Artykuł metodologiczny

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

DOI:

10.3791/58003

⸱

21 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, Harvard University, 3Department of Physics, Korea University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszczepialne sondy elektrofizjologiczne mózgu są cennymi narzędziami w neurobiologii, ze względu na ich zdolność do rejestrowania aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną z płytkich i głębokich obszarów mózgu. Ich stosowanie jest jednak utrudnione przez mechaniczne i strukturalne niedopasowania między sondami a tkanką mózgową, które często prowadzą do mikroruchu i glejozy, co skutkuje niestabilnością sygnału w eksperymentach z przewlekłym nagrywaniem. W przeciwieństwie do tego, po wszczepieniu ultraelastycznej elektroniki siatkowej poprzez wstrzyknięcie strzykawki, sondy siatkowe tworzą bezszwowy, wolny od glejozy interfejs z otaczającą tkanką mózgową, który umożliwia stabilne śledzenie poszczególnych neuronów w skali co najmniej roku. Protokół ten szczegółowo opisuje kluczowe kroki w typowym eksperymencie z zapisem neuronowym myszy przy użyciu elektroniki siatkowej wstrzykiwanej za pomocą strzykawki, w tym wytwarzanie elektroniki siatkowej w standardowym procesie opartym na fotolitografii możliwym na wielu uniwersytetach, ładowanie elektroniki siatkowej do standardowych igieł kapilarnych, wstrzykiwanie stereotaktyczne in vivo, podłączenie wejścia/wyjścia siatki do standardowych interfejsów oprzyrządowania, ograniczone lub swobodnie poruszające się sesje nagraniowe, oraz przekrój histologiczny tkanki mózgowej zawierającej siatkową elektronikę. Przedstawiono reprezentatywne nagrania neuronalne i dane histologiczne. Badacze zaznajomieni z tym protokołem będą posiadali wiedzę niezbędną do włączenia elektroniki siatkowej do własnych eksperymentów i wykorzystania unikalnych możliwości oferowanych przez długoterminowe stabilne interfejsy neuronowe, takich jak badania procesów starzenia, rozwoju mózgu i patogenezy chorób mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój narzędzi zdolnych do mapowania mózgu z rozdzielczością pojedynczego neuronu ma kluczowe znaczenie dla neuronauki i neurologii. Nieinwazyjne technologie do badań neuronowych, takie jak elektroencefalografia (EEG), magnetoencefalografia (MEG) i funkcjonalne obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (fMRI), okazały się cenne w korelacji aktywności mózgu z zachowaniem u ludzi1,2, ale brakuje im rozdzielczości czasoprzestrzennej niezbędnej do badania struktury i dynamiki sieci neuronowych w ich podstawowych skalach mikrometru i milisekundy, odpowiednio3,4. Niektóre sondy elektrokortykograficzne (ECoG) i metody obrazowania optycznego wykorzystujące barwniki wrażliwe na napięcie odniosły sukces w rejestrowaniu pojedynczej jednostki pobudzającej aktywność in vivo5,6, ale są one na ogół skuteczne tylko w pobliżu powierzchni mózgu, co ogranicza możliwość zastosowania do badań płytkich obszarów mózgu. W przeciwieństwie do tego, wszczepialne sondy elektryczne mogą mierzyć elektrofizjologię pojedynczego neuronu u swobodnie poruszających się zwierząt z praktycznie dowolnego obszaru mózgu bez potrzeby znakowania fluorescencyjnego, co czyni je niezbędnymi dla neuronauki na poziomie systemów, zwłaszcza że techniki mikrowytwarzania z branży półprzewodników przesunęły liczbę kanałów do setek i tysięcy3,7,8,9. Dzięki tym możliwościom, wszczepialne sondy elektryczne wniosły wiele ważnych wkładów w neuronaukę i neurologię, w tym w fundamentalne badania nad przetwarzaniem informacji w układzie wzrokowym10, leczenie zaburzeń neurologicznych, takich jak choroba Parkinsona11, oraz demonstracja interfejsów mózg-maszyna (BMIs) dla zaawansowanej protetyki12,Rozdział 13.

Niemniej jednak, długotrwała niestabilność objawiająca się malejącymi amplitudami skoków i niestabilnymi sygnałami w skalach czasowych od tygodni do miesięcy14,15 ograniczyło możliwość zastosowania wszczepialnych sond do badania stosunkowo krótkoterminowych zjawisk, pozostawiając pytania takie jak starzenie się i rozwój mózgu w dużej mierze bez odpowiedzi. Ograniczenia w długoterminowej niestabilności są wynikiem niezgodności między konwencjonalnymi sondami a tkanką mózgową pod względem rozmiaru, mechaniki i topologii14,15,16,17,18. Jeśli chodzi o rozmiar, podczas gdy synapsy neuronalne i somaty mają średnicę około dziesiątek nanometrów do kilkudziesięciu mikrometrów19, odpowiednio, tradycyjne sondy są często znacznie większe, w przypadku matryc mikroelektrod krzemowych >4 razy większe niż ciało pojedynczej komórki neuronowej7,8. Stosunkowo duży rozmiar tych sond może zakłócać naturalną strukturę i łączność gęstej tkanki nerwowej, przyczyniając się w ten sposób do przewlekłej odpowiedzi immunologicznej i zaburzając badane obwody nerwowe. Pod względem właściwości mechanicznych tradycyjne sondy są drastycznie sztywniejsze niż niezwykle miękka tkanka nerwowa, w którą są wszczepiane; Nawet "elastyczne" sondy wykonane z arkuszy poliimidu o grubości 10–20 μm są co najmniej 100 000 razy sztywniejsze niż tkanka mózgowa20,21. To niedopasowanie sztywności zginania powoduje względny ruch ścinający między sondą a tkanką mózgową, co prowadzi do niewiarygodnego śledzenia pojedynczej jednostki podczas dłuższych nagrań i indukowania przewlekłego glejozy w miejscu implantacji. Wreszcie, struktura topologiczna konwencjonalnych sond mózgowych z konieczności wyklucza solidną objętość tkanki. Takie niedopasowanie w topologii zakłóca łączność obwodów neuronalnych, wyklucza naturalną, trójwymiarową, wzajemnie przenikającą dystrybucję neuronów, komórek glejowych i naczyń krwionośnych w tkance mózgowej22 i utrudnia transport 3D cząsteczek sygnałowych23. Wszystkie te niedociągnięcia konwencjonalnych sond sprawiły, że nie są one w stanie zapewnić długoterminowej kompatybilności poszukiwanej w zastosowaniach klinicznych i podłużnych badaniach neurobiologicznych na poziomie pojedynczego neuronu.

Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, staraliśmy się zatrzeć granicę między systemami neuronowymi i elektronicznymi, rozwijając nowy paradygmat "tkankopodobnych" sond neuronowych zwanych elektrolityką siatkową16,21,24. Elektronika mesh rozwiązuje powyższe problemy związane z dopasowaniem pod względem rozmiaru, mechaniki i topologii, uwzględniając (1) cechy strukturalne tej samej skali wielkości od nanometra do mikrometra tkanki nerwowej, (2) właściwości mechaniczne podobne do tkanki mózgowej oraz (3) makroporowatą topologię 3D, która jest >90% otwartą przestrzenią, a tym samym umożliwia przenikanie się neuronów i dyfuzję cząsteczek przez środowisko zewnątrzkomórkowe. Elektroniczne sondy siatkowe mogą być precyzyjnie dostarczane do określonych obszarów mózgu za pomocą strzykawki i igły, powodując minimalne ostre uszkodzenia podczas implantacji nawet w głębokich obszarach mózgu21,25. Wykazano, że soma neuronalna i aksony przenikają ze sobą otwartą strukturę sondy elektronicznej 3D w ciągu kilku tygodni po wstrzyknięciu, tworząc w ten sposób płynny, wolny od glejozy interfejs między elektroniką rejestrującą a otaczającą tkanką mózgową21,26,27. Te unikalne cechy umożliwiły elektroelektronicznym sondom siatkowym stabilne śledzenie aktywności impulsowej z tych samych pojedynczych neuronów przez co najmniej rok skali czasowej27. Co więcej, produkcja elektroniki siatkowej w oparciu o fotolitografię (PL) zapewnia wysoką skalowalność liczby elektrod, które można wbudować, z zademonstrowaną liczbą kanałów do 128 elektrod na sondę przy użyciu prostej litografii maski kontaktowej28 oraz konstrukcji wejścia/wyjścia plug-and-play (I/O), która pozwala na szybkie połączenie elektryczne z elektroniką peryferyjną bez specjalistycznego sprzętu29.

