Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania autologicznych komórek macierzystych pochodzących z mięśni w pobliżu nawrotnego nerwu krtaniowego za pomocą elektrycznego stymulatora nerwów. Ta nowatorska technika może stać się przydatna w leczeniu nawracającej neuropatii krtani koni.
Artykuł metodologiczny
Wstrzyknięcie autologicznych komórek macierzystych pod sterowaniem stymulatorem nerwów w pobliżu lewego nerwu krtaniowego wstecznego konia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nawracająca neuropatia krtaniowa (RLN) często dotyka konie i charakteryzuje się nieprawidłowymi dźwiękami oddechowymi oraz nietolerancją wysiłku. Nerw krtaniowy wsteczny wykazuje zmiany demielinizacyjne. Korzyści płynące z zastosowania komórek macierzystych do zdemielinizowanych nerwów wykazano w różnych modelach zwierzęcych. Celem pracy było sprawdzenie wykonalności i bezpieczeństwa okołoneuronalnej iniekcji autologicznych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia mięśniowego do lewego nerwu krtaniowego wstecznego u zdrowych koni za pomocą elektrycznego stymulatora nerwów.
Komórki macierzyste pochodzące z mięśni są uzyskiwane od pięciu zdrowych koni rasy standardowej poprzez pobranie 20 mg tkanki mięśniowej za pomocą półautomatycznej igły do biopsji 14 G z mięśnia trójgłowego. Ruchy krtani są monitorowane za pomocą wideoendoskopii górnych dróg oddechowych. Do lewego nerwu krtaniowego wstecznego zbliża się izolowaną igłą do blokowania nerwów. Stosuje się stymulację nerwów, zaczynając od 2 mA, i monitoruje się pomyślne odwodzenie lewego arytenoidu. Intensywność stymulacji zmniejsza się stopniowo. Gdy obserwuje się utratę odpowiedzi motorycznej przy 0,5 mA, wstrzykuje się 107 autologicznych komórek macierzystych pochodzących z mięśni. Dwóch egzaminatorów, którzy są zaślepieni do punktu czasowego, ocenia czynność krtani koni przed leczeniem oraz w dniu 1, 7 i 28 dniu po wstrzyknięciu komórek. U szóstego konia wstrzykuje się 1 ml 2% lidokainy, aby dodatkowo potwierdzić prawidłowe ustawienie igły. Prowadzi to do czasowego paraliżu lewej chrząstki arytenoidalnej.
To badanie dowodzi, że do nerwu krtaniowego wstecznego można dotrzeć za pomocą elektrycznego stymulatora nerwów i że stymulacja elektryczna nerwu jest dobrze tolerowana przez konie. Nie zaobserwowano modyfikacji funkcji krtani u żadnego z koni po wstrzyknięciu komórek macierzystych. Należy przeprowadzić dalsze badania w celu opisania skutków okołoneuronalnego wstrzykiwania autologicznych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z mięśni koniom cierpiącym na RLN.
Wprowadzenie
RLN to powszechna patologia górnych dróg oddechowych u koni charakteryzująca się różnym stopniem paraliżu awantenoidalnego. Najczęściej dotyczy to lewej strony krtani. Częstość występowania choroby może sięgać nawet 35% w niektórych populacjach koni. Chociaż kilka hipotez próbowało wyjaśnić etiologię i patogenezę tej choroby, dokładna przyczyna RLN pozostaje niepewna. Patologia jest opisywana jako dystalna aksonopatia nawrotnego nerwu krtaniowego ze zmianami demielinizacji, ale także pewnym stopniem remielinizacji. Ta aksonopatia prowadzi do odnerwienia wewnętrznych mięśni krtani i współistniejącego zaniku1,2. Ta patologia jest często powoli postępująca i może prowadzić do całkowitej utraty odwodzenia arytenoidalnego dotkniętej strony3.
Konie dotknięte chorobą emitują nienormalne dźwięki oddechowe podczas ćwiczeń, a czasami wykazują nietolerancję wysiłku w cięższych przypadkach. Ostateczną diagnozę stawia się na podstawie badania endoskopowego na stojącym koniu bez sedacji, w którym obserwuje się częściową lub całkowitą utratę odwodzenia krtani1,2,4. Obecnie najczęstszym sposobem leczenia jest laryngoplastyka (znana również jako "tie-back"), która czasami wiąże się z kordektomią komorowo-kordektomiczną. Chociaż ogólny wskaźnik powodzenia tych operacji jest uważany za dobry lub doskonały5, powikłania pooperacyjne są bardzo częste. Najczęstszym powikłaniem jest stopniowa utrata zdolności do odwodzenia. Barnett i wsp.6 zgłosiło utratę co najmniej jednego stopnia uprowadzenia w ciągu pierwszych sześciu tygodni po operacji u co najmniej 76% koni. Inne powikłania, takie jak awaria protezy, kaszel i zanieczyszczenie dróg oddechowych, są również zgłaszane5.
