Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.

Streszczenie

Wiele zwierząt, w tym muszka owocowa, Drosophila melanogaster, jest w stanie rozróżniać drobne różnice w temperaturze otoczenia, co pozwala im na poszukiwanie preferowanego krajobrazu termicznego. Aby określić preferencje temperaturowe larw w określonym zakresie liniowym, opracowaliśmy test wykorzystujący gradient temperatury. Aby ustalić gradient jednokierunkowy, dwa aluminiowe bloki są połączone z niezależnymi łaźniami wodnymi, z których każdy kontroluje temperaturę poszczególnych bloków. Dwa bloki wyznaczają dolną i górną granicę gradientu. Gradient temperatury ustala się poprzez umieszczenie aluminiowej płyty pokrytej agarozą na dwóch blokach sterowanych wodą, tak aby płyta obejmowała odległość między nimi. Końce aluminiowej płyty, która jest umieszczona na górze bloków wodnych, definiują minimalną i maksymalną temperaturę, a obszary pomiędzy tymi dwoma blokami tworzą liniowy gradient temperatury. Test gradientowy może być stosowany do larw w różnym wieku i może być stosowany do identyfikacji mutantów, które wykazują fenotypy, takie jak te z mutacjami wpływającymi na geny kodujące kanały TRP i opsyny, które są wymagane do dyskryminacji temperatury.

Wprowadzenie

Termotaksja jest wykorzystywana przez zwierzęta mobilne do wyboru środowiska o najkorzystniejszych warunkach^1,2,3. Jeśli klimat jest nadmiernie gorący lub zimny, takie zachowanie ma kluczowe znaczenie dla przetrwania. Ponadto wiele zwierząt jest wrażliwych na bardzo małe różnice temperatur w komfortowym zakresie i poszukuje otoczenia o idealnej temperaturze. Ma to szczególne znaczenie dla organizmów poikilotermicznych, takich jak muszki owocowe, które równoważą temperaturę swojego ciała z temperaturą otoczenia. Testy monitorujące termotaksję larw odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji i wyjaśnieniu roli czujników molekularnych, takich jak kanały Drosophila Transient Receptor Potential (TRP)^4,5,6, rhodopsins^7,8 oraz receptory receptorów jonotropowych (IRs)⁹, które nadają tym zwierzętom wrażliwość na temperaturę w różnych zakresach temperatur.

Dwukierunkowy test wyboru zapewnia jedno podejście do badania preferencji termicznych larw^6,7. Test polega na ustaleniu dwóch odrębnych stref temperaturowych i pozwala zwierzętom wybrać jedną stronę zamiast drugiej. Wyniki dwukierunkowych testów wyboru mogą być solidne, zwłaszcza jeśli różnice temperatur między tymi dwiema opcjami są duże. Ponadto, ponieważ każdy test obejmuje zestawienie tabelaryczne tylko dwóch grup, dane można wyrazić jako prosty indeks preferencji. Łatwość i prostota testów dwukierunkowego wyboru jest również podatna na genetyczne badania przesiewowe. Jednak głównym ograniczeniem jest to, że potrzeba wielu eksperymentów, aby ustalić preferowaną temperaturę zwierząt typu dzikiego lub zmutowanego.

Test gradientowy daje możliwość ustalenia preferowanej temperatury w pojedynczym teście⁸. Ponadto, w przeciwieństwie do testu wyboru dwukierunkowego, pozwala on na ocenę rozmieszczenia grupy zwierząt w konfrontacji z ciągłym zakresem temperatur. Jeden test gradientowy wykorzystuje szalkę Petriego i pojedyncze zwierzęta i dobrze nadaje się do charakteryzowania szczegółowego zachowania poszczególnych zwierząt¹⁰. Ponieważ jednak szalki Petriego są okrągłe, rozmiary stref temperaturowych różnią się i są stopniowo zmniejszane w zależności od odległości od środka. Dlatego ta konfiguracja nie jest idealna do monitorowania wyboru temperatury populacji zwierząt.