Szeroki zakres badań może skorzystać z włączenia elektroniki mesh do protokołów pomiarowych. Większość eksperymentów z zapisem wewnątrzkorowym może skorzystać z minimalnie inwazyjnej procedury implantacji elektrotechniki mesh poprzez wstrzyknięcie strzykawki, drastycznie zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej po implantacji oraz możliwości pozostawienia elektroniki siatki w tkance podczas późniejszej histologii i barwienia immunologicznego w celu precyzyjnej analizy środowiska biologicznego otaczającego każde miejsce rejestracji. W szczególności eksperymenty z przewlekłym nagrywaniem będą czerpać wartość z unikalnej zdolności elektroniki siatkowej do śledzenia dużej liczby pojedynczych neuronów przez miesiące lub lata. Ta zdolność stwarza możliwości dla badań z rozdzielczością pojedynczego neuronu, które wcześniej były niepraktyczne, takich jak badania podłużnego starzenia się obwodów neuronalnych, badania rozwijającego się mózgu i badania patogenezy encefalopatii16.

W tym protokole opisujemy wszystkie kluczowe kroki w typowym eksperymencie z nagrywaniem neuronów myszy przy użyciu elektroniki siatkowej do wstrzykiwania strzykawki (zobacz Rysunek 1). Opisane kroki obejmują wytwarzanie elektroniki siatkowej w standardowym procesie opartym na PL możliwym na wielu uniwersytetach, ładowanie elektroniki siatkowej do standardowych igieł kapilarnych, stereotaktyczne wstrzykiwanie elektroniki siatkowej in vivo, podłączenie I/O siatki do standardowych interfejsów oprzyrządowania, skrępowane lub swobodnie poruszające się sesje nagraniowe oraz histologiczne cięcie tkanki mózgowej zawierającej elektronikę siatkową. Niektórzy badacze używający elektroniki siatkowej tylko do badań histologicznych mogą nie wymagać elektrycznego łączenia i nagrywania, w takim przypadku mogą pominąć te kroki. Po zapoznaniu się z tym protokołem, badacze powinni posiadać całą wiedzę niezbędną do wykorzystania elektroniki mesh we własnych eksperymentach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury wykonywane na kręgowcach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Harvarda.

1. Produkcja elektroniki mesh

UWAGA: Procedura opisana w tej sekcji jest przeznaczona do użytku w standardowych pomieszczeniach czystych uniwersytetu, takich jak Center for Nanoscale Systems (CNS) na Uniwersytecie Harvarda. Obiekt ten, jak również podobne obiekty, są dostępne dla użytkowników zewnętrznych w całych Stanach Zjednoczonych, na przykład w ramach Narodowej Sieci Infrastruktury Nanotechnologicznej (NNIN) wspieranej przez Narodową Fundację Nauki (NSF). W tych obiektach wiele narzędzi, sprzętu i materiałów opisanych w tej sekcji jest dostarczanych wraz z dostępem do pomieszczenia czystego i nie wymaga osobnego zakupu.

UWAGA: Wiele substancji chemicznych używanych do produkcji elektroniki siatkowej jest niebezpiecznych, w tym rezystu, CD-26, zmywacz PG, wywoływacz SU-8 i roztwór do trawienia Ni. Przed użyciem należy zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS) dla tych chemikaliów oraz wdrożyć i przestrzegać odpowiednich środków bezpieczeństwa przez cały czas.

  1. Odparować termicznie 100 nm Ni na czystą płytkę Si.
    UWAGA: Typowe parametry osadzania to ciśnienie podstawowe 5 x 10-7 T i szybkość 1–2 A/s. Cienka warstwa Ni służy jako warstwa protektorowa, która później zostanie rozpuszczona, aby uwolnić elektronikę siatkową z płytki.
  2. Użyj pierwszej maski PL (PL mask-1), aby zdefiniować dolną warstwę pasywacyjną elektroniki siatkowej za pomocą ujemnego fotorezystu SU-8 (Rysunek 2A).
    UWAGA: PL to standardowa technika mikrofabrykacji, w której światło ultrafioletowe (UV) jest świecone na maskę trzymaną na podłożu światłoczułym. Światło sprawia, że odsłonięte obszary na podłożu stają się nierozpuszczalne (ujemne rezystu) lub rozpuszczalne (dodatnie opory). Maski są rysowane w oprogramowaniu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), a następnie zwykle zamawiane u dostawcy. Nakładka do masek służy do wyrównywania masek do istniejących wzorów na podłożu i wystawiania ich na działanie światła UV. Wytwarzanie elektroniki siatkowej wymaga czterech różnych masek (PL maska-1 do PL maska-4). Nasze projekty masek są dostępne na życzenie lub na stronie z zasobami, meshelectronics.org.
    1. Spin-coat SU-8 2000.5 ujemnego fotorezystu na płytce z prędkością 4 000 obr./min, aby uzyskać przybliżoną grubość SU-8 400–500 nm.
    2. Wafel pieczemy na miękko na płycie grzejnej przez 1 minutę w temperaturze 65 °C, a następnie 1 minutę w temperaturze 95 °C.
    3. Załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby odsłonić SU-8 z maską PL-1 odpowiadającą dolnej warstwie siatki SU-8. Naświetlić w dawce i-line (długość fali 365 nm) 100 mJ/cm2.
    4. Piecz wafel na płycie grzejnej przez 1 minutę w temperaturze 65 °C, a następnie 1 minutę w temperaturze 95 °C.
    5. Zanurz wafel w tacy z wywoływaczem SU-8. Delikatnie mieszaj roztwór przez 2 minuty, aż wzór siatki w SU-8 zostanie w pełni rozwinięty. Opłucz na tacy z alkoholem izopropylowym przez 1 minutę i wysusz suszarką.
    6. Wafel pieczemy na twardo na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C przez 1 godz
      UWAGA: SU-8 jest zwykle pieczony na twardo w temperaturze od 150 °C do 250 °C po wywołaniu. Twardy bak wyżarza wszelkie pęknięcia powierzchniowe, które mogą powstać podczas rozwoju, i dodatkowo łączy SU-8, aby zapewnić stabilność mechaniczną. Pieczenie na twardo w temperaturze 180 °C dla dolnej warstwy SU-8 i 190 °C dla górnej warstwy SU-8 daje dobre wyniki dla elektroniki siatkowej.
  3. Użyj maski PL-2, aby zdefiniować metalowe połączenia i pola I/O (Rysunek 2B).
    1. Przędzić LOR3A na płytce z prędkością 4000 obr./min, uzyskując przybliżoną grubość 300 nm.
      UWAGA: LOR3A jest rezystantem na bazie polidimetyloglutarymidu, który przyspiesza podcinanie podczas późniejszej procedury metalizacji.
    2. Piecz wafelek na płycie grzejnej w temperaturze 180 °C przez 5 minut.
    3. Dodatni fotorezyst Spin-coat S1805 przy 4000 obr./min dla przybliżonej grubości 500 nm.
    4. Piecz wafel na płycie grzewczej w temperaturze 115 °C przez 1 min.
    5. Załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby odsłonić S1805 z maską PL-2 odpowiadającą metalowym interkonektorom i padom I/O. Naświetlić na linię h (długość fali 405 nm) dawkę 40 mJ/cm2.
    6. Zanurz wafel w tacy z wywoływaczem fotorezystu CD-26. Delikatnie mieszaj roztwór przez 1 minutę, aż wzór metalowych łączników zostanie w pełni rozwinięty. Płucz na tacy z wodą dejonizowaną (DI) przez 1 minutę i wysusz suszarką.
    7. Odparować termicznie 3 nm Cr, a następnie 80 nm Au.
      UWAGA: Ciśnienie podstawowe wynoszące co najwyżej 5 x 10-7 T i szybkość stapiania 1 A/s zazwyczaj zapewniają najlepszą jakość folii.
    8. Zanurz wafel w płaskiej zlewce ze zmywaczem PG na około 3 godziny, aż metal całkowicie się podcinie, pozostawiając metal tylko w żądanych obszarach interkonektu i padów I/O elektroniki siatkowej. Spłucz w alkoholu izopropylowym i wysusz suszarką.
  4. Użyj maski PL-3, aby zdefiniować elektrody Pt (Rysunek 2C).
    1. Powtórz kroki od 1.3.1 do 1.3.4.
    2. Załaduj wafel do wyrównywacza maski, aby naświetlić S1805 z maską PL-3 odpowiadającą elektrodom Pt. Eksponować w dawce 40 mJ/cmw linii h2.
    3. Zanurz wafel w tacy z wywoływaczem fotorezystu CD-26. Delikatnie mieszać roztwór przez 1 minutę, aż wzór elektrod Pt zostanie w pełni rozwinięty. Opłucz na tacy z DI przez 1 minutę i wysusz suszarką.
    4. Użyj parownika wiązki elektronów, aby zdeponować 3 nm Cr, a następnie 50 nm Pt.
      UWAGA: Typowe parametry osadzania to ciśnienie podstawowe 5 x 10-7 T i szybkość 2 A/s.
    5. Zanurz wafel w płaskiej zlewce ze zmywaczem PG na około 3 godziny, aż metal całkowicie się podcinie, pozostawiając Pt tylko w pożądanych miejscach elektrod elektroniki siatkowej. Spłucz w alkoholu izopropylowym i wysusz suszarką.
  5. Użyj maski PL-4, aby zdefiniować górną warstwę pasywacyjną elektroniki siatkowej za pomocą ujemnego fotorezystu SU-8 ( Rysunek 2D).
    1. Powtórzyć kroki od 1.2.1 do 1.2.5, z wyjątkiem odsłonięcia za pomocą maski PL-4 odpowiadającej górnej warstwie siatki pasywacyjnej SU-8.
    2. Wafel pieczemy na twardo na płycie grzejnej w temperaturze 190 °C przez 1 godz.
      UWAGA: Ta temperatura jest o 10 °C wyższa niż w przypadku twardego pieczenia dna SU-8 (krok 1.2.6). Ta podwyższona temperatura nieznacznie przelała się przez dolną warstwę SU-8, powodując jej połączenie z górną warstwą SU-8 i w ten sposób tworząc jedną, ciągłą strukturę SU-8.
  6. Elektronika siatki jest teraz kompletna (Rysunek 2E i Rysunek 3); uwolnij je z płytki Si, rozpuszczając warstwę protektorową Ni.
    1. Potraktuj płytkę plazmą tlenową o mocy 50 W przez 1 minutę. Powoduje to utlenianie powierzchni SU-8, czyniąc ją hydrofilową i umożliwiając łatwe zawieszenie siatki w roztworze wodnym.
    2. W płaskiej zlewce połącz kwas solny, chlorek żelaza i DI w stosunku objętościowym odpowiednio 1:1:20, aby uzyskać roztwór wytrawiacza Ni.
    3. Zanurz wafel w płaskiej zlewce z roztworem wytrawiacza Ni na około 3 godziny, aż elektronika siatki zostanie całkowicie uwolniona z płytki Si.
    4. Za pomocą pipety Pasteura przenieś uwolnione sondy elektroniczne siatki z wytrawiacza Ni do zlewki o pojemności 100 ml z DI. Przenieś elektronikę siatkową do świeżej zlewki z DI co najmniej 3 razy, aby zapewnić płukanie.
    5. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść elektronikę siatki do 70%/30% roztworu etanolu/wody w celu dezynfekcji, a następnie użyj pipety, aby przenieść elektronikę siatki do sterylnej wody w celu spłukiwania.
      UWAGA: Po sterylizacji elektronikę siatkową można przenieść do innych roztworów w celu funkcjonalizacji. Na przykład, aby zwiększyć adhezję komórkową, elektronikę siatki można przenieść do wodnego roztworu poli-D-lizyny (1 mg / ml) na 24 godziny.
    6. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść elektroelektroniczne sondy siatkowe do 100 ml zlewki sterylnego 1x buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przed wstrzyknięciem in vivo.