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są częścią medycyny koni w badaniach i praktyce od ponad dekady, chociaż udowodnione badania nad ich skutecznością są nadal rzadkie. Dwa najczęściej wykorzystywane źródła dorosłych mezenchymalnych komórek macierzystych u koni to szpik kostny i tkanka tłuszczowa7. Obie techniki pobierania próbek są stosunkowo inwazyjne i nie zawsze prowadzą do uzyskania wystarczającej liczby komórek. Ostatnio Ceusters i wsp.7 opisywał hodowlę komórek macierzystych pochodzących z tkanki mięśni prążkowanych, która jest uzyskiwana za pomocą mniej inwazyjnej techniki mikrobiopsji.
MSC są zdolne do samoodnawiania, samogenerowania, multipotencji i różnicowania7,8. Ich zdolność do różnicowania się we wszystkie linie mezodermy: tłuszczu, kości, mięśni i chrząstek jest teraz dobrze znana9. Jednak w określonych warunkach środowiskowych mogą różnicować się w linie niemezenchymalne, takie jak neurony, astrocyty i komórki mielinizacyjne obwodowego układu nerwowego i rdzenia kręgowego9,10. MSCs były już używane w kilku modelach neuropatii10,11. Ich zdolność do migracji do obszarów zdegenerowanej tkanki nerwowej i do regeneracji komórek nerwowych została wykazana po podaniu ogólnoustrojowym i miejscowym11. Co więcej, komórki podobne do Schwanna pochodzące z MSCs mogą rekrutować makrofagi w celu usuwania resztek komórkowych i wydzielania czynników neurotroficznych sprzyjających wzrostowi aksonów i remielinizacji9.
Celem tego badania jest opisanie techniki wstrzykiwania autologicznych komórek macierzystych pochodzenia mięśniowego w pobliżu lewego nerwu krtaniowego wstecznego u zdrowych koni. Zazwyczaj stymulator nerwów połączony z igłą do wstrzykiwań jest używany do elektrolokalizacji nerwów obwodowych w celu zastosowania miejscowych środków znieczulających na ten obszar12. Słaby impuls prądu stałego jest dostarczany w pobliżu nerwu w celu wywołania reakcji motorycznej. Zdolność do wytworzenia tej odpowiedzi motorycznej zależy od kilku parametrów, takich jak obszar przewodzenia igły, impedancja tkanki, przyłożony prąd, czas trwania impulsu i odległość od igły do nerwu. Igły stymulatorów nerwów są zaprojektowane tak, aby miały bardzo restrykcyjny obszar przewodzący na końcu igły, podczas gdy reszta igły jest izolowana. Taka konstrukcja pomaga precyzyjnie zlokalizować nerw. Nowoczesne stymulatory nerwów dostosowują się do różnych impedancji tkanek i dostarczają stałe natężenie prądu ustawione na maszynie. Ponadto większość maszyn wykorzystuje czas trwania impulsu wynoszący 0,1 s, dzięki czemu parametrami decydującymi są przyłożony prąd i odległość do igły. Zależność między odległością między igłą a nerwem a prądem niezbędnym do wywołania reakcji motorycznej opisuje prawo Coulomba: E = kQ/r; gdzie E jest wymaganym ładunkiem stymulacji, k jest stałą Coulomba, Q jest minimalnym wymaganym ładunkiem stymulacji, a r jest odległością między dwiema elektrodami. W elektrolokalizacji nerwów odległość między dwiema elektrodami jest uważana za odległość między igłą a nerwem12. Ładunek elektryczny rozprasza się zgodnie z zasadą odwrotności kwadratu odległości między igłą a nerwem13. Praktyka kliniczna wykazała, że stymulacja nerwu ruchowego przy natężeniu 0,5 mA jest silnie skorelowana z udaną blokadą nerwów i że utrata sygnału motorycznego przy niższych prądach uniemożliwi użytkownikowi podanie przypadkowych wstrzyknięć wewnątrzneuronalnych. Celem tego badania jest przetestowanie wykonalności i bezpieczeństwa tej techniki na ograniczonej liczbie koni. Jeśli wykonalność i bezpieczeństwo tej techniki zostaną potwierdzone, można ją łatwo przenieść na dotknięte nią konie. Co więcej, RLN koni może służyć jako model obwodowej neuropatii zwyrodnieniowej.
Protokół
Komisja ds. etycznego użytkowania zwierząt na Uniwersytecie w Liège zatwierdziła protokół badawczy.
1. Mikrobiopsja mięśni
- Wybierz miejsce pobrania próbki na podstawie oceny wzrokowej i badania palpacyjnego, w długiej głowie mięśnia trójgłowego ramienia, w przybliżeniu w połowie odległości między łokciem a guzkami barkowymi.
- Wygol obszar o powierzchni około 2 x 2 cm2 za pomocą maszynki elektrycznej. Na wygolony obszar nałóż środek chirurgiczny w postaci mydła ciekłego z poliiodkiem oraz kompresy alkoholowe i pozostaw na 1 minutę. Wstrzyknij podskórnie 1 mL 2% roztworu lidokainy za pomocą igły 25 G w środek wygolonego i odkażonego obszaru.
- Umij ręce mydłem przeciwbakteryjnym. Załóż sterylną rękawiczkę. Użyj jednorazowego sterylnego prześcieradła jako sterylnego pola, na którym umieścisz igłę do biopsji oraz trokar.
