Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

DOI:

10.3791/57952

⸱

19 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kontrolowanie napadów padaczkowych pozostaje wyzwaniem dla społeczności medycznej. Aby poczynić postępy, naukowcy potrzebują sposobu na dogłębne zbadanie dynamiki napadów i zbadanie ich mechanizmów leżących u ich podstaw. Modele ostrych napadów są wygodne, oferują możliwość wykonywania zapisów elektrofizjologicznych i mogą generować dużą ilość zdarzeń elektrograficznych podobnych do napadów (ictal). Obiecujące wyniki badań nad ostrymi napadami padaczkowymi mogą zostać następnie wykorzystane w modelach przewlekłej padaczki i badaniach klinicznych. W związku z tym badanie napadów w ostrych modelach, które wiernie odwzorowują sygnatury elektrograficzne i dynamiczne napadu klinicznego, będzie miało zasadnicze znaczenie dla uzyskania klinicznie istotnych wyników. Badanie zdarzeń zakaźnych w modelach ostrych napadów padaczkowych przygotowanych z tkanki ludzkiej jest również ważne dla uzyskania wyników, które są istotne klinicznie. Główny nacisk w tym artykule położono na korowy model 4-AP ze względu na jego wszechstronność w generowaniu zdarzeń ictal zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro, a także w tkance mysiej i ludzkiej. Metody przedstawione w tym artykule opiszą również alternatywną metodę indukcji napadów przy użyciu modelu Zero-Mg2+ i zapewnią szczegółowy przegląd zalet i ograniczeń aktywności podobnej do padaczkowatej generowanej w różnych modelach ostrych napadów. Ponadto, wykorzystując dostępne na rynku optogenetyczne szczepy myszy, krótki (30 ms) impuls świetlny może być wykorzystany do wywołania zdarzenia ictal identycznego z tymi, które występują spontanicznie. Podobnie, 30-100 ms zaciągnięcia neuroprzekaźników (kwas gamma-aminomasłowy lub glutaminian) mogą być stosowane do tkanki ludzkiej, aby wywołać zdarzenia ictal, które są identyczne z tymi, które występują spontanicznie. Możliwość wywoływania zdarzeń napadowych na żądanie w modelach ostrych napadów daje nowo odkrytą możliwość obserwowania dokładnej sekwencji zdarzeń, które leżą u podstaw dynamiki inicjacji napadów i skutecznej oceny potencjalnych terapii przeciwpadaczkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele ostrych napadów mogą z powodzeniem odtwarzać sygnatury elektrograficzne przypominające zdarzenia ictal obserwowane w elektroencefalogramie (EEG) u osób doświadczających napadu. Badacze używają tych zdarzeń podobnych do napadów (zwanych dalej "zdarzeniami ictal") jako substytutów zdarzenia napadowego1. Klinicznie zdarzenia ictal służą jako wiarygodny wskaźnik zastępczy dla napadów, ponieważ napady są zaburzeniem neurologicznym, które wywodzi się z mózgu. Na oddziale monitorowania padaczki neurolodzy polegają na wykrywaniu zdarzeń zakaźnych, aby potwierdzić obszar padaczkowy mózgu i wyizolować go do resekcji2. Na oddziale intensywnej terapii lekarze monitorują aktywność pacjenta, aby ocenić, czy u pacjentów w sedacji utrzymuje się jakakolwiek aktywność napadowa3. Kontrolowanie napadów padaczkowych pozostaje wyzwaniem dla środowiska medycznego, ponieważ 30% pacjentów z padaczką jest opornych na dostępne leki4,5, a 10% przypadków medycznych obejmujących napady wywołane lekami nie reaguje na standardowe leczenie3. Stanowi to poważny problem dla społeczeństwa, ponieważ przewiduje się, że 10% populacji amerykańskiej doświadczy jednego napadu padaczkowego w swoim życiu, a 3% oczekuje się, że rozwinie się padaczka6.

Badanie napadów padaczkowych w modelach przewlekłej padaczki jest kosztowne, pracochłonne i często zajmuje miesiące7. Trudno jest również wykonywać zapisy elektrofizjologiczne u swobodnie poruszających się zwierząt. Badania kliniczne na ludziach borykają się z podobnymi problemami, a także z dodatkowymi zawiłościami związanymi ze zgodą pacjenta, zmiennością pochodzenia uczestników oraz związanymi z tym względami moralnymi i etycznymi8. Z drugiej strony, modele ostrych napadów są korzystne, ponieważ są stosunkowo wygodne w przygotowaniu, opłacalne i zdolne do generowania dużych ilości zdarzeń ictal do badania9. Dodatkowo tkanka jest unieruchomiona w stabilnej pozycji, dzięki czemu warunki są idealne do wykonania zapisów elektrofizjologicznych niezbędnych do zbadania dynamiki napadów i związanej z nimi patofizjologii. Modele ostrych napadów pozostają korzystne w porównaniu z modelami in silico (komputerowymi), ponieważ opierają się na materiale biologicznym składającym się z sieci neuronalnej mózgu ze wszystkimi jej nieodłącznymi czynnikami i połączeniami synaptycznymi, które mogą nie zostać uchwycone nawet przez najbardziej szczegółowe modele komputerowe10. Cechy te sprawiają, że modele ostrych napadów padaczkowych mogą być skuteczne w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych terapii przeciwpadaczkowych i dokonywaniu wstępnych ustaleń przed przekazaniem ich do dalszych badań w modelach przewlekłej padaczki i badaniach klinicznych.