2. Ładowanie elektroniki siatkowej do igieł

  1. Zakupiony uchwyt na pipety jest otwarty na przepływ na obu końcach. Uszczelnij koniec naprzeciwko okrągłego łącznika śrubowego żywicą epoksydową, aby nie było wycieków podczas wtryskiwania (Rysunek 4A). Pozwól żywicy epoksydowej stwardnieć przed kontynuowaniem.
  2. Włożyć szklaną igłę kapilarną do uchwytu na pipety. Zamocuj go na miejscu za pomocą okrągłej dokręcającej i podkładki stożkowej (Rysunek 4B). Do tego protokołu użyto szklanej igły kapilarnej o średnicy wewnętrznej 400 μm (średnica zewnętrzna 650 μm). Można stosować inne materiały igieł kapilarnych (np. metal) i średnice, ale mogą wymagać zmian w konstrukcji elektroniki siatkowej, aby zapewnić wstrzykiwalność.
    UWAGA: W naszym laboratorium zastosowano igły kapilarne o średnicy wewnętrznej od 150 μm do 1,17 mm (średnica zewnętrzna od 250 μm do 1,5 mm). Wstrzykiwanie przez mniejsze igły może być wspomagane poprzez zaostrzenie kąta przecięcia między poprzecznymi i podłużnymi elementami siatki SU-8, zmniejszenie szerokości elementów siatki SU-8, zastosowanie cieńszego SU-8 i zastosowanie grubszej (tj. Większej komórki elementarnej) struktury siatki. Fotomaski do siatek przeznaczonych do mniejszych igieł kapilarnych są dostępne na życzenie lub na stronie z zasobami, meshelectronics.org. W handlu dostępne są również szklane igły kapilarne o średnicy wewnętrznej 400 μm i średnicy zewnętrznej 550 μm. Zmniejszają one ostre uszkodzenia tkanek spowodowane wstrzyknięciem, zachowując przy tym kompatybilność z siatkami wymagającymi średnicy wewnętrznej 400 μm, ale nie zostały wykorzystane w opisanych tutaj badaniach.
  3. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml do bocznego wylotu uchwytu pipety za pomocą rurki kapilarnej o długości 2–4 cm.
  4. Włożyć szklaną igłę kapilarną do 100-mililitrowej zlewki PBS zawierającej elektronikę siatki. Umieść koniec igły w pobliżu końcówek I/O sondy elektronicznej z siatką i ręcznie cofnij strzykawkę, aby wciągnąć siatkową sondę elektroniczną do igły (Rysunek 5 i dodatkowe wideo 1).
    UWAGA: Pady I/O, obszar połączenia trzpienia i obszar urządzenia siatkowego są łatwe do zidentyfikowania gołym okiem, gdy sondy elektroniczne siatki są zawieszone w roztworze. Umożliwia to jednoznaczne załadowanie elektroniki siatkowej do igieł o prawidłowej orientacji.
  5. Popchnąć/pociągnąć tłok strzykawki, gdy jest ona zanurzona w soli fizjologicznej, aby wyregulować położenie elektroniki siatkowej w igle.
    UWAGA: Idealne pozycjonowanie to ultraelastyczny obszar urządzenia siatkowego jak najbliżej końca igły. Taka konfiguracja minimalizuje objętość płynu, który zostanie wstrzyknięty do mózgu, gwarantując jednocześnie, że obszar urządzenia jest wstrzykiwany jako pierwszy, a pady I/O jako ostatnie.
  6. Ostrożnie odłącz rurkę kapilarną od bocznego wylotu uchwytu pipety. Odłączaj go powoli, aby uniknąć wytwarzania siły ssącej, która mogłaby zmienić położenie elektroniki siatki w igle.

3. Stereotaktyczne wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do żywego mózgu myszy

UWAGA: Myszy zostały znieczulone przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniną 75 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg dekdomitoru. Stopień znieczulenia został zweryfikowany metodą szczypania palców u nóg przed rozpoczęciem operacji. Temperaturę ciała utrzymywano poprzez umieszczenie myszy na kocu homeotermicznym o temperaturze 37 °C w znieczuleniu. Podczas operacji zastosowano odpowiednią technikę sterylną, w tym między innymi autoklawowanie wszystkich metalowych narzędzi chirurgicznych przez 1 godzinę przed użyciem, przy użyciu wysterylizowanych rękawiczek, używanie sterylizatora z gorącymi kulkami przez cały czas trwania operacji, utrzymanie sterylnego pola wokół pola operacyjnego, dezynfekcję narzędzi plastikowych 70% etanolem, a depilowaną skórę głowy preparowano jodoforem przed nacięciem. W przypadku operacji przeżycia, po zakończeniu operacji, wokół rany nałożono maść z antybiotykiem, a mysz zwrócono do klatki wyposażonej w poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C. Myszy nie pozostawiono bez opieki, dopóki nie odzyskały wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Myszom podawano analgezję buprenorfiny we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 0,05 mg/kg masy ciała co 12 godzin przez okres do 72 godzin po operacji. Myszy odizolowano od innych zwierząt po operacji. Myszy poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu w dawce 270 mg/kg masy ciała lub przez perfuzję przezsercową (patrz krok 6.1). Badacze mogą odwołać się do Geigera i wsp.30, Kirby, et al.31, oraz Gage, et al. 32 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat chirurgii stereotaktycznej gryzoni.

