Method Article

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

DOI:

10.3791/58000

⸱

September 30th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 2Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 3PKU-Tsinghua-NIBS Graduate Program, Peking University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki endokrynne trzustki, które są skupione w wyspach trzustkowych, regulują stabilność stężenia glukozy we krwi i metabolizm energetyczny. Odrębne typy komórek w wyspach trzustkowych, w tym komórki β wydzielające insulinę, różnią się od powszechnych komórek progenitorowych układu hormonalnego w stadium embrionalnym. Niedojrzałe komórki endokrynne rozwijają się w wyniku proliferacji komórek i dojrzewają w długim okresie rozwoju pourodzeniowego. Mechanizmy leżące u podstaw tych procesów nie są jednak jasno określone. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki jest obiecującym podejściem do charakteryzowania odrębnych populacji komórek i śledzenia szlaków różnicowania linii komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę sekwencjonowania jednokomórkowego RNA izolowanych komórek β trzustki z trzustki embrionalnej, noworodkowej i poporodowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustka jest ważnym organem metabolicznym u ssaków. Trzustka składa się z przedziałów hormonalnych i zewnątrzwydzielniczych. Komórki endokrynne trzustki, w tym komórki β produkujące insulinę i komórki α produkujące glukagon, skupiają się razem w wysepkach Langerhansa i koordynują ogólnoustrojową homeostazę glukozy. Dysfunkcja komórek endokrynnych prowadzi do cukrzycy, która stała się poważnym problemem zdrowia publicznego na całym świecie.

Komórki endokrynne trzustki pochodzą od progenitorów Ngn3+ podczas embriogenezy1. Później, w okresie okołoporodowym, komórki endokrynne namnażają się, tworząc niedojrzałe wysepki. Te niedojrzałe komórki nadal się rozwijają i stopniowo stają się dojrzałymi wyspami trzustkowymi, które stają się bogato unaczynione, aby regulować homeostazę poziomu glukozy we krwi u dorosłych2.

Chociaż zidentyfikowano grupę czynników transkrypcyjnych, które regulują różnicowanie komórek β, dokładny szlak dojrzewania β komórek jest nadal niejasny. Co więcej, proces dojrzewania komórek β obejmuje również regulację ekspansji liczby komórek3,4 oraz generowanie niejednorodności komórkowej5,6. Mechanizmy regulacyjne tych procesów nie zostały jednak dobrze zbadane.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki to potężne podejście, które może profilować subpopulacje komórek i śledzić szlaki rozwoju linii komórkowych7. Korzystając z tej technologii, kluczowe zdarzenia, które zachodzą podczas rozwoju wysp trzustkowych, można rozszyfrować na poziomie pojedynczej komórki8. Wśród protokołów sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek, Smart-seq2 umożliwia generowanie pełnowymiarowego cDNA z lepszą czułością i dokładnością oraz stosowanie standardowych odczynników przy niższych kosztach9. Smart-seq2 potrzebuje około dwóch dni na zbudowanie biblioteki cDNA do sekwencjonowania10.

Tutaj proponujemy metodę izolacji komórek β znakowanych fluorescencyjnie od trzustki płodu do dorosłego myszy transgenicznych Ins1-RFP11, przy użyciu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), oraz przeprowadzanie analiz transkryptomicznych na poziomie pojedynczej komórki, przy użyciu technologii Smart-seq2 (Rysunek 1). Protokół ten można rozszerzyć o analizę transkryptomów wszystkich typów komórek endokrynnych trzustki w stanie normalnym, patologicznym i starzenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Pekińskiego.