Aparat do ciągłego gradientu termicznego, który jest dobrze przystosowany do oceny preferencji temperaturowych grup larw, wykorzystuje prostokątną arenę i jest opisany tutaj. Urządzenie jest proste w budowie i montażu. Ponadto gradient jest liniowy i elastyczny, ponieważ można go wykorzystać do oceny termotaksji w dużych zakresach temperatur od 10 °C do 42 °C. Test jest szybki i prosty do wykonania oraz daje powtarzalne dane. Oprócz informowania o preferowanej temperaturze larw, ujawnia preferencje populacji zwierząt w całym zakresie liniowym w jednym eksperymencie. Ze względu na te zalety jest to doskonały wybór do identyfikacji genów wymaganych do termotaksji.

Protokół

1. Aparatura do produkcji i montażu sprzętu do testów gradientowych

1. Wytwarzaj aluminiowe płytki testowe do jednokierunkowego testu gradientowego.
   1. Przytnij i zmiel każdą aluminiową płytkę testową (Rysunek 1A) z jednego kawałka aluminium za pomocą piły taśmowej i ostrego młyna pionowego o następujących wymiarach: rozmiar zewnętrzny to 140 x 100 x 9 mm, a rozmiar wewnętrzny to 130 x 90 x 8 mm (Rysunek 1B). Anodować wnętrze każdej płytki testowej czarną farbą, aby ułatwić wizualizację larw i zapobiec rdzy.
      UWAGA: Produkcja aluminiowych płytek testowych dla gradientu jednokierunkowego jest wykonywana przez warsztat mechaniczny. Anodowanie jest wykonywane przez komercyjnego dostawcę.
   2. Zaznaczyć górną i dolną krawędź każdej płytki testowej 13 liniami rozgraniczającymi w odległości 10 mm za pomocą trwałego markera. Umieść pierwsze i ostatnie rozgraniczenie w odległości 5 mm od wewnętrznej krawędzi płytek testowych (Rysunek 1A, B).
2. Aby wyprodukować aluminiową płytkę testową dla gradientu dwukierunkowego, należy wyciąć aluminiową płytę o następujących wymiarach za pomocą nożyc do blachy: 250 x 220 x 2 mm. Anodować płytki testowe czarną farbą.
   UWAGA: Produkcja aluminiowych płytek testowych dla gradientów dwukierunkowych jest wykonywana przez warsztat mechaniczny. Anodowanie jest wykonywane przez komercyjnego dostawcę.
3. Wyprodukuj bloki aluminiowe.
   UWAGA: Do gradientu jednokierunkowego potrzebne są dwa bloki, a do gradientu dwukierunkowego potrzebne są trzy bloki.
   1. Wytnij aluminiowe bloki (Rysunek 1C) z jednego kawałka aluminium za pomocą piły taśmowej (wymiary 50 x 255 x 14 mm) (Rysunek 1C, D).
   2. Wywierć kanał wodny wewnątrz bloku (o średnicy 7 mm) za pomocą pionowego frezu i gwintuj rowki w otwartych końcach po jednej stronie (Rysunek 1D). Zamknij rowkowane otwory i taśmą uszczelniającą gwint, aby utworzyć kanał wodny w kształcie litery U (Rysunek 1C, D).
      UWAGA: Produkcja aluminiowych bloków testowych jest wykonywana przez warsztat mechaniczny.
   3. Zamocuj złącze w aluminiowym bloku (Rysunek 1D) za pomocą gwintów śrubowych i taśmy uszczelniającej gwint na jednym końcu. Dopasuj drugi koniec z wieloma zadziorami do silikonowej rurki (1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" ścianka).
4. Zaopatrzyć się w dwie chłodzone/podgrzewane kąpiele obiegowe.
5. Zmontuj bloki z kontrolowaną temperaturą do systemu oznaczania gradientu.
   1. W przypadku gradientu jednokierunkowego podłącz każdy z dwóch aluminiowych bloków do oddzielnej łaźni wodnej, tak aby temperatura każdego bloku była kontrolowana przez niezależny system cyrkulacji wody (Rysunek 2A). Użyj silikonowej rurki (1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" ścianka), aby podłączyć wylot łaźni wodnej do złącza po wewnętrznej stronie bloku aluminiowego (Rysunek 2A). Użyj również rurki, aby połączyć zewnętrzne złącze boczne na bloku aluminiowym z wlotem łaźni wodnej.
   2. Aby uzyskać gradient dwukierunkowy, umieść dwa z trzech bloków pod lewą i prawą stroną płyty i podłącz je do tej samej łaźni wodnej z rurką (Rysunek 2B). Podłącz trzeci aluminiowy blok do drugiej łaźni wodnej i umieść poniżej środka płyty (Rysunek 2B).
      UWAGA: To przyrządy i test są konieczne tylko wtedy, gdy larwy gromadzą się w strefie na jednej lub drugiej krawędzi gradientu jednokierunkowego. Jeśli tak, ważne jest, aby ocenić, czy występuje efekt krawędzi. Aby przetestować tę możliwość, należy ustalić gradient dwukierunkowy, w którym temperatura strefy krawędziowej preferowana przez larwy przy użyciu gradientu jednokierunkowego (np. 18 °C) jest temperaturą w środku płytki gradientu dwukierunkowego (Rysunek 3E, F).