  1. Znieczul mysz i zamocuj ją w stereotaktycznej ramce.
  2. Nałóż lubrykant do oczu myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Użyj wiertła dentystycznego i ramy stereotaktycznej, aby otworzyć kraniotomię w żądanych współrzędnych czaszki. Otworzyć drugą kraniotomię z dala od miejsca wstrzyknięcia w celu wprowadzenia lub drutu uziemiającego ze stali nierdzewnej.
  4. Przymocuj podłoże zaciskowe do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Wytnij szczelinę w podłożu o szerokości około 1 mm, aby poprawić niezawodność etapu składania w dalszej części procedury.
    UWAGA: Płaski elastyczny (FFC) przycięty do kształtu litery "L" działa dobrze (Rysunek 7A), chociaż wiele materiałów będzie działać, o ile mają odpowiednią grubość dla 32-kanałowego złącza o zerowej sile wstawiania (ZIF) (przeznaczonego do o grubości 0,18 ± 0,05 mm).
  5. Zamontuj uchwyt pipety z igłą zawierającą elektronikę siatkową na ramie stereotaktycznej za pomocą zacisku końcowego pod kątem prostym (Rysunek 4C i Rysunek 6A).
  6. Podłącz boczny wylot uchwytu pipety do strzykawki o pojemności 5 ml zamocowanej w pompie strzykawkowej (Rysunek 6D) za pomocą rurki kapilarnej o długości około 0,5–1 m.
    UWAGA: Upewnij się, że w rurki kapilarnej nie ma pęcherzyków powietrza przed podłączeniem jej do uchwytu na pipety. Pęcherzyki mogą przerywać przepływ podczas wstrzykiwania i uniemożliwiać płynne, kontrolowane dostarczanie elektroniki siatkowej.
  7. Użyj ramki stereotaktycznej, aby ustawić końcówkę igły w żądanym miejscu początkowym w mózgu.
    UWAGA: Zastosowane tutaj sondy elektroniczne siatkowe są zaprojektowane z elektrodami rejestrującymi rozmieszczonymi na długości ok. 2 mm, przy czym pierwsza elektroda znajduje się ok. 0,5 mm od krawędzi początkowej elektroniki siatkowej (skrajna lewa krawędź w Rysunek 3A). Z tego powodu współrzędne stereotaktyczne powinny być tak dobrane, aby lokalizacja początkowa znajdowała się o 0,5 mm głębiej niż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Rozmieszczenie i lokalizacja elektrod rejestrujących w elektronice siatkowej może być dowolnie wybierana podczas procesu projektowania maski i powinna być dobrana tak, aby elektrody rejestrujące obejmowały obszar (y) mózgu będący przedmiotem zainteresowania, gdy są wstrzykiwane wzdłuż ich trajektorii stereotaktycznej.
  8. Ustaw kamerę ( Rysunek 6B) tak, aby wyświetlić górną część sondy elektronicznej siatki w szklanej igle. Niektóre programy pozwalają użytkownikowi narysować linię na ekranie, aby zaznaczyć pierwotną pozycję elektroniki siatki.
  9. Zainicjuj przepływ, ustawiając pompę strzykawkową na niską prędkość i naciskając przycisk Start. 10 ml/h to typowe początkowe natężenie przepływu dla igły kapilarnej o średnicy wewnętrznej 400 μm. Powoli zwiększaj natężenie przepływu, jeśli sonda elektroniczna siatki nie porusza się w obrębie igły.
    UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować objętość płynu wstrzykiwanego do mózgu, ponieważ może to uszkodzić tkankę otaczającą miejsce wstrzyknięcia. Najlepsze wyniki osiąga się przy objętościach wtrysku mniejszych niż 25 μl na 1 mm wstrzykiwanej długości siatki. Idealne wartości to mniej niż połowa tej objętości; W naszym laboratorium zazwyczaj wstrzykujemy 10–50 μl na wstrzykiwaną siatkę o długości 4 mm.
  10. Gdy sonda elektroniczna siatki zaczyna poruszać się w obrębie igły, użyj ramki stereotaktycznej, aby cofnąć igłę z taką samą szybkością, z jaką wstrzykiwana jest sonda elektroniczna siatki, używając oznaczonej oryginalnej pozycji elektroniki siatki jako przewodnika.
    UWAGA: Ta procedura, określana jako metoda wstrzykiwania pola widzenia (FoV)25, pozwala na precyzyjne dostarczanie elektroniki siatkowej do docelowego obszaru mózgu bez zgniecania lub zwichnięcia. Często natężenie przepływu można zmniejszyć, gdy sonda elektroniczna siatki zacznie poruszać się w igły. W naszym laboratorium natężenie przepływu wynoszące 20–30 ml/h jest często wymagane do pokonania tarcia statycznego między siatką a ściankami igły kapilarnej, ale po rozpoczęciu procesu wstrzykiwania można je zmniejszyć do 10 ml/h. Natężenia przepływu i objętości iniekcji są zwykle mniejsze w przypadku igieł kapilarnych o mniejszej średnicy.
  11. Kontynuuj przepływ soli fizjologicznej i cofanie igły, aż igła opuści czaszkę. Zatrzymać przepływ z pompy strzykawkowej.

4. Interfejs wejścia/wyjścia

UWAGA: W tym momencie, sonda elektroniczna z pożądanym punktem początkowym w mózgu została wstrzyknięta wzdłuż wybranej trajektorii. Igła została cofnięta i znajduje się tuż nad kraniotomią, z siatkowymi połączeniami elektronicznymi rozciągającymi się od mózgu do igły i podkładkami I/O nadal wewnątrz igły (Rysunek 7B). W tej sekcji wykorzystano płytkę drukowaną (PCB; Rysunek 7, Rysunek 8) do interfejsu z sondą elektroniczną siatki. Płytka drukowana łączy złącze ZIF z 32-kanałowym standardowym złączem wzmacniacza poprzez podłoże izolacyjne, które staje się stopniem głównym do eksperymentów z nagrywaniem neuronowym. Płytkę drukowaną można dostosować, aby dostosować ją do różnych konfiguracji stopnia głównego. Nasze pliki projektowe są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org, i mogą być wykorzystane do niedrogiego zakupu płytek PCB od dostawców usług produkcji i montażu PCB.

  1. Użyj ramy stereotaktycznej, aby ostrożnie poprowadzić igłę do podłoża zaciskowego FFC i w poprzek szczeliny, przepływając roztwór za pomocą pompy strzykawkowej, aby wygenerować luz w połączeniach elektroniki siatkowej (Rysunek 7C).
  2. Gdy igła znajdzie się nad podłożem zaciskowym i w poprzek szczeliny, wznowij przepływ z dużą prędkością, aby wysunąć elektrotechniczne podkładki I/O z siatki na podłoże zaciskowe (Rysunek 7D).
  3. Za pomocą pęsety i pipety DI zegnij końcówki I/O pod kątem ok. 90° jak najbliżej pierwszej końcówki I/O.
    UWAGA: Gięcie jest konieczne, aby umożliwić włożenie padów do złącza ZIF na płytce drukowanej w kolejnym kroku. Złącze ZIF ma dokładnie taką samą szerokość jak 32 pady I/O sondy elektroniki siatkowej, więc niedoskonałe wygięcie pod kątem 90° lub zagięcie nie występujące tuż przed pierwszym padem I/O spowoduje konieczność odcięcia padów I/O (skrajne lewe pady w Rysunek 7E).
  4. Po wyrównaniu, rozłożeniu i ustawieniu pod kątem 90° do trzpienia siatki, wysusz je na miejscu delikatnie przepływającym sprężonym powietrzem.
    UWAGA: Sondy elektroniczne Mesh z mniej niż 32 kanałami mogą być połączone za pomocą tej samej 32-kanałowej karty interfejsu. Na przykład nasze laboratorium często używa 16-kanałowych sond elektronicznych z 32-kanałowymi płytkami drukowanymi. Zapewnia to dodatkową przestrzeń w złączu ZIF, ułatwiając interfejs, a dodatkowe kanały bezstykowe są łatwo identyfikowane jako obwody otwarte za pomocą testów impedancji podczas sesji nagraniowych.
  5. Przyciąć podłoże zaciskowe na prostej krawędzi około 0,5–1 mm od krawędzi podkładek we/wy. Odetnij również obce części podłoża zaciskowego, które utrudnią włożenie do 32-kanałowego złącza ZIF montowanego na płytce drukowanej (Rysunek 7F).
  6. Włóż pady I/O do złącza ZIF na płytce drukowanej i zamknij zatrzask (Rysunek 7G). Użyj elektroniki pomiarowej, aby zmierzyć impedancję między kanałami a śrubą uziemiającą, aby potwierdzić pomyślne połączenie. Jeśli wartości impedancji są zbyt wysokie, odblokuj złącze ZIF, wyreguluj włożenie i przetestuj ponownie, aż zostanie potwierdzone pomyślne połączenie.
  7. Zakryj złącze ZIF i odsłonięte połączenia elektroniczne siatki cementem dentystycznym w celu ochrony. Odwróć płytkę drukowaną w szczelinie w podłożu i przymocuj płytkę drukowaną za pomocą cementu do czaszki myszy ( Rysunek 7H).
    UWAGA: Wygięcie FFC w szczelinie zmniejsza naprężenia mechaniczne, które czasami mogą spowodować zerwanie połączeń elektronicznych siatki.
  8. Pozwól cementowi stwardnieć, zamieniając płytkę drukowaną w solidną, kompaktową stopkę czołową do łączenia podczas kolejnych sesji nagraniowych (Rysunek 7I).

