Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół obrazowania mielinowanych aksonów w ustalonym wycinku mózgu przy użyciu bezznacznikowej techniki obrazowania w nanoskali opartej na reflektometrii spektralnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W układzie nerwowym ssaków, mielina zapewnia izolację elektryczną, owijając włókna aksonów wielowarstwową spiralą. Zainspirowani wysoce zorganizowaną architekturą subkomórkową, opracowaliśmy niedawno nową metodę obrazowania, nazwaną reflektometrią spektralną (SpeRe), która umożliwia bezprecedensowe obrazowanie w nanoskali żywych mielinizowanych aksonów in situ bez znaczników. Podstawową zasadą jest uzyskanie informacji nanostrukturalnej poprzez analizę widma odbicia wielowarstwowej struktury subkomórkowej. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół krok po kroku do wykonywania podstawowego obrazowania SpeRe tkanek nerwowych przy użyciu komercyjnego konfokalnego systemu mikroskopowego, wyposażonego w laser światła białego i przestrajalny filtr. Zajmujemy się procedurami przygotowania próbek, pozyskiwania danych spektralnych i przetwarzania obrazu w celu uzyskania informacji nanostrukturalnej.
Wprowadzenie
W układzie nerwowym ssaków mielina zapewnia szybkie przewodzenie impulsów nerwowych i integralność aksonów poprzez otaczanie włókien aksonalnych wielowarstwowymi osłonkami błoniastymi. Jej wielowarstwowa struktura składa się z naprzemiennych nanometrowych cienkich warstw tworzonych przez błony plazmatyczne (~5 nm), cytozol (~3 nm) oraz przestrzenie zewnątrzkomórkowe (~7 nm)1,2. Mikroskopia optyczna, w tym nowoczesna mikroskopia superrozdzielcza, nie nadaje się do obserwacji nanometrowej dynamiki mieliny ze względu na niewystarczającą rozdzielczość wynikającą z dyfrakcji optycznej3,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan.
1. Przygotowanie próbki
Uwaga: Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed kontaktem ze zwierzętami. Przeprowadzaj wszystkie zabiegi chirurgiczne w pomieszczeniu przeznaczonym do zabiegów chirurgicznych. Sterylne fartuchy chirurgiczne i rękawiczki powinny być noszone przez cały personel na sali operacyjnej przez cały czas.
- Utrwalenie tkanek
- Przygotować dwie strzykawki o pojemności 10 ml, każda wypełniona solą fizjolo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem, przygotowano stałą sekcję mózgu z barwieniem egzogennym za pomocą fluoroforu wiążącego mielinę (patrz Tabela materiałów). Obrazowanie SpeRe przeprowadzono na sekcji mózgu za pomocą komercyjnego konfokalnego mikroskopu hiperspektralnego w połączeniu z konfokalnym obrazowaniem fluorescencyjnym (Rycina 4a). W przypadku SpeRe natężenie optyczne wejściowe ustawiono na 5 µW/µm2 przy czasie przebywania piksela wynosz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
SpeRe to nowa, bezznacznikowa metoda obrazowania oparta na interferometrii spektralnej, która po raz pierwszy oferuje informacje w nanoskali w żywych mielinizowanych aksonach. W obecnym protokole akwizycji rozdzielczość przestrzenna dla średnicy aksonu jest rzędu 10 nm. Co więcej, SpeRe wykorzystuje o rzędy wielkości niższą dawkę światła w porównaniu z innymi mikroskopami o wysokiej rozdzielczości; Dzięki temu jest wolny od fototoksyczności i fotowybielania. Projekt SpeRe stworzy nową drogę do badania dynamiki aksonów mi.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują sprzeczne interesy finansowe: J. Kwon i M. Choi są wynalazcami zgłoszonej do opatentowania technologii opisanej w niniejszym artykule.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R015-D1) oraz przez Program Badań Nauk Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1A6A1A03015642).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nóż do szkła | - | można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych. | |
| Lakier do paznokci | - | można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych. | |
| Obiektyw apochromatyczny 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Typ zanurzeniowy w wodzie |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatywnie można użyć Fluoromyelin Red (F34652). |
| Mikroskop Leica SP8 TCS | Leica Microsystems | SP8 | Szczegółowe informacje można znaleźć w rozdziale "Konfiguracja mikroskopu" w rozdziale Wprowadzenie. |
| Oprogramowanie do obrazowania | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | ||
| -Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Pokryty chronionym srebrem. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Technologie życia | 14190-136-Paraformaldehyd | |
| Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS | |
| Szkiełko nakrywkowe | Thermo Fisher | 3306 | Grubość: #1 (0,13 do 0,17 mm) |
| Szkło przesuwne | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Grubość: ~1 mm |
| Super klej | Henkel | Loctite 406 | Używaj urządzenia dozującego, aby uniknąć kontaktu ze skórą lub oczami. |
| Pompa strzykawkowa | Brainetree Scientific | BS-8000 | |
| Leica Biosystems | VT1200S-Laser | ||
| światła białego | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 została wycofana z produkcji i zastąpiona przez EXU-6. |
Bibliografia
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS mye....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