2. Synchronizacja larw

1. Odżywiaj muchy do składania jaj.
   1. Wymieszaj granulki drożdży i wodę destylowaną za pomocą tłuczka, aby uzyskać pastę drożdżową. Dokładnie zmiel i mieszaj, aż konsystencja pasty będzie zbliżona do masła orzechowego. Unikaj nadmiernie suchej pasty, która może się łuszczyć podczas przenoszenia much do świeżych fiolek, lub mokrej pasty, która może uwięzić muchy.
   2. Za pomocą tłuczka dodaj pastę drożdżową blisko wewnętrznych ścianek standardowych fiolek Drosophila, tuż nad powierzchnią żywności.
   3. Policz 12-35 samic i do połowy mniej samców (ale nie więcej niż 10) na podkładce CO₂ i dodaj samice i samce do każdej fiolki zawierającej pastę drożdżową.
   4. Aby pokarm dla much z pastą drożdżową był wilgotny, podczas gdy muchy żerują, połącz te fiolki w tacy, która mieści do 100 fiolek z 20 otwartymi fiolkami zawierającymi tylko wodę destylowaną. Umieść tackę w przezroczystej plastikowej torbie i zamknij.
   5. Inkubować tacę w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 48 godzin, aby samice były odpowiednio odżywione, co umożliwiło im złożenie dużej liczby jaj.
2. Ustaw fiolki do składania jaj.
   1. Przenieś odżywione muchy do nowych fiolek z jedzeniem do zbierania jaj, stukając w nie. Nie należy stosować CO 2 , ponieważ może to spowodować_, że muchy złożą mniej jaj w następnym krótkim czasie.
      UWAGA: Standardowe fiolki z karmą Drosophila są używane bez pasty drożdżowej do zbierania jaj.
   2. Pozwól muszkom złożyć jaja przez 3 godziny w temperaturze 25 °C, tak aby wszystkie jaja zostały zebrane w stosunkowo wąskim oknie czasowym.
      UWAGA: Umożliwi to synchronizację larw na tym samym etapie rozwoju.
   3. Umieścić fiolki zawierające jaja w tacce zawierającej fiolki z wodą i zacisnąć torebkę. Inkubować w temperaturze 25 °C w 12 godzinach światła: 12 godzin ciemności.
   4. Wiekowanie larw przez określoną liczbę godzin po złożeniu jaj (AEL) w zależności od pożądanego stadium larwalnego.
      UWAGA: Tabela 1 przedstawia szacunkowy stosunek między godzinami AEL a stadium larwalnym, który będzie się różnił w zależności od stada much, użytego pokarmu, temperatury odchowu itp. Dokładny związek między AEL a stadium rozwojowym musi zostać zweryfikowany przez każdego badacza przy użyciu kryteriów fizycznych, takich jak morfologia haczyków gębowych i przetchlink¹¹.