1. Izolacja trzustki

  1. Dla zarodków E17,5 (17,5 dnia embrionalnego):
    1. Oszacuj dzień embrionalny 0,5 dnia na podstawie punktu czasowego, w którym pojawia się czop pochwowy.
    2. Poświęć ciężarne myszy przez podanie CO2 . Spryskaj sierść na brzuchu 70% alkoholem.
    3. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V nożyczkami od okolicy narządów płciowych sięgającej do żeber. Ten proces całkowicie otworzy jamę brzuszną.
    4. Wypreparuj macicę z jamy brzusznej i umieść ją w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym zimny PBS.
    5. Wypreparuj zarodki z macicy za pomocą cienkich kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym, usuwając inne tkanki, takie jak łożysko i pępowina. Umieść wszystkie zarodki w 10 cm naczyniu zawierającym zimny PBS.
    6. Rozerwij jamę brzuszną zarodków i wykop tkankę trzewną za pomocą pęsety łokciowej. Przenieść tkankę trzewną do naczynia o czarnym dnie o średnicy 6 cm, zawierającego zimny PBS.
    7. Trzustka znajduje się w lewej górnej części brzucha i przyczepia się do żołądka, śledziony i dwunastnicy (żółta przerywana linia w Rysunek 2A)12. Odłączyć trzustkę od tkanki trzewnej za pomocą kleszczy i połączyć tkankę trzustki w 20 ml fiolce zawierającej 5 ml 0,5 mg/ml zimnego roztworu kolagenazy o stężeniu 0,5 mg/ml w buforze izolacyjnym (HBSS zawierający 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glukozy, pH 7,4).
  2. Dla myszy P0-P15 (dzień po urodzeniu 0-15):
    1. Poświęć i przymocuj mysz, przyklejając kończyny do kawałka ochraniacza stołowego za pomocą taśmy. Spryskaj sierść na brzuchu 70% alkoholem.
    2. Całkowicie otwórz jamę brzuszną zgodnie z opisem w kroku 1.1.3. Wyciągnij jelito i przesuń się na lewą stronę myszy. Ta procedura odsłoni płaty dwunastnicy, żołądka i śledziony trzustki. Ostrożnie wypreparuj wszystkie płaty trzustki (Rysunek 2B)12 i połącz tkankę trzustki razem w 20 ml fiolce zawierającej 5 ml 0,5 mg/ml zimnego roztworu kolagenazy.
  3. Dla myszy P18-P60 (18-60 dzień po urodzeniu):
    1. Przygotuj roztwór kolagenazy. Trzymaj na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.
    2. Poświęć mysz i otwórz jamę brzuszną, jak wspomniano powyżej (kroki 1.1.2 i 1.1.3).
      UWAGA: Nie uszkadzaj wątroby, każda rana wątroby zmniejszy ciśnienie przepływu do przewodu żółciowego i zmniejszy skuteczność perfuzji w następnym kroku.
    3. Usuń mieczykowaty. Wyciągnij jelito i przesuń się na prawą stronę myszy, a następnie popchnij lewy i prawy przyśrodkowy płat wątroby na każdą stronę, aby odsłonić woreczek żółciowy (biała strzałka w Rysunek 2C) i wspólny przewód żółciowy.
    4. Zacisnąć dwunastnicę za pomocą pary małych zacisków naczyniowych w górnej i dolnej pozycji, flankując miejsce, w którym przewód żółciowy wchodzi do dwunastnicy (Rysunek 2D).
      UWAGA: Nie zaciskaj płatów żołądkowych ani śledzionowych trzustki. Roztwór kolagenazy nie wpłynie do płata żołądkowego i śledziony trzustki w następnym kroku, jeśli zostanie zaciśnięty.
    5. Napełnij strzykawkę 5 ml 0,5 mg/ml zimnego roztworu kolagenazy i wprowadź igłę 30 G do pęcherzyka żółciowego. Ostrożnie i płynnie manipuluj igłą przez wspólny przewód żółciowy.
    6. Perfuzję trzustki należy wprowadzić w postaci 1–5 ml roztworu zimnej kolagenazy o stężeniu 0,5 mg/ml, w zależności od wielkości myszy. Wstrzyknięcie powinno być powolne i stałe, aby zapobiec wysunięciu się igły z przewodu i pęknięciu jelita pod wysokim ciśnieniem cieczy. Wstrzyknięcie jest zakończone, gdy trzustka jest całkowicie rozciągnięta.
    7. Wypreparuj trzustkę (żółta przerywana linia w Rysunek 2D) z jamy brzusznej za pomocą kleszczy natychmiast po perfuzji. Umieścić tkankę w fiolce o pojemności 20 ml zawierającej 5 ml roztworu zimnej kolagenazy o stężeniu 0,5 mg/ml. Jeśli manipulujesz więcej niż jedną myszą na raz, perfaktoruj myszy jedna po drugiej i połącz tkanki w zimnym roztworze kolagenazy w fiolce o pojemności 20 ml, aż wszystkie myszy zostaną wypreparowane.