5. Eksperymenty z nagrywaniem neuronowym

  1. Umieść mysz w tailveiner lub innym ograniczniku33. Włóż przedwzmacniacz PCB do standardowego złącza wzmacniacza na płytce PCB stopnia głównego. Użyj oddzielnego, aby uziemić odniesienia.
  2. W przypadku ograniczonych nagrań pozostaw mysz w ograniczniku. Rejestruj dane za pomocą systemu akwizycji danych dla żądanego okresu czasu (Rysunek 8A).
  3. W przypadku swobodnie poruszających się nagrań, zwolnij mysz z ogranicznika po włożeniu płytki PCB przedwzmacniacza i uziemieniu odniesienia. Nagrywaj przez żądany okres czasu za pomocą systemu akwizycji danych, podczas gdy mysz zachowuje się swobodnie ( Rysunek 8B).
  4. Pod koniec sesji nagraniowej, jeśli to konieczne, włóż mysz z powrotem do ogranicznika. Odłącz przewód uziemiający i przedwzmacniacz, a następnie zwolnij mysz z powrotem do klatki i umieść ją z powrotem w pomieszczeniu dla zwierząt do następnej sesji nagraniowej.

6. Sekcja histologiczna, barwienie i obrazowanie

  1. Poczekaj na pożądany czas po wstrzyknięciu, a następnie znieczul mysz i przezsercowo perfuzję z formaldehydem. Wyjmij, zamroź i kriosekcję mózgu na plastry o grubości 10 μm. Szczegółowy protokół dotyczący immunohistochemii i kriosekcji tkanki mózgowej gryzoni można znaleźć w Evilsizor i wsp. 34.
    UWAGA: Tkanka mózgowa zawierająca siatkę elektroniczną może być normalnie mocowana i cięta, nawet jeśli elektronika monitorująca pozostaje w środku. Jest to wyjątkowa funkcja w porównaniu z konwencjonalnymi sondami neuronowymi, które muszą zostać usunięte przed cięciem, a zatem mogą modyfikować tkankę lub utrudniać analizę granicy faz sonda-tkanka.
  2. Opłucz zamrożone skrawki tkanki mózgowej 3 razy w 1x PBS.
  3. Zablokuj skrawki w roztworze 0,3% Triton X-100 i 5% koziej surowicy w 1x PBS. Odstawić w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  4. Inkubować skrawki z roztworem przeciwciał pierwszorzędowych. Podstawowymi roztworami przeciwciał zastosowanymi tutaj były królicze anty-NeuN (rozcieńczenie 1:200), mysie anty-Neurofilament (rozcieńczenie 1:400) i szczurzy anty-GFAP (rozcieńczenie 1:500) z 0,3% Triton X-100 i 3% kozią surowicą. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Przepłukać skrawki 9 razy, w sumie przez 40 minut za pomocą 1x PBS.
  6. Inkubuj sekcje mózgu roztworem przeciwciał drugorzędowych. Zastosowanymi tutaj drugorzędowymi roztworami przeciwciał były kozia Alexa Fluor 488 anty-królik (rozcieńczenie 1:200), Alexa Fluor 568 kozia anty-mysia (rozcieńczenie 1:200) i Alexa Fluor 647 kozia anty-szczura (rozcieńczenie 1:200). Inkubować sekcje przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przepłukać skrawki 9 razy, w sumie przez 30 minut za pomocą 1x PBS.
  8. Zamontuj sekcje na szkiełkach z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą mocowania zapobiegającego blaknięciu. Pozostaw szkiełka w ciemności na co najmniej 24 godziny przed obrazowaniem.
  9. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu laserów 488 nm, 561 nm i 633 nm jako źródeł wzbudzenia odpowiednio dla Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 i Alexa Fluor 647. Użyj różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), aby zobrazować elektronikę siatki pod tym samym mikroskopem w celu późniejszego nałożenia obrazów i analizy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki będą się różnić w zależności od gatunku zwierzęcia w badaniu, docelowego obszaru mózgu, czasu, jaki upłynął od wstrzyknięcia, ilości ostrych uszkodzeń spowodowanych podczas iniekcji oraz powodzenia procedury łączenia I/O, między innymi. Jednojednostkowa aktywność impulsowa może pojawić się dopiero od 1 dnia (w przypadku igieł o średnicy wewnętrznej 150 μm) do 1 tygodnia po wstrzyknięciu, a amplituda kolców może się wahać do 4-6 tygodni. Rysunek 9 pokazuje reprezentatywne dane elektrofizjologiczne z 32-kanałowej sondy elektronicznej mesh wstrzykniętej do hipokampa i pierwotnej kory somatosensorycznej dorosłego samca myszy C57BL/6J. Na wszystkich 32 kanałach zarejestrowano lokalne potencjały pola o amplitudzie około 300 μV (LFP), a na 26 kanałach zarejestrowano aktywność impulsową pojedynczej jednostki. LFP i izolowane skoki pozostały podobne między 2 a 4 miesiącami, co sugeruje bardzo stabilny interfejs między elektroniką rejestrującą a neuronami w tym wydłużonym okresie czasu. Rysunek 10 pokazuje reprezentatywne wyniki przekroju histologicznego i barwienia immunologicznego tkanki mózgowej zawierającej elektronikę mesh 1 rok po wstrzyknięciu. Barwienie NeuN, markera somatów nerwowych i neurofilamentu, markera aksonów nerwowych, ujawnia niewielką lub żadną utratę gęstości tkanki w miejscu wstrzyknięcia, co oznacza bezproblemowe połączenie między elektroniką siatki a tkanką mózgową. Barwienie pod kątem GFAP (markera astrocytów) dodatkowo ujawnia poziomy astrocytów w pobliżu tła wokół elektroniki siatki, co wskazuje, że jego obecność wywołuje niewielką przewlekłą odpowiedź immunologiczną.