3. Ustawienie gradientu temperatury

1. Przygotowanie gradientu jednokierunkowego
   1. Aby stworzyć wilgotne środowisko otoczenia podczas testów, umieść dwa aluminiowe bloki połączone z dwiema kąpielami wodnymi na mokrych ręcznikach papierowych, oddalonych od siebie o 10 cm (Rysunek 2A).
   2. Włącz dwie łaźnie wodne ~ 2 godziny przed rozpoczęciem testu, aby dać wystarczająco dużo czasu na wyrównanie temperatury bloków aluminiowych.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie próbnego eksperymentu w celu określenia temperatury każdej kąpieli wodnej, która jest potrzebna do osiągnięcia pożądanego liniowego gradientu temperatury. Niektóre typowe pary temperatur do ustawiania łaźni wodnych są wymienione w tabeli 2. Należy jednak pamiętać, że na temperaturę powierzchni ma wpływ temperatura otoczenia. Długość rurki również wpływa na temperaturę, ponieważ w rurkach występuje chłodzenie. Długość rurki w naszej konfiguracji wynosi 1,5 m.
   3. Kuchenkę mikrofalową 100 ml 1% agarozy przy ustawieniu wysokiej mocy w okrągłej butelce o pojemności 500 ml z szeroką szyjką i wlać 25 ml / płytkę testową na płaskim blacie. Przygotuj dwie płytki testowe, które można umieścić na aluminiowych blokach w tym samym czasie (Rysunek 2A).
   4. Po zastygnięciu agarozy (10-20 min) delikatnie przetrzyj każdą powierzchnię agarozy standardową gąbką kuchenną lub gąbką melaminową, aby powierzchnia agarozy była lekko szorstka, tak aby podczas rozpylania wody na żel agarozowy powstała gładka cienka membrana wodna i nie tworzyły się kropelki wody.
   5. Całkowicie zanurz płytki w pojemniku z wodą destylowaną, aż test będzie gotowy do wykonania, aby zapobiec wysuszeniu płytek.
2. Przygotuj gradient dwukierunkowy (opcjonalnie)
   1. Aby stworzyć wilgotne środowisko otoczenia podczas testów, umieść trzy aluminiowe bloki w odległości 8 cm od siebie (Rysunek 2B) na mokrych ręcznikach papierowych.
   2. Włącz dwie łaźnie wodne ~ 2 godziny przed rozpoczęciem testu, aby dać wystarczająco dużo czasu na wyrównanie temperatury bloków aluminiowych.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie próbnego eksperymentu w celu określenia temperatury każdej kąpieli wodnej dla gradientu dwukierunkowego. Niektóre typowe pary temperatur do ustawiania kąpieli wodnych są wymienione w tabeli 3. Należy jednak pamiętać, że na temperaturę powierzchni ma wpływ temperatura otoczenia. Długość rurki również wpływa na temperaturę, ponieważ w rurkach występuje chłodzenie. Długość rurki w naszej konfiguracji wynosi 1,5 m.
   3. Aby zapobiec wysypywaniu się agarozy z płyty, owiń krawędzie aluminiowej płyty taśmą do etykietowania, aby utworzyć ściankę o wysokości 10 mm (Rysunek 2B).
   4. Korzystając z ustawienia wysokiej mocy, podgrzej w kuchence mikrofalowej 200 ml 1% agarozy w okrągłej butelce o pojemności 500 ml z szeroką szyjką i wlej 120 ml na płytkę testową.
   5. Po zastygnięciu agarozy (~30 min) delikatnie przetrzyj każdą powierzchnię agarozy standardową gąbką kuchenną lub gąbką melaminową, aby powierzchnia agarozy była lekko szorstka, tak aby podczas rozpylania wody na żel agarozowy powstała gładka cienka membrana wodna i nie tworzyły się kropelki wody.
   6. Całkowicie zanurz płytki testowe w pojemniku z wodą destylowaną, aż test będzie gotowy do wykonania, aby zapobiec ich wysychaniu.
3. Ustawianie gradientu jednokierunkowego
   1. Przygotować odczynniki i przedmioty na stole obok aparatury do oznaczania gradientu (patrz Tabela materiałów).
   2. Aby zapewnić wydajny transfer temperatury, wypełnij wszelkie szczeliny między blokami aluminiowymi a płytkami testowymi, rozpylając wodę na granicy między blokami a płytą.
   3. Za pomocą rękawic wyjmij płytki testowe z pojemnika na wodę. Jeśli woda dostanie się między żel agarozowy a płytkę i spowoduje powstanie guzków na powierzchni, usuń wodę za pomocą mikropipety P1000.
