Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół obrazowania mielinowanych aksonów w ustalonym wycinku mózgu przy użyciu bezznacznikowej techniki obrazowania w nanoskali opartej na reflektometrii spektralnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinizowanych aksonach in situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W układzie nerwowym ssaków, mielina zapewnia izolację elektryczną, owijając włókna aksonów wielowarstwową spiralą. Zainspirowani wysoce zorganizowaną architekturą subkomórkową, opracowaliśmy niedawno nową metodę obrazowania, nazwaną reflektometrią spektralną (SpeRe), która umożliwia bezprecedensowe obrazowanie w nanoskali żywych mielinizowanych aksonów in situ bez znaczników. Podstawową zasadą jest uzyskanie informacji nanostrukturalnej poprzez analizę widma odbicia wielowarstwowej struktury subkomórkowej. W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół krok po kroku do wykonywania podstawowego obrazowania SpeRe tkanek nerwowych przy użyciu komercyjnego konfokalnego systemu mikroskopowego, wyposażonego w laser światła białego i przestrajalny filtr. Zajmujemy się procedurami przygotowania próbek, pozyskiwania danych spektralnych i przetwarzania obrazu w celu uzyskania informacji nanostrukturalnej.
Wprowadzenie
W układzie nerwowym ssaków mielina zapewnia szybkie przewodzenie impulsów nerwowych i integralność aksonów poprzez otaczanie włókien aksonalnych wielowarstwowymi osłonkami błoniastymi. Jej wielowarstwowa struktura składa się z naprzemiennych nanometrowych cienkich warstw tworzonych przez błony plazmatyczne (~5 nm), cytozol (~3 nm) oraz przestrzenie zewnątrzkomórkowe (~7 nm)1,2. Mikroskopia optyczna, w tym nowoczesna mikroskopia superrozdzielcza, nie nadaje się do obserwacji nanometrowej dynamiki mieliny ze względu na niewystarczającą rozdzielczość wynikającą z dyfrakcji optycznej3,4,5. Choć mikroskopia elektronowa pozwala na uzyskanie szczegółowych informacji o nanostrukturze mieliny, nie jest ona kompatybilna z żywymi układami biologicznymi ze względu na wysoce inwazyjne przygotowanie próbek, obejmujące fiksację chemiczną i ultramićciecie6,7. Do niedawna nie istniała technika pozwalająca na obserwację nanometrowej dynamiki zmielinizowanych aksonów in situ.
Schain i in. wcześniej zgłoszono, że aksony zmielinizowane wykazują kolorową refleksyjność światła8Dzięki zastosowaniu analizy spektroskopowej światła odbitego opracowaliśmy nową metodę obrazowania do obrazowania aksonów zmielinizowanych w skali nanometrycznej, nazwaną reflektometrią spektralną (SpeRe).9SpeRe opiera się na interferencji cienkowarstwowej występującej w wielowarstwowej strukturze osłonki mielinowej (Rycina 1). Przeprowadzona symulacja optyczna dla różnych aksonów wykazała, że widmo odbicia jest funkcją okresową liczby falowej, a jego okresowość (
) jest odwrotnie proporcjonalna do średnicy aksonu (d). Ta prosta zależność (
) umożliwia łatwą kwantyfikację średnicy aksonów na podstawie danych SpeRe. Wykorzystując tę metodę, w naszej poprzedniej publikacji wykazaliśmy powszechne pęcznienie aksonów w przebiegu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu.