Zazwyczaj, modele ostrych napadów pochodzą z normalnej tkanki mózgowej, która została poddana działaniu warunków nadpobudliwości. Aby wywołać klinicznie istotne zdarzenia ictal w zdrowej tkance mózgowej, ważne jest, aby zrozumieć, że mózg funkcjonuje optymalnie w stanie krytycznym11, gdzie pobudzenie (E) i hamowanie (I) są zrównoważone12. Zaburzenie równowagi E-I może prowadzić do stanu napadu nadpobudliwego, w którym przyspieszają się zdarzenia ictal. W związku z tym, w ramach tych ram koncepcyjnych, istnieją dwie główne strategie generowania zdarzeń ictal w wycinkach mózgu (in vitro) lub w preparatach z całego mózgu (in vivo): albo zmniejszone hamowanie ("odhamowanie"), albo zwiększone pobudzenie ("brak odhamowania"). Jednak zdarzenia ictal są wysoce uporządkowanymi i zsynchronizowanymi zdarzeniami, które wymagają wpływu interneuronów GABAergic do orkiestracji aktywności sieci neuronowej13,14. Z tego powodu modele bez odhamowania są najbardziej skuteczne w generowaniu zdarzeń ictal w izolowanych sieciach neuronowych, takich jak in vitro slice15, podczas gdy modele odhamowania in vitro zwykle prowadzą do aktywności skokowej przypominającej skok międzynapadowy. Co więcej, w tych ramach koncepcyjnych, chwilowe zdarzenie synchronizujące może również niezawodnie wywołać ictal event16. W rzeczywistości zdarzenie ictal może zostać wywołane przez każde drobne zakłócenie zastosowane w systemie neuronowym17, gdy znajduje się on w 18. Tradycyjnie, zaburzenia te były wywoływane przez stymulację elektryczną. Niedawny rozwój optogenetyki w neurobiologii oferuje jednak teraz bardziej elegancką strategię wywoływania przejść stanów krytycznych16.

Metody opisane w tym artykule pokazują, jak generować zdarzenia ictal na żądanie w modelach ostrych napadów zarówno dla badań in vitro (krok 1 Protokołu), jak i in vivo (krok 2 Protokołu). Obejmują one wybór regionu mózgu, metody indukcji napadów, rodzaju badania i gatunku; jednak nacisk zostanie położony na zalecany wybór modelu ostrego napadu korowego 4-AP ze względu na jego wszechstronność w wielu różnych typach badań. Model ostrego napadu 4-AP in vitro opiera się na standardowym protokole przygotowania wysokiej jakości wycinków mózgu do zapisów elektrofizjologicznych i badań obrazowych19. Protokoły te zostały już wykorzystane do stworzenia in vitro koronalnych wycinków mózgu z kory somatosensoryczno-ruchowej myszy16,20 i people21. Modyfikacje mające na celu generowanie zdarzeń ictal w tego typu wycinkach mózgu zostały już wcześniej zademonstrowane16, a pełne szczegóły są opisane w Protokole poniżej. Model ostrego napadu korowego in vivo 4-AP opiera się na standardowym protokole przygotowania kraniotomii do badań obrazowych22. Modyfikacja polega na tym, że po kraniotomii nie jest instalowane żadne okno (szklane przesuwne). Zamiast tego środki prokondracyjne (4-AP) są miejscowo nakładane na odsłoniętą korę mózgową w celu wywołania zdarzeń ictal, gdy zwierzę jest w znieczuleniu ogólnym. O ile nam wiadomo, nasza grupa była pierwszą, która opracowała ten model ostrego napadu korowego in vivo u myszy16,23. Model ostrego napadu korowego 4-AP in vivo przygotowany na dorosłych myszach został opracowany w celu uzupełnienia modelu in vitro slice z tkanki młodocianej. Replikacja wyników w modelu napadów padaczkowych in vivo u dorosłych pomaga uogólnić wyniki z modeli warstwowych, rozwiązując nieodłączne obawy dotyczące niefizjologicznych warunków wycinka mózgu 2D (w porównaniu ze strukturą 3D całego mózgu) oraz fizjologicznych różnic między tkanką młodzieńczą a dorosłą

.