2. Trawienie kolagenazy i izolacja wysp trzustkowych

  1. Umieścić fiolkę o pojemności 20 ml zawierającą tkankę trzustki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 3 minuty w celu wyrównania temperatury.
  2. Delikatnie potrząsaj probówką przez kolejne 3 do 5 minut. Jeśli tkanka trzustki jest w pełni napompowana, będzie stopniowo dysocjować na małe kawałki tkanki, aż w końcu zostanie równomiernie rozproszyła. Czas trawienia różni się w zależności od wielkości trzustki i wydajności perfuzji.
  3. Przefiltruj strawiony produkt przez nylonowe sitko o średnicy 0,25 mm do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dokładnie umyj sitko za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml zawierającej lodowaty PBS.
  4. W przypadku trzustki E17.5-P15 przejdź do kroku 3.1.
  5. W przypadku trzustki P18-P60 odwirować przy 200 x g przez 1 minutę i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić tkankę za pomocą zimnego PBS.
  6. Wlać 5 ml zawiesiny tkankowej do naczynia z czarnym dnem o średnicy 6 cm. Wyspy trzustkowe są małymi, zwartymi, mlecznobiałymi strukturami, a tkanka groniasta jest luźna i półprzezroczysta na biało. Pobrać wysepki pipetą o pojemności 200 μl i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej niewielką ilość zimnego PBS.

3. Trawienie trypsyny w tkance trzustkowej lub wyspach trzustkowych

  1. Odwirować probówkę zawierającą tkankę trzustkową lub wyspy trzustkowe o sile 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
  2. Ponownie zawiesić osad z 0,25% trypsyną-EDTA i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po 4 minutach inkubacji delikatnie i od czasu do czasu odsysać (pipetować) przez 1 minutę za pomocą końcówek o pojemności 200 μl.
    UWAGA: W przypadku trzustki E17.5-P3 dodaj 1 ml trypsyny-EDTA. W przypadku trzustki P4-P15 dodaj 3 ml trypsyny-EDTA. W przypadku 100-300 wysepek dodaj 1 ml trypsyny-EDTA. Dostosuj objętość trypsyny-EDTA w zależności od ilości tkanki.
  3. Zatrzymaj trawienie, dodając 0,4 razy większą objętość zimnej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i wymieszaj delikatnym wirem.
  4. Wirować przy 250 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
  5. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 μl zimnego buforu FACS (HBSS zawierający 1% FBS, pH 7,4). Przenieś komórki do probówki FACS o pojemności 5 ml.
  6. Szybko obróć rurkę FACS, aby zawiesina komórkowa mogła przejść przez filtr w celu usunięcia niestrawionych dużych resztek tkankowych. Zawiesina jednokomórkowa w probówce jest teraz gotowa do sortowania FACS.

4. Liza pojedynczej komórki

  1. Przygotuj bufor do lizy komórek.
    UWAGA: Wykonuj wszystkie eksperymenty pod kapturem wysterylizowanym promieniami UV z przepływem laminarnym. Wszystkie probówki, płytki i końcówki do pipet powinny być wolne od RNaz/DNaz. Przed użyciem odkazić kaptur i pipety roztworem RNase away.
    1. Rozmrozić odczynniki na lodzie: dNTP (10 mM), starter oligo-dT (10 μM) i roztwór podstawowy ERCC (1:20).
    2. Rozcieńczyć ERCC w stosunku 1:5 x 10:5 wodą wolną od nukleaz.
    3. Oblicz potrzebną objętość buforu do lizy komórek. Dodać 0,1 μl inhibitora RNazy (40 U/μL), 1,9 μl 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μl dNTP, 1 μl startera oligo-dT i 0,05 μl rozcieńczonego ERCC do końcowej objętości 4,05 μl dla każdej komórki.
    4. Porcjować bufor do lizy komórek na cienkościenne probówki PCR z 8 paskami o pojemności 0,2 ml lub płytki 96-dołkowe. Odwirować probówki lub płytki przez 30 s w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Odwirować 0,2 ml cienkościennych probówek do PCR z 8 paskami o pojemności 7500 x g i płytek 96-dołkowych o sile 800 x g w następujących krokach.
  2. Pobieranie i liza pojedynczych komórek.
    1. Ręcznie pobieraj posortowane przez FACS pojedyncze komórki Ins1-RFP+ z bufora FACS do 8-paskowych probówek PCR za pomocą pipety kapilarnej 30–40 μm lub bezpośrednio sortuj pojedyncze komórki Ins1-RFP+ na płytki 96-dołkowe. Przyjmuje się, że objętość zawierająca pojedynczą komórkę jest mniejsza niż 0,3 μL,
      Uwaga: Użyj strategii bramkowania wysokości rozproszenia do przodu (FSC-H) w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu (FSC-A) do dyskryminacji dubletów, FSC-H vs obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) do sortowania zanieczyszczeń i bramkowania fluorescencyjnego do sortowania komórek Ins1-RFP+ (Rysunek 3A-3C). W przypadku metody pobierania należy posortować komórki docelowe do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 300 μl buforu FACS. Odpowiednie stężenie końcowe to 5–10 komórek/μl. Należy odpowiednio dostosować objętość buforu. W przypadku metody pobierania płytek, należy posortować pojedynczą komórkę do każdej studzienki 96-dołkowej płytki zgodnie z instrukcją obsługi. 7,13
    2. Wiruj rurki lub płytki, aby zlizować komórki i uwolnić RNA. Odwirować probówki lub płytki przez 30 s w temperaturze 4 °C i natychmiast umieścić je na lodzie.
      Uwaga: Ogniwa można przechowywać w temperaturze -80 °C przez tydzień.

