryby w oparciu o sekcję zwłok.
    UWAGA: Dostępnych jest wiele publikacji ilustrujących i opisujących zmiany chorobowe oraz anomalie32,33,34,35.
    1. Zadokumentuj anomalie zewnętrzne, w tym zmiany na powierzchni ciała i płetwach (Rysunek 2), oczach i skrzela (Rysunek 3), pasożyty zewnętrzne, takie jak pijawki (Rysunek 2D), larwy owadów lub cysty metacerkarii trematodów (Rysunek 2D, 3B) oraz pasożyty skrzeli (Rysunek 3D). W arkuszach danych oraz, jeśli to możliwe, fotograficznie, udokumentuj rodzaj, lokalizację i wielkość zaobserwowanych anomalii.
    2. Otwórz jamę brzuszną (Rysunek 4A) za pomocą nożyczek, wykonując cięcie od okolicy odbytowej do pokrywy skrzelowej, a następnie usuwając płat mięśniowy, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
      UWAGA: Jeśli przednia nerka ma zostać pobrana do oceny funkcji immunologicznych (patrz krok 5 poniżej) lub pobierane są próbki do badań bakteriologicznych bądź wirusologicznych, zewnętrzną powierzchnię ciała należy zdezynfekować 70% alkoholem, a próbki te należy pobrać przed przeprowadzeniem sekcji. Jeśli tkanki są wykorzystywane wyłącznie do obserwacji wizualnych, analizy osocza i histopatologii, technika sterylna nie jest wymagana.
    3. Zadokumentuj anomalie wewnętrzne (Rysunek 4), w tym ogólne lub ogniskowe odbarwienia różnych narządów (Rysunek 4B-4D), obecność wyniesień (Rysunek 4E), cyst, pasożytów oraz anomalie wielkości (powiększenie, zanik).

Badanie zmian skórnych u ryb; schemat wyróżnia możliwe markery chorobowe na okazach ryb.
Rycina 2: Przykłady widocznych zmian zaobserwowanych na powierzchni ciała i płetwach ryb. (A) Mała, lekko erodyzowana zmiana (strzałka) na bocznej powierzchni ciała. (B) Duży zaczerwieniony obszar (strzałka) obejmujący ogonową powierzchnię ciała. (C) Wypukłe, czarne zmiany (strzałki) na powierzchni ciała i płetwach. (D) Pijawki (biała strzałka) i małe czarne plamki (czarne strzałki) na płetwie. Pasek skali = 3 mm. (E) Wypukła, wieloklapowa, blada zmiana (strzałka) na powierzchni ciała. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat anatomii skrzela ryby przedstawiający struktury wewnętrzne, z etykietami części do celów edukacyjnych.
Rycina 3: Przykłady widocznych zmian chorobowych skrzeli i oczu ryb. (A) Blady obszar (strzałka) w soczewce oka. Pasek skali = 5 mm. (B) Białe cysty (białe strzałki) i małe czarne plamki (czarne strzałki) wywołane przez pasożytnicze trematody na operculum pokrywającym skrzela (a). Pasek skali = 1 cm. (C) Blady, erodowany obszar (strzałka) na skrzelu (a). Pasek skali = 5 mm. (D) Usunięte skrzelo wykazujące pasożyty (strzałki) przyczepione do włókien skrzelowych. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment z sekcji ryby; identyfikacja wątroby i gonad; metoda w analizie badań biologicznych.
Rycina 4: Przykłady nekropsji i nieprawidłowości wewnętrznych u ryb. (A) Podczas nekropsji ryba jest rozcinana (wzdłuż białej strzałki), a płat mięśnia (czarna strzałka) usuwany, aby odsłonić gonadę (a) oraz śledzionę, przytrzymywane pęsetą i nożyczkami. (B) Wątroba cętkowana (a), jądra (b), jelito otoczone tkanką tłuszczową (c) i żołądek (d). Pasek skali = 5 mm. (C) Wątroba (a) z ciemnoczerwonym obszarem (strzałka), jajnik (b) i jelita (c). Pasek skali = 5 mm. (D) Wątroba z zielonkawymi obszarami przebarwień (strzałki). Pasek skali = 1 cm. (E) Przykład prawidłowych (a) i nieprawidłowych (b) jąder z wyniesionymi guzkami. Pasek skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Wyznaczenie indeksu hepatosomatycznego (HSI).
    1. Usunąć wątrobę poprzez przecięcie tętnicy wątrobowej oraz tkanki łącznej w przedniej części. Delikatnie wyciągnąć organ, odcinając zrosty oraz inne połączenia z jelitami i tkanką tłuszczową. Należy uważać, aby nie przebić pęcherzyka żółciowego. Zważyć wątrobę.
      UWAGA: Niektóre ryby, np. karpiowate, nie posiadają wyraźnie wydzielonej wątroby, lecz tkankę wątrobową otaczającą jelita i inne organy. W przypadku tych gatunków uzyskanie masy wątroby może być niemożliwe.
    2. Obliczyć indeks hepatosomatyczny (HSI), korzystając ze wzoru:
      HSI=masa wątroby/całkowita masa ciała
  2. Obliczenie indeksu gonadosomatycznego.
    1. Usunąć gonady i zważyć je.
    2. Obliczyć indeks gonadosomatyczny (GSI), korzystając ze wzoru:
      GSI = masa gonad/całkowita masa ciała