Metoda inicjacji zdarzenia ictal na żądanie jest demonstrowana przy użyciu albo zaciągnięć neuroprzekaźników za pomocą pikospritzera, albo strategii optogenetycznych. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nasza grupa jest pierwszą, która zainicjowała zdarzenia ictal w tkance ludzkiej za pomocą neuroprzekaźników za pomocą picospritzer16. W przypadku strategii optogenetycznych szczep myszy C57BL/6 jest konwencjonalnym szczepem używanym do ekspresji transgenów. Ekspresja rodopsyny kanałowej-2 (ChR2) w interneuronach GABA-ergicznych lub glutaminergicznym komórkach piramidowych zapewni opcjonalną zdolność do generowania zdarzeń ictal na żądanie za pomocą krótkich impulsów świetlnych. Odpowiednie szczepy myszy optogenetycznych obejmują dostępny na rynku wariant C57BL / 6, który wyraża ChR2 w interneuronach, przy użyciu promotora mysiego pęcherzykowego transportera GABA (VGAT) < klasa sup = "xref">24, lub komórki piramidalne, przy użyciu promotora antygenu 1 komórek grasicy myszy (Thy1) < sup class = "xref">25. Te komercyjnie dostępne myszy VGAT-ChR2 i Thy1-ChR2 oferują możliwość aktywacji neuronów GABA-ergicznych lub neuronów glutaminergiczne, odpowiednio, w korze nowej za pomocą niebieskiego (470 nm) światła. Możliwość generowania zdarzeń ictal na żądanie w modelach ostrych napadów może dać nowe możliwości badania dynamiki inicjacji napadów i skutecznej oceny potencjalnych terapii przeciwpadaczkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania z udziałem pacjentów zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Radę Etyki Badań Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia zgodnie z Deklaracją Helsińską. Zabiegi z udziałem zwierząt były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego Krembil.