System SpeRe opiera się na mikroskopii konfokalnej i składa się ze specjalistycznego źródła laserowego oraz filtrów (Rysunek 2). Źródłem wejściowym jest laser białego światła, zapewniający szerokopasmową emisję widmową od zakresu widzialnego do podczerwieni. Do skanowania widmowego system wyposażony jest w dwa urządzenia akustyczno-optyczne: akustyczno-optyczny filtr strojący (AOTF), służący do dostarczania wybranej długości fali z szerokopasmowego źródła wejściowego, oraz akustyczno-optyczny rozdzielacz wiązki (AOBS), który kieruje wybraną odbitą długość fali do detektora. Oprogramowanie do konfokalnej mikroskopii hiperspektralnej (patrz Tabela materiałów) oferuje możliwość konfigurowalnego skanowania widmowego w celu sekwencyjnego pozyskiwania obrazów odbiciowych przy różnych długościach fali wejściowej. Ponadto aberracja chromatyczna może istotnie zakłócać pomiar widmowy; dlatego zaleca się stosowanie obiektywu apochromatycznego.
Należy zauważyć, że lasery białego światła generują nierównomierny sygnał widmowy, a komponenty optyczne również wpływają na profil widmowy. W związku z tym nabyte widma muszą zostać skalibrowane przed przeprowadzeniem dalszej analizy ilościowej. Jako wzorca zazwyczaj stosuje się chronione lustro srebrne, które zapewnia niemal stałą odbijalność (> 97%) w całym zakresie widzialnym. Następnie nabyte widma dzieli się przez widma referencyjne uzyskane z lustra.
Krok spektralny w skanowaniu spektralnym określa prędkość akwizycji, dlatego musi on zostać zoptymalizowany. Ponieważ większy akson ma dłuższy okres spektralny, wymaga on gęstszego próbkowania spektralnego. Na przykład akson o średnicy 10 µm, będący jednym z największych fizjologicznych aksonów, ma okres spektralny wynoszący ~8 nm. Stosując kryterium próbkowania Nyquista, zastosowaliśmy interwał próbkowania spektralnego wynoszący 4 nm, aby objąć wszystkie fizjologiczne aksony w tkankach nerwowych myszy. Takie podejście zazwyczaj trwa kilka sekund dla pełnego skanowania spektralnego i nie nadaje się zatem do zastosowań in vivo, gdzie ruchy fizjologiczne (np. oddychanie i bicie serca) zakłócają stabilną akwizycję spektralną. Rozwiązaliśmy ten problem wcześniej, konstruując specjalistyczny mikroskop pionowy, zaprojektowany do pozyskiwania pełnego widma dla każdego punktu przy użyciu spektrometru matrycowego (prędkość akwizycji ≈ 30 ms na piksel).
W niniejszym raporcie opisujemy szczegółowy protokół obrazowania SpeRe na utrwalonym skrawku mózgu, który można przeprowadzić przy użyciu komercyjnego mikroskopu hiperspektralnego (patrz Tabela materiałów). Dzięki temu badacze nieposiadający specjalistycznej wiedzy z zakresu instrumentacji optycznej mogą samodzielnie przeprowadzić ten protokół. Omówiliśmy również potencjalne problemy oraz sposoby ich rozwiązywania podczas akwizycji i analizy danych SpeRe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan.
1. Przygotowanie próbki
Uwaga: Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przed kontaktem ze zwierzętami. Przeprowadzaj wszystkie zabiegi chirurgiczne w pomieszczeniu przeznaczonym do zabiegów chirurgicznych. Sterylne fartuchy chirurgiczne i rękawiczki powinny być noszone przez cały personel na sali operacyjnej przez cały czas.
- Utrwalenie tkanek
- Przygotować dwie strzykawki o pojemności 10 ml, każda wypełniona solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS.
- Znieczulić 7-12-tygodniową mysz (C57BL/6J lub dowolną linię myszy dowolnej płci), podając mieszaninę zoletilu i ksylazyny (1:1, 20 mg/kg każdy) lub alternatywny odpowiedni reżim znieczulenia (np. mieszaninę 80 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.
- Gdy mysz osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia (użyj metody reakcji szczypania palca u nogi), odsłoń serce, odcinając skórę i klatkę piersiową nożyczkami.