5. Amplifikacja cDNA pojedynczej komórki

  1. Odwrotna transkrypcja (RT).
    1. Rozmrozić odczynniki RT (Tabela 1) na lodzie.
    2. Inkubować próbki w temperaturze 72 °C przez 3 minuty i natychmiast umieścić probówki lub płytki na lodzie na co najmniej 1 minutę. Krótko odwirować probówki lub płytki przez 30 s w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Do wszystkich inkubacji należy używać termocyklera z podgrzewaną pokrywą o temperaturze 105 °C.
    3. Przygotować mieszaninę RT dla wszystkich reakcji, jak opisano w tabeli 1.
    4. Do każdej próbki należy dozować 5,7 μl mieszanki RT, aby uzyskać całkowitą objętość 10 μl. Delikatnie mieszać mieszaninę i wirować przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    5. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić program RT w następujący sposób: 42 °C przez 90 minut, 10 cykli (50 °C przez 2 minuty, 42 °C przez 2 minuty), 70 °C przez 15 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  2. Wstępna amplifikacja PCR.
    1. Rozmrozić odczynniki PCR (tabela 2) na lodzie.
    2. Przygotować mieszaninę PCR dla wszystkich reakcji, jak opisano w tabeli 2.
    3. Dozować 15 μl mieszanki PCR do każdej próbki, która zawiera reakcje pierwszej nici. Delikatnie mieszać i wirować przez 30 s w temperaturze 4 °C.
    4. Umieścić próbki w termocyklerze i uruchomić następujący program PCR: 98 °C przez 3 minuty, 18 cykli (98 °C przez 20 s, 67 °C przez 15 s, 72 °C przez 6 minut), 72 °C przez 5 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Produkt PCR może być przechowywany w temperaturze 4 °C krócej niż tydzień lub w temperaturze -20 °C / -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Oczyszczanie PCR.
    1. Dodać 25 μl ponownie zawieszonych kulek oczyszczających DNA (1x) do każdej próbki z poprzedniego etapu i dobrze wymieszać za pomocą wiru. Następnie szybko obróć rurkę lub płytki w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn, ale unikaj osiadania kulek.
      UWAGA: Zrównoważ kulki oczyszczające DNA do temperatury pokojowej przez 15 minut i dokładnie zmieszaj przed użyciem.
    2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieścić probówkę lub płytkę na odpowiednim stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny, a następnie ostrożnie wyjąć i wyrzucić supernatant.
    4. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby umyć kulki w stojaku magnetycznym, inkubować przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić roztwór etanolu.
      UWAGA: Roztwór etanolu o stężeniu 80% (obj./obj.) należy za każdym razem przygotowywać na świeżo.
    5. Powtórz krok 5.3.4, co daje w sumie dwa prania.
    6. Ostrożnie usuń i wyrzuć pozostały roztwór etanolu i wysusz kulki na powietrzu, gdy rurka lub płytka znajduje się na stojaku magnetycznym.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia kulek, aby zapewnić maksymalną wydajność elucji.
    7. Dodaj 11 μl wody wolnej od nukleaz, aby wymyć cel DNA z kulek i dobrze wymieszaj wirowo. Następnie szybko obróć probówkę lub płytkę i umieść ją na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny. Przenieść 10 μl próbki do nowej probówki do PCR.
      Uwaga: Jeśli dimery istnieją po jednej rundzie oczyszczania, w oparciu o wykrywanie rozkładu wielkości cDNA, oczyść ponownie, aby całkowicie usunąć dimery. Dimery mogą wpływać na obliczanie wydajności cDNA, jeśli pozwolą im pozostać w próbce.
  4. Kontrola jakości cDNA.
    1. Losowo wybierz próbki, aby wykryć całkowitą wydajność cDNA za pomocą fluorometru.
    2. Oceń poziomy ekspresji genów markerowych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) ( Rysunek 4E). Pobrać 1 μl próbki w celu rozcieńczenia 40 razy i przeprowadzić qPCR na płytce 384-dołkowej. Przygotować mieszaninę qPCR zgodnie z opisem w Tabeli 3. Warunki cyklu: 95 °C przez 10 min, 45 cykli (95 °C przez 10 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 15 s).
    3. Losowo wybieraj próbki do wykrywania rozkładu wielkości za pomocą równoległego przyrządu do elektroforezy kapilarnej.

