Method Article

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

DOI:

10.3791/58027

⸱

September 5th, 2018

 ,  ,  , 
1RIKEN Brain Science Institute, 2Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora nowa ssaków składa się z wielu typów neuronów pobudzających i hamujących, z których każdy ma specyficzne właściwości elektrofizjologiczne i biochemiczne, połączenia synaptyczne i funkcje in vivo, ale ich podstawowa funkcjonalna i anatomiczna organizacja od skali komórkowej do sieciowej jest słabo poznana. Tutaj opisujemy metodę trójwymiarowego obrazowania neuronów znakowanych fluorescencyjnie na dużych obszarach mózgu w celu zbadania organizacji komórkowej kory mózgowej. Określone typy neuronów są znakowane przez wstrzyknięcie fluorescencyjnych wstecznych znaczników neuronalnych lub ekspresję białek fluorescencyjnych u myszy transgenicznych. Blokowe próbki mózgu, np. półkuli, są przygotowywane po utrwaleniu, stają się przezroczyste za pomocą metod oczyszczania tkanek i poddawane fluorescencyjnemu znakowaniu immunologicznemu określonych typów komórek. Duże obszary są skanowane za pomocą mikroskopów konfokalnych lub dwufotonowych wyposażonych w obiektywy o dużej odległości roboczej i zmotoryzowane stoliki. Ta metoda może rozwiązać okresową organizację modułów funkcjonalnych mikrokolumn specyficznych dla typu komórki w korze nowej myszy. Procedura może być przydatna do badania trójwymiarowej architektury komórkowej w różnych obszarach mózgu i innych złożonych tkankach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kora nowa ssaków składa się z dużej liczby typów komórek, z których każda ma specyficzne wzorce ekspresji genów, właściwości elektrofizjologiczne i biochemiczne, połączenia synaptyczne i funkcje in vivo1,2,3,4,5,6,7. Nie jest jasne, czy te typy komórek są zorganizowane w powtarzające się struktury. Kolumny korowe, w tym kolumny orientacji wzrokowej i beczki somatosensoryczne, mają powtarzające się struktury, ale ich organizacja komórkowa pozostaje niejasna8,9. Są one obecne w określonych obszarach kory mózgowej i nie są systemem obejmującym cały mózg.

W warstwie 5 kory nowej, zdecydowana większość neuronów jest podzielona na cztery główne typy. Główny typ neuronów pobudzających, neurony projekcyjne podmózgowe, rzutuje aksony na cele podkorowe, w tym most, rdzeń kręgowy i wzgórek górny, a zatem reprezentuje główną korową ścieżkę wyjściową10. Neurony projekcyjne kory, inny główny typ neuronów pobudzających, unerwiają korę10. Neurony hamujące zawierają również dwie główne klasy: komórki wyrażające parwalbuminę i komórki wyrażające somatostatynę11.

Ostatnie analizy wskazują, że cztery typy komórek są zorganizowane w powtarzające się struktury12,13,14. Zarówno neurony projekcyjne podmózgowe12,13,14 i neurony projekcyjne kory mózgowej14 organizują się w mikrokolumny specyficzne dla typu komórki o średnicy 1–2 komórek. Komórki wyrażające parwalbuminę i somatostatynę wyrównują się specyficznie z mikrokolumnami neuronów projekcyjnych podmózgowych, ale nie z mikrokolumnami neuronów projekcyjnych kory mózgowej14. Same mikrokolumny okresowo wyrównują się, tworząc sześciokątną siatkową tablicę14 i są obecne w wielu obszarach korowych, w tym wzrokowych, somatosensorycznych i motorycznych w mózgu myszy12,14 oraz w obszarach językowych ludzkiego mózgu13. Neurony w pojedynczej mikrokolumnie wykazują zsynchronizowaną aktywność i mają podobne reakcje sensoryczne14. Obserwacje te wskazują, że typy komórek warstwy 5 organizują się w strukturę siatki mikrokolumnowej, reprezentującą pierwszą znaną organizację powtarzających się modułów funkcjonalnych w całym mózgu.

