Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

DOI:

10.3791/58024

⸱

29 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute, 2Department of Biology, University of Ottawa

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio) (Danio rerio) posiada ortologi dla 84% genów, o których wiadomo, że są związane z chorobami ludzkimi. Ponadto zwierzęta te mają krótki czas pokoleniowy, są łatwe w obsłudze, wykazują wysoki wskaźnik reprodukcji, niski koszt i są łatwo podatne na manipulacje genetyczne poprzez mikroiniekcję DNA do zarodków. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie narzędzi do edycji genów umożliwiają precyzyjne wprowadzanie mutacji i transgenów u danio pręgowanego. Modelowanie chorób u danio pręgowanego często prowadzi do fenotypów larw i przedwczesnej śmierci, co może być trudne do zinterpretowania, jeśli genotypy są nieznane. Ta wczesna identyfikacja genotypów jest również potrzebna w eksperymentach wymagających łączenia próbek, takich jak badania ekspresji genów lub spektrometrii mas. Jednak szeroko zakrojone badania przesiewowe genotypu są ograniczone tradycyjnymi metodami, które w większości laboratoriów wykonuje się tylko na dorosłych danio pręgowanych lub larwach pośmiertnych. Rozwiązaliśmy ten problem, dostosowując metodę izolacji genomowego DNA gotowego do PCR z żywych larw danio pręgowanego, co można osiągnąć już po 72 godzinach od zapłodnienia (hpf). Ta efektywna czasowo i kosztowo technika, ulepszona w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu genotypowania, umożliwia identyfikację genotypów na podstawie mikroskopowych biopsji płetw. Płetwy szybko się regenerują w miarę rozwoju larw. Naukowcy są następnie w stanie wybrać i wyhodować pożądane genotypy do dorosłości, wykorzystując tę wysokoprzepustową procedurę genotypowania opartą na PCR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio (Danio rerio) to organizm kręgowców szeroko stosowany jako model do badania chorób, jak również do przedklinicznych testów hipotez terapeutycznych1,2,3. Zwierzęta te mają krótki czas generacji, są łatwe w obsłudze, wykazują wysoki wskaźnik reprodukcji, niski koszt i są łatwo podatne na manipulacje genetyczne poprzez mikroiniekcję DNA do zarodków4. Poprzez rosnący rozwój nowatorskich technologii transgenicznych i edycji genów, takich jak nukleazy palców cynkowych (ZFN)5, NAL podobne do efektorów (TALENs)6,7, oraz system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9 (Cas9) system8, danio pręgowany ma szansę znacznie poprawić zrozumienie kilku stanów patologicznych. Technologie te zostały wykorzystane do stworzenia ukierunkowanych nokautów zarówno w komórkach somatycznych, jak i rozrodczych u danio pręgowanego, skutecznie rozmnażając genetycznie zmodyfikowane zwierzęta8. Najnowsze przykłady w literaturze obejmują pomyślny rozwój modeli genetycznych padaczki i zaburzeń metabolicznych u danio pręgowanego3,9,10,11,12.

Dzięki postępowi w edycji genomu danio pręgowanego, szybkie i niezawodne genotypowanie stało się niezaprzeczalnym krokiem ograniczającym szybkość. Identyfikacja specyficznych mutacji DNA sąsiadujących z przewidywanym miejscem docelowym edycji genomu jest niezbędnym etapem protokołu. Tradycyjnie, techniki genotypowania poprzez obcinanie płetw są zwykle wykonywane tylko u młodych lub dorosłych danio pręgowanego. Jednak czas spędzony na hodowli danio pręgowanego do dorosłości (>2 miesiące) znacznie opóźnia postęp w badaniach. W wielu przypadkach dorosłość nie może zostać osiągnięta z powodu nokautu niezbędnych genów (np. w modelowaniu choroby) lub mutacji związanych ze wzmocnieniem funkcji, co prowadzi do szkodliwych skutków fenotypowych. Ponadto niektóre testy wymagają łączenia larw, takich jak ekstrakcja RNA lub metabolitów, a zatem wymagają wcześniejszej identyfikacji genotypów, co może być trudne, gdy dostępne są tylko techniki genotypowania post hoc. Powyższe przykłady podkreślają znaczenie technik genotypowania larw, które są jednocześnie precyzyjne i umożliwiają pełną regenerację i prawidłowy rozwój larw. Genotypowanie danio pręgowanego we wczesnym stadium nie wydaje się być obecnie szeroko stosowane; Znajduje to odzwierciedlenie w ostatnich publikacjach modeli chorób, w których genotypy larw są identyfikowane za pomocą genotypowania pośmiertnego, a nie genotypowania przed wykonaniem eksperymentu12,13,14. W artykule przedstawiono strategię obcinania płetw larw, mającą na celu ulepszenie wcześniej ustalonych procedur genotypowania.