- Odetnij prawy przedsionek małymi nożyczkami, aby spuścić krew i przeprowadź sekwencyjną fuzję roztworu PBS i PFA przez lewą komorę za pomocą igły (szybkość perfuzji = 4 ml / min, objętość = 10 ml dla każdego roztworu).
Uwaga: Mysz staje się sztywna, jeśli procedura zostanie pomyślnie zakończona. Stosowanie maści do oczu lub sterylizacji nie jest konieczne, ponieważ zabieg jest nieuleczalny. Procedurę utrwalania można pominąć. Jednak ten krok jest zalecany w celu zminimalizowania deformacji strukturalnych, w tym mechanicznego uszkodzenia tkanek i niedokrwiennego obrzęku aksonów. Więcej informacji na temat fiksacji tkanek można znaleźć w artykule Gage'a, G. J. i wsp.10
- Przygotowanie wycinka mózgu
- Odetnij głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi przez brzuszną klatkę piersiową i brzuch.
- Usuń skórę głowy i okostną za pomocą odpowiednio małych nożyczek, aż do całkowitego odsłonięcia czaszki.
- Złam kość czołową i odetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego od kości potylicznej za pomocą małych nożyczek, uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
- Delikatnie usuń czaszkę i oponę twardą kolejno za pomocą cienkich kleszczy.
- Wyciągnij mózg za pomocą miękkiej plastikowej łyżki, uważając, aby nie uszkodzić tkanki.
- Wyekstrahowany mózg opłukać i namoczyć w 4% roztworze PFA przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Pokrój nieruchomy mózg na sekcje 100 – 150 μm za pomocą wibratomu.
Uwaga: Więcej informacji na temat przygotowania tkanek można znaleźć w artykule Segev i wsp.11. W przypadku kolejnych zabiegów, tkanka powinna być pokrojona na odcinki cieńsze niż grubość przekładki.
- Montaż wycinka mózgu
- Przygotuj 1 szkiełko podstawowe i 2 kwadratowe szklanki nakrywkowe (22 × 22 × 0,17 mm) dla każdego plastra chusteczki.
- Przetnij jedną z kwadratowych szklanek nakrywkowych na pół (dwa prostokątne kawałki) za pomocą noża do szkła.
- Przymocuj dwie przepołowione szklanki nakrywkowe za pomocą super kleju do szkła szkiełkowego.
Uwaga: Przestrzeń między dwoma przepołowionymi szklankami powinna być nieco większa niż rozmiar wycinka chusteczki. - Zbierz plasterek mózgu za pomocą pędzla lub pipety i połóż chusteczkę na szkiełku szkiełkowym między przekładką. Uważaj, aby nie złożyć chusteczki.
- Dozuj 100 μl PBS na powierzchnię tkanki.
- Umieść drugą kwadratową szklankę nakrywkową na chusteczce. Na tym etapie należy unikać wtrącania pęcherzyków powietrza.
- Uszczelnij wokół szkła nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci (lub alternatywnie odpowiednich klejów), aby zapobiec parowaniu PBS i zanieczyszczeniu pyłem podczas kolejnej sesji obrazowania.
Uwaga: Na tym etapie eksperymentator może zrobić pauzę.
2. Kalibracja
- Włączyć mikroskop co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić stabilizację termiczną źródła lasera (patrz Tabela materiałów). Następnie włącz oprogramowanie do skanowania spektralnego (patrz Spis materiałów) i kliknij przycisk Acquire w górnej części GUI (Rysunek 3a)".
- Włącz migawkę programową dla lasera światła białego (WLL) i lampy fotopowielacza (PMT) (Rysunek 3a).
- Wybierz tryb xyΛ z listy rozwijanej w trybie akwizycji, a następnie tryb wprowadzania lasera zostanie automatycznie zmieniony ze stałego procentu na stałą moc. Odznacz pole wyboru Automatyczny ruch SP. Następnie ustaw okno spektralne lasera wejściowego na 470–670 nm, a rozmiar kroku spektralnego na 4 nm w ustawieniach skanowania lambda wzbudzenia λ (Rysunek 3b).