Mikrokolumny mają promień około 10 μm i okresowość przestrzenną około 40 μm. Ponadto orientacja mikrokolumn jest równoległa do ich dendrytów wierzchołkowych i zmienia się w zależności od ich położenia w korze mózgowej14. W związku z tym układ mikrokolumn jest trudny do analizy przy użyciu konwencjonalnych wycinków korowych o typowej grubości kilkudziesięciu mikrometrów. Ponadto analiza okresowości wymaga trójwymiarowych danych z szerokiego zakresu obszarów mózgu, a zatem typowy obszar obrazowania mikroskopii konfokalnej lub obrazowania 2-fotonowego in vivo jest zbyt wąski.

Ostatnio opracowano techniki usuwania grubych tkanek15,16. W tym miejscu opisujemy zastosowanie tych metod do uzyskania wielkoskalowych, trójwymiarowych obrazów głównych typów komórek w warstwie 5 kory nowej myszy, które składają się na system mikrokolumn. Podmózgowe neurony projekcyjne są znakowane przez etykietowanie wsteczne lub przez ekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji u myszy transgenicznych Crym-egfp12, a neurony projekcyjne kory są znakowane albo przez etykietowanie wsteczne, albo przez ekspresję tdTomato u myszy Tlx3-cre / Ai9<sup class="xref">17. Komórki wyrażające parwalbuminę i somatostatynę są znakowane przez immunohistochemię. Metoda AbScale (Antibody Scale S) 18 jest używana do eksperymentów z barwieniem przeciwciał, podczas gdy metoda (See Deep Brain) SeeDB19 jest używana do innych eksperymentów. Metody te przezwyciężają wyżej wymienione trudności konwencjonalnych metod obrazowania i ujawniają dokładną organizację komórkową warstwy 514.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach RIKEN Wako oraz Komitet Bezpieczeństwa Eksperymentów Genetycznych Rekombinowanych RIKEN i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi obiektów dla zwierząt Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN.

1. Przygotowanie komór obrazowania

  1. Komora obrazowania19
    1. Za pomocą arkuszy kauczuku silikonowego przygotuj komorę o grubości około 5 mm oraz płyty podłogowe o różnej grubości. Przygotuj również szalki Petriego z dnem szklanym i bez niego (Rysunek 1A).
  2. Przekładka do plastrów
    1. Przygotuj przekładki do przechowywania próbek, używając arkuszy gumy silikonowej o grubości 0,5 mm (Rysunek 1C).

2. Wstrzyknięcie znacznika

UWAGA: Zrób zastrzyki do mostu (2.1) lub górnego wzgórka (2.2). Wstrzyknięcie do mostu oznacza neurony projekcyjne podmózgowe w szerokim obszarze mózgu, w tym w obszarze wzrokowym i motorycznym, podczas gdy wstrzyknięcie do górnego wzgórka oznacza neurony projekcyjne podmózgowe w obszarze wzrokowym. W eksperymentach kontrolnych wstrzyknąć sól fizjologiczną zamiast znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny. Do utrzymania stanu sterylnego należy używać wysterylizowanego sprzętu i plastikowych rękawiczek oczyszczonych etanolem.