W przeszłości strategie wykorzystujące trawienie proteinazy K do genotypowania żywych larw danio pręgowanego prowadziły do zmiennej wydajności reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)15. Chociaż niedawno opublikowana technika mikroskopowej biopsji ogona dostarczyła bardziej obiecujących wyników16, my i inne grupy nie byliśmy w stanie odtworzyć wysokiej wydajności i odzyskiwania DNA zgłoszonego przez autorów. Poważnym niepowodzeniem protokołu opisanego przez Wilkinsona i wsp.16 może być transferem tkanki ogona do probówki PCR. Ze względu na mikroskopijne rozmiary trudno jest upewnić się, że płetwa została prawidłowo pobrana i dozowana przez pipetowanie. Aby rozwiązać tę barierę, opracowaliśmy ulepszony protokół genotypowania dużej liczby żywych larw danio pręgowanego z prawie 100% skutecznością9. Za pomocą mikroskalpela usuwa się końcówkę ogona płetwy i umieszcza na kawałku bibuły filtracyjnej. Kawałek bibuły filtracyjnej zawierający tkankę można łatwo zobrazować i prawidłowo umieścić w probówce PCR. Następnie przeprowadza się ekstrakcję genomowego DNA, a następnie amplifikację PCR regionu będącego przedmiotem zainteresowania w celu genotypowania próbki. Do zalet tej metody należy wysoka skuteczność PCR, niski odsetek wyników fałszywie dodatnich i niska śmiertelność. Dodatkowo przy użyciu tego protokołu możliwe jest genotypowanie dużej liczby zarodków. Opisany tu protokół pozwala na obcinanie płetw setkom larw w ciągu 2 - 3 godzin przy użyciu tego podejścia oraz prawidłową identyfikację zgenotypowanych ryb i regenerację ogona w ciągu dwóch dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone i są zgodne z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami dostarczonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami i komitety ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie.

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj powierzchnię preparacyjną, przyklejając 9-centymetrową pokrywkę szalki Petriego taśmą autoklawową do jej wewnętrznej powierzchni. Umieść go pod mikroskopem stereoskopowym.
  2. Umieścić 3 - 5 dni po zapłodnieniu (dpf) larwy danio pręgowanego na szalce Petriego i znieczulić w ̃1,5 mM trikainy w 1x pożywce zarodkowej E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, pH 7,2).
  3. Odetnij koniec końcówki pipety P1000 nożyczkami lub żyletką do średnicy 2 mm, aby pomieścić larwę o natężeniu 3 dpf przy minimalnym naprężeniu.

2. Obcinanie płetw larw danio pręgowanego

  1. Pobrać znieczuloną larwę za pomocą zmodyfikowanej mikropipety P1000 i umieścić larwę danio pręgowanego na umieszczonej taśmie autoklawu na pokrywie szalki Petriego.
  2. Usunąć nadmiar roztworu trikainy otaczającego larwę za pomocą mikropipety. Obszar powinien być tak suchy, jak to możliwe, aby z powodzeniem przeciąć i podnieść płetwę, ale nadal mokry, aby zapewnić przetrwanie.
  3. Za pomocą mikroskalpela przeciąć płetwę ogonową pod mikroskopem stereoskopowym, jak wskazano w Rysunek 1, zgodnie z opisem w Wilkinson et al16. Podczas nacięcia należy wywierać stały nacisk w dół w miejscu przerwy pigmentowej płetwy ogonowej, dystalnie do granicy krążenia krwi (Rysunek 1A). Delikatnie dociśnij, aby uniknąć uszkodzenia struny grzbietowej.
  4. Wizualizuj podzieloną na sekcje płetwę pod mikroskopem i umieść element na czubku ostrza mikroskalpela (Rysunek 2A). Umieść mikroskalpel zawierający płetwę na powierzchni małego kawałka bibuły filtracyjnej.
    UWAGA: Ze względu na obecność melanocytów w przeciętej tkance, ten krok umożliwia wizualizację płetwy jako małej czarnej plamki (Rysunek 2B).
  5. Za pomocą nożyczek i pęsety (Rysunek 2C) przenieś bibułę filtracyjną zawierającą płetwę na 96-dołkową płytkę PCR, zawierającą 25 μl 50 mM roztworu NaOH na studzienkę (Rysunek 2D).
  6. Przygotuj 96-dołkową płytkę z płaskim dnem, numerując studzienkę zgodnie z etykietą płytki do PCR. Używając zmodyfikowanej pipety P1000 wypełnionej 200 μl świeżej pożywki 1x E3 z zarodków, ostrożnie zebrać larwy danio pręgowanego, delikatnie uciskając. Dozuj larwę do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, w tym samym numerze dołka, co płytka PCR (Rysunek 2E).
  7. Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest dobrze zanurzona w roztworze ( Rysunek 2F). Wyczyść ostrze mikroscapelu i pęsetę między każdym cięciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu, zanurzając je w 70% roztworze EtOH. Wytrzyj ostrze czystą chusteczką papierową/chusteczką.
  8. Powtarzaj kroki 2.1 - 2.7, aż wszystkie zarodki zostaną przycięte.
  9. Larwy należy przechowywać na 96-dołkowej płytce w temperaturze 28 °C do czasu zidentyfikowania genotypów.
    UWAGA: Pożywka zarodkowa nie musi być zmieniana, ponieważ protokół można łatwo wykonać w czasie krótszym niż 2 dni. Jeśli potrzeba więcej czasu, zalecana jest wymiana nośnika.