   4. Umieść płytki testowe na blokach aluminiowych tak, aby rozgraniczenia znajdujące się 2 cm od każdej krawędzi dokładnie pokrywały się z krawędziami bloków aluminiowych (Rysunek 2A, C).
   5. Spryskaj powierzchnię płytki wodą (wystarczy cienka membrana wodna pokrywająca powierzchnię agarozy), aby zapobiec wysychaniu żelu agarozowego. Upewnij się, że membrana wodna jest ciągła i wolna od kropelek wody, ponieważ larwy mogą zostać uwięzione w kropelkach wody.
   6. Przykryj system gradientowy kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie wody i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj 5-10 minut, aby temperatura się wyrównała.
   7. Sprawdź temperaturę powierzchni w 12 punktach na tabliczce (Rysunek 2C). Wykonaj dwa pomiary w każdej strefie, aby ustalić, czy istnieje zmienność w strefie. Upewnij się, że temperatura w obu miejscach mieści się w zakresie ± 0.2 °C od żądanej temperatury.
      UWAGA: Zmienność w obrębie strefy zwykle występuje, ponieważ dokładne odległości dwóch punktów do krawędzi aluminiowych bloków nie są identyczne. Dostosuj położenie płyty na aluminiowych blokach, aby upewnić się, że rozgraniczenia znajdujące się 2 cm od dowolnej krawędzi dokładnie pasują do krawędzi aluminiowych bloków.
   8. Jeśli zmierzony gradient temperatury odbiega od pożądanego gradientu, zwiększ lub zmniejsz ustawienie temperatury łaźni wodnej i ponownie sprawdź temperaturę powierzchni po ustabilizowaniu się temperatury łaźni wodnej.
   9. Przykryj system gradientu kartonowym pudełkiem do momentu rozpoczęcia testu.
4. Ustawianie gradientu dwukierunkowego (opcjonalnie)
   1. Przygotować odczynniki i przedmioty na stole obok aparatury do oznaczania gradientu (patrz Tabela materiałów).
   2. Rozpyl wodę na powierzchnie trzech bloków aluminiowych, aby zapewnić wydajny transfer temperatury z bloków aluminiowych na płytki testowe, wypełniając wszelkie szczeliny między powierzchniami.
   3. Ostrożnie wyjmij płytki testowe z pojemnika na wodę i umieść je na aluminiowych blokach. Jeśli woda dostanie się między żel agarozowy a płytkę, co może spowodować powstanie guzków na powierzchni, usuń wodę za pomocą mikropipety P1000.
   4. Umieść płytkę testową na aluminiowych blokach tak, aby linie środkowe pierwszej i ostatniej strefy z dowolnej krawędzi dokładnie pokrywały się z krawędziami dwóch bocznych bloków aluminiowych (Rysunek 2B, D).
   5. Spryskaj powierzchnię płytki wodą (wystarczy cienka membrana wodna pokrywająca powierzchnię agarozy), aby zapobiec wysychaniu żelu agarozowego. Upewnij się, że membrana wodna jest ciągła i wolna od kropelek wody, ponieważ larwy mogą zostać uwięzione w kropelkach wody.
   6. Przykryj system gradientowy kartonowym pudełkiem, aby zmniejszyć parowanie wody i pomóc ustabilizować temperaturę powierzchni żelu. Odczekaj 5-10 minut, aby temperatura się wyrównała.
   7. Sprawdź temperaturę powierzchni w dwóch punktach wzdłuż linii środkowej każdej z 10 stref (Rysunek 2D). Wykonaj dwa pomiary w każdej strefie, aby ustalić, czy istnieje zmienność w strefie. Upewnij się, że temperatura w obu miejscach mieści się w zakresie ± 0.2 °C od żądanej temperatury.
      UWAGA: Zmienność w obrębie strefy zwykle występuje, ponieważ dokładne odległości dwóch punktów do krawędzi aluminiowych bloków nie są identyczne. Dostosuj położenie płyty na aluminiowych blokach, aby upewnić się, że linie środkowe pierwszej i ostatniej strefy najbliżej każdej krawędzi dokładnie pokrywają się z krawędziami dwóch bocznych bloków aluminiowych.
   8. Jeśli zmierzony gradient temperatury odbiega od żądanego gradientu, wyreguluj ustawienie temperatury łaźni wodnej i ponownie sprawdź temperaturę powierzchni po ustabilizowaniu się temperatury łaźni wodnej.
   9. Przykryj bloki kartonowym pudełkiem do momentu rozpoczęcia testu.