6. Budowa biblioteki cDNA

  1. Reakcja znakowania przez transpozę Tn5.
    1. Wykryj całkowitą wydajność cDNA komórek wybranych metodą qPCR z kroku 5.4.2 za pomocą fluorometru. Użyj 2 ng cDNA jako materiału wyjściowego.
    2. Rozmrozić odczynniki do reakcji znakowania (tabela 4) na lodzie.
    3. Przygotować reakcję znakowania w cienkościennej probówce PCR z 8 paskami o pojemności 0,2 ml, jak opisano w Tabeli 4, i dokładnie wymieszać za pomocą wiru. Następnie szybko odwiruj roztwór w temperaturze pokojowej.
    4. Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 10 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    5. Natychmiast dodaj 2 μl 5x TS do każdej próbki zawierającej oznakowane DNA, aby zatrzymać reakcję. Dokładnie wymieszaj za pomocą wiru, a następnie szybko odkręć roztwór w temperaturze pokojowej.
    6. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. DNA należy natychmiast przetworzyć w celu ostatecznego wzbogacenia PCR.
  2. Amplifikacja fragmentów podwiązanych adapterem.
    1. Rozmrozić odczynniki PCR (Tabela 5) na lodzie.
    2. Przygotować wzbogacającą mieszaninę PCR, jak opisano w tabeli 5, i ostrożnie wymieszać za pomocą wiru. Następnie szybko odwiruj roztwór w temperaturze pokojowej.
    3. Wykonaj PCR za pomocą następującego programu: 72 °C przez 10 min, 98 °C przez 30 s, 8 cykli (98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 3 min), 72 °C przez 5 min i trzymaj w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Liczba cykli zależy od oczekiwanej ilości DNA w bibliotece.
  3. Oczyszczanie PCR z wyborem rozmiaru.
    1. Dodać 14 μl ponownie zawieszonych kulek oczyszczających DNA (0,7 x) do każdej próbki z poprzedniego etapu i dobrze wymieszać za pomocą wiru. Następnie szybko zakręć rurką w temperaturze pokojowej, aby zebrać płyn, ale unikaj osiadania kulek.
      UWAGA: Zrównoważ kulki oczyszczające DNA do temperatury pokojowej przez 15 minut i dokładnie zmieszaj przed użyciem.
    2. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umieść probówkę na odpowiednim stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny, ostrożnie przenieś supernatant na nowy pasek probówki i wyrzuć poprzedni pasek probówki.
    4. Dodać 3 μl ponownie zawieszonych kulek oczyszczających DNA (0,15x) do każdej próbki w pasku probówki i dobrze wymieszać wirem. Następnie szybko zakręć rurkę w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umieścić probówkę lub płytkę na odpowiednim stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny, a następnie ostrożnie wyjąć i wyrzucić supernatant.
    7. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby umyć kulki w stojaku magnetycznym, inkubować przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić roztwór etanolu.
      UWAGA: Roztwór etanolu o stężeniu 80% (obj./obj.) należy za każdym razem przygotowywać na świeżo.
    8. Powtórz krok 6.3.7, co daje w sumie dwa prania.
    9. Ostrożnie usuń i wyrzuć pozostały roztwór etanolu i wysusz kulki na powietrzu, gdy rurka lub płytka znajduje się na stojaku magnetycznym.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego suszenia kulek, aby zapewnić maksymalną wydajność elucji.
    10. Dodaj 11 μl wody wolnej od nukleaz, aby wymyć cel DNA z kulek i dobrze wymieszaj wirowo. Następnie szybko obróć probówkę lub płytkę i umieść ją na stojaku magnetycznym, aż roztwór będzie klarowny. Przenieść 10 μl próbki do nowego paska probówki.
  4. Kontrola jakości końcowej biblioteki cDNA.
    1. Zmierz stężenie każdej biblioteki za pomocą fluorometru i sprawdź rozkład wielkości za pomocą równoległego przyrządu do elektroforezy kapilarnej.
      Uwaga: Wydajność DNA wynosi zwykle od 15 do 25 ng dla każdej biblioteki. Obserwowane będą fragmenty o masie od 250 pz do 450 pz. Jeśli dimery pozostaną po oczyszczeniu, co zostanie potwierdzone kontrolą rozkładu wielkości, należy jeszcze raz oczyścić 1 x kulki oczyszczające DNA.
  5. Łączenie bibliotek
    1. Opierając się na przybliżonym rozmiarze fragmentu, zbierz równe ilości DNA z każdej próbki, upewniając się, że żadna z nich nie zawiera tych samych kombinacji adapterów N6XX i N8XX.