3. Ekstrakcja genomowego DNA

  1. Uszczelnij 96-dołkową płytkę PCR i odwiruj próbki przy 1 000 x g przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie bibuły filtracyjne są zanurzone w roztworze NaOH.
  2. W celu lizy tkanek należy podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie schładzać do 4 °C przez 10 minut.
  3. Do każdej próbki dodać 6 μl 500 mM Tris-HCl, pH 8,0. Wir.
  4. Krótko odwirować płytkę o sile 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Użyć 1,5 μl supernatantu DNA na reakcję PCR.
  6. Przygotować PCR w celu genotypu larw, jak pokazano w tabeli 1-2.
    UWAGA: Ten protokół został przetestowany pod kątem dwóch zastosowań: multipleksowych reakcji PCR ujawniających genotyp przy użyciu żeli agarozowych9, oraz testu topnienia heterodupleksu (HMA) ujawniającego genotypy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE)17.

4. Alternatywna ekstrakcja genomowa przy użyciu żywicy chelatującej

  1. Wykonaj krok 2.5, dodając bibułę filtracyjną z przyciętą płetwą do 96-dołkowej płytki PCR, zawierającej 30 μl 5% żywicy chelatującej (kopolimer styren-diwinylobenzen zawierający sparowane jony iminodioctanu).
    UWAGA: Ten rodzaj żywicy jest powszechnie stosowany do lizy tkanek i przygotowania DNA gotowego do PCR w szybki i skuteczny sposób18.
  2. Wykonaj kroki 2.6 - 2.8, jak wskazano
    3. .
  3. Zamknij 96-dołkową płytkę do PCR i krótko odwiruj próbki, aby upewnić się, że cała bibuła filtracyjna jest zanurzona w żywicy chelatującej.
  4. W celu lizy tkanek podgrzewać próbki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 15 minut, a następnie schładzać do 4 °C przez 10 minut
    UWAGA: Ten etap umożliwia lizę, a następnie wiązanie kulek żywicy polarnej ze składnikami komórkowymi, podczas gdy DNA i RNA pozostają w roztworze.
  5. Krótko odwirować próbki, aby osadzać kulki żywicy i uzyskać DNA w zawiesinie.
  6. Wykonaj kroki 3.5 - 3.6, aby zakończyć procedurę genotypowania.

5. Aplikacja 1: Multiplex PCR, a następnie analiza żelu agarozowego

  1. Postępując zgodnie z Tabelą 1, ustaw reakcję multipleksową PCR, aby umożliwić rozróżnienie między homozygotycznymi mutantami, heterozygotami i larwami WT. Użyj 96-dołkowego termocyklera do przeprowadzenia reakcji PCR w warunkach cyklicznych opisanych w tabeli 3.
    UWAGA: Reakcje PCR można również przeprowadzić w dowolnym innym konwencjonalnym termocyklerze PCR. Ten przykład opisuje strategię PCR stosowaną przez Penę i wsp.9 do identyfikacji zmutowanych alleli insercji aldh7a1 WT i 5-bp w tej samej reakcji multipleksowej.
  2. Przygotować 1% żel agarozowy w buforze boranu sodu, zabarwiony 1x GelRed.
    UWAGA: 20x buz boranu sodu składa się z 40 ml 10 M NaOH, 1800 ml ddH2O, pH dostosowanego do 8,5 za pomocą 76 g kwasu borowego, a następnie uzupełnionego do 2 l końcowej objętości za pomocą ddH2O.
  3. Uruchom żel w 1x buforze boranu sodu na 15 minut przy 250 V. Aby ułatwić proces, jeśli to możliwe, należy użyć systemu żelowego, który jest kompatybilny z pipetami wielokanałowymi, aby zapewnić większą przepustowość poprzez skrócenie czasu ładowania próbek.
  4. Zobrazuj żel w świetle ultrafioletowym (UV), aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów.