1. Protokół I: Model ostrego napadu padaczkowego in vitro

  1. Przygotowanie roztworów rozwarstwiających i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego
    1. Karbogeniczna woda ultraczysta (która jest wodą filtrowaną z rezystywnością 18,2 MΩ·cm) z karbogenem (95% O2/5% CO2) przez 5 min za pomocą dyfuzorów pęcherzykowych z kamienia powietrznego (aeratory do akwariów).
      Uwaga: Kamienie napowietrzające można podłączyć do regulatora zbiornika karbogenu za pomocą standardowej rurki silikonowej. Jeśli kamienie napowietrzające nie są dostępne, uszczelnij koniec silikonowej rurki i zrób małe otwory w uszczelce, aby gaz karbogeniczny mógł wydostać się na zewnątrz i skarbonować roztwór.
    2. Przygotować roztwór preparacyjny, rozpuszczając substancje rozpuszczone z tabeli 1 w ultraczystej wodzie. Dodaj CaCl2 do roztworu, który był karbogenowany przez co najmniej 5 minut, aby pomóc mu się rozpuścić.
      Uwaga: Alternatywnie należy najpierw dodać CaCl2, aby mógł łatwo rozpuścić się w roztworze nienasyconym. Roztwór w postaci płynnej powinien mieć 300 - 320 mOsm/l i pH 7,4 po nasyceniu karbogenem.
      1. Schłodzić roztwór preparacyjny do temperatury 0 - 4 °C. Pozostawić roztwór na noc w lodówce lub umieścić roztwór w zamrażarce na 1 godzinę i stale monitorować temperaturę.
        Uwaga: Roztwór do preparacji można przechowywać do 3 nocy; Wyrzuć później.
      2. Roztwór preparacyjny należy karbonizować przez 5 - 10 minut przed użyciem.
        Uwaga: Idealnie byłoby, gdyby roztwór wyglądał jak błoto pośniegowe lub przed użyciem przechodził w błoto pośniegowe.
    3. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy dla gryzoni (ACSF), rozpuszczając substancje rozpuszczone z tabeli 2 (lub tabeli 3 dla ludzkiego ACSF) w ultraczystej wodzie. Roztwór ACSF należy skarbonować w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 35 °C, aż do użycia. Dodaj CaCl2 do roztworu, który był karbogenowany przez co najmniej 5 minut, aby pomóc mu się rozpuścić.
      Uwaga: Alternatywnie dodaj najpierw CaCl2, aby mógł łatwiej rozpuścić się w nienasyconym roztworze. Roztwór w postaci płynnej powinien mieć 290 - 320 mOsm/L i pH 7,4 po nasyceniu karbogenem. Roztwory należy sporządzać w objętościach 1, 2 lub 4 litrów w zależności od czasu trwania eksperymentów. Przygotuj 4 litry na cały dzień (8 godzin) eksperymentów. ACSF powinien być codziennie przygotowywany na świeżo; Nie przechowuj go dłużej niż 1 dzień.
  2. Sekcja myszy w celu pobrania tkanki mózgowej
    Uwaga: W przypadku tkanki ludzkiej przejdź do następnego kroku (krok 1.3) dotyczącego tworzenia plasterków mózgu za pomocą wibratomu. Bloki tkanki mózgowej w kształcie sześcianu (1 cm3) należy pobrać od neurochirurga za pomocą procedur opisanych wcześniej26,27.
    1. Zbierz wszystkie narzędzia i materiały niezbędne do sekcji zwierząt. Skonfiguruj przestrzeń roboczą, aby przygotować się do sekcji zwierząt.
      1. Sprawdź zbiornik karbogeniczny (95%O2/5%CO2), aby upewnić się, że nie jest pusty. Wymień butlę z gazem przed eksperymentami, jeśli pozostało ciśnienie mniejsze niż 500 psi.
      2. Skalibruj wibratom (krajalnicę do tkanek z wibracyjnym ostrzem) zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Dostosuj ustawienie wibratomu tak, aby miało amplitudę cięcia 1 mm i prędkość cięcia 0.12 mm/s.
        Uwaga: Optymalne ustawienia mogą się różnić dla każdego wibrującego ostrza do tkanek; Jednak ogólnie rzecz biorąc, amplituda powinna być wysoka, a prędkość skrawania niska.
      3. Napełnij komorę inkubacji plasterków mózgu (tj. pojemnik na plasterki mózgu) ACSF i bąbelkuj ją karbogenem. Następnie umieścić komorę inkubacyjną w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C.
        Uwaga: Użyj ACSF gryzoni do wycinków mózgu gryzoni i ludzkiego ACSF do wycinków ludzkiego mózgu.
    2. Uzyskaj młodocianą mysz dowolnej płci, w wieku od 13 d (p13) do 21 d (p21, gdzie p0 jest datą urodzenia).
    3. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym pentobarbitalu sodu (55 mg/kg masy ciała). Gdy mysz jest głęboko znieczulona, na co wskazuje brak odruchu szczypania palców, natychmiast użyj zatwierdzonego przez weterynarza narzędzia gilotynowego, aby odciąć głowę myszy jednym szybkim ruchem.
      Uwaga: Przygotować wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu zgodnie z procedurami zalecanymi przez wytyczne instytucji.
    4. Przytrzymaj nos myszy, aby ustabilizować odciętą głowę i delikatnie wykonaj nacięcie w linii środkowej, zaczynając między oczami myszy i na całej długości skóry głowy, aby odsłonić czaszkę. Upewnij się, że czaszka nie jest ściśnięta przez nacisk wywierany przez maszynkę do golenia. Użyj rogu krawędzi maszynki do golenia, aby zwiększyć precyzję cięcia.
    5. Rozsuń płaty skóry głowy myszy palcami, aby odsłonić czaszkę. Następnie użyj świeżego rogu krawędzi brzytwy, aby wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki; Zwróć szczególną uwagę, aby uniknąć kontaktu z korą mózgową.