- Wprzęgnij półautomatyczną igłę do biopsji 14 G, naciskając mechanizm sprężynowy, jak pokazano na ryc. 1b i 1c. Zwolnij igłę do biopsji, aby zapoznać się z jej mechanizmem działania. Umieść naładowaną igłę do biopsji na powierzchni sterylnej. Zapoznaj się z trokarem, składającym się z kanulki i koreczka, jak pokazano na ryc. 1a.
Rycina 1: Zestaw igły biopsji. Zestaw igły biopsji składa się z (a) kanulii z tulejem wprowadzającym oraz igły biopsji (od góry do dołu). Pozostałe obrazy przedstawiają igłę biopsji w pozycji (b) neutralnej oraz (c) naładowanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Przygotuj trokar, składając kanulę i tuleję wprowadzającą, i utrzymuj je w pozycji zablokowanej. Wprowadź trokar prostopadle do skóry przez wcześniej znieczulony obszar. Przesuń trokar do pozycji, w której jego koniec znajduje się około 1,5 cm w głąb mięśnia. Wyjmij trokar, oddziel kanulę od tulei wprowadzającej i umieść tuleję na powierzchni sterylnej.
- Wprowadź załadowaną igłę biopsyczną przez kanulę. Wprowadź igłę i kanulę przez nacięcie skórne do wnętrza mięśnia. Przesuń igłę do pozycji, w której jej koniec znajduje się w środku długiej głowy mięśnia trójgłowego ramienia.
- Wyzwól igłę biopsyczną, a następnie wyciągnij igłę biopsyczną razem z kanulą. Wyciągnij igłę biopsyczną z kanuli. Pozostaw kanulę na powierzchni sterylnej.
- Otwórz igłę biopsyczną, ciągnąc sprężynę jedną ręką i przytrzymując ją drugą.
UWAGA: Próbka staje się widoczna na końcu igły biopsycznego. - Przy pomocy drugiej osoby otwórz próbkę w rurce zawierającej ośrodek próbkowania. Użyj igły do wstrzykiwania o kalibrze 19 G, aby usunąć mały fragment mięśnia z igły biopsycznego. Umieść próbkę mięśnia w ośrodku próbkowania. Zamknij rurkę nakrętką i delikatnie przechyl ją 2 razy, aby upewnić się, że próbka unosi się w ośrodku.
- Załaduj igłę biopsyczną. Weź kanulę ze sterylnej powierzchni i ponownie połącz załadowaną igłę biopsyczną z kanulą. Wprowadź załadowaną igłę i kanulę przez nacięcie skórne, jak opisano wcześniej. Powtórz procedurę pobierania próbki 2–3 razy, aż zostanie zebranych około 20 mg tkanki mięśniowej. Zamknij rurkę z próbką. Delikatnie obróć rurkę 2 razy, aby wymieszać fragmenty mięśnia z ośrodkiem próbkowania.
- Wystaw próbki do laboratorium w stałej temperaturze od 4 do 8 °C.
UWAGA: Laboratorium przetworzy następnie próbkę. Protokół może zostać tutaj wstrzymany. - Procedura jest dobrze tolerowana i bólu w miejscu pobierania próbki nie obserwuje się. W mało prawdopodobnym przypadku wystąpienia bólu mięśnia w miejscu pobierania próbki należy podać odpowiednie leczenie przeciwbólowe.
2. Obróbka komórek
UWAGA: Komórki macierzyste wykorzystane w tym badaniu przygotowano zgodnie z metodą opisaną przez Ceustersa et al.7. W ich artykule opisano również charakterystykę tych komórek.
- Przygotuj specyficzny podłoże hodowlane DF20, dodając 20% ciepłoszczelnego surowicy cielęcej, 5 mL penicyliny (1000 IU/mL)–streptomycyny (10 000 µg/mL) oraz 2,5 mL amfoterycyny B (250 µg/mL) do butelki zawierającej 500 mL komercyjnie dostępnego podłoża hodowlanego z glutaminą i czerwienią fenolową.
- Wlej po 150 µL podłoża hodowlanego DF20 do każdej z 16 wewnętrznych dołków płytki 24-dołkowej. Do pozostałych zewnętrznych dołków wlej po 1 mL buforu fosforanowego (PBS) [chlorek potasu (200 mg/L), fosforan potasu jednosoleny (200 mg/L), chlorek sodu (8000 mg/L) i fosforan potasu dwusoleny (2160 mg/L)].
- Przepłucz drobne kawałki mięśnia dwukrotnie w PBS. Rozdziel je na bardzo małe fragmenty za pomocą skalpela i szczypczyków, a następnie umieść niewielki kawałek (o wielkości czubka ostrza skalpela) w każdym z 16 wewnętrznych dołków płytki wielodołkowej.
- Umieść płytkę wielodołkową w inkubatorze utrzymywanym w następujących warunkach: 37 °C, 21% O2 i 5% CO2. Monitoruj dołki codziennie pod mikroskopem odwróconym i w razie potrzeby dodaj 50 µL DF20, aby zapobiec wyschnięciu komórek.