figure-results-1
Rysunek 1: Etapy eksperymentu z elektroniką siatkową do wstrzykiwania strzykawki. Protokół ten opisuje wszystkie kluczowe kroki w typowym eksperymencie z rejestracją neuronalną gryzoni przy użyciu elektroniki siatkowej. Eksperymenty zwykle obejmują, w kolejności implementacji, (1) wytwarzanie elektroniki siatkowej, (2) ładowanie elektroniki siatkowej do igieł kapilarnych, (3) stereotaktyczne wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do mózgu, (4) elektryczne połączenie I/O z elektroniką siatkową, (5) skrępowane lub swobodnie poruszające się nagrania oraz (6) cięcie i barwienie siatki/tkanki do histologii. W niektórych badaniach mogą być pożądane tylko dane histologiczne, w których to przypadkach kroki (4) i (5) można pominąć. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Ilustracja 2: Schemat przedstawiający procedurę produkcji elektroniki siatkowej typu plug-and-play w obszarze ultraelastycznego urządzenia (górny rząd), obszarze połączeń trzpieniowych (środkowy rząd) i regionie I/O (dolny rząd). (A) Ujemny fotorezystor SU-8 (czerwony) jest wzorowany na masce PL-1 w celu zdefiniowania dolnej warstwy pasywacyjnej każdej sondy elektronicznej typu plug-and-play. (B) Wzór z maską PL-2, odparowanie termiczne i metalowe uniesienie definiują interkonekty Au i pady I/O (złote). (C) Wzorowanie za pomocą maski PL-3, odparowanie wiązki elektronów i uniesienie metalu definiują elektrody Pt (niebieskie). (D) Ujemny fotorezystor SU-8 (czerwony) jest wzorowany na masce PL-4 w celu zdefiniowania górnej warstwy pasywacji. Otwory w SU-8 są pozostawione na każdej elektrodzie Pt i podkładce I/O. (E) Kompletna sonda elektroniczna z siatkową siatką z przerywanymi ramkami wskazującymi miejsca powiększone w górnym, środkowym i dolnym rzędzie. Pliki projektu Photomask są dostępne na żądanie od autorów lub na stronie zasobów meshelectronics.org. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Fotografie i obrazy z mikroskopu optycznego elektroniki siatkowej typu plug-and-play. (A) Kafelkowe obrazy mikroskopu optycznego sondy elektronicznej siatkowej do wstrzykiwania strzykawki z wejściem/wyjściem typu plug-and-play. Sonda została zobrazowana po zakończeniu etapów produkcji w Rysunek 2, ale przed uwolnieniem z podłoża pokrytego niklem. Przerywane pola odpowiadają od lewej do prawej sekcjom ultraelastycznego obszaru urządzenia, trzonu i obszaru I/O powiększonych odpowiednio w C, D i E. Podziałka = 1 mm. (B) Zdjęcie 3-calowej płytki krzemowej zawierającej 20 kompletnych sond elektronicznych z siatką. Podziałka = 20 mm. (C) Obraz z mikroskopu optycznego elektrod rejestrujących Pt o średnicy 20 μm w obszarze ultraelastycznego urządzenia. Podziałka = 100 μm. (D) Obraz z mikroskopu optycznego połączeń Au o dużej gęstości w obszarze trzpienia. Każdy interkonekt Au jest izolowany elektrycznie i łączy pojedynczą elektrodę Pt z pojedynczym padem I/O. Podziałka = 100 μm. (E) Obraz z mikroskopu optycznego pól I/O. Każda podkładka składa się ze składanego obszaru siatki i ciągłego cienkowarstwowego obszaru umieszczonego na trzpieniu. Nieprzewodzące taśmy SU-8 łączą ze sobą siatkowe części padów, aby pomóc w utrzymaniu wyrównania. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Montaż aparatury do przytrzymywania igieł kapilarnych podczas iniekcji. (A) Fotografia części składowych aparatury. Elementy obejmują (1) szklaną igłę kapilarną, (2) uchwyt na pipety, (3) okrągły łącznik śrubowy do uchwytu pipety oraz (4) podkładkę stożkową do uchwytu pipety. Elementy od (2) do (4) są dołączone do zakupu uchwytu na pipety. Strzałka oznacza wylot uchwytu na pipety, który należy przykleić żywicą epoksydową. (B) Fotografia uchwytu do pipet po zmontowaniu i włożeniu szklanej igły kapilarnej. Dodana żywica epoksydowa jest widoczna na górnym wylocie uchwytu pipety (oznaczonej strzałką), a rurka kapilarna łączy uchwyt pipety ze strzykawką (nie pokazano). (C) Fotografia uchwytu do pipet i igły kapilarnej po przymocowaniu do ramy stereotaktycznej za pomocą zacisku końcowego pod kątem prostym. Podziałka skali wynosi 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ładowanie elektroniki siatkowej do szklanych igieł. (A) Schematyczne ilustracje procedury ładowania dla elektroniki siatkowej typu plug-and-play. Szklana igła jest umieszczana w pobliżu końca I/O sondy elektronicznej z siatką, gdy jest zawieszona w roztworze. Tłok strzykawki jest następnie ręcznie wsuwany w celu wciągnięcia sondy elektronicznej siatki. Idealne ułożenie to ultraelastyczny obszar urządzenia znajdujący się tuż wewnątrz końca igły. (B) Fotografie odpowiadające (A) elektrosondy siatkowej ładowanej do szklanej igły. Podziałka = 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Schemat stereotaktycznej stacji chirurgicznej. Zmotoryzowana rama stereotaktyczna (A) z dołączonym uchwytem na pipetę służy do umieszczania igły w żądanym obszarze mózgu. Położenie igły i załadowanej elektroniki siatkowej jest monitorowane za pomocą obiektywu i dołączonej kamery (B) i wyświetlane na komputerze (C). Pompa strzykawkowa (D) przepuszcza przez igłę precyzyjne objętości soli fizjologicznej, co pozwala na dokładne, kontrolowane wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do pożądanego obszaru mózgu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Procedura łączenia we/wy typu plug-and-play. (A) Podłoże zaciskowe FFC jest zabezpieczone cementem dentystycznym przylegającym do kraniotomii. (B) Elektronika mesh typu plug-and-play jest stereotaktycznie wstrzykiwana do pożądanego obszaru mózgu przy użyciu metody FoV. (C) Igłę, z podkładkami I/O sondy elektronicznej siatki nadal w środku, umieszcza się ponownie na podłożu zaciskowym FFC. (D) Przepływ jest wznawiany przez igłę w celu wysunięcia padów I/O na podłoże zaciskowe FFC. (E) Podkładki I/O są wygięte pod kątem 90° w stosunku do trzpienia, rozłożone stroną przewodzącą skierowaną do góry i wysuszone na miejscu. (F) Podłoże FFC przycina się nożyczkami do linii prostej w odległości ok. 0,5 mm od krawędzi padów I/O. Nadmiar podłoża jest odcinany, aby umożliwić włożenie do 32-kanałowego złącza ZIF. (G) Pady I/O są wkładane do 32-kanałowego złącza ZIF zamontowanego na niestandardowej płytce drukowanej. Złącze ZIF jest zatrzaśnięte w celu zetknięcia się z padami I/O. (H) Zatrzask jest zacementowany zamknięty, płytka drukowana jest przerzucana na czaszkę, a płytka drukowana jest mocowana na miejscu za pomocą cementu dentystycznego. (I) Płytka drukowana tworzy kompaktową scenę czołową ze standardowym złączem wzmacniacza dla łatwego łączenia podczas sesji nagraniowych. Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Powściągliwe i swobodnie poruszające się nagrania. (A) Zdjęcie samca myszy C57BL/6J w uwięzi podczas sesji nagraniowej. 32-kanałowa płytka PCB przedwzmacniacza została włożona do standardowego złącza wzmacniacza. (B) Zdjęcie tej samej myszy z 32-kanałową płytką drukowaną przedwzmacniacza podczas eksperymentu z nagrywaniem w swobodnym ruchu. Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Reprezentatywne wyniki rejestracji neuronowej. (A) Reprezentatywne mapy cieplne LFP z 32-kanałowych sond elektronicznych typu mesh wstrzykniętych do hipokampa myszy i kory somatosensorycznej. Dane zostały zarejestrowane, gdy mysz swobodnie eksplorowała swoją klatkę po 2 miesiącach (na górze) i 4 miesiącach (na dole) po wstrzyknięciu. Amplituda LFP jest oznaczona kolorami zgodnie z kolorowym paskiem po prawej stronie. Filtrowane górnoprzepustowo ślady (czarne) pokazujące aktywność impulsową są nakładane na spektrogram dla każdego z 32 kanałów. (B) Spajki wyizolowane po posortowaniu danych wykreślonych w (A). Jednojednostkową aktywność skokową wykryto na 26 z 32 kanałów zarówno 2 miesiące po wstrzyknięciu (na górze), jak i 4 miesiące po wstrzyknięciu (na dole). Liczby powyżej każdej grupy kolców odpowiadają numerom kanałów w (A). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fu i wsp.28. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Reprezentatywne wyniki histologiczne. (A) Schemat ilustrujący orientację elektroniki siatkowej w poziomych (środkowy panel) i strzałkowych (dolny panel) wycinkach mózgu. (B) Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego korowego wycinka mózgu o grubości 10 μm rok po wstrzyknięciu 16-kanałowej sondy elektronicznej z siatką. Wycinek został wybarwiony immunologicznie na obecność NeuN (kolor zielony). (C) Ten sam wycinek mózgu wybarwiony immunologicznie na neurofilament (czerwony). (D) Ten sam wycinek mózgu wybarwiony immunologicznie na GFAP (cyjan). (E) Złożony obraz od (B) do (D) przedstawiający interfejs elektroniki / tkanki siatki z oznakowanym NeuN (zielony), neurofilamentem (czerwony), GFAP (cyjan) i elektroniką siatki (niebieski). Podziałka = 100 μm. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Fu et al.27. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Wielokrotne ładowanie i wstrzykiwanie elektroniki siatkowej do roztworu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie etapy produkcji i stosowania elektroniki mesh są ważne, ale kilka z nich jest szczególnie krytycznych. Przed uwolnieniem elektroniki siatkowej z płytki konieczne jest utlenienie powierzchni, aby siatki były łatwo zawieszone w roztworze wodnym (krok 1.6.1). Jeśli ten krok zostanie pominięty, siatki zwykle unoszą się na powierzchni wody, co utrudnia ich załadowanie do igieł, a jeśli można je załadować, często przyklejają się do boków szklanych igieł, co wymaga dużych objętości (>100 μl) do wstrzyknięcia. Brak utlenienia powierzchni przed zwolnieniem oznacza zatem, że siatki nie mogą być używane, a produkcja musi być wykonana od początku. Kolejnym krytycznym krokiem jest wygięcie "trzpienia" elektroniki siatki do ~90° podczas interfejsu I/O (krok 4.3). Jeśli kąt jest mniejszy niż 90°, wszystkie 32 pady I/O nie będą pasować do złącza ZIF; Niektóre będą musiały zostać odcięte na końcu, aby umożliwić wprowadzenie, zmniejszając liczbę podłączonych elektrod. Proces ten należy również wykonać delikatnie, aby zapobiec pękaniu łodygi.

Konstrukcję elektroniki siatkowej można dostosować do różnych zastosowań, modyfikując fotomaski i stosując tę samą procedurę produkcyjną opisaną na rysunku 2. Na przykład, podczas gdy elektroniczne sondy siatkowe użyte do rejestrowania danych na rysunku 9 zostały zaprojektowane tak, aby miały 32 elektrody rejestrujące obejmujące hipokamp myszy i pierwotną korę somatosensoryczną, rozmieszczenie elektrod w ultraelastycznej siatce można wybrać tak, aby celować w praktycznie dowolny obszar mózgu lub można włączyć większe elektrody do stymulacji27. Ta sama podstawowa struktura siatki i procedura wytwarzania są zachowane, ale rozmieszczenie i konstrukcja elektrod są dostosowywane do potrzeb badania. Badacze powinni jednak zachować ostrożność i zawsze sprawdzać, czy zmodyfikowane projekty mogą być łatwo wstrzykiwane przez przeznaczone igły. Niewielkie zmiany w mechanice zginania elektroniki siatkowej mogą mieć znaczący wpływ na wtryskiwalność. Jednym z takich przykładów jest to, że kąt 45° między poprzecznymi i podłużnymi wstęgami SU-8 daje siatkową sondę elektroniczną, którą można łatwo wstrzyknąć, ale kąt 90° powoduje, że igły zgniatają się i zatykają21.