4. Pobieranie i mycie larw

1. Odizolować czyste larwy (opcja 1)
   1. Dodaj ~40 ml 18% roztworu sacharozy do probówki o pojemności 50 ml. Zebrać wszystkie larwy z fiolki (fiolek) z pokarmem za pomocą czerpaka i przenieść do 18% roztworu sacharozy.
   2. Wymieszaj dokładnie, ale delikatnie za pomocą czerpaka, aby oddzielić larwy od resztek jedzenia. Odczekaj 30-60 s, aż larwy uniosą się na wierzchnią warstwę rurki. Wlej górną warstwę zawierającą larwy (~10 ml) do kolejnej probówki o pojemności 50 ml i napełnij probówkę świeżym 18% roztworem sacharozy. Poczekaj 30-60 s, aż larwy ponownie uniosą się na wierzchniej warstwie.
      UWAGA: Duże cząstki pokarmu czasami przenoszą się razem z larwami i mogą wpływać na termotaksję larw, jeśli nie zostaną usunięte. Jeśli w górnej warstwie pozostaną duże cząstki jedzenia, powtórz kroki 4.1.1-4.1.2 lub usuń je ręcznie za pomocą czerpaka.
   3. Przenieś górną warstwę larw (~10 ml) do dwóch innych probówek o pojemności 50 ml i napełnij dwie probówki wodą destylowaną, aby zmniejszyć stężenie sacharozy, aby larwy szybko zanurzyły się w wodzie. Poczekaj 30-60 sekund, aż larwy opadną na dno. Wykonaj tę i kolejne kroki tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec utonięciu larw.
   4. Wylej jak najwięcej wody, delikatnie przechylając rurki. Połącz larwy w jedną probówkę, wylewając larwy pozostałą wodą i napełnij probówkę wodą destylowaną.
   5. Poczekaj 30-60 sekund, aż wszystkie larwy opadną i usuń jak najwięcej wody, delikatnie przechylając rurki. Powtórz ten etap mycia 2-4 razy, aby całkowicie usunąć sacharozę i całe widoczne jedzenie.
   6. Wylać jak najwięcej wody i przenieść larwy na pustą szalkę Petriego o średnicy 35 mm przez dekantację. Spryskaj tubkę wodą i użyj małego pędzla, aby pomóc przenieść larwy.
   7. Usunąć nadmiar wody z szalki Petriego za pomocą mikropipety P1000. Pozostaw ~0,5 ml wody, aby zapobiec odwodnieniu larw.
   8. Umieść pokrywkę na naczyniu, aby zapobiec ucieczce larw. Odwróć pokrywkę do góry nogami, aby zmniejszyć zdolność larw do ucieczki przez małą szczelinę między pokrywką a naczyniem. Pozwól larwom zregenerować się przez 10-20 minut.
2. Odizolować czyste larwy (opcja 2)
   UWAGA: Ta alternatywna metoda czyszczenia larw zmniejsza możliwość uduszenia larw podczas procedury mycia. Aby skorzystać z tej metody, wykonaj następujące czynności po wykonaniu powyższych kroków 4.1.1-4.1.2.
   1. Umieść sitko do komórek (300 μm, zatrzymuje larwy 72 h AEL lub starsze) na probówce o pojemności 50 ml.
   2. Po upewnieniu się, że na powierzchni roztworu sacharozy nie unoszą się ciała dorosłych osobników ani resztki jedzenia, należy przelać wierzchnią warstwę zawierającą larwy przez sitko, aby uwięzić wszystkie larwy na siatce. Dokładnie umyj larwy wodą destylowaną, aż do napełnienia probówki o pojemności 50 ml.
   3. Wyjmij sitko z larwami i wylej zużytą wodę z probówki. Umieścić sitko zawierające larwy na pustej probówce i ponownie umyć larwy wodą destylowaną, aż do napełnienia probówki o pojemności 50 ml.
   4. Odwróć sitko do góry nogami na pustej szalce Petriego o średnicy 35 mm i spryskaj wodą z górnej części sitka komórkowego, aby przenieść larwy na szalkę Petriego. Przenieś pozostałe larwy za pomocą małego pędzla.
   5. Przejdź do kroku 4.1.7 powyżej, zanim przejdziesz do kroku 5.