UWAGA: Po około 10 d pojawi się wystarczająca liczba komórek wyrosłych z ekspiantu, aby umożliwić izolację komórek macierzystych. Protokół może zostać tutaj wstrzymany. - Gdy wokół ekspiantów mięśniowych będzie widoczna aureola komórek, usuń ekspiant tkanki mięśniowej. Odetnij komórki za pomocą 150 µL roztworu trypsyny zawierającego EDTA w każdym dołku: usuń podłoże hodowlane, przepłucz komórki 1 mL PBS, usuń PBS i dodaj roztwór trypsyny na maksymalnie 10 min w 37 °C. Dodaj podłoże hodowlane, aby zatrzymać działanie trypsyny, zebrać zawiesinę komórkową, a następnie odwirować zawiesinę przy 200 x g przez 10 min w 37 °C. Usuń supernatant i zawieś osad w roztworze soli fizjologicznej.
- Przenieś zawiesinę komórkową na nieciągły gradient gęstości trzech warstw (15%, 25% i 35%). Owiń probówkę zawierającą zawiesinę komórkową i roztwór nieciągłego gradientu gęstości przy 1250 x g przez 20 min w 25 °C. Nie używaj hamulca wirówki. Obserwuj frakcje komórkowe o różnej gęstości, które pojawią się pomiędzy poszczególnymi warstwami roztworu nieciągłego gradientu gęstości po wirowaniu.
- Kontynuuj hodowlę frakcji znajdującej się między 15% a 25%. Przenieś ją do probówki i przepłucz roztworem soli fizjologicznej. Owiń zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 10 min w 37 °C. Usuń supernatant. Następnie zawieś osad w 1 mL DF20. Wstępnie napełnij fiolkę hodowlaną o powierzchni 25 cm2 6 mL DF20. Przenieś komórki do wstępnie napełnionej fiolki hodowlanej i hoduj je w inkubatorze w następujących warunkach: 37°C, 21% O2 i 5% CO2.
UWAGA: Protokół może zostać tutaj wstrzymany. - Monitoruj komórki codziennie pod mikroskopem odwróconym. W razie potrzeby wymień podłoże hodowlane (usuń stare podłoże i dodaj 6 mL świeżego podłoża). Oceń stopień zacieśnienia komórek poprzez obserwację warstwy komórkowej w fiolkach hodowlanych przy użyciu mikroskopu o ustalonej wielokrotności powiększenia. Oszacuj powierzchnię fiolki zajmowaną przez komórki. Pracuj przy stałym powiększeniu mikroskopowym przy każdej obserwacji, aby móc ocenić stopień zacieśnienia. Gdy komórki zajmą 85% powierzchni fiolki, przystąp do przesiewu komórek.
- Gdy komórki osiągną zacieśnienie, odczep je za pomocą roztworu trypsyny zawierającego EDTA, zgodnie z protokołem opisanym w kroku 2.4. Następnie odwiń zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 10 min w 37 °C. Usuń supernatant i zawieś komórki w 5 mL DF20. Umieść je w fiolce hodowlanej o powierzchni 175 cm2 wstępnie napełnionej 25 mL DF20. Umieść fiolkę w inkubatorze w następujących warunkach: 37°C, 21% O2 i 5% CO2.
UWAGA: Protokół może zostać tutaj wstrzymany. - Monitoruj komórki codziennie pod mikroskopem odwróconym. W razie potrzeby wymień podłoże (usuń stare podłoże i dodaj 30 mL nowego podłoża). Gdy komórki osiągną zacieśnienie, odczep je za pomocą trypsyny-EDTA, jak opisano w kroku 2.4. Następnie odwiń zawiesinę komórkową przy 200 x g przez 10 min w 37 °C. Usuń supernatant i zawieś komórki w 6 mL DF20. Umieść po 1 mL zawiesiny komórkowej do sześciu fiolkek o powierzchni 175 cm2, każda wstępnie napełniona 25 mL DF20, i hoduj je w 37 °C w inkubatorze CO2 (z 21% O2 i 5% CO2).
- Monitoruj komórki codziennie pod mikroskopem odwróconym. W razie potrzeby wymień podłoże (usuń stare podłoże i dodaj 30 mL nowego podłoża do każdej fiolki). Gdy komórki osiągną zacieśnienie, odczep je za pomocą trypsyny-EDTA, jak opisano w kroku 2.5. Owiń je trzykrotnie przy 200 x g przez 10 min w 37 °C, usuwając supernatant po każdym etapie.
- Policz komórki za pomocą komory liczącej Bürkera i mikroskopu świetlnego. Przygotuj zawiesinę komórkową o stężeniu 10 milionów komórek/mL w specyficznym podłożu do kriokonserwacji.
- Zamróź dawki terapeutyczne po 1 x 107 komórek w 1 mL podłoża do kriokonserwacji i przechowuj je w fazie parowej ciekłego azotu aż do momentu użycia.
UWAGA: Protokół może zostać tutaj wstrzymany. - Wysyłaj komórki w fiolce na suchym lodzie do ostatecznego zastosowania.
3. Wstrzyknięcie komórek
UWAGA: Do przeprowadzenia iniekcji komórek macierzystych wymagane są dwie osoby.