- USTAW zakres spektralny PMT na 450-690, klikając dwukrotnie lub przesuwając pasek regulacji zakresu spektralnego (Rysunek 3c).
Uwaga: Ten zakres spektralny powinien obejmować pełną szerokość pasma źródła wejściowego. - Wybierz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie, odpowiednio z dużą aperturą numeryczną (NA > 0,7) i podaj dowolną wartość PMT i mocy lasera, aby aktywować konfigurację AOBS i przycisk Live Scan. Przełącz ścieżkę optyczną, sprawdzając odbicie w konfiguracji AOBS (Rysunek 3d).
- Zamontuj lustro referencyjne (patrz Tabela materiałów) na stoliku mikroskopu. Powierzchnia lustra powinna być zwrócona w stronę soczewki obiektywu. Jeśli nie jest łatwo umieścić lustro na stoliku mikroskopu, przymocuj lustro do płaskiej płyty (np. szkła szkiełkowego).
- Kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej z powierzchnią lustra.
- Dostosuj wzmocnienie PMT i moc lasera, biorąc pod uwagę zakres dynamiczny detektora, a następnie zmień tryb wprowadzania lasera ze stałego procentu na stałą moc.
Uwaga: Jak to zwykle bywa, przy 570 nm stosuje się wzmocnienie PMT 500 (V) i względną moc lasera 0,1%. - Potwierdź w trybie pseudokolorowym, aby sprawdzić, czy nie ma nasycenia w całym zakresie długości fali. Jeśli zaobserwuje się nasycenie, zmniejsz moc lasera (Rysunek 3a).
- Uruchom pobieranie skanowania lambda.
- Zdjąć lustro ze stolika i powtórzyć tę samą akwizycję bez próbki, aby uzyskać ciemne odniesienie (tj. ciemne przesunięcie).
- Zapisz dane w formacie wielostosowym TIF.
3. Akwizycja obrazu SpeRe
- Umieść zamontowaną tkankę na stoliku mikroskopu. Aby z grubsza wyrównać tkankę z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu, użyj trybu fluorescencji szerokokątnej przez okular .
- Przy włączonym Live Scan kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej do interesującego obszaru tkanki. Aby uniknąć szumu tła z szkiełka nakrywkowego, wybierz obszar docelowy o głębokości co najmniej 15 μm z granicy faz szkło-chusteczka.
- Uzyskaj stos obrazów spektralnych dla obszaru docelowego, stosując tę samą procedurę, jak opisano w krokach 2.1–2.10.
- Zapisz dane dla tkanki i ciemnego offsetu w formacie Multistacked TIF.
Uwaga: Na tym etapie eksperymentator może zrobić pauzę.
4. Przetwarzanie i analiza obrazu
- Otwórz dane spektralne (wielowarstwowy TIF) dla lustra referencyjnego i tkanki mózgowej w ImageJ.
- Wybierz ROI (obszary zainteresowania) dla otwartych stosów obrazów — centralny obszar dla lustra referencyjnego i segment włókna aksonowego dla tkanki mózgowej.
- Uzyskaj nieprzetworzone widma dla wybranych ROI, uruchamiając polecenie Image → Stacks → Plot Z-axis profile (Obraz stosów) w menu ImageJ (ImageJ).
- Otwórz dane z ciemnego przesunięcia, jedno wykonane dla lustra referencyjnego, a drugie dla tkanki mózgowej.
- Aby uzyskać widma ciemnych przesunięć, uruchom polecenie Image → Stacks → Plot Z-axis profile (Obraz Wykres profilu osi Z) w menu ImageJ.
- Zapisz wszystkie uzyskane widma za pomocą opcji Kopiuj i wklej.