  1. Wykonaj zastrzyki do mostu dorosłych myszy.
    1. Pobierz 1 μl znakowanej fluorescencyjnie podjednostki B toksyny (25 μg/μL w PBS) do strzykawki Hamiltona 26G.
    2. Umieścić pompę wtryskową na strzykawce.
    3. Umieść strzykawkę i pompę na uchwycie narzędziowym manipulatora umieszczonego na przyrządzie stereotaktycznym. Przechylić manipulator o 12° do tyłu od osi pionowej.
    4. Znieczulenie dorosłej myszy płci męskiej lub żeńskiej (C57BL/6J lub Tlx3-cre/Ai9) należy wstrzyknąć dootrzewnowo pentobarbital sodu (60 mg/kg masy ciała) lub podać izofluran (2–3%). Poczekaj, aż mysz nie zareaguje, gdy jej ogon zostanie ściśnięty kleszczami, co oznacza, że mysz jest w pełni znieczulona.
    5. Umieść mysz na instrumencie stereotaktycznym.
    6. Ostrożnie usuń włosy za pomocą żyletki, aby zapobiec infekcji i przyciąć 10 mm skóry głowy, aby widoczna była bregma i lambda. Podawać 0,1 ml 1% lidokainy za pomocą pipety. Ustaw kąt nachylenia główki, regulując pionową pozycję ustnika na instrumencie stereotaktycznym tak, aby bregma i lambda miały ten sam poziom z.
    7. Dostosuj położenie manipulatora, przesuwając go po przyrządzie stereotaktycznym tak, aby końcówka strzykawki znajdowała się blisko bregmy i zapisz pozycję manipulatora. Wycofać strzykawkę, przesuwając uchwyt narzędziowy na manipulatorze.
    8. Przesuń manipulator o 5.4 mm do tyłu i 0.4 mm na boki. Przesunąć strzykawkę tak, aby końcówka znajdowała się blisko punktu wejścia na czaszce. Wycofać strzykawkę i zaznaczyć punkt wejścia.
    9. W zaznaczonym miejscu wywierć otwór o średnicy około 1 mm.
    10. Włożyć końcówkę strzykawki przez otwór tak, aby głębokość końcówki była o 6,9 mm większa niż zmierzona na bregmie.
    11. Wstrzyknąć 1 μl znaczników za pomocą pompy w tempie 0,2 μl/min.
    12. Wyjąć strzykawkę z mózgu.
    13. W razie potrzeby przykryj odsłonięty mózg małymi fragmentami hemostatu mikrofibrylarnego i klejem błyskawicznym.
    14. Opłucz odsłonięty mózg solą fizjologiczną dostarczaną pipetą, aby zapobiec infekcji i zszyć skórę głowy.
    15. Wyjmij mysz z instrumentu stereotaktycznego. Pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu w inkubatorze w temperaturze 30 °C, zwykle przez 1 godzinę. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Przywróć mysz do towarzystwa innych zwierząt, gdy w pełni wyzdrowieje.
    16. Utrzymuj mysz przez 3–7 dni.
  2. Wykonaj zastrzyki do górnego wzgórka dorosłych myszy.
    1. Przygotuj szklaną pipetę o średnicy końcówki 30–50 μm.
    2. Podłącz szklaną pipetę do strzykawki Hamilton przez plastikową rurkę (Rysunek 2A).
    3. Napełnij szklaną pipetę, plastikową rurkę i strzykawkę Hamilton płynem parafinowym.
    4. Umieścić pompę wtryskową na strzykawce.
    5. Umieść szklaną pipetę na manipulatorze i przechyl manipulator o 60° do tyłu od osi pionowej (Rysunek 2B).
    6. Wykonać czynności 2.1.4–2.1.9. Położenie manipulatora wynosi 1,4 mm z tyłu, 0,5 mm z boku do lambdy.
    7. Umieść małą plastikową folię parafinową na czaszce, a następnie nałóż na nią około 1 μl roztworu znacznikowego. Szybko przesunąć szklaną pipetę i napełnić ją co najmniej 0,5 μl roztworu znacznikowego.
    8. Włóż szklaną pipetę tak, aby głębokość końcówki wynosiła 3,0 mm od powierzchni mózgu.
    9. Wstrzyknąć 0,5 μl znaczników za pomocą pompy z prędkością 0,2 μl/min.
    10. Wyjmij szklaną pipetę z mózgu.
    11. Wykonaj czynności 2.1.13–2.1.16.