3. Utrwalanie tkanek do badań patomorfologicznych

UWAGA: Do utrwalania tkanek w terenie można użyć szeregu utrwalaczy, w tym 10% neutralnej buforowanej formaliny oraz Z-fix, utrwalacza na bazie formaliny z dodatkiem cynku. Ten drugi jest preferowany, jeśli planowane jest zastosowanie metod takich jak hybrydyzacja in situ lub barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi.

  1. Ostrożnie wycinać, ale nie wyrywać próbek tkanek. Aby zapewnić prawidłową utrwalenie, poszczególne fragmenty tkanek powinny mieć rozmiar <2 cm i grubość <5 mm. Jako ogólną zasadę należy przyjąć, że dla właściwej konserwacji objętość utrwalacza powinna być około 10-krotnie większa niż objętość tkanki. Wszystkie próbki tkanek od jednej ryby umieścić w tym samym szczelnym pojemniku o odpowiedniej wielkości, zależnie od rozmiaru pobieranej próbki ryby.
  2. Fragmenty wszelkich nieprawidłowości zewnętrznych umieścić w pojemniku z utrwalaczem. Należy również dołączyć sąsiedni fragment prawidłowej tkanki.
    UWAGA: Nieprawidłowa obsługa, taka jak kompresja lub inne uszkodzenia mechaniczne, długotrwała ekspozycja na powietrze lub światło słoneczne, a także zamrażanie, mogą powodować powstawanie artefaktów.
  3. Wyciąć co najmniej pięć fragmentów wątroby o grubości 3–4 mm z różnych obszarów i umieścić je w pojemniku z utrwalaczem. Należy uwzględnić obszary prawidłowe i nieprawidłowe, jeśli zostały zaobserwowane.
  4. W zależności od wielkości, do pojemnika z utrwalaczem umieścić całą gonadę lub kilka fragmentów pobranych wzdłuż jednej gonady.
  5. Do pojemnika z utrwalaczem umieścić całe organy (jeśli są małe) lub fragmenty wszystkich pozostałych organów (śledziony, przedniej i tylnej nerki, skrzeli, serca, jelita i żołądka). W przypadku zaobserwowania nieprawidłowej tkanki, należy zakonserwować również sąsiedni fragment prawidłowej tkanki.

4. Usunięcie otolitów do analizy wieku

UWAGA: Wiek może być istotną zmienną w badaniach nad chorobami i zdrowiem ryb. Chociaż do określania wieku wykorzystywano szereg struktur, w tym łuski i kolce, większość badań porównawczych wykazała, że otolity dają najlepsze wyniki36,37. Ryby kostnoszkieletowe posiadają trzy pary otolitów: lapillus, sagitta oraz asteriscus. Zazwyczaj do określania wieku pobiera się otolity sagitta lub lapillus, choć może się to różnić w zależności od gatunku. Techniki usuwania i określania wieku zostały opisane wcześniej38.

  1. Przetnij przemysłek skrzelowy i odgnij głowę do tyłu. Usuń tkankę łączną i mięśniową z dolnych części neurokranium, aby zlokalizować bąble prootyczne (prootic bullae), czyli wypukły obszar kostny.
  2. Nacinaj lub przetnij za pomocą cęgów do kości i rozłam, aby odsłonić otolity. Są one widoczne gołym okiem.
  3. Umieść otolity w opisanej fiolce lub kopercie na monety i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu analizy wieku poprzez liczenie pierścieni lub przyrostów38. W przypadku umieszczenia w fiolce, po powrocie do laboratorium otwórz zakrętkę i pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed przechowywaniem.