    6. Włóż kleszczyki odłamkowe do oczodołów myszy, aby ustabilizować odciętą głowę i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej zimnym (0 - 4 °C) roztworem preparacyjnym. Upewnij się, że głowa jest całkowicie zanurzona w roztworze preparacyjnym.
    7. Użyj drugiego zestawu kleszczy do odłamków, aby delikatnie oderwać skórę głowy myszy, usuń kość nosa, obierając ją, i usuń tył (stronę ogonową) czaszki.
      Uwaga: Kość nosowa młodych myszy jest bardzo miękka i łatwo się łamie.
    8. Użyj mikroszpatułki, aby przeciąć nerwy wzrokowe, nerwy trójdzielne i rdzeń kręgowy. Następnie użyj mikroszpatułki, aby delikatnie oddzielić mózg od czaszki. Pozostaw mózg całkowicie zanurzony na szalce Petriego wypełnionej roztworem preparacyjnym
      9. .
  3. Przygotowanie wycinków korowych z kory somatosensoryczno-ruchowej
    1. Napełnij tackę buforową wibratomu ~150 ml zimnego (0 - 4°C) roztworu preparacyjnego.
      Uwaga: Opcjonalnie przechowuj tackę buforową w zamrażarce do czasu, gdy będzie to konieczne do utrzymania niskiej temperatury podczas procedury krojenia.
    2. Przyklej tkankę mózgową myszy lub człowieka do stolika wibratomu (uchwyt na próbkę/tacę) za pomocą kleju błyskawicznego. W przypadku myszy odetnij niewielką część ogonową mózgu (tj. Móżdżek), aby można ją było łatwo przykleić płasko do uchwytu na próbki (pozwalając, aby rostralna strona mózgu była skierowana w stronę sufitu).
      Uwaga: Alternatywnie, poziome wycinki mózgu myszy można przygotować, przyklejając grzbietową stronę mózgu do uchwytu na próbkę (brzuszna strona mózgu powinna być skierowana w stronę sufitu)28.
    3. Delikatnie umieść uchwyt próbki (z tkanką mózgową) w tacce buforowej. Upewnij się, że grzbietowa część mózgu jest skierowana w stronę ostrza wibratomu.
      Uwaga: Bardzo ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym mózg jest wystawiony na działanie powietrza.
  4. Cięcie i pobieranie tkanki mózgowej
    1. Pokrój mózg na plastry o grubości 450 μm, używając wibratomu w kierunku grzbietowym do brzusznego. Upewnij się, że mózg pozostaje całkowicie zakotwiczony w tacy na próbki podczas jej krojenia.
      1. Wykonaj pierwsze cięcie w mózgu myszy, aby usunąć opuszkę węchową. Następnie wykonuj kolejne cięcia, aż do zaobserwowania obszaru somatosensoryczno-motorycznego (znajdującego się mniej więcej w połowie drogi między opuszką węchową a bregmą).
        Uwaga: Opcjonalnie pokrój mózg w cieńsze (200 μm) plasterki, aż ciało modzelowate pojawi się w widoku koronalnym mózgu, co wskazuje, że obszar somatosensoryczno-motoryczny jest blisko.
    2. Za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze zebrać plastry koronalne (450 μm) zawierające obszar somatosensoryczno-motoryczny i zanurzyć je na szalce Petriego zawierającej zimny (0 - 4 °C) roztwór preparacyjny.
    3. Użyj nowej żyletki i odetnij nadmiar tkanki z plastrów. W przypadku wycinków koronalnych od myszy należy wykonać poprzeczne cięcie tuż poniżej spoidła kory nowej (tj. ciała modzelowatego). Nie ciąć ruchem piłowania; Wystarczy docisnąć ostrze do tkanki i użyć szczoteczki do detali, aby delikatnie oddzielić tkankę. Upewnij się, że zminimalizujesz ruch wycinka koronalnego.
    4. Za pomocą pipety transferowej o szerokim otworze przenieś grzbietową część wycinków koronalnych, które zawierają korę nową (warstwa 1 - 6) na drugą szalkę Petriego wypełnioną ciepłym (35 °C) ACSF na chwilę (~1 s). Następnie niezwłocznie przenieść plastry do komory inkubacyjnej zawierającej ciepły (35 °C) karbogenowany ACSF.
      Uwaga: Celem transferu na szalkę Petriego za pomocą ACSF jest zminimalizowanie przenoszenia roztworu preparacyjnego do komory inkubacyjnej podczas przenoszenia wycinków mózgu za pomocą pipety o szerokim otworze. Wykorzystaj wiele dołków w komorze inkubacyjnej, aby uporządkować różne wycinki mózgu.
    5. Wyrzuć resztę mózgu i tuszy zwierzęcej zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  5. Inkubacja i utrzymanie
    1. Pozostawić wycinki mózgu lekko zanurzone w komorze inkubacyjnej w temperaturze 35 °C na 30 minut. Następnie wyjąć komorę inkubacyjną z łaźni wodnej i pozostawić do powrotu do temperatury pokojowej (20 - 25 °C). Odczekaj 1 godzinę, aż wycinki mózgu zregenerują się przed wykonaniem zapisów elektrofizjologicznych.
      Uwaga: Upewnij się, że pod plastrami mózgu w komorze inkubacyjnej nie zbierają się pęcherzyki powietrza. Pęcherzyki powietrza to interfejsy powietrzne, które powodują uszkodzenie tkanek. Wycinki mózgu myszy mogą być przechowywane przez 6 - 8 godzin, podczas gdy ludzka tkanka mózgowa może być przechowywana do 24 godzin w dobrze karbogenowanej komorze inkubacyjnej z odpowiednim ACSF.
  6. Zapisy elektrofizjologiczne warstwy korowej powierzchniowej