3. Utrwalanie i przycinanie

  1. Wstrzykiwać pentobarbital sodu (60 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo myszom (C57BL/6J lub Tlx3-cre/Ai9, z wstrzyknięciem znacznika lub bez, jak opisano w kroku 2. Poczekaj, aż mysz nie zareaguje, gdy jej ogon zostanie ściśnięty kleszczami, co oznacza, że mysz jest w pełni znieczulona.
  2. Poddaj mysz eutanazji w sposób humanitarny, poddając ją transcardially20 0,9% soli fizjologicznej.
  3. Napraw mouse20 poprzez perfuzję 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,5).
  4. Wytnij skórę głowy za pomocą nożyczek, aby odsłonić czaszkę zgodnie z opisem20.
    1. Wytnij linię środkową odsłoniętej czaszki za pomocą nożyczek. Usuń czaszkę za pomocą kleszczy.
    2. Jeśli konieczne jest zaznaczenie pozycji bregmy i lambdy, najpierw usuń jedną półkulę czaszki. Włóż cienkie igły wolframowe do mózgu w miejscach bregmy i lambdy na czaszce pozostałej na mózgu, a następnie usuń pozostałą czaszkę.
      UWAGA: Mózg może być przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C.
  5. Aby przeprowadzić barwienie przeciwciałami neuronów hamujących, pokrój próbki mózgu na plasterki.
    1. Umieść próbkę mózgu na wibratomie.
    2. Pokrój plastry o grubości do 500 μm w PBS w temperaturze pokojowej i przejdź do kroku 5 (metoda AbScale).
  6. Jeśli barwienie przeciwciałami nie jest konieczne, przytnij próbkę mózgu do bloków (o grubości do 3 mm) za pomocą żyletki (Rysunek 3) i przejdź do kroku 4 (metoda SeeDB).
    UWAGA: Mózg może być przechowywany w PBS w temperaturze 4 °C po ścięciu lub przycięciu. Metoda SeeDB jest preferowana, gdy barwienie przeciwciałami nie jest konieczne, ponieważ wymaga mniej czasu niż metoda AbScale.

4. Czyszczenie bez barwienia przeciwciałami (metoda SeeDB)

  1. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 20% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  2. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 40% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 60% (m/v) fruktozy i inkubować przez 4 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 80% (m/v) fruktozy i inkubować przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 100% (m/v) fruktozy i inkubować przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieść próbkę za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml 0,5% α-tioglicerolu i 80,2% (m/m) fruktozy i inkubować przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Z próbką należy obchodzić się ostrożnie, aby deformacje były jak najmniejsze. Nie należy inkubować próbek dłużej niż wskazano, ponieważ próbki mogą szybko stać się nieprzezroczyste.
  7. Osadź próbkę w komorze obrazowania wypełnionej 80,2% roztworem fruktozy (Rysunek 1B). W razie potrzeby utrwal próbkę, umieszczając wokół nią małe kawałki kleju kauczukowego. Jeśli komora jest zbyt głęboka, przed umieszczeniem próbek należy umieścić w niej płytę podłogową.
  8. Umieścić szalkę Petriego ze szklaną pokrywą na komorze obrazowania i wlać wodę do naczynia, a następnie zobrazować za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem o dużej odległości roboczej zanurzonym w wodzie. Długości fal wzbudzenia i filtry emisyjne opisano w tabeli 1. W razie potrzeby użyj zmotoryzowanego stolika.