Sekcja ryby w celu analizy skrzeli; kroki przedstawiające proces ekstrakcji za pomocą nożyczek i pęsety.
Rycina 5: Usuwanie otolitów. (A) Przecina się przemyczko, a tkankę łączną i mięśnie odsuwa, aby odsłonić podstawę kręgosłupa i obszar neurospinalny. (B) Kość zostaje rozłupana, aby odsłonić otolity. (C) Otolity lapillares zostają usunięte. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Pobranie tkanek do testów funkcji odpornościowych

UWAGA: Przednia nerka jest głównym organem krwiotwórczym, źródłem limfocytów i makrofagów do testów funkcjonalnych i musi zostać usunięta aseptycznie, jeżeli komórki mają być hodowane do testów funkcjonalnych, takich jak mitogeneza, zdolność fagocytarna i zabójcza makrofagów39,40.

  1. Spryskaj zewnętrzną powierzchnię ryby 70% etanolem. Używając sterylnych nożyczek, skalpela i pęsety, otwórz jamę brzuszną i usuń tkankę przedniej części nerki, która jest ciemnoczerwonym organem znajdującym się przed pęcherzem pławny.
  2. Umieść próbkę przedniej części nerki w pożywce (np. Leibovitz's L-15), aby utrzymać żywotność komórek. Homogenizuj próbki nerek za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora tkankowego (np. homogenizatora Tenbroeck), aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Przechowuj na mokrym lodzie do momentu powrotu do laboratorium.

6. Konserwacja tkanek do analiz kwasów nukleinowych

UWAGA: Jeśli planowane są dalsze analizy molekularne, takie jak badanie ekspresji genów z wykorzystaniem ilości transkryptów41 lub ilościowy PCR42 (reakcja łańcuchowa polimerazy), należy jak najszybciej umieścić fragmenty tkanki przeznaczone do oceny w odpowiednim konserwancie (np. roztwór stabilizujący RNAlater).

  1. W celu konserwacji RNA umieść dwa do trzech małych fragmentów (2–3 mm) w odpowiednim konserwancie, zachowując stosunek objętości konserwanta do tkanki 10:1.
    UWAGA: Próbki należy chronić przed światłem słonecznym lub nadmiernym ciepłem i transportować w lodzie kruszonym.
  2. W celu konserwacji DNA umieść dwa do trzech małych fragmentów tkanki w 95% etanolu (stosunek objętości etanolu do tkanki 10:1). Następnie utrzymuj próbki w lodzie kruszonym, a potem przechowuj w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Obszary Zagrożenia Wielkich Jezior (AOC) to obszary geograficzne, które zostały wyznaczone ze względu na ograniczenia różnych użytek korzystnych. Jednym z ograniczeń użytek korzystnych (BUI) w wielu AOC są guzy u ryb lub inne deformacje. Wydano miliony dolarów na rekultywację i przywrócenie każdego z tych obszarów, aby usunąć poszczególne BUI, a ostatecznie także sam AOC43. Kryteria usuwania BUI związanego z guzami u ryb różnią się w poszczególnych stanach (zobacz epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf oraz dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); jednak, jak wspomniano w dokumentach dotyczących usuwania z listy, istnieje wymóg określenia częstości występowania guzów wątroby, a w niektórych przypadkach także guzów skóry. We wielu przypadkach częstość tę porównuje się z niezanieczyszczonym obszarem referencyjnym poza AOC.

Oceny guza ryb BUI przeprowadzono w trzech AOC (rzeka St. Louis, rzeka Milwaukee i rzeka Sheboygan) oraz w miejscu referencyjnym poza AOC (rzeka Kewaunee) na jeziorach Superior i Michigan, wykorzystując ocenę opartą na badaniu zwłok białego podgrobka (Catostomus commersonii), a następnie analizę mikroskopijną tkanek skóry i wątroby. Ryby zebrano z rzek Milwaukee, Sheboygan i Kewaunee w latach 2012 i 201344, a z rzeki St. Louis – w 2015 roku (niepublikowane dane). Oceniono 200 białych podgrobków z Milwaukee, Kewaunee i St. Louis oraz 193 z Sheboygan.