5. Test i obliczenia

1. Wyjmij karton i sprawdź temperaturę powierzchni żelu bezpośrednio przed przeniesieniem larw na płytkę. Zminimalizuj czas, w którym karton jest otwarty, aby zapobiec zakłóceniu równowagi temperatury. Jeśli powierzchnia jest sucha, spryskaj ją niewielką ilością wody.
2. Rozmieść od 150 ± 50 larw w pobliżu środka każdej płytki (między strefami 3 i 4 z 6 stref) dla gradientu jednokierunkowego (strefa uwalniania; Rysunek 2C).
   UWAGA: W przypadku gradientu dwukierunkowego rozmieść 200-400 larw wzdłuż środkowej strefy każdej połowy (Rysunek 2D).
3. Umieść pokrywkę mikropłytki na każdej płytce testowej, aby zapobiec wypełzaniu larw. Przykryj zestaw kartonowym pudełkiem, aby zapobiec ekspozycji na światło, która może wpłynąć na wybór larw na żelu agarozowym.
   UWAGA: W przypadku gradientu dwukierunkowego nie powinno być konieczne przykrywanie płytki pokrywką, ponieważ płytka jest większa, a preferowana temperatura larw znajduje się w strefie środkowej. W związku z tym niewiele larw gromadzi się na krawędziach i ma możliwość wyczołgania się.
4. Pozostawić test na 10-30 minut w przypadku gradientu jednokierunkowego i na 15-35 minut w przypadku gradientu dwukierunkowego, w zależności od wieku larw (tabela 4).
5. Wyjmij pudełko tekturowe i pokrywkę mikropłytki. Sfotografuj tablice z góry za pomocą aparatu cyfrowego. Zrób dwa zdjęcia każdej płytki testowej, aby badacz mógł wybrać tę o lepszym kontraście i jasności do analizy.
6. Usunąć wszystkie larwy z płytek testowych i w dowolnym miejscu poza płytkami przez aspirację.
7. Dokładnie oczyścić płytki testowe, probówki i sitko do komórek wodą destylowaną. Ponownie użyć płytek do oznaczania przygotowanych tego dnia, chyba że powierzchnia agarozy jest uszkodzona.
8. Oblicz procentowy rozkład larw w każdej strefie.
   1. Otwórz obraz fotograficzny wyników testu za pomocą dowolnego oprogramowania, które umożliwia dodawanie oznaczeń do obrazu. Aby wskazać strefy oznaczania, należy narysować pionowe linie co 2 cm w oparciu o rozgraniczenia na tabliczce testowej.
   2. Policz liczbę larw w każdej strefie i zapisz liczby. Nie licz larw w obszarach oddalonych o 0,5 cm od którejkolwiek ze ścian. Żel jest grubszy w pobliżu ścian, a temperatury powierzchni nie są liniowe w tych regionach.
   3. W przypadku gradientu jednokierunkowego oblicz rozkład procentowy w każdej strefie w następujący sposób:
      (liczba larw w danej strefie 2 cm)/ (łączna liczba larw w 6 strefach) x 100.
   4. Dla gradientu dwukierunkowego oblicz rozkład procentowy w każdej strefie w następujący sposób:
      (liczba larw w danej strefie 2 cm)/ (całkowita liczba larw w 5 strefach po każdej stronie gradientu) x 100.