7. Sekwencjonowanie DNA

  1. Poddaj biblioteki kodów kreskowych sekwencjonowaniu pojedynczemu końca 51 pz przy użyciu systemu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Sekwencjonowanie należy wykonać zgodnie z protokołem producenta. Głębokość sekwencjonowania każdej komórki wynosi średnio około 1 miliona odczytów8, co najmniej 0,5 miliona odczytów na komórkę14.

8. Analizy bioinformatyczne

  1. Sekwencjonowanie, ocena jakości i dopasowanie.
    1. Oceń jakość sekwencjonowanych odczytów za pomocą FastQC (v0.11.3)15 z następującymi parametrami: "fastqc --extract -o output_dir input_fastq".
    2. Połącz genom myszy z sekwencjami ERCC za pomocą polecenia "cat mm10.fa ERCC.fa >mm10_ERCC.fa".
    3. Zbuduj indeks bowtie2 (v2.2.5)16 z następującymi parametrami: "bowtie2-build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
    4. Wyrównaj odczyty przy użyciu tophat2 (v2.1.0)17 z następującymi parametrami: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf --transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. Określ ilościowo poziomy ekspresji genów.
    1. Zliczanie odczytów zmapowanych dla każdego genu przy użyciu HTSeq (v 0.6.0)18 z następującymi parametrami: ''htseq-count -f bam -r pos -s no -a 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
    2. Znormalizuj poziomy ekspresji genów do transkryptów na milion (TPM)19.
  3. Kontrola jakości ogniw.
    1. Wyklucz komórki z mniej niż 0,5 miliona zmapowanych odczytów lub mniej niż 4 000 genów (TPM > 1).
      UWAGA: kryterium wykluczenia zależy od typów komórek i głębokości sekwencji.
    2. Zachowaj komórki wykazujące ekspresję markerów endokrynnych (np. Ins1 dla komórek β, Gcg dla komórek α) i wyklucz komórki wykazujące ekspresję markerów nieendokrynnych (np. Spi1 dla leukocytów).
  4. Analiza głównych składowych (PCA)
    1. Zidentyfikuj wysoce zmienne geny zgodnie ze skokami ERCC, jak opisano wcześniej20.
    2. Wykonaj PCA za pomocą funkcji "PCA" w pakiecie R FactoMineR (v1.31.4)21, z log2 (TPM + 0.1) wysoce zmiennych genów.
    3. Wizualizuj wyniki PCA za pomocą ggplot2 (v2.0.0)22.
  5. Grupowanie hierarchiczne.
    1. Zidentyfikuj geny z najwyższymi ładunkami składnika głównego (PC) za pomocą funkcji "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
    2. Wykonaj grupowanie hierarchiczne przy użyciu funkcji "heatmap.2" w gplots pakietu R (wersja 3.0.1)23, z wartościami względnymi log2 (TPM + 1) genów o wysokim obciążeniu komputera.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustki zostały wycięte od myszy embrionalnych, noworodkowych i postnatalnych (Rysunek 2A i 2B). W przypadku myszy starszych niż 18 dzień po urodzeniu efekt trawienny zależy od stopnia perfuzji; dlatego wstrzyknięcie jest najważniejszym krokiem do izolacji wysp trzustkowych (Rysunek 2C-2E i Tabela 6). Na tym etapie wstrzyknięto tyle kolagenazy, ile było możliwe, aby wypełnić trzust...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole zademonstrowaliśmy skuteczną i łatwą w użyciu metodę badania profili ekspresji pojedynczych komórek β trzustki. Metoda ta może być stosowana do izolowania komórek endokrynnych z trzustki embrionalnej, noworodkowej i pourodzeniowej oraz do wykonywania analiz transkryptomicznych pojedynczych komórek.