Z definicji guz może być dowolnym obrzękiem lub wypukłym obszarem, choć powszechnie uważa się, że obrzęk spowodowany nieprawidłowym wzrostem tkanki z komórkami o nieprawidłowej budowie to nowotwór łagodny lub złośliwy. Uklenice białe zebrane ze wszystkich stanowisk wykazywały różnorodne zewnętrzne wypukłe zmiany, w tym małe, odrębne białe plamki, większe białe obszary, lekko wypukłe zmiany śluzowe oraz wielodzielne wypukłe obszary na powierzchni ciała i wargach (Rycina 6). Ryby ważono i mierzono w celu wyznaczenia współczynnika kondycji, rejestrowano nieprawidłowości zewnętrzne i wewnętrzne, a także pobierano próbki tkanki skóry i wątroby do badań histopatologicznych.

Papillomatoza u ryb; zmiany makroskopowe na skórze karpi i ogonie, jak pokazano na szczegółowych obrazach badania.
Rycina 6: Uniesione zmiany skórne zaobserwowane u byczka białego z Wielkich Jezior. (A) Odrębna biała plama na powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 5 mm. (B) Lekko uniesione zmiany śluzowe (strzałki) i wielodzielne zmiany (a) na tylnej powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 1 cm. (C) Duża, wielodzielna zmiana na powierzchni ciała. Szerokość podziałki = 1 cm. (D) Liczne wielodzielne zmiany na wargach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Odsetek ryb z zewnętrznymi guzami lub podniesionymi, przebarwionymi obszarami wahał się od 15,5% w obszarze Milwaukee AOC do 58,0% w obszarze St. Louis AOC. Ogólnie rzecz biorąc, pojedyncze białe plamy były najrzadszymi zmianami widocznymi gołym okiem, podczas gdy zmiany na wargach i powierzchni ciała o wielodolnej strukturze występowały najczęściej. Liczba ryb z widocznymi guzkami wątroby była niska i wahała się od 1,5% w Kewaunee i St. Louis do 2,5% w Milwaukee (Tabela 1).

Rzeki i lata pobierania próbek
Widoczne zmianyKewaunee 2013St. Louis 2015Sheboygan 2012Milwaukee 2013
Osobne białe plamy1633,15
Śluzowate209,59,830,5
Wielodolne22,5329,540
Łączna liczba podniesionych zmian skórnycha4615,538,358
Widoczne guzki wątroby1,51,51,62,5
aCałkowita liczba ryb z podniesionymi zmianami. Niektóre ryby miały wiele rodzajów zmian.

Tabela 1: Obserwacje oparte na badaniach necropsyjnych byczka białego zebranego w obszarach zanieczyszczenia Wielkich Jezior oraz w miejscu referencyjnym (rzeka Kewaunee), przedstawione w procentach.
Badanie wizualne może służyć do udokumentowania odsetka ryb z różnymi nieprawidłowościami. Jednakże, aby jednoznacznie zdiagnozować występowanie i typ nowotworu, tkanki należy zbadać mikroskopowo (histopatologia). Podczas badania mikroskopowego stwierdzono, że nie wszystkie guzy były nowotworami. Wiele pojedynczych białych plamek oraz zmian śluzowych, szczególnie w Kewaunee, stanowiło zmiany hiperplastyczne, a nie nowotwory (Tabela 2). Dodatkowo, w Kewaunee oraz St. Louis wszystkie zaobserwowane guzy skórne były łagodnymi brodawkami. W Sheboygan i Milwaukee zaobserwowano zarówno brodawki, jak i raka płaskonabłonkowego, czyli złośliwe guzy skóry (Tabela 2).

Próby rzek
Typ nowotworuKewaunee 2013St. Louis 2015Sheboygan 2012Milwaukee 2013
Papilloma215,230,537,5
Rak komórkowy płaskokomórkowy002,110,5
Łączna liczba nowotworów skóry215,232,648
Nowotwory przewodów żółciowycha2,546,29,5
Nowotwory komórkowe wątrobyb102,18
Łączna liczba nowotworów wątroby3,548,315,0c
aW tym cholangioma i cholangiocarcinoma
bW tym gruczolak komórkowy wątroby i rak komórkowy wątroby
cNiektóre ryby miały zarówno nowotwory przewodów żółciowych, jak i wątroby

Tabela 2: Mikroskopowo potwierdzone zmiany nowotworowe u bystrzaka białego zebranego w obszarach dotkniętych problemami w Wielkich Jeziorach oraz na stanowisku referencyjnym (rzeka Kewaunee), przedstawione w procentach.
Analiza histopatologiczna wykazała również guzy wątroby, których nie stwierdzono podczas obserwacji makroskopowej. Choć jedynie 1,5% ryb zebranych z Kewaunee i St. Louis miało widoczne węzły w wątrobie (Tabela 1), odpowiednio 3,5% i 4,0% miało nowotwory wykryte mikroskopowo (Tabela 2). Większa różnica wystąpiła w Sheboygan (1,6% widocznych vs. 8,3% mikroskopowych) oraz w Milwaukee (2,5% widocznych vs. 15,0% mikroskopowych). Badanie mikroskopowe pozwala ponadto na odróżnienie nowotworów pochodzących z przewodów żółciowych od tych pochodzących z komórek wątrobowych (Tabela 2) oraz na rozróżnienie guzów łagodnych i złośliwych.