Pomiar impedancji elektrod rejestrujących jest pomocny w rozwiązywaniu problemów. Okrągła elektroda Pt o średnicy 20 μm powinna mieć impedancję bliską 1 MΩ przy pomiarze z częstotliwością 1 kHz in vivo lub w 1x PBS29. Impedancja znacznie większa oznacza, że elektroda nie jest odsłonięta, co może się zdarzyć, jeśli jest zanieczyszczona pozostałościami fotorezystu lub nie jest podłączona elektrycznie. To ostatnie może wystąpić, jeśli na przykład na masce fotograficznej podczas PL znajduje się kurz, który powoduje rozłączenie w interkonektach Au lub jeśli jeden z siatkowych padów I/O nie styka się z pinami złącza ZIF podczas łączenia I/O. Wielkość impedancji mniej więcej o połowę mniejsza od oczekiwanej wartości sugeruje, że kanał może być zwarty z sąsiednim, tworząc obwód dwóch impedancji elektrod równolegle do siebie. Zmierzone wartości impedancji działają jako wskazówka podczas rozwiązywania problemów; w połączeniu z mikroskopią optyczną sond elektronicznych Mesh, źródło problemu można zwykle zidentyfikować i odpowiednio skorygować w następnym cyklu produkcyjnym lub próbie połączenia I/O.

Stosowanie elektrotechniki siatkowej do wstrzykiwania strzykawek w badaniach ostrych jest ograniczone, ponieważ aktywność impulsowa pojedynczej jednostki zwykle nie jest obserwowana do 1 tygodnia po wstrzyknięciu27, chociaż ostatnie prace (nieopublikowane) pokazują, że problem ten można łatwo przezwyciężyć. Kluczowymi determinantami czasu wymaganego do zaobserwowania aktywności impulsowej są konstrukcja siatki, objętość płynu wstrzykiwanego do mózgu wraz z elektroniką siatki oraz średnica igły używanej do wstrzykiwania, ponieważ wpływają one na stopień uszkodzenia tkanki podczas wstrzyknięcia i szybkość gojenia. Mogą być wymagane duże objętości wtrysku, jeśli elektronika siatki nie zostanie potraktowana plazmą tlenową przed uwolnieniem w wytrawiaczu Ni; Oznacza to, że jeśli siatka nie jest hydrofilowa, może przylegać do szklanej igły. Czasami siatki mają wady, które prowadzą do mechaniki zginania, co utrudnia ich wtryskiwanie. Podczas ładowania elektroniki siatkowej ważne jest, aby sprawdzić, czy siatki poruszają się łatwo i płynnie w igle (jak pokazano na filmie uzupełniającym 1). Jeśli nie, należy użyć innej elektronicznej sondy siatkowej. Najlepsze wyniki w zakresie bezproblemowego interfejsu neuronowego zostaną osiągnięte przy idealnych objętościach iniekcji wynoszących 10–50 μl na 4 mm wstrzykiwanej długości siatki. Nowsze wyniki z wstrzykiwanymi sondami elektronicznymi o drobniejszych oczkach i/lub igłami kapilarnymi o mniejszej średnicy (tak małe jak średnica wewnętrzna 150 μm, średnica zewnętrzna 250 μm) pokazują, że pojedyncze jednostki mogą być obserwowane od wkrótce po wstrzyknięciu (ostre pomiary) przez dłuższy czas. Pliki projektowe masek dla tych drobniejszych struktur siatkowych są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej zasobów, meshelectronics.org. Szacujemy, że ogólna wydajność naszych procedur iniekcji siatkowych in vivo przy użyciu igieł o średnicy wewnętrznej 400 μm (średnica zewnętrzna 650 μm) wynosi około 70%, chociaż wydajność jest bliższa 80–90% w przypadku naszych nowszych prac z igłami o średnicy wewnętrznej 150 μm (średnicy zewnętrznej 250 μm). Najczęstszymi przyczynami niepowodzenia są: (1) to, że siatka nie wstrzykuje się płynnie, co powoduje obrzęk mózgu spowodowany nieoczekiwanie dużymi objętościami wstrzyknięć do mózgu, (2) pęknięcie siatki podczas ręcznej manipulacji wymaganej w procedurze interfejsu I/O oraz (3) krwawienie z powodu uszkodzenia naczynia krwionośnego podczas wstrzykiwania. Uszkodzenie naczynia krwionośnego podczas iniekcji jest rzadkie (przyczyna mniej niż 10% niepowodzeń) i można je jeszcze bardziej ograniczyć, stosując chirurgię sterowaną obrazem. Zwracamy również uwagę, że uszkodzenie naczyń krwionośnych jest powszechnym ograniczeniem wszystkich procedur obejmujących penetrację tkanki mózgowej, w tym wstrzykiwania cząstek wirusa w celu transfekcji, wszczepiania sztywnych sond mózgowych i wstrzykiwania elektroniki siatkowej.

Sondy elektroniczne Mesh są w stanie stabilnie rejestrować i śledzić te same pojedyncze neurony w skali czasowej co najmniej miesięcy do roku i nie wywołują prawie żadnej przewlekłej odpowiedzi immunologicznej, jak pokazano odpowiednio na rysunku 9 i rysunku 10. Stanowi to istotną zaletę w porównaniu z konwencjonalnymi elektrodami głębokościowymi, które często cierpią z powodu zmniejszających się amplitud skoków, niestabilnych sygnałów i przewlekłego stanu zapalnego w trakcie długotrwałych eksperymentów rejestracyjnych14,15. Ponadto elektronika siatkowa ma tę zaletę, że można ją pozostawić w tkance podczas sekcji histologicznej, barwienia i obrazowania, w przeciwieństwie do konwencjonalnych sond, które są zbyt sztywne i dlatego muszą zostać usunięte przed analizami histologicznymi. W związku z tym elektronika siatkowa pozwala na unikalną możliwość wykorzystania analizy immunohistochemicznej do precyzyjnego badania środowiska komórkowego otaczającego każde miejsce rejestracji.