- Stopniowo ogrzej zawiesinę komórkową do temperatury pokojowej. Wessij zawiesinę do strzykawki o pojemności 2 mL.
- Uspokój konia, wstrzykując detomidynę w dawce 10 µg/kg do żyły szyjnej za pomocą igły podskórnej 19 G. Poczekaj 5 minut, aby zaobserwować pełny efekt uspokojenia, który objawia się charakterystyczną pozycją głowy skierowanej w dół.
- Wygol część o powierzchni 20 x 10 cm2 w lewym rejonie krtani konia za pomocą maszynki do golenia, jak pokazano na Rysunku 2. Następnie nałóż na ogoloniony obszar preparat chirurgiczny z mydła poliiodowego i alkoholu.
- Wprowadź giętki standardowy wideoendoskop przez lewe nozdrze konia i przesuwaj go w kierunku gardła. Dostosuj położenie endoskopu, aż uzyskasz pełny widok obu chrząstek arytnoidalnych i strzemiączka. Utrzymuj endoskop w tej pozycji podczas całej procedury i skieruj ekran wideoendoskopu w stronę operatorów.
- Połącz igłę do stymulacji/wstrzykiwania z ujemnym elektrodą stymulatora nerwowego. Zachowaj sterylność igły. Połącz dodatnią elektrodę stymulatora nerwowego z elektrodą samoprzylepną, którą przyklejasz do ogolonego obszaru skóry.
- Połącz strzykawkę zawierającą zawiesinę komórkową z układem wstrzykującym i wypełnij wstępnie rurkę, aby usunąć powietrze z układu. Zapamiętaj objętość układu i przygotuj strzykawkę z taką samą objętością sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
- Jeśli nie jesteś obeznany z tą techniką, użyj zdezynfekowanego liniowego przetwornika ultradźwiękowego o częstotliwości 5–7 MHz, aby zobrazować struktury anatomiczne w badanym rejonie. Użyj sterylnego żelu sprzęgającego do ultrasonografii, aby poprawić jakość obrazu. Zobacz krtanię oraz naczynia krwionośne przebiegające w tylnej części krtani.
- Po zapoznaniu się z anatomią rejonu wprowadź igłę do stymulacji/wstrzykiwania w kierunku boczno-tylnej części krtani. Gdy igła zbliża się do boczno-tylnej części krtani, uruchom stymulator nerwowy w trybie stymulacji 1 Hz przy natężeniu prądu 2 mA.
- Delikatnie przesuwaj igłę w stronę nerwu krtaniowego wstecznego, obserwując obraz endoskopowy na ekranie. Gdy tylko na ekranie wideo pojawi się ruch odwodzenia lewej chrząstki arytnoidalnej, zmniejsz natężenie prądu, aż ruch zniknie, zachowując jednocześnie pozycję igły.
- Określ optymalną pozycję igły. Utratę odpowiedzi ruchowej przy natężeniu 0,5 mA uznaj za optymalną odległość od nerwu. Jeśli ruchy chrząstki arytnoidalnej utrzymują się przy natężeniach niższych niż 0,4 mA, nie wstrzykuj komórek, ponieważ może to prowadzić do wstrzyknięcia wewnątrznerwowego.
- Gdy zaobserwujesz utratę odpowiedzi ruchowej przy natężeniu 0,5 mA, wstrzyknij zawiesinę komórkową zawierającą 107 autologicznych komórek macierzystych i przepłucz układ wstrzykujący roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 3.6. Spowoduje to wstrzyknięcie reszty zawiesiny komórkowej pozostałej w rurce wstrzykującej.
- Po wstrzyknięciu komórek usuń igłę oraz endoskop.
- Pozwól koniowi wyjść z uspokojenia. Nie jest wymagane żadne dalsze leczenie miejsca pobrania biopsji.
Wyniki
Komisja ds. etycznego wykorzystania zwierząt Uniwersytetu w Liège zatwierdziła protokół badania. Do badania włączono sześć koni z stada koni badawczych w Centrum Badań Konnych Mont-le-Soie. U pierwszego konia nerw krtaniowy wsteczny zlokalizowano za pomocą elektrostymulacji. Rysunek 2 przedstawia zastosowany układ, w którym igła stymulująca została wprowadzona w lewą grzbietowo-boczną część krtani konia za pomocą stymulatora nerwów. Po zaobserwowaniu utraty ruchu chrząstki nalepkowej przy 0,5 mA wstrzyknięto 1 mL 2% lidokainy. Skutkowało to brakiem ruchu przy wyższych natężeniach prądu oraz przejściowym porażeniem lewej chrząstki nalepkowej. Endoskopia kontrolna przeprowadzona 24 h później wykazała całkowity powrót funkcji chrząstki nalepkowej. Pełny protokół powtórzono z sukcesem u pięciu koni. Żaden z koni nie wykazał negatywnej reakcji na mikrobiopsję mięśni. U wszystkich koni w wyznaczonym czasie wyhodowano odpowiednią liczbę komórek. U wszystkich pięciu koni wykonano endoskopię górnych dróg oddechowych i określono oceny funkcji krtani I lub II.1 zgodnie z klasyfikacją Robinson et al.14. Wszystkie konie bardzo dobrze tolerowały stymulację nerwu krtaniowego wstecznego. Nie zaobserwowano żadnych niepożądanych reakcji podczas lub po stymulacji bądź wstrzyknięciu komórek macierzystych.