5. Oczyszczanie za pomocą barwienia przeciwciałami (metoda AbScale)

  1. Przygotować odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 2.
  2. Przenieść plastry za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 5 ml zawierającej 4 ml roztworu Sca/eS0 i inkubować je przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C (Rysunek 4B).
  3. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eA2 i inkubować plastry przez 36 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  4. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eB4 i inkubować plastry przez 24 godziny, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  5. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eA2 i inkubować plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  6. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml PBS i inkubować plastry przez 6 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  7. Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą szpatułki.
  8. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (Tabela 3) w 1 ml roztworu AbScale przez 48-72 godzin w temperaturze 37 °C (Rysunek 4C) delikatnie wstrząsając.
  9. Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 5 ml za pomocą szpatułki.
  10. Inkubować w 4 ml roztworu AbScale przez 2 godziny 2 razy w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  11. Ostrożnie wyjmij plastry do plastikowej probówki o pojemności 2 ml za pomocą szpatułki.
  12. Inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela materiałów, 1:100) w 1 ml roztworu AbScale przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
  13. Ostrożnie wyjąć plastry za pomocą szpatułki do plastikowej probówki o pojemności 5 ml zawierającej 4 ml roztworu AbScale i inkubować plastry przez 6 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  14. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu AbScale i inkubować plastry przez 2 godziny 2 razy, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  15. Wyjmij roztwór z probówki za pomocą pipety i dodaj 4 ml 4% PFA i inkubuj plastry przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  16. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml PBS i inkubować plastry przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  17. Wyjąć roztwór z probówki za pomocą pipety i dodać 4 ml roztworu Sca/eS4 i inkubować plastry przez 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C.
  18. Umieść przekładkę na szkiełku podstawowym i umieść plastry w ramce dystansowej, a następnie zanurz plastry w roztworze Sca/eS4. Uszczelnij przekładkę szkłem nakrywkowym (Rysunek 1D).
  19. Nałóż wodę na szkło nakrywkowe i obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej lub dwufotonowej z obiektywem o dużej odległości roboczej zanurzonym w wodzie. W razie potrzeby użyj zmotoryzowanego stolika.
    UWAGA: Sprawdź, czy głębokie części próbki są oznaczone podobnie jak części powierzchowne, aby potwierdzić brak znaczącego odchylenia etykietowania.
    UWAGA: Przenikanie badanych przeciwciał opisano w tabeli 3.