    Uwaga: Zdarzenia ictal obserwuje się w zewnątrzkomórkowych zapisach potencjału pola lokalnego (LFP) z wycinków mózgu. LFP wycinka mózgu można obserwować i rejestrować za pomocą typu interface chamber29 lub systemu zanurzonej matrycy wieloelektrodowej (MEA)16. Procedura została już wcześniej opisana16, a dodatkowe szczegóły opisano poniżej.
    1. Użyj pipety transferowej o szerokim otworze lub szczoteczki do detali, aby przesunąć plasterek mózgu na nieco większy, wstępnie przycięty papier do soczewek, który jest utrzymywany na miejscu za pomocą pęsety dentystycznej. Przenieś papier do soczewek (na którym spoczywa wycinek mózgu) do komory nagraniowej i zabezpiecz go na miejscu za pomocą sitka harfowego.
    2. Przepuścić ciepły (35 °C), karbogeniczny perfuzat ACSF przez komorę zapisu nad wycinkiem mózgu z szybkością 3 ml/min (~1 kroplówka/s). Użyj termometru cyfrowego, aby upewnić się, że komora zapisu ma 33 - 36°C.
    3. Elektrody szklane o impedancji 1 - 3 MΩ wyciągnąć z rurki ze szkła borokrzemianowego (o średnicy zewnętrznej 1,5 mm) za pomocą ściągacza. Napełnij szklane elektrody ACSF (~10 μL) za pomocą strzykawki Hamiltona. Natychmiast wyrzuć elektrodę, jeśli końcówka jest uszkodzona.
      Uwaga: Wybiel srebrny drut (5 minut) i pozwól, aby tylko minimalna część (tj. końcówka) srebrnego drutu była zanurzona w szklanych elektrodach wypełnionych ACSF, aby zminimalizować szumy i dryf podczas nagrywania. W razie potrzeby usunąć nadmiar ACSF ze szklanej elektrody za pomocą strzykawki Hamiltona.
    4. Użyj mikroskopu stereoskopowego 20X, aby dokładnie wprowadzić szklaną elektrodę rejestrującą do powierzchownej warstwy kory mózgowej (2/3) za pomocą ręcznych manipulatorów. Rejestruj/przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu na komputerze za pomocą standardowego oprogramowania.
      Uwaga: Żywotne (wysokiej jakości) wycinki mózgu będą wykazywać silny potencjał wywołany w odpowiedzi na zastosowane bodźce elektryczne (100 μs, 30 - 300 μA) lub impulsy świetlne (30 ms, 10 mW/mm2) dla tkanki optogenetycznej.
  7. Indukcja czynności podobnych do napadów padaczkowych
    1. Perfuzja ACSF zawierająca 100 μM 4-aminopirymidyny (4-AP) na wycinku mózgu. Rozpuścić 80 mg 4-AP w 8,5 ml wody, aby uzyskać roztwór podstawowy 100 mM 4-AP. Dodać 100 μl 100 mM roztworu podstawowego 4-AP do 100 ml ACSF, aby uzyskać perfuzat ACSF ze 100 μM 4-AP.
      Uwaga: Alternatywnie użyj Zero-Mg2+ ACSF (Tabela 4), zmodyfikowanego roztworu ACSF bez dodatku Mg2+, aby perfundować wycinek mózgu. W przypadku tkanek ludzkich należy zastosować kombinację 100 μM 4-AP w Zero-Mg2+ Human ACSF (Tabela 5), aby osiągnąć optymalne wyniki. Średni czas pojawienia się zdarzeń ictal wynosi 15 minut; Jednak w przypadku niektórych wycinków mózgu może to potrwać do 40 minut.
  8. Generowanie napadów na żądanie: strategia optogenetyczna dla myszy optogenetycznych
    1. Zastosuj krótki (30 ms) impuls niebieskiego (470 nm) światła (o minimalnym natężeniu wyjściowym 1 mW/mm2), aby zainicjować zdarzenie ictal. Użyj ręcznego manipulatora, aby ustawić światłowód o średnicy rdzenia 1,000 μm (0,39 NA) bezpośrednio nad obszarem nagrywania.
      Uwaga: Ustaw szybkość fotostymulacji tak, aby odpowiadała żądanej szybkości występowania zdarzenia ictal (tj. 1 impuls co 50 s). Nie można jednak nadmiernie przeceniać wskaźnika w stosunku do wewnętrznego tempa, w jakim zachodzą zdarzenia ictal.
  9. Generowanie napadów na żądanie: strategia nieoptogenetyczna dla tkanki ludzkiej
    1. Umieść wycinek mózgu tak, aby warstwy powierzchowne znajdowały się przed komorą, a warstwy głębokie znajdowały się poniżej przepływu perfuzatu przez komorę zapisu.
    2. Wyciągnij szklaną elektrodę (tego samego typu, która jest używana do nagrań LFP) i delikatnie dotknij jej końcówki delikatną wycieraczką zadaniową, aby utworzyć mały otwór. Napełnij elektrodę ~25 μL 100 mM GABA (rozpuszczonego w wodzie) i podłącz ją do pikospritzera. Alternatywnie, wypełnij elektrodę 200 μM glutaminianem (rozpuszczonym w wodzie).
      Uwaga: Aby oszacować objętość zaciąganą się z picospritzera (~50 μL), nałóż próbne zaciągnięcie na plastikową płytkę (najlepiej w kratkę). Następnie nanieść kroplę o znanych objętościach (tj. 10 μl, 20 μl, 50 μl lub 100 μl) za pomocą pipety w celu porównania z testowym zaciągnięciem.
    3. Nałóż wdmuchiwanie neuroprzekaźnika (GABA lub glutaminianu) do tkanki ludzkiej za pomocą pikospritzera (10 - 20 psi przez 30 - 100 ms), aby zainicjować zdarzenie ictal. Nałóż pojedyncze zaciągnięcie 100 mM GABA na głęboką warstwę (5) tkanki mózgowej, aby wygenerować zdarzenia ictal w warstwie powierzchownej (2/3). Alternatywnie, nałóż pojedyncze zaciągnięcie 200 μM glutaminianu bezpośrednio na warstwę powierzchniową, aby wygenerować zdarzenia ictal w warstwie powierzchownej.
      Uwaga: Ustaw szybkość zaciągania się pikospritzera tak, aby odpowiadała żądanej częstotliwości występowania zdarzenia ictal (tj. 1 impuls co 50 s). Nie można jednak nadmiernie przeceniać wskaźnika w stosunku do wewnętrznego tempa, w jakim zachodzą zdarzenia ictal.