Wszystkie badania endoskopowe zostały zarejestrowane i ocenione przez dwóch klinicystów pracujących w ślepym badaniu. Nie stwierdzono różnic między wynikami funkcji krtani przed wstrzyknięciem a wynikami uzyskanymi w 1., 7. i 28. dniu po podaniu komórek macierzystych, co potwierdzono testem Wilcoxona15. Tabela 1 podsumowuje wyniki oceny krtani wszystkich koni w różnych punktach czasowych, a także czas od wprowadzenia igły do wstrzyknięcia komórek macierzystych oraz natężenie prądu wywołujące ruch chrząstek naleźnych w momencie podania komórek.
Komórki wykorzystane w niniejszym badaniu zostały przygotowane zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem7. Komórki ze wszystkich frakcji wykazywały zdolność do różnicowania trójliniowego, wykaziwały ekspresję CD90 i CD4, nie wykazywały ekspresji CD45 i MHC II oraz posiadały zdolności klonogenne. Do dalszych analiz wybrano komórki z frakcji 15–25%, ponieważ wykazywały one najwyższą ekspresję CD90 oraz największe zdolności proliferacyjne.
Celem niniejszego badania nie była ocena skuteczności zastosowania komórek macierzystych w regeneracji uszkodzonego nerwu obwodowego, lecz jedynie sprawdzenie wykonalności procedury oraz ocena bezpieczeństwa wstrzyknięcia komórek macierzystych do nerwu krtaniowego wstecznego u niewielkiej liczbie zdrowych koni. Brak jakichkolwiek zmian funkcjonalnych w obrazowaniu endoskopowym u pięciu koni do 28 dni po wstrzyknięciu oraz brak objawów klinicznych u czterech z pięciu koni do 1 roku po wstrzyknięciu potwierdzają wykonalność i bezpieczeństwo tej procedury. Jeden koń musiał zostać poddany eutanazji w okresie obserwacji z przyczyn niezwiązanych z badaniem. Chociaż techniki te okazały się bezpieczne u niewielkiej liczby koni, liczba zwierząt włączonych do niniejszego badania jest zbyt mała, aby wykazać brak rzadkich zdarzeń.
| Ocena przed wstrzyknięciem | Czas do wstrzyknięcia (min) | Natężenie prądu przy wstrzyknięciu (mA) | Ocena w 1. dniu po wstrzyknięciu | Ocena w 7. dniu po wstrzyknięciu | Ocena w 28. dniu po wstrzyknięciu | |
| Koń 1 (Standardbred, klacz, 16 lat) | II.1 | 12 | 0.5 | I | II.1 | II.1 |
| Koń 2 (Standardbred, klacz, 2 lata) | I | 3 | 0.7 | I | I | I |
| Koń 3 (Standardbred, klacz, 1 lat) | II.1 | 4 | 0.5 | II.2 | II.1 | II.1 |
| Koń 4 (Standardbred, klacz, 12 lat) | I | 7 | 0.5 | I | II.1 | I |
| Koń 5 (Standardbred, klacz, 10 lat) | I | 3 | 0.7 | II.1 | I |
Tabela 1: Dane sygnałowe i oceny funkcji krtani u koni. Tabela ta przedstawia czas wstrzyknięcia, najniższy prąd wywołujący jakikolwiek ruch chrząstek naleźnych przed wstrzyknięciem oraz oceny krtani u pięciu zdrowych koni przed wstrzyknięciem oraz w 1., 7. i 28. dniu po wstrzyknięciu autologicznych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z mięśni w okolicy lewego nerwu krtaniowego wstecznego. Koń nr 5 nie był dostępny do badania kontrolnego w 28. dniu po wstrzyknięciu z przyczyn niezwiązanych z niniejszym badaniem. Wyniki odnoszą się do ocen opisanych przez Robinson et al.14. W tym systemie ocena I oznacza, że ruchy obu chrząstek naleźnych były synchroniczne i symetryczne, a pełna abdukcja obu chrząstek naleźnych mogła zostać osiągnięta i utrzymana. Ocena II.1 oznacza, że ruchy chrząstek naleźnych były asynchroniczne lub mogły być w pewnych momentach asymetryczne; jednak pełna abdukcja obu chrząstek naleźnych mogła zostać osiągnięta i utrzymana.