Wyniki

Aby ustalić jednokierunkowy gradient 18 °C-28 °C, ustawiamy temperatury dwóch kąpieli wodnych na 16,8 °C i 31 °C. Temperatury uzyskujemy w 13 punktach, mierząc temperaturę w 26 pozycjach w górnej i dolnej części wszystkich 6 stref, linii granicznych między strefami oraz na skrajnych końcach powierzchni żelu agarozowego (Rysunek 2C, 2E). Rozkład temperatury wzdłuż gradientu był prawie liniowy (Y = 0,9672*X + 16,19, R² = 0,9961) (

Dyskusja

Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, ważne jest, aby podjąć kroki w celu uzyskania odpowiedniej liczby larw do przeprowadzenia eksperymentów. Obejmują one wstępne karmienie much w fiolkach zawierających pastę drożdżową przez 2-3 dni, aby poprawić składanie jaj. Fiolki należy umieścić na tacy zawierającej fiolki z wodą i zamknąć w przezroczystej plastikowej torbie, która utrzymuje wilgotność pokarmu i wspomaga skuteczne odżywianie się larw, umożliwiając jednocześnie narażenie na normalne cykle światło-ciemność. Jednak ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gradientowy aparat testowy
PolyScience 9106, Chłodzona/podgrzewana kąpiel cyrkulacyjna 6L	Thomas Scientific	9106	Ten model został wycofany z produkcji. Zaktualizowane modele zamienne obejmują: 1186R00 i 1197U04 dla 120 V, 60 Hz lub 1184L08 i 1197U04 dla 240 V, 50 Hz.
Aluminiowa płytka testowa (do gradientu jednokierunkowego)			Rozmiar zewnętrzny: 14 x 10,1 x 0,9 cm, rozmiar wewnętrzny: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodowany na czarno.
Płyta aluminiowa (do dwukierunkowego gradientu)			25 x 22 x 0,2 cm, anodowana na czarno.
Blok			Wymiary zewnętrzne: 25,5 x 5 x 1,4 cm, parametry kanałów wewnętrznych pokazano na rysunku 1D.
Łącznik do aluminiowych bloków i rurek	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitarne rurki silikonowe	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" ściana
Nazwa	Firma<	silny>Numer katalogowy	Komentarze
Items i odczynniki do testu
Pestle	USA Scientific	17361	Tłuczek do probówek do mikrowirówek 1,5 ml
Termometr	Fluke	51II
Termopara	Fluke	typ K
Uniwersalna pokrywka do mikropłytek	Corning	6980A77
Szalka 35 mm	Corning	9380D40
Taśma opisowa (do gradientu dwukierunkowego)	Fisher Scientific	15-951	Taśma do etykietowania Fisherbrand 2 cale x 14 jardów
Agaroza	Invitrogen	16500500	Przygotuj 1% roztwór
Sacharoza	Sigma	S0389-5KG	Przygotuj 18% roztwór tuż przed rozpoczęciem oznaczania
Pędzel	malarski Fisher Scientific	11860
50 ml probówki	wirówkoweDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 ml okrągła butelka z szerokim otworem	Pyrex	1395-500
Sitko do komórek (por 300 mm)	PluriSelect	43-50300	Opcjonalny przedmiot do mycia larw
Pudełko tekturowe (tacka na fiolki)	Genesee Scientific	FS32-124
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Uwagi
Drosophila food
Woda			22 400 ml
Mąka kukurydziana, żółta (o bardzo drobnych oczkach, flokowana) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
Drożdże piwne 100 funtów	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Mąka sojowa (10 kg/szt.)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Typ II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo jasny syrop kukurydziany	Karo		1,700 mL
4-hydroksybenzoesan metylu (zawiesina w 200 proof etanolu)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Kwas propionowy puriss. rocznie,>99,5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 ml
Kwas fosforowy  odczynnik ACS, ≥ 85 % wag. w H2O	Sigma Aldrich	438081-500 ml	8,5 ml