Tutaj prezentujemy protokół szybkiej ekstrakcji kwasu nukleinowego wirusa z inaktywowanej wirusem krwi pełnej. Ekstrakcja odbywa się bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani energii elektrycznej. Metoda nie jest zależna od zaplecza laboratoryjnego i może być stosowana wszędzie (np. w szpitalach polowych).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybka diagnoza infekcji jest niezbędna do opanowania epidemii, ograniczenia ryzyka i opieki nad pacjentem. Wcześniej pokazaliśmy metodę szybkiej inaktywacji wirusa Ebola przy łóżku pacjenta podczas pobierania próbek krwi w celu przeprowadzenia bezpiecznych testów kwasów nukleinowych (NA) poprzez dodanie komercyjnego buforu do lizy/wiązania bezpośrednio do probówek próżniowych do pobierania krwi. Korzystając z tego podejścia do inaktywacji przyłóżkowej, opracowaliśmy bezpieczną, szybką i uproszczoną metodę ekstrakcji NA przy łóżku pacjenta w celu późniejszego wykrywania wirusa w krwi pełnej inaktywowanej buforem. Ekstrakcja NA jest wykonywana bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani prądu.
Po zebraniu krwi do buforu do lizy/wiązania, zawartość jest mieszana przez ręczne obracanie probówki, a mieszanina jest inkubowana przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Cząsteczki szkła magnetycznego (MGP) są dodawane do probówki, a zawartość miesza się, ręcznie obracając probówkę zbiorczą. MGP są następnie pobierane z boku probówki do pobierania krwi za pomocą uchwytu magnetycznego lub magnesu i gumki. MGP są trzykrotnie przemywane, a po dodaniu buforu elucyjnego bezpośrednio do probówki zbiorczej, NA są gotowe do testów NA, takich jak qPCR lub amplifikacja w pętli izotermicznej (LAMP), bez usuwania MGP z reakcji. Metoda ekstrakcji NA nie jest zależna od żadnego zaplecza laboratoryjnego i może być łatwo stosowana w dowolnym miejscu (np. w szpitalach polowych i izolatkach szpitalnych). Gdy ta metoda ekstrakcji NA jest połączona z LAMP i przenośnym instrumentem, diagnozę można uzyskać w ciągu 40 minut od pobrania krwi.
Wprowadzenie
W sytuacjach wybuchu epidemii wirusa, gdy pacjenci są zamknięci w szpitalnych izolatkach lub gdy potrzebna jest szybka diagnoza, bezpieczna, prosta i dokładna diagnoza molekularna w miejscu opieki nad pacjentem jest niezbędna do opieki nad pacjentem i ograniczenia ryzyka. Dwa niedawne wybuchy wirusa, wirusa Ebola (EBOV) w Afryce Zachodniej (2013) i wirusa Zika w Ameryce Południowej (2015), zwiększyły zainteresowanie ulepszonymi molekularnymi testami diagnostycznymi w miejscu opieki nad pacjentem, takimi jak amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)1,2 i amplifikacja poli....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Komitet ds. Etyki Badań Biomedycznych, Region Stołeczny wyraził świadomą zgodę, a wszystkie opisane tutaj metody zostały wyłączone z oceny przez system komisji etyki, zgodnie z duńską ustawą o projektach rozwoju testów.
1. Przygotowanie probówek próżniowych do pobierania krwi do inaktywacji wirusa i szybkiej ekstrakcji NA
UWAGA: Bufor używany do tego protokołu zawiera tiocyjanian guanidyny (GITC) i niejonowy środek powierzchniowo czynny, które są drażniące. Podejmij odpowiednie laboratoryjne środki bezpieczeństwa, używaj kaptura przepływowego i noś rękawice podczas obchodzenia się z nim. Unikać kontaktu ze skórą i ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiony tutaj protokół jest prosty i wydajny i może być szeroko stosowany w dowolnym badaniu molekularnym wykonywanym na zakaźnych próbkach krwi pełnej inaktywowanych buforem lizującym/wiążącym. Schemat inaktywacji krwi i ekstrakcji kwasów nukleinowych (NA) przedstawiono na Rysunku 1, obejmując przygotowanie próżniowych probówek do pobierania krwi7 (Rysunek 1A), pobranie krwi7.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym raporcie opisujemy bezpieczną, szybką i prostą metodę ręcznej ekstrakcji NA przy łóżku pacjenta do dalszego molekularnego wykrywania wirusa w pełnej krwi inaktywowanej przez lizę/bufor wiążący. Opisana metoda ekstrakcji NA została opracowana do wykonywania bezpośrednio na próbkach krwi pełnej pobranych w probówkach próżniowych do pobierania krwi zawierających bufor do lizy/wiązania (tabela materiałów)7. Ten specyficzny bufor dezaktywuje EBOV7 i jest k.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Susanne Lopes Rasmussen i Solvej Kolbjørn Jensen za ich pomoc techniczną i obsługę próbek klinicznych. Projekt ten jest częścią konsorcjum EbolaMoDRAD, które otrzymało dofinansowanie ze Wspólnego Przedsięwzięcia na rzecz Inicjatywy 2 w zakresie Innowacyjnej Medycyny na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 115843. Wspólne przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki Vacutainer K2 EDTA (4 ml) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Pobieranie krwi | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 igła | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK (3 mL) | Igła Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly z rurką przedłużającą o małym otworze | Jø rgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Bufor do lizy/wiązania - Wkład | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| Zestaw do izolacji całkowitych kwasów nukleinowych MagNA Pure LC | Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Probówki kriogeniczne do biobankowania i hodowli komórkowych (1,8 ml) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Probówki kriogeniczne do biobankowania i hodowli komórkowych (3,6 ml) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobankowanie i hodowle komórkowe Probówki kriogeniczne (4,5 ml) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Pipeta transferowa (3,5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco&handel; Pipety transferowe z cienką końcówką (1,5 ml) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc&handel; 50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
Bibliografia
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