Dyskusja

Oparta na sekcji zwłok ocena stanu zdrowia ryb może być wykorzystana na dowolnym gatunku ryb, dla których badacz rozumie normalny wygląd zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych struktur. Stosowanie ustandaryzowanego podejścia pozwala na porównywanie miejsc i gatunków, a także sezonowych i czasowych zmian w populacji. Wyniki badań mogą być wykorzystane do identyfikacji skutków związanych z punktowymi i niepunktowymi źródłami zanieczyszczeń oraz do informowania o działaniach zarządczych. Może być również używany do śledzenia ulepszeń po zainicjowaniu działań zarządczych. Metodologia może być modyfikowana w celu poszerzenia dokumentacji zewnętrznych nieprawidłowości wizualnych na różne sposoby. Oceny, oparte wyłącznie na obserwacjach wizualnych, mogą być nieśmiertelne, stosunkowo niedrogie, a dane mogą być generowane szybko dla dużej liczby osób. W związku z tym mogą być przydatne do ocen rozpoznawczych lub wstępnych, do monitorowania zmian w czasie lub w połączeniu z innymi wskaźnikami. Jeśli długość i waga ryb są mierzone podczas obserwacji wizualnych, można również obliczyć współczynnik stanu. Chociaż oceny oparte wyłącznie na obserwacji wzrokowej nie dostarczają informacji na temat przyczyn lub powiązanych czynników ryzyka, długoterminowe tendencje dotyczące niektórych nieprawidłowości skórnych45 i parametrów biometrycznych46 wskazują na poprawę w niektórych obszarach związanych z poprawą jakości wody.

Ocena oparta na sekcji zwłok dostarcza więcej informacji, ponieważ badane są również narządy wewnętrzne i można obliczyć inne czynniki stanu, takie jak indeks hepatosomatyczny i indeks gonadosomatyczny. Goede iBarton opracowali metodę sekcji zwłok w terenie, która obejmowała parametry krwi, czynniki biometryczne, odsetek nieprawidłowości i wartości indeksu dla określonych nieprawidłowości. Udoskonalenie metody obejmowało ocenę dotkliwości niektórych zmiennych, która pozwoliła na obliczenie wskaźnika oceny stanu zdrowia, który można było porównać statystycznie23. Ten wskaźnik oceny stanu zdrowia został wykorzystany w regionalnych porównaniach lokalizacji 23,47,48 oraz w połączeniu z innymi wskaźnikami biologicznymi, w tym analizami osocza i histopatologicznymi, w programie Biomonitoringu Stanu i Trendów Środowiskowych U.S. Geological Survey, oceniającym potencjalne skutki narażenia na zanieczyszczenia w dużych rzekach w całym kraju 49,50,51. Indeks chorób ryb oparty na widocznych z zewnątrz chorobach i pasożytach, widocznych nowotworach wątroby i innych histopatologicznych zmianach wątroby został opracowany i szeroko stosowany na Morzu Północnym, Morzu Bałtyckim i u wybrzeży Islandii. Stwierdzono, że indeks ten jest ważnym narzędziem jako wskaźnik zdrowia ekosystemu52.

Istnieje kilka krytycznych czynników w przeprowadzaniu oceny opartej na sekcji zwłok ryb. Po pierwsze, oceny muszą być przeprowadzone na rybach natychmiast po śmierci. Zmiany w kolorze i konsystencji narządów mogą wystąpić dość szybko po śmierci. Dodatkowo niektóre pasożyty mogą opuścić żywiciela wkrótce po śmierci. Po drugie, ważne jest, aby wiedzieć, co jest normalne dla interesujących gatunków. Na przykład niektóre ryby mają zwykle tłuste, a co za tym idzie, blade wątroby, podczas gdy dla większości gatunków blada wątroba byłaby nienormalna. Ważne jest również, aby rozpoznać zmiany sezonowe, które występują naturalnie. Niektóre ryby będą miały zmiany koloru lub rozwiną guzki lęgowe w okresie tarła.