6. Określanie pozycji komórki

  1. Dla każdej pozycji na zeskanowanych obrazach oblicz wartości korelacji za pomocą trójwymiarowego filtra obrazu14 (Rysunek 5A-5D).
  2. Określ położenie pików wartości korelacji (Rysunek 5D).
  3. Zbadaj obrazy wokół szczytów, aby zlokalizować komórki (Rysunek 5E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oznaczyliśmy neurony projekcyjne kory mózgowej przez ekspresję tdTomato u transgenicznych myszy Tlx3-cre/Ai9 i zobrazowaliśmy neurony projekcyjne podmózgowe, wstrzykując znacznik wsteczny CTB488 do mostu. Lewa półkula mózgu została poddana metodzie SeeDB i zeskanowana za pomocą mikroskopu dwufotonowego wyposażonego w zanurzeniowy w wodzie obiektyw o dużej odległości roboczej (25X, N.A. 1,1, odległość robocza 2 mm) oraz zmotoryzowany stolik. Uzyskano stos 401 obrazów (512...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy procedury uzyskiwania wielkoskalowych trójwymiarowych obrazów specyficznej dla typu komórki organizacji głównych typów komórek w warstwie 5 kory nowej myszy. W porównaniu z konwencjonalnym barwieniem plastrów, metoda ta jest bardziej przydatna w określaniu trójwymiarowej organizacji kory nowej. Metoda ta umożliwia pozyskiwanie obrazu z szerszych i głębszych obszarów mózgu w porównaniu z typową mikroskopią 2-fotonową in vivo lub konwencjonalną mikroskopią konfokalną, a tym samym może pozwolić na k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Atsushi Miyawaki i Hiroshi Hama za ich rady dotyczące eksperymentów AbScale, Charlesowi Yokoyamie za redakcję manuskryptu, Eriko Ohshimie i Miyuki Kishino za ich pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez fundusze badawcze z RIKEN dla T.H. oraz granty na badania naukowe z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii dla T.H. (Innowacyjne Obszary "Mezoskopowe Obwody Nerwowe"; 22115004) i S.S. (25890023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Myszy transgeniczne Crym-egfpMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre myszy transgeniczneMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdMyszy pomidoroweJackson LaboratoryJAX #7909
Arkusz gumy silikonowejAS ONE6-611-01o grubości 0,5 mm
Arkusz gumy silikonowejAS ONE6-611-02o grubości 1,0 mm
Arkusz kauczuku silikonowegoAS ONE6-611-05o grubości 3,0 mm
Szalki PetriegoFalcon351008
Toksyna podjednostka B (rekombinowana), koniugat Alexa Fluor 488InvitrogenC22841
Toksyna podjednostka B (rekombinowana), Alexa Fluor 555 koniugatInvitrogenC22843
Toksyna podjednostka B (rekombinowana), Alexa Fluor 594 koniugatInvitrogenC22842
Podjednostka B toksyny (rekombinowana), Alexa Fluor 647 koniugatInvitrogenC34778
26 G Strzykawka Hamilton701N
Pompa wtryskowaKD ScientificKDS 310Pons wtrysk
Pompa wtryskowaKD ScientificKDS 100Superior manipulator do wstrzykiwań colliculus
NarishigeSM-15
Pentobarbital soduKyoritsu SeiyakuSomnopentyl
IsofluranePfizer
LidocaineAstraZenecaXylocaine iniekcja 1% z epinefryną
WiertłoToyo AssociatesHP-200
Avitene microfibrillar hemostatDavol Inc1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
Jedwab chirurgicznyInkubator EthiconK881H
UVPHB-1000 Hybrydyzator
Szklana pipetaDrummond Scientific Company2-000-075
Ściągacz elektrodSutter Instrument CompanyP-97
Parafina w płynie, lekkaNacalai tesque26132-35
SalineOtsuka1326
ParaformaldehydNacalai tesque26126-54
Igła wolframowaInter medicalΦ 0,1 * L200 mm
VibratomeLeicaVT1000S
50 ml plastikowa rurkaFalcon352070
&alfa;-tioglicerolNacalai tesque33709-62
D(-) FruktozaNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
Mikroskop dwufotonowyNikonA1RMP
Zanurzenie w wodzie Obiektywy o dużym zasięgu roboczymNikonCFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Zanurzone w wodzie obiektywy o dużej odległości roboczejNikonCFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Stopień z napędemCOMSPT100C-50XY
FiltrSemrockFF01-492/SP-25
FiltrSemrockFF03-525/50-25
FiltrSemrockFF03-575/25-25
FiltrSemrockFF01-629/56
FiltrChromaD605/55m
5 mL plastikowa tubkaAS ONEVIO-5B
2 mL plastikowa tubkaEppendorf 
MocznikNacalai tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D(-)-sorbitolWako191-14735
Metylo-β-cyklodekstrynaTokio przemysł chemicznyM1356
γ- CyklodekstrynaWako037-10643
N-acetylo-L-hydroksyprolinaSkin Essential Actives33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
Albumina surowicy bydlęcejSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1,1 g / mL)Nacalai tesque35624-15
Kozia anty-mysia IgG (H + L) Adsorbowana krzyżowo wtórna Przeciwciało, Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L), Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) wysoce adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
Przeciwciało drugorzędowe anty-królikowe IgG (H+L) o wysokim stopniu adsorbcji krzyżowej, Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000
Zanurzenie w wodzie Obiektywy o dużej odległości roboczejOlympusXLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Anty-ParwalbuminaSigmaP3088
Anty-ParwalbuminaAbcamab11427
Laboratoria PółwyspuAnty-SomatostatynowegoT-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38
Szkło nakrywkowe Matsunami C022241 0030120094

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462(2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
  5. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
  6. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  7. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  8. Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
  9. Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
  10. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
  11. Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
  12. Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
  13. Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
  14. Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  15. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
  16. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
  17. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  18. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  19. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  21. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  22. Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  23. Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  25. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  26. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  27. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three dimensional ImagingMouse NeocortexFluorescent LabelingTissue ClearingConfocal MicroscopyTwo photon MicroscopyRetrograde TracersTransgenic MiceImmunolabelingMicrocolumn Organization

Related Articles