Przedstawiony tutaj protokół otwiera nowe, ekscytujące możliwości w neurobiologii. Minimalnie inwazyjna metoda dostarczania i bezproblemowa integracja elektroniki siatkowej z tkanką mózgową minimalizuje zakłócenia obwodów nerwowych i pozwala uniknąć przewlekłej odpowiedzi immunologicznej, co może przynieść korzyści większości rodzajów eksperymentów z przewlekłym zapisem neuronowym. Zdolność elektroniki siatkowej do rejestrowania i śledzenia tych samych pojedynczych neuronów przez długi czas będzie szczególnie interesująca dla badaczy starających się skorelować aktywność impulsową w skali milisekundowej z procesami trwającymi od miesiąca do roku, takimi jak starzenie się, patogeneza chorób mózgu lub rozwój mózgu16,18. Ponadto istnieją znaczne możliwości rozszerzenia i dostosowania tego protokołu, takie jak dodanie aktywnej elektroniki do stopnia głównego PCB w celu wdrożenia funkcji takich jak multipleksowanie cyfrowe 8,35, komunikacja bezprzewodowa 35,36,37 i przetwarzanie sygnału35, jednoczesne wstrzykiwanie komórek macierzystych lub polimerów z elektroniką siatkową w celu pomocy w regeneracji tkanek 18,38,39 i włączenie nanoprzewodowych tranzystorów polowych (NW-FET) do elektroniki siatkowej dla wysoce zlokalizowanych i wielofunkcyjnych sond mózgowych 24,29,40,41,42.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.M.L. dziękuje za wsparcie tej pracy przez Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych (FA9550-14-1-0136), nagrodę Akceleratora Nauk Fizycznych i Inżynierii Uniwersytetu Harvarda oraz Nagrodę Pioniera Dyrektora National Institutes of Health (1DP1EB025835-01). T.G.S. dziękuje za wsparcie ze strony Departamentu Obrony (DoD) poprzez program National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. dziękuje za wsparcie stypendialne od amerykańskiego Heart Association (16POST27250219) oraz Nagroda Pathway to Independence (Rodzic K99/R00) przyznana przez National Institute on Aging of the National Institutes of Health. Prace te zostały częściowo wykonane w Centrum Systemów Nanoskalowych (CNS) Uniwersytetu Harvarda, będącym członkiem National Nanotechnology Coordinated Infrastructure Network (NNCI), która jest wspierana przez National Science Foundation w ramach nagrody NSF ECCS Award nr 1541959.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zmotoryzowana rama stereotaktycznaWorld Precision InstrumentsMTM-3Do chirurgii stereotaktycznej myszy
512-kanałowy kontroler nagrywaniaIntan TechnologiesC3004Element systemu rejestracji neuronowej
RHD2132 płytka wzmacniaczaIntan TechnologiesC3314Element systemu rejestracji neuronowej
RHD2000 ultracienkiinterfejsu SPI o długości 3 stópIntan TechnologiesC3213Komponent neuronowego systemu rejestracji
Ogranicznik myszyBraintree ScientificTV-150  STDStandardowa średnica wewnętrzna 1,25 cala; służy do przytrzymywania myszy podczas ograniczonych sesji nagraniowych.
Wafle krzemoweNova Electronic Materials3" P < 100> 0,001-0,005 oma-cm 356-406 μ m Grube
Płytki SSP Si klasy Prime z 2 pół-std. Mieszkania &
6,000 A° ± 5% mokrego tlenku termicznego po obu stronach.
Fotomaski (chrom na szkle sodowo-wapniowym)Zaawansowane reprodukcjeAdvance Reproductions i inni dostawcy produkują fotomaski z dostarczonych plików projektowych. Nasze pliki z projektami fotomasek są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org. Alternatywnie, niektóre uniwersyteckie pokoje czyste mają maszyny do robienia masek do robienia fotomasek na miejscu.
Oprogramowanie AutoCADAutodesk Inc.Oprogramowanie do projektowania do rysowania fotomasek. Darmową alternatywą jest LayoutEditor. Nasze pliki z projektami fotomasek są dostępne na żądanie lub na stronie internetowej z zasobami, meshelectronics.org.
Parownik termicznySharon VacuumSłuży do odparowywania Ni, Cr i Au na elektronikę siatkową podczas produkcji. Wiele uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.
SU-8 2000.5 ujemny fotorezystorMicroChem Corp.Fotorezystor ujemny używany do definiowania dolnej i górnej warstwy pasywacyjnej elektroniki siatkowej.
Wyrównywacz maski MA6Karl Suss Microtec AGSłuży do wyrównania każdej fotomaski do wzoru na płytce i wystawienia płytki na działanie światła UV. Większość uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.
Deweloper SU-8MicroChem Corp.Służy do wywoływania ujemnego fotorezystu SU-8 po ekspozycji na światło UV.
Odporność na podnoszenie LOR3AMicroChem Corp.Używany z fotorezystem Shipley 1805 w celu promowania podcinania podczas procesów podnoszenia metalu
Shipley 1805 dodatni fotorezystorMicroposit, The Dow Chemical CompanyDodatni fotorezystor używany do definiowania metalowych interkonektorów i elektrod Pt w elektronice siatkowej
MF-CD-26 dodatni fotorezystuMicroposit, The Dow Chemical CompanyOpracowanie dodatniego fotorezystu S1805 po naświetleniu w nakładce maski. Wiele uniwersyteckich pomieszczeń czystych przechowuje tę substancję chemiczną.
Powlekarka wirowaReynolds TechDo powlekania wafli o dodatnich i ujemnych rezystancjach. Większość uniwersyteckich pomieszczeń czystych jest wyposażona w powlekarki wirowe.
System plazmowej obróbki powierzchniPJ AST Products, Inc.Służy do utleniania powierzchni elektroniki siatkowej przed uwolnieniem do roztworu wodnego. Większość uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.
Parownik wiązki elektronówDenton VacuumDo odparowywania Cr i Pt podczas wytwarzania elektroniki siatkowej. Wiele uniwersyteckich czystych pomieszczeń ma to lub podobne narzędzie.
Zmywacz PGMicroChem Corp.Służy do rozpuszczania LOR3A i Shipley S1805 jest odporny na podnoszenie metalu
Roztwór chlorku żelazaMG Chemicals415-1LSkładnik roztworu do trawienia Ni
36% roztwór kwasu solnegoKanto Corp.Składnik roztworu do trawienia
Ni Szklane igły kapilarneDrummond Scientific Co.Średnica wewnętrzna 0,40 mm, średnica zewnętrzna 0,65 mm. Dostępne są inne średnice.
Uchwyt do mikropipet U-typeMolecular Devices, LLC1-HL-USłuży do przytrzymywania szklanych igieł kapilarnych podczas wstrzykiwania stereotaktycznego
Strzykawka 1 mlNORM-JECT®, Henke Sass WolfSłuży do ręcznego ładowania elektroniki siatkowej do igieł kapilarnych
Rurki cewnika doaminiskowego z polietylenuBecton Dickinson and CompanyŚrednica wewnętrzna 1,19 mm, średnica zewnętrzna 1,70 mm
Strzykawka 5 mlBecton Dickinson and CompanyUżywana w pompie strzykawkowej do wstrzykiwania elektroniki siatkowej in vivo
Aparatokularowy Thorlabs Inc.DCC1240CSłuży do przeglądania elektroniki siatki w igłach kapilarnych podczas wstrzykiwania
Oprogramowanie do akwizycji obrazu ThorCam uc480 do kamer USBThorlabs Inc.Służy do oglądania elektroniki siatki w igłach kapilarnych podczas wstrzykiwań Pompa
strzykawkowaAparat HarvardPHD 2000Służy do przepływu precyzyjnych objętości roztworu przez igły kapilarne podczas wstrzykiwania elektroniki siatkowej
Wiertło dentystyczne EXL-M40Osada3144-830Do wiercenia kraniotomii
Frez wiertarski 0,9 mmFine Science Tools19007-09Do wiercenia kraniotomii
Sterylizator gorących kulek 14 cmFine Science Tools18000-50Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych
Instrument do kriosekcji CM1950Leica MicrosystemsSłuży do krojenia zamrożonej tkanki na sekcje. Wiele uniwersytetów ma to lub podobne narzędzie dostępne we wspólnym obiekcie.
0,3% Triton x-100Life TechnologiesUżywany do histologii
5% koziej surowicyLife TechnologiesUżywany do histologii
3% koziej surowicyLife TechnologiesUżywany do histologii
Królik anty-NeuNAbcamab177487Używany do histologii
Mysz anty-NeurofilamentAbcamab8135Używany do histologii
Szczur anty-GFAPThermo Fisher Scientific Inc.PA516291Używany do histologii
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific Inc.P36930Używany do histologii
Poly-D-lizynaSigma-Aldrich Corp.P6407-5MGMasa cząsteczkowa = 70-150 kDA
Zacisk końcowy pod kątem prostymThorlabs Inc.RA180/MSłuży do mocowania uchwytu pipety do ramy stereotaktycznej
Płytka obwodu drukowanego (PCB)Zaawansowane obwodySłuży do interfejsu między elektroniką siatkową a peryferyjną elektroniką pomiarową, taką jak system nagrywania Intan. Advanced Circuits i inni dostawcy produkują i montują płytki PCB na podstawie dostarczonych plików projektowych. Nasze pliki projektowe PCB są dostępne na żądanie lub na stronie z zasobami meshelectronics.org
32-kanałowym standardowym złączu wzmacniaczaOmnetics Connector Corp.A79024-001Komponent montowany na płytce drukowanej
32-kanałowy płaski elastyczny (FFC)Molex, LLC152660339Używany jako podłoże zaciskowe podczas łączenia z elektrolityką siatkową Pady I/O ze złączem ZIF montowanym na płytce drukowanej
32-kanałowe złącze o zerowej sile wprowadzania (ZIF)Hirose Electric Co., LTDFH12A-32S-0.5SH(55)Komponent zamontowany na płytce drukowanej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
  2. Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
  3. Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066(2017).
  4. Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
  5. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
  6. Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
  7. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
  8. Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
  9. Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
  10. Schiller, P. H. The Central Visual System. Vision Research. 26 (9), 1351-1386 (1986).
  11. Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
  12. Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
  13. Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
  14. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  15. Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004(2013).
  16. Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
  17. Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
  18. Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076(2017).
  19. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
  20. Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
  21. Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
  22. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  23. Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
  24. Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
  25. Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
  26. Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
  27. Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
  28. Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
  29. Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
  30. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
  31. Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079(2012).
  32. Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  33. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  34. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293(2015).
  35. Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
  36. Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021(2011).
  37. Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
  38. Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
  39. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  40. Zhang, A., Lieber, C. M. Nano-Bioelectronics. Chemical Reviews. 116 (1), 215-257 (2016).
  41. Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M. Advances in nanowire bioelectronics. Reports on Progress in Physics. 80 (1), 016701(2017).
  42. Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytwarzanie elektroniki siatkowejstereotaktyczne wstrzykiwanie do m zgusesje rejestracji neuronowejsekcjonowanie histologicznepomiar impedancjirejestracje u zwierz t swobodnie poruszaj cych silokalny potencja polowyaktywno pojedynczych jednostek

Powiązane artykuły