Najważniejszym krokiem jest izolacja pojedynczych komórek β w dobrym stanie. W pełni perfundowane trzustki lepiej reagują na późniejsze trawienie. Niewystarczająca perfuzja, która zw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Narodowemu Centrum Nauk o Białkach w Pekinie (Uniwersytet Pekiński) oraz Centrum Peking-Tsinghua za platformę obliczeniową Life Science. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2015CB942800), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31521004, 31471358 i 31522036) oraz finansowanie z Centrum Nauk Przyrodniczych Peking-Tsinghua dla C.-R.X.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kolagenaza PRoche11213873001
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200114
Płodowa surowica bydlęca (FBS)HyklonSH30071.03
Dumont #4 KleszczeRobozRS-4904
Dumont #5 KleszczeRobozRS-5058
30 G BD Igła 1/2" DługośćMikroskop305106
mikroskop fluorescencyjnyZeiss
Eppendorf5810R
WirówkaEppendorf5424R
rurka
96-dołkowa mikropłytka do PCRAxygenPCR-96-C
Silikonowa mata uszczelniającaAxygenAM-96-PCR-RD
Probówka do PCR cienkodołkowa ekstrageneP-02X8-CF
Sortownik komórekBD BiosciencesBD FACSAria
SutterB100-58-10
RNaseZapAmbionAM9780
ERCC RNA Spike-In MixLife Technologies4456740
Woda destylowanaGibco10977
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
dNTP mixNew England BiolabsN0447
Rekombinowany inhibitor RNazyTakara2313
Indeks górny II odwrotna transkryptazaInvitrogen18064-014
Bufor pierwszej nici (5x)Invitrogen18064-014
DTTInvitrogen18064-014
BetainaSigma-Aldrich107-43-7
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3
Woda wolna od nukleazInvitrogenAM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)KAPA BiosystemsKK2601
VAHTS DNA Czyste koraliki XP koralikiVazymeN411-03
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32854
AceQ qPCR SYBR Green Master MixVazymeQ121-02
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA TruePrep V2 dla IlluminaVazymeTD502Zawiera 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 dla IlluminaVazymeTD203Zawiera 16 N6XX i 24 N8XX
Zestaw do analizy fragmentów NGS o wysokiej czułościZaawansowane technologie analityczneDNF-474
1x HBSS bez Ca2+ i Mg2+138 mM NaCl; 5,34 mM KCl
4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4
0,44 mM KH2PO4
Bufor1 i razy; HBSS zawierający 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM glukozy, pH 7,4
bufor1 i razy; HBSS zawierający 15 mM HEPES, 5,6 mM glukozy, 1% FBS, pH 7,4
NaClSigma-AldrichS5886
KClSigma-AldrichP9541
NaHCO3Sigma-AldrichS6297
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG5767
HEPESSigma-AldrichH4034
MgCl2Sigma-AldrichM2393
Oligo-dT30VN starter5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO
5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR
startery5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Starter5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Starter5'- GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Starter5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Podkład5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'
stereoskopowy BD Stereofoniczny Stemi DV4 Wirówka Zeiss Stereo Lumar V12 Polistyrenowa okrągłodenna z nasadką sitową BD-Falcon 352235 Pipeta kapilarna izolacyjny FACS do przodu odwrotny do przodu odwrócony

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  2. Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the beta cell. Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).
  3. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  4. Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
  5. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  6. Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
  7. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  8. Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
  9. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
  10. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  11. Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
  12. Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
  13. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).
  14. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).
  15. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  17. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
  18. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  19. Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
  20. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  21. Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
  22. Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
  23. Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
  24. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  25. Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
  26. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  27. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  28. Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell RNA SequencingPancreatic Endocrine CellsIslet Lineage DifferentiationFlow CytometryCollagenase DigestionCell IsolationReverse TranscriptionPCR PurificationcDNA Library PreparationFACS Sorting

Related Articles