2. Protokół II: Model ostrego napadu padaczkowego in vivo

  1. Przygotowanie chirurgiczne i chirurgiczne
    1. Uzyskaj dorosłą mysz (p35 - p60) dowolnej płci.
    2. Głęboko znieczulij mysz ketaminą (95 mg / kg) i ksylazyną (5 mg / kg). Wykonaj test odruchu szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że mysz jest uspokojona. Alternatywnie, użyj izofluranu (4% do indukcji, 1,5 - 2% do operacji) do znieczulenia myszy.
      Uwaga: Wybór środków znieczulających może mieć wpływ na aktywność napadową30,31.
    3. Zamontuj mysz w ramie stereotaktycznej, zabezpieczając jej głowę paskami nausznymi. Umieść podgrzewaną podkładkę pod myszą na czas trwania zabiegu.
    4. Ogol czubek głowy myszy za pomocą trymera do gryzoni, aby odsłonić skórę głowy. Wstrzyknąć 0,3 ml lidokainy za pomocą igły 25 G 5/8 in do okostnej, aby uniknąć nadmiernego krwawienia lub bólu. Nałóż maść na oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas eksperymentu.
    5. Ściśnij i unieś środek skóry głowy myszy, aby ocenić, czy zniknęły jej odruchy. Następnie wykonaj cięcie poziome, aby odsłonić bregmę w obszarze lambda czaszki. Delikatnie zeskrob cały odsłonięty obszar czaszki bawełnianym wacikiem, aby uzyskać suchą powierzchnię.
    6. Wykonaj kraniotomię o średnicy 4 mm na współrzędnych 2,0 mm boczno-przyśrodkowej i -2,0 mm rostrocaudalnej, aby odsłonić korę somatosensoryczną. Zaznacz miejsce okręgiem (o średnicy 4 mm) za pomocą markera permanentnego. Wywierć wokół koła za pomocą pneumatycznej wiertarki dentystycznej, aż pozostała warstwa kości kraniotomii łatwo ustąpi po popchnięciu. Nałóż roztwór soli fizjologicznej na warstwę kości przed usunięciem kraniotomii za pomocą kleszczy odłamkowych. Następnie nałóż ciepły roztwór soli fizjologicznej na odsłonięty obszar.
  2. Metody rejestrowania i chemiczna indukcja napadów
    1. Elektrody szklane o impedancji 1 - 3 MΩ wyciągnąć z rurki ze szkła borokrzemianowego (o średnicy zewnętrznej 1,5 mm) za pomocą ściągacza. Napełnij szklane elektrody ~10 μl ACSF lub soli fizjologicznej za pomocą strzykawki Hamiltona. Natychmiast wyrzuć elektrodę, jeśli końcówka jest uszkodzona.
      Uwaga: Wybiel srebrny drut (5 minut) i pozwól, aby tylko minimalna część (tj. końcówka) srebrnego drutu była zanurzona w szklanych elektrodach wypełnionych ACSF, aby zminimalizować szumy i dryf podczas nagrywania. W razie potrzeby usunąć nadmiar ACSF ze szklanej elektrody za pomocą strzykawki Hamiltona.
    2. Użyj manipulatora ręcznego, aby wprowadzić szklaną elektrodę do powierzchownej warstwy korowej (2/3) w obszarze somatosensoryczno-motorycznym. Rejestruj/przeglądaj aktywność elektryczną wycinka mózgu na komputerze za pomocą standardowego oprogramowania.
      Uwaga: Warstwa 2/3 znajduje się na głębokości około 0,3 mm od powierzchni32.
    3. Miejscowo nanieść ~0,5 ml 1,5 mM 4-AP soli fizjologicznej na odsłoniętą korę myszy za pomocą strzykawki, aż całkowicie pokryje kraniotomię. Rozpuścić 14 mg 4-AP w 100 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór podstawowy 1,5 mM 4-AP soli fizjologicznej.
      Uwaga: Przygotuj sól fizjologiczną 4-AP przed rozpoczęciem eksperymentu. Średnio zdarzenia ictal pojawiają się 15 - 30 minut po zastosowaniu miejscowym.
  3. Generowanie napadów na żądanie u myszy optogenetycznych
    1. Zastosuj krótki (30 ms) impuls niebieskiego (470 nm) światła (o minimalnym natężeniu wyjściowym 10 mW/mm2), aby zainicjować zdarzenie ictal. Użyj ręcznego manipulatora, aby ustawić światłowód o średnicy rdzenia 1,000 μm (0,39 NA) bezpośrednio nad obszarem nagrywania.