6. Aplikacja 2: Test topnienia heterodupleksu

  1. Przygotuj żele PAGE 12% za pomocą płytki dystansowej 1,5 mm i grzebieni na 15 próbek. Przygotuj dwa żele PAGE przy użyciu 12,21 ml ddH2O, 2,52 ml 10x Tris/Boran/EDTA (TBE), 10 ml 30% akrylamidu, 250 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS) i 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Użyj 1x bufor TBE (0,089 M Tris-HCl, 0,089 M kwas borowy i 0,002 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) jako bufor bieżący.
  2. Podgrzewać produkty PCR w temperaturze 94 °C przez 5 minut.
  3. Schłodzić probówki na lodzie lub w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Załadować 10 μl na próbkę PCR i 8 μl markera masy cząsteczkowej.
  5. Uruchom PAGE przy napięciu 150 V w 1x TBE za pomocą pionowego systemu elektroforezy przez 1 godzinę lub do momentu, gdy znacznik masy cząsteczkowej prawie dotrze do linii stopy szklanej płytki.
  6. Zobrazuj żel w świetle UV, aby umożliwić rozróżnienie różnych genotypów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność protokołu została zademonstrowana poprzez genotypowanie potomstwa heterozygotycznej krzyżówki (aldh7a1+/ot100, tutaj pokazane jako aldh7a1+/-) (Rysunek 3A-C)9. Zmutowany allel aldh7a1ot100 ma insercję 5 par zasad (bp) w pierwszym eksonie kodującym genu danio pręgowanego aldh7a1, co prowadzi do przesunięcia ramki i utraty f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich lat narzędzia do edycji genów zostały wykorzystane do precyzyjnego wprowadzania mutacji i transgenów u danio pręgowanego 5,6,7,8. Podczas modelowania chorób u danio pręgowanego często obserwuje się wczesne fenotypy larwalne lub młodociane 9,12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Sieci Modeli i Mechanizmów Chorób Rzadkich (RDMM) (finansowanej przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Genome Canada). CK jest wspierany przez stypendium UROP (University of Ottawa). DLJ jest wspierany przez stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship. IAP jest wspierany przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) w ramach stypendium podoktorskiego. Autorzy dziękują Amerykańskiemu Towarzystwu Genetycznemu za udzielenie zgody na publikację tego protokołu i wykorzystanie adaptacji rysunku uzupełniającego 5 z Pena i wsp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
szalka PetriegoCorning430167
MicroscalpelWorld Precyzyjne instrumenty500249
mikroskop stereoskopowyNikonSMZ1500
3-aminobenzoesan trikainy/etylu metanosulfonianSigma-AldrichE10521
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowejCostar3595
96-dołkowa PCR płytaFisher14230232
NaOHFisherS25548A 
Baza Tris Sigma-AldrichT1503
NaClFisherBP358-10
KClSigma-AldrichP3911
MgSO4Sigma-Aldrich230391
5% forma sodowa Chelex 100Sigma-AldrichC7901
GelRed 1xBiotium41003
Kwas borowySigma-AldrichB6768
System Sub-Cell Model 192Bio-Rad 
30 % roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1Bio-Rad 
GoTaq Green Master Mix, 2XPromegaM7123
(chusteczki jednorazowe Kimwipes®)Sigma-AldrichZ188956
1kb-plus marker masy cząsteczkowej Thermo ScientificSM1343
Woda wolna od nukleaz System Sigma-AldrichW4502
Sub-Cell Model 192 (wysokoprzepustowy system żelu agarozowego)Bio-Rad 
pionowy system elektroforezy żelowej Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 
17045081610158 chusteczki papierowe 17045081658004

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
  2. Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
  3. Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
  4. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115(2009).
  5. Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
  6. Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  7. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
  8. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  9. Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genetics. 207, 1501-1518 (2017).
  10. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410(2013).
  11. Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
  12. Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
  13. Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
  14. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
  15. Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
  16. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  17. Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420(2014).
  18. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
  19. Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok genotypowaniawysokoprzepustowe PCRlizy wodorotlenkiem soduekstrakcja ywic chelatuj cwielokrotny test PCRelektroforeza w elu agarozowymanaliza w elu poliakrylamidowym

Powiązane artykuły