Ograniczenia oceny opartej na sekcji zwłok jako metody oceny zdrowia ryb obejmują niemożność 1) konsekwentnego identyfikowania "przyczyny" określonych zmian chorobowych oraz 2) identyfikowania skutków, które mogą nie być widoczne gołym okiem. Wady te można przezwyciężyć poprzez dodanie histopatologii, molekularnej lub kulturowej identyfikacji patogenów i pasożytów oraz ekspresji genów. Na przykład "guz" lub wypukła zmiana (obrzęk) może być rzeczywistą neoplazją lub może to być pasożyt, stan zapalny, obrzęk lub hiperplazja (wzrost liczby normalnych komórek), spowodowane ekspozycją na chemikalia, czynniki zakaźne lub inne czynniki drażniące. Jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, ostateczne rozpoznanie guza lub nowotworu wymaga mikroskopowej patologii w celu zidentyfikowania rodzaju i nasilenia zmiany (tj . łagodnej lub złośliwej). Ocena białych "guzów" zewnętrznych przyssawki na podstawie obserwacji wzrokowej przeszacowała częstość występowania, szczególnie w miejscu referencyjnym. Wiele z podniesionych zmian nie było nowotworami, ale raczej zmianami rozrostowymi. Obecnie nie wiadomo, czy te zmiany hiperplastyczne są przednowotworowe. I odwrotnie, obserwacja wypukłych guzków w wątrobie znacznie zaniżyła częstość występowania nowotworów wątroby. W związku z tym konieczne było pobranie tkanek do badań patologicznych pod mikroskopem, aby odpowiednio zaradzić możliwości skreślenia z wykazu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez programy U.S. Geological Survey's Ecosystems (Chesapeake Bay Environments and Fisheries) i Environmental Health (Conmisants Biology) oraz Departament Zasobów Naturalnych Wirginii Zachodniej. Używanie nazw handlowych służy wyłącznie do celów identyfikacyjnych i nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stoły składaneDowolne
Krzesła składaneDowolne
deski do preparowaniaDowolna
Tablica pomiarowa (mm)Dowolna
Waga zasilana bateryjnie (g) do wagi rybDowolna
Waga zasilana bateryjnie (mg) do odważników narządówDowolna
Kleszcze preparacyjneDowolne
Obcinacze do kościWszelkie
skalpele i ostrzaDowolne
Rękawiczki jednorazoweDowolne
wiadraDowolne
szczelne butelki Nalgene (250 ml)ThermoFischer Scientific02-924-5C
Probówki próżniowe z heparyną sodowąThermoFischer Scientific02-689-6Do pobierania krwi
Jednorazowe  3 mL strzykawki z igłą 23 GKriowiale ThermoFischer Scientific14-826-11
1 – 2 mLDowolnaUżywany do próbek osocza i RNAlater
Invitrogen RNAlater Roztwór stabilizującyThermoFischer ScientificAM7021
Z-Fix Formaldehyd UtrwalaczAnatech LTDSKU-174
Tricaine-S (MS-222)Syndel USAznieczulenie do ryb
Koperty na monetyDowolnadla otolitów
Ołówki i długopisyDowolna
70% alkoholuDowolna
Karty katalogoweDowolna

Bibliografia

  1. Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
  2. Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
  3. Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
  4. Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
  5. Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
  6. Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
  7. Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
  8. Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
  9. Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
  10. Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
  11. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
  12. Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
  13. Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
  14. Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
  15. Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
  16. Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
  17. Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
  18. Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
  19. Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
  20. Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
  21. Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
  22. Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
  23. Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
  24. Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
  25. Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
  26. American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
  27. Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
  28. Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009(2013).
  29. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
  30. Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
  31. Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
  32. Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46(2002).
  33. Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
  34. Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
  35. European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
  36. Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
  37. Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
  38. Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
  39. Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
  40. Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
  41. Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
  42. Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
  43. Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
  44. Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
  45. Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
  46. Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
  47. Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
  48. Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
  49. Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
  50. Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241(2002).
  51. Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
  52. Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena stanu zdrowia ryb na podstawie nekropsjimonitorowanie stanu zdrowia ryb dziko yj cychdokumentacja nieprawid owo ci zewn trznychpobieranie pr bek krwiekstrakcja otolit w do okre lania wiekuhistopatologia tkanki w trobytest immunologiczny przedniej cz ci nerkipomiar masy gonadobliczanie indeksu organosomatycznegopunktacja indeksu stanu zdrowia ryb

Powiązane artykuły