      Uwaga: Ustaw szybkość fotostymulacji tak, aby odpowiadała żądanej szybkości występowania zdarzenia ictal (tj. 1 impuls co 300 s). Nie można jednak nadmiernie przeceniać wskaźnika w stosunku do wewnętrznego tempa, w jakim zachodzą zdarzenia ictal.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie 100 μM 4-AP do dobrej jakości (nieuszkodzonych) wycinków mózgu o wielkości 450 μm od młodocianej myszy VGAT-ChR2 niezawodnie wywołało powtarzające się zdarzenia ictal (> 5 s) w ciągu 15 minut (Rysunek 1Ai). Zastosowanie 100 μM 4-AP do plastrów o niskiej jakości skutkowało zdarzeniami pękania lub gwałtownym wzrostem aktywności (Rysunek 1Aii). Średnio 40% wycinków z każdego wypreparowanego mózgu myszy z powodzeniem wygenerowało zdarzen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wycinki mózgu są leczone lekiem prokonwulsyjnym lub zmienionym perfuzatem ACSF w celu zwiększenia pobudliwości sieci neuronowej i przyspieszenia zdarzeń ictal (zdarzeń podobnych do napadów elektrograficznych). W przypadku myszy preferowane wycinki koronalne obszaru somatosensoryczno-motorycznego powinny zawierać korę obręczy, obszar 2 (CG), ale nie obszar zaśledziony (RS); Te markery anatomiczne pomagają zidentyfikować zakres wycinków koronalnych, które najlepiej nadają się do wywoływania zdarzeń ICTAL. Opcjonalną modyfi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (MOP 119603 do Petera L. Carlena i Taufika A. Valiante), Ontario Brain Institute (do Taufika A. Valiante) oraz Mightex Student Research Grant (do Michaela Changa). Chcielibyśmy podziękować Liamowi Longowi za pomoc w sfilmowaniu rękopisu wideo. Chcielibyśmy podziękować Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabasaran i Shadini Dematagoda za ich pomoc w opracowaniu rycin i tabel w tym manuskrypcie. Rysunki 1A, 3A, 4A i 6A są oryginalnymi rycinami wykonanymi na podstawie danych opublikowanych w Chang i wsp.16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pentobarbital soduNieNie dotyczy Zakupiono za pośrednictwem dostawców Toronto Western Hospital
Strzykawka 1 mmNIEZakupiono w sklepie UT Med Store
25G 5/8" sterylna igłaNIEDOTYCZY NIE DOTYCZYZakupiono w sklepie UT Med
Żyletka jednoostrzowa (2x)Nie dotyczyNie dotyczy Zakupiono w sklepie
UT MedKlej błyskawicznyN/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Store Papier do soczewekNIEDOTYCZYZakupiony w sklepie UT Med
Szklana szalka Petriego (2x)N/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Kleszczyki do odłamków (2x)N/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Mikroszpatułka z uchwytem PVCN/A/AZakupiony przez UT Med Przechowywać
Micro Spoon z płaską końcówkąN/A N/AZakupiony w sklepie UT Med
Pędzel do detali 5/0N/A/AZakupiony w butikowym sklepie ze sztuką
Pipeta transferowa o szerokim otworzeN/A/AZakupiony w sklepie UT Med
Pęseta dentystycznaN/AN/AZakupiony w UT Med Store
Termometr (cyfrowy)N/ANie dotyczy Zakupionow dniu Amazon.ca
Sprawdź zbiornik karbogeniczny (95% O2/5%CO2) NieNie dotyczyZakupiono za pośrednictwem dostawców Toronto Western Hospital
VibratomeLeicaNie dotyczy Zakupionoza pośrednictwem dostawców Toronto Western Hospital
Komora inkubacji wycinków mózgu (znana również jako Brain Slice Keeper) Scientific Systems Design IncNie dotyczy
Chlorek sodu (NaCl)N/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Wodorowęglan soduNIEZakupiony w sklepie UT Med
DekstrozaNieZakupiony w sklepie UT Med
Chlorek potasu (KCl)N/AN/AZakupiony w sklepie
UT MedSiarczan magnezu (MgSO4 H2O)N/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Jednozasadowy fosforan sodu jednowodny (HNaPO4· H2O)N/AN/AZakupiony w sklepie UT Med
Chlorek wapnia (CaCl2· 2H2O)N/A/AZakupione w sklepie UT Med
Store SacharozaN/A N/A Zakupionew sklepie UT Med
dotyczy DOTYCZY Store N N N dotyczy DOTYCZY Store dotyczy N

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750(2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele ostrych napad w drgawkowychprzygotowanie skrawk w kory m zgowejindukcja 4 APstymulacja optogenetycznarejestracje elektrofizjologicznedetekcja zdarze iktalnychregeneracja skrawk w m zgukarbogenizowany ACSFbadanie mechanizm w napad w drgawkowychprzesiewowe badanie terapii przeciwdrgawkowych

Powiązane artykuły