Uwaga: W przypadku obrazowania SpeRe zaleca się użycie centralnego pola obrazowania w celu zminimalizowania aberracji optycznych poza osią. Włókna aksonów mogą być strukturalnie niejednorodne na całej swojej długości. W związku z tym zaleca się wybranie zwrotu z inwestycji w małym segmencie aksonu, zwykle < 5 μm, w celu zminimalizowania artefaktu częściowej objętości.
5. Korekta linii bazowej i analiza sygnału SpeRe
- Odejmij widma przesunięte od widm lustra referencyjnego i tkanek mózgowych.
- Znormalizuj każde widmo, dzieląc maksymalne natężenie widma.
- Podziel znormalizowane widmo aksonu przez znormalizowane widmo lustra odniesienia i odejmij przesunięcie DC od znormalizowanego widma.
- Zmierz częstotliwość liczby falowej, dopasowując nabyte widmo do krzywej sinusoidalnej (patrz Tabela materiałów), a następnie przelicz uzyskaną liczbę falową na okresowość, biorąc odwrotność.
- Przelicz okresowość liczby falowej na średnicę aksonu, korzystając z równania w Rysunek 4c.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z protokołem, przygotowano stałą sekcję mózgu z barwieniem egzogennym za pomocą fluoroforu wiążącego mielinę (patrz Tabela materiałów). Obrazowanie SpeRe przeprowadzono na sekcji mózgu za pomocą komercyjnego konfokalnego mikroskopu hiperspektralnego w połączeniu z konfokalnym obrazowaniem fluorescencyjnym (Rycina 4a). W przypadku SpeRe natężenie optyczne wejściowe ustawiono na 5 µW/µm2 przy czasie przebywania piksela wynosz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
SpeRe to nowa, bezznacznikowa metoda obrazowania oparta na interferometrii spektralnej, która po raz pierwszy oferuje informacje w nanoskali w żywych mielinizowanych aksonach. W obecnym protokole akwizycji rozdzielczość przestrzenna dla średnicy aksonu jest rzędu 10 nm. Co więcej, SpeRe wykorzystuje o rzędy wielkości niższą dawkę światła w porównaniu z innymi mikroskopami o wysokiej rozdzielczości; Dzięki temu jest wolny od fototoksyczności i fotowybielania. Projekt SpeRe stworzy nową drogę do badania dynamiki aksonów mi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują sprzeczne interesy finansowe: J. Kwon i M. Choi są wynalazcami zgłoszonej do opatentowania technologii opisanej w niniejszym artykule.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Instytut Nauk Podstawowych (IBS-R015-D1) oraz przez Program Badań Nauk Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1A6A1A03015642).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nóż do szkła | - | można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych. | |
| Lakier do paznokci | - | można go kupić w lokalnym sklepie spożywczym lub sklepach internetowych. | |
| Obiektyw apochromatyczny 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Typ zanurzeniowy w wodzie |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatywnie można użyć Fluoromyelin Red (F34652). |
| Mikroskop Leica SP8 TCS | Leica Microsystems | SP8 | Szczegółowe informacje można znaleźć w rozdziale "Konfiguracja mikroskopu" w rozdziale Wprowadzenie. |
| Oprogramowanie do obrazowania | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | ||
| -Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Pokryty chronionym srebrem. |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Technologie życia | 14190-136-Paraformaldehyd | |
| Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS | |
| Szkiełko nakrywkowe | Thermo Fisher | 3306 | Grubość: #1 (0,13 do 0,17 mm) |
| Szkło przesuwne | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Grubość: ~1 mm |
| Super klej | Henkel | Loctite 406 | Używaj urządzenia dozującego, aby uniknąć kontaktu ze skórą lub oczami. |
| Pompa strzykawkowa | Brainetree Scientific | BS-8000 | |
| Leica Biosystems | VT1200S-Laser | ||
| światła białego | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 została wycofana z produkcji i zastąpiona przez EXU-6. |
Bibliografia
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832(2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024(2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
