Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego. Zapewniają one wiele korzyści eksperymentalnych, takich jak dostęp do wielu metod obrazowania, technik elektrofizjologicznych i testów behawioralnych. Układ węchowy kijanki Xenopus jest szczególnie dobrze przystosowany do badania funkcji synaps powstałych podczas normalnego rozwoju lub zreformowanych po urazie. W tym miejscu opisujemy metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus. Przedstawiamy połączenie pomiarów in vivo presynaptycznych odpowiedzi wapniowych w kłębuszkach nerkowych opuszki węchowej z testami zachowania sterowanymi węchem. Metody można łączyć z przecięciem nerwów węchowych w celu zbadania ponownego okablowania połączeń synaptycznych. Eksperymenty przedstawiono na zwierzętach zarówno typu dzikiego, jak i modyfikowanych genetycznie wykazujących ekspresję reporterów GFP w komórkach ośrodkowego układu nerwowego. Zastosowanie opisanych podejść do genetycznie zmodyfikowanych kijanek może być przydatne do rozwikłania zasad molekularnych, które definiują zachowanie kręgowców.
Wprowadzenie
Kijanki Xenopus stanowią doskonały model zwierzęcy do badania normalnej funkcji układu nerwowego. Przezroczystość, w pełni zsekwencjonowany genom1,2, oraz dostępność do technik chirurgicznych, elektrofizjologicznych i obrazowania to unikalne właściwości larw Xenopus, które pozwalają badać funkcje neuronalne in vivo3. Niektóre z wielu możliwości eksperymentalnych tego modelu zwierzęcego są zilustrowane przez dokładne badania przeprowadzone na systemach sensorycznych i motorycznych kijanki4,5,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki badań nad zwierzętami na Uniwersytecie w Barcelonie.
UWAGA: Kijanki X. tropicalis i X. laevis są hodowane zgodnie ze standardowymi metodami13,14. Wodę dla kijanek przygotowuje się poprzez dodanie soli komercyjnych (patrz Tabela materiałów) do wody uzyskanej metodą odwróconej osmozy. Przewodność jest dostosowana do poziomu odpowiednio ∼700 µS dla kijanek X. tropicalis oraz ∼1,400 µS dla kijanek X. laevis. Larwy można uzyskać drogą naturalnego kojarzenia l....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy przedstawiamy połączenie dwóch komplementarnych podejść do badania in vivo funkcjonalności układu węchowego kijanek Xenopus: i) metody obrazowania zmian presynaptycznego stężenia Ca2+ w kłębuszkach żywych kijanek przy użyciu fluorescencyjnego wskaźnika wapnia oraz ii) behawioralnego testu sterowanego zapachami, który może być wykorzystany do zbadania reakcji na konkretne wodne substancje zapachowe. Ponieważ podejścia te zostały zastosowane d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano techniki, które są przydatne do badania funkcjonalności szlaków węchowych u żyjących kijanek Xenopus. Obecny protokół jest szczególnie przydatny dla tych laboratoriów, które pracują lub mają dostęp do Xenopus; Jest to jednak również interesujące dla tych badaczy, którzy badają komórkowe i molekularne podstawy regeneracji i naprawy neuronów. Wyniki uzyskane w ramach projektu Xenopus można połączyć z danymi zebranymi w innych modelach kręgowców w celu zidentyfikowania zachowany.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty od El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) współfinansowane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR), konkurencyjne nagrody badawcze z M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura and Arthur Colwin Endowed Summer Research Fellowship Fund, Fischbach Fellowship oraz Great Generation Fund of the Marine Biological Laboratory i National Xenopus Resource RRID: SCR_013731 (Woods Hole, MA), gdzie przeprowadzono część tych prac. Dziękujemy również programowi CERCA / Generalitat de Catalunya za wsparcie instytucjonalne. A.L. jest stypendystą Serra Húnter.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sole do akwariów (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu) | Pęseta Sigma-Aldrich | E10521 | |
| #5 (końcówka 0,025 x 0,005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Nożyczki (końcówka 0,015 x 0,015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman jakościowa bibuła filtracyjna | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | Europejskie Centrum Zasobów Xenopus (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Dekstran Calcium Green, sól potasowa, 10 000 MW, Anionowe | borokrzemianowe ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| do mikroiniekcji | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1,0 mm., ID=0,75 mm. |
| Ściągacz | Sutter Instrument | P-97 | |
| Mikrowtryskiwacz | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Mikropipety World | Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Mikroskop pionowy | Stymulator Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 | A.M.P.I. | ||
| Kamera CCD | Hamamatsu | Image EM | |
| Zawory elektromagnetyczne | Warner Instruments | VC-6 System sześciokanałowy | |
| Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Chlorowodorek tubokuraryny | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| Kamera CCD | Zeiss | MRC-5 Kamera | sterowana przez Zen oprogramowanie |
| obiektywu aparatu | Thorlabs | MVL8ML3 | Istnieje wiele możliwości, które należy dostosować do zastosowanego modelu kamery |
| Żywica epoksydowa | RS Komponenty | ||
| Kolektor | perfuzyjny | Warner Instruments | |
| Mikromanipulator do lokalnego dostarczania roztworów | Narishige | MN-153 | |
| Mini zaciski magnetyczne | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Rurka polietylenowa | Warner Instruments | 64-0755 | OD=1,57 mm., ID = 1,14 mm. |
Bibliografia
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