Rysunek 2Ustawienia podczas wstrzykiwania komórek macierzystych. Igłę do stymulacji nerwów wprowadza się po lewej stronie krtani i kieruje w stronę lewego nerwu krtaniowego wstecznego. Stymulator nerwów ustawiono na wartość 0,8 mA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Protokół ten opisuje skuteczne zastosowanie autologicznych komórek macierzystych pochodzenia mięśniowego do nawracających nerwów krtaniowych u koni przy użyciu podejścia sterowanego przez stymulatory nerwów. Pobranie próbki z mikrobiopsji mięśni, jak również izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych, zostały szczegółowo opisane wcześniej, podczas gdy wstrzyknięcie tych komórek w pobliżu nerwu obwodowego jest oryginalne. Elektrolokalizacja nerwu za pomocą elektrycznego stymulatora nerwów posłużyła do niniejszego badania i została wykorzystana do wstrzykiwania mezenchymalnych komórek macierzystych w bezpośredniej bliskości nerwu krtaniowego wstecznego. Odpowiedź motoryczną monitorowano za pomocą wideoendoskopii przez nosogardziel. Jeśli podczas procesu pozycjonowania igły stymulowane były inne nerwy, odpowiedni ruch był widoczny na ekranie endoskopowym. Skuteczna stymulacja nerwu krtaniowego wstecznego charakteryzowała się typowym odwodzeniem chrząstki arytenoidalnej. U jednego konia wstrzyknięto środek znieczulający miejscowo w celu wywołania przejściowego paraliżu mięśnia awantoidalnego. Chociaż udana implantacja komórek w pobliżu nerwu nie została przetestowana konkretnie w niniejszym badaniu, elektrolokalizacja nerwu i wstrzyknięcie przy niskim natężeniu dowiodły, że komórki macierzyste zostały zaaplikowane w pobliżu nerwu. Bliskość iniekcji do nerwu została dodatkowo wykazana przez udaną blokadę motoryczną wywołaną wstrzyknięciem środka znieczulającego miejscowo.
U pozostałych pięciu koni czas od pierwszej stymulacji do udanego wstrzyknięcia komórek macierzystych wynosił od 3 do 12 minut. Podczas zabiegu konie były lekko uspokojone, co zwiększyło ich podatność na stymulację elektryczną. Żaden z koni nie wykazywał działań niepożądanych w żadnym momencie, co wskazuje, że czas trwania stymulacji można przedłużyć, jeśli jest to konieczne, aby uzyskać dobre ułożenie igły. Oczekuje się, że stroma krzywa uczenia się zostanie zaobserwowana, jeśli operator stosuje tę technikę regularnie i u większej liczby koni o różnej anatomii.
Konie często cierpią na RLN, który charakteryzuje się różnym stopniem paraliżu lewej chrząstki arytenoidalnej, co prowadzi do nieprawidłowych dźwięków oddechowych i nietolerancji wysiłku. Badanie histologiczne uszkodzonych nerwów ujawnia typowe zmiany w neuropatii obwodowej16. Neuropatia obwodowa to termin używany do opisania różnego rodzaju uszkodzeń nerwów obwodowych prowadzących do upośledzenia czuć, ruchów lub funkcji narządów. Przyczyny są bardzo różne i mogą obejmować cukrzycę, niedobory składników odżywczych, leczenie określonymi lekami, uraz, niedokrwienie lub infekcję, lub mogą być idiopatyczne. Niezależnie od przyczyny, neuropatie obwodowe mają wspólne objawy histopatologiczne, takie jak zwyrodnienie Wallera, aksonopatia dystalna lub demielinizacja segmentowa. Wykazano, że podawanie mezenchymalnych komórek macierzystych uszkodzonym nerwom obwodowym może być korzystne dla ich regeneracji; Jednak mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska nie są dobrze poznane. Tradycyjnie uważamy, że mezenchymalne komórki macierzyste różnicują się tylko w komórki progenitorowe tkanki tłuszczowej, mięśniowej, chrzęstnej i kostnej, ale w określonych warunkach wykazano, że różnicują się w miocyty17, astrocyty18 i komórki mielinizujące obwodowego19 i ośrodkowego układu nerwowego19. Podczas hodowli in vitro ekspozycja na neuropeptydy będzie sprzyjać różnicowaniu mezenchymalnych komórek macierzystych w komórki wykazujące ekspresję markerów neuronalnych21,22. Kilka badań in vivo wykazało korzystny wpływ mezenchymalnych komórek macierzystych na regenerację nerwów i funkcjonalne odzyskiwanie w szczurzych modelach uszkodzenia nerwu kulszowego10,23. Jest to prawdopodobnie spowodowane korzystnymi warunkami środowiskowymi, które przyczyniają się do różnicowania komórek macierzystych w komórki specyficzne tkankowo24. Przyszłe badania powinny również zbadać tę technikę podawania wstępnie zróżnicowanych komórek u koni dotkniętych RLN.
Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze doniesienie, które opisuje zastosowanie stymulatora nerwów do lokalizacji nerwu obwodowego w celu wstrzyknięcia do niego określonego leczenia. Inne patologie nerwów obwodowych u różnych gatunków, takie jak ból neuropatyczny, mogą być leczone przez podawanie komórek macierzystych w pobliżu nerwu25,26. Przyszłe badania powinny przetestować wpływ tej techniki na pacjentów klinicznych i zbadać ryzyko migracji oraz potencjał różnicowania wstrzykniętych komórek.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie zostało sfinansowane przez Mont-le-Soie Equine Research Centre.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Detomidyna (Domidine) | Dechra sprzedawana | w aptece | |
| Lidokaina (Xylocaine) | Movianto | sprzedawane w aptece | |
| TOF Watch S (Stymulator nerwów) | Alsevia | 79950161 | |
| TSK Starcut (igła do biopsji) | Laboratorium STSK | SAG - 14090C | |
| Igła do elektrostymulacji | Pajunk | 001185-79 | |
| DMEM - F12 (pożywka hodowlana) | Lonza | LO BE12-719F | |
| Inaktywowany termicznie FBS | Technologie życia | 10500 | |
| Penicylina-streptomycyna | Lonza | DE17-602E | |
| Amfoterycyna B (Fungizone) | Lonza | 17-836E | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem | Lonza | LO BE17-512F | |
| Naczynie 24-dołkowe | Corning | 3524 | |
| Trypsin | Life technologies | 12604 | |
| HBSS | Lonza | LO BE10-508F | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | 17544502 | |
| NaCl | Sigma | S8776 | |
| T-25 cm² kolby | Nunclon | 136196 | |
| T-175 cm² Kolby | Nunclon | 178883 | |
| Rozwiązania Cryostore CS5 | Biolife | 205373 |
Bibliografia
- Duncan, I. D., Griffiths, I. R., Madrid, R. E. A light and electron microscopic study of the neuropathy of equine idiopathic laryngeal hemiplegia. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (6), 483-501 (1978).
- Cahill, J. I., Goulden, B. E. Equine laryngeal hemiplegia. IV. Muscle pathology. New Zealand Veterinary Journal. 34 (11), 186-190 (1986).
- Dixon, P. M., et al. Laryngeal paralysis: a study of 375 cases in a mixed-breed population of horses. Equine Veterinary Journal. 33 (5), 452-458 (2001).
- Dixon, P. M., Robinson, E., Wade, J. F. Review of the pathological changes in equine recurrent laryngeal neuropathy. Havemeyer Workshop on Equine Laryngeal Neuropathy. Havemeyer Monograph Series No. 11. , R&W Publications. Newmarket, UK. 9-11 (2003).
- Biasutti, S., Dart, A. J., Jeffcott, L. B. A review of recent developments in the clinical application of prosthetic laryngoplasty for recurrent laryngeal neuropathy: Indications, complications and outcome. Equine Veterinary Education. 29 (6), 337-345 (2016).
- Barnett, T. P., O'Leary, J. M., Parkin, T. D. H., Dixon, P. M., Barakzai, S. Z. Long-Term Maintenance of Arytenoid Cartilage Abduction and Stability During Exercise After Laryngoplasty in 33 Horses. Veterinary Surgery. 42 (3), 291-295 (2013).
- Ceusters, J., et al. From skeletal muscle to stem cells: an innovative and minimally-invasive process for multiple species. Scientific Reports. 7 (1), 696(2017).
- Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin, C. Z. Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 20 (1), 5-14 (2011).
- Jiang, L., Jones, S., Jia, X. Stem Cell Transplantation for Peripheral Nerve Regeneration: Current Options and Opportunities. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 94(2017).
- Tohill, M., Mantovani, C., Wiberg, M., Terenghi, G. Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neuroscience Letters. 362 (3), 200-203 (2004).
- Ji, J. F., He, B. P., Dheen, S. T., Tay, S. S. W. Interactions of Chemokines and Chemokine Receptors Mediate the Migration of Mesenchymal Stem Cells to the Impaired Site in the Brain After Hypoglossal Nerve Injury. Stem Cells. 22 (3), 415-427 (2004).
- Urmey, W. F. Using the nerve stimulator for peripheral or plexus nerve blocks. Minerva Anesthesiologica. 72 (6), 467-471 (2006).
- De Andrés, J., Sala-Blanch, X. Peripheral nerve stimulation in the practice of brachial plexus anesthesia: a review. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 26 (5), 478(2001).
- Robinson, N. E. Consensus statements on equine recurrent laryngeal neuropathy: conclusions of the Havemeyer Workshop. Equine Veterinary Education. 16 (6), 333-336 (2004).
- The BMJ: Rank Score Tests. , Available from: https://www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/10-rank-score-tests (2018).
- Hahn, C. N., et al. Histological and ultrastructural evidence that recurrent laryngeal neuropathy is a bilateral mononeuropathy limited to recurrent laryngeal nerves. Equine Veterinary Journal. 40 (7), 666-672 (2008).
- Orlic, D., et al. marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410 (6829), 701-705 (2001).
- Kopen, G. C., Prockop, D. J., Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Science. 96 (19), 10711-10716 (1999).
- Dezawa, M., Takahashi, I., Esaki, M., Takano, M., Sawada, H. Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone marrow stromal cells. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1771-1776 (2001).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39 (3), 229-236 (2002).
- Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth. Journal of Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).
- Sanchez-Ramos, J., et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology. 164 (2), 247-256 (2000).
- Farzamfar, S., et al. Sciatic nerve regeneration by transplantation of menstrual blood-derived stem cells. Molecular Biology Reports. 44 (5), 407-412 (2017).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Brini, A. T., et al. Therapeutic effect of human adipose-derived stem cells and their secretome in experimental diabetic pain. Scientific Reports. 7 (1), 9904(2017).
- Liu, W., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Stem Cells for Treating Diabetic Neuropathy in Metabolic Syndrome. Biomed Research International. 2017, 8945310(2017).
Przedruki i uprawnienia
