Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58028

⸱

11 grudnia 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurobiology, Neuroscience Program, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), L'Hospitalet de Llobregat, 2Department of Pathology and Experimental Therapy, School of Medicine, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 3Institute of Neurosciences, University of Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego in vivo. Opisano metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus w normalnych warunkach chowu lub po urazie.

Streszczenie

Kijanki Xenopus oferują unikalną platformę do badania funkcji układu nerwowego. Zapewniają one wiele korzyści eksperymentalnych, takich jak dostęp do wielu metod obrazowania, technik elektrofizjologicznych i testów behawioralnych. Układ węchowy kijanki Xenopus jest szczególnie dobrze przystosowany do badania funkcji synaps powstałych podczas normalnego rozwoju lub zreformowanych po urazie. W tym miejscu opisujemy metodologie oceny przetwarzania informacji węchowych u żywych larw Xenopus. Przedstawiamy połączenie pomiarów in vivo presynaptycznych odpowiedzi wapniowych w kłębuszkach nerkowych opuszki węchowej z testami zachowania sterowanymi węchem. Metody można łączyć z przecięciem nerwów węchowych w celu zbadania ponownego okablowania połączeń synaptycznych. Eksperymenty przedstawiono na zwierzętach zarówno typu dzikiego, jak i modyfikowanych genetycznie wykazujących ekspresję reporterów GFP w komórkach ośrodkowego układu nerwowego. Zastosowanie opisanych podejść do genetycznie zmodyfikowanych kijanek może być przydatne do rozwikłania zasad molekularnych, które definiują zachowanie kręgowców.

Wprowadzenie

Kijanki Xenopus stanowią doskonały model zwierzęcy do badania normalnej funkcji układu nerwowego. Przezroczystość, w pełni zsekwencjonowany genom1,2, oraz dostępność do technik chirurgicznych, elektrofizjologicznych i obrazowania to unikalne właściwości larw Xenopus, które pozwalają badać funkcje neuronalne in vivo3. Niektóre z wielu możliwości eksperymentalnych tego modelu zwierzęcego są zilustrowane przez dokładne badania przeprowadzone na systemach sensorycznych i motorycznych kijanki4,5,6. Szczególnie dobrze nadającym się obwodem neuronalnym do badania wielu aspektów przetwarzania informacji na poziomie synaps jest system węchowy kijanki Xenopus7. Po pierwsze, jego łączność synaptyczna jest dobrze zdefiniowana: neurony receptorów węchowych (ORN) rzutują na opuszkę węchową i nawiązują kontakty synaptyczne z dendrytami komórek mitralnych / kępkowych w kłębuszkach nerkowych w celu wygenerowania map zapachowych. Po drugie, jego ORN są stale generowane przez neurogenezę przez całe życie, aby utrzymać funkcjonalność szlaków węchowych8. I po trzecie, ponieważ układ węchowy wykazuje duże zdolności regeneracyjne, kijanki Xenopus są w stanie całkowicie zreformować swoją opuszkę węchową po ablacji9.

W tym artykule opisujemy podejścia łączące obrazowanie kłębuszków węchowych u żywych kijanek z eksperymentami behawioralnymi w celu zbadania funkcjonalności szlaków węchowych. Opisane tutaj metody zostały wykorzystane do zbadania funkcjonalnego odzyskiwania połączenia kłębuszkowego w opuszce węchowej po transsekcji nerwu węchowego10. Dane uzyskane w kijankach Xenopus są reprezentatywne dla kręgowców, ponieważ przetwarzanie węchowe jest ewolucyjnie zachowane.

Opisane metody są zilustrowane przy użyciu X. tropicalis, ale można je łatwo zaimplementować w X. Laevis. Pomimo większych rozmiarów dorosłego osobnika X. laevis, oba gatunki są niezwykle podobne w stadiach kijanki. Główne różnice występują na poziomie genomu. X. laevis wykazuje słabą podatność genetyczną, determinowaną głównie przez genom allotetraploidalny i długi czas generacji (około 1 roku). Natomiast X. tropicalis jest bardziej podatny na modyfikacje genetyczne ze względu na krótszy czas generacji (5-8 miesięcy) i diploidalny genom. Reprezentatywne doświadczenia zilustrowano dla zwierząt typu dzikiego i trzech różnych linii transgenicznych: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) i tubb2:GFP (X. laevis).

Metodologie przedstawione w obecnej pracy powinny być brane pod uwagę równolegle z postępem genetycznym w dziedzinie Xenopus. Prostota i łatwa implementacja przedstawionych technik sprawia, że są one szczególnie przydatne do oceny już opisanych mutantów11, a także linii Xenopus generowanych przez technologię CRISPR-Cas912. Opisujemy również zabieg chirurgiczny stosowany do transektu nerwów węchowych, który może być wdrożony w każdym laboratorium mającym dostęp do kijanek Xenopus. Podejścia stosowane do oceny presynaptycznych odpowiedzi wapniowych i zachowań sterowanych węchem wymagają specjalnego sprzętu, aczkolwiek dostępnego po umiarkowanych kosztach. Metodologie są przedstawione w prostej formie, aby promować ich stosowanie w grupach badawczych i mogą stanowić podstawę dla bardziej złożonych testów poprzez wdrażanie ulepszeń lub powiązanie z innymi technikami, tj. podejściami histologicznymi lub genetycznymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki badań nad zwierzętami na Uniwersytecie w Barcelonie.

UWAGA: Kijanki X. tropicalis i X. laevis są hodowane zgodnie ze standardowymi metodami13,14. Wodę dla kijanek przygotowuje się poprzez dodanie soli komercyjnych (patrz Tabela materiałów) do wody uzyskanej metodą odwróconej osmozy. Przewodność jest dostosowana do poziomu odpowiednio ∼700 µS dla kijanek X. tropicalis oraz ∼1,400 µS dla kijanek X. laevis. Larwy można uzyskać drogą naturalnego kojarzenia lub poprzez zapłodnienie in vitro14. Embriony są oczyszczane z galaretki za pomocą 2% L-cysteiny przygotowanej w 0,1x roztworze Marc's Modified Ringers (MMR). 1x MMR zawiera (w mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0,1 EDTA, pH 7,8. Po 2–3 dniach (stadium 25) larwy przenosi się do zbiorników o pojemności 2 L z wodą dla kijanek. Gdy kijanki osiągną stadium 40 według kryteriów Nieuwkoop-Faber (NF)15, są umieszczane w zbiornikach 5 L i utrzymywane w zagęszczeniu 10 zwierząt/L. Temperaturę utrzymuje się na stałym poziomie odpowiednio 23–25 °C dla kijanek X. tropicalis oraz 18–20 °C dla kijanek X. laevis. Do eksperymentów wykorzystuje się zwierzęta znajdujące się w stadiach 48–52 według kryteriów NF.

1. Przecięcie nerwów węchowych

  1. Przygotować roztwór znieczulający 0,02% MS-222 w 50 mL wody dla kijanek w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować mały zbiornik (1–2 L) z wodą dla kijanek, aby umożliwić regenerację zwierząt po zabiegu.
  3. Wyciąć prostokątne kawałki jakościowego papieru filtrującego z celulozy (4 cm x 3 cm, patrz Tabela materiałów).
  4. Namoczyć 2 kawałki jakościowego papieru filtrującego z celulozy w 0,02% roztworze MS-222 i umieścić je pod stereomikroskopem.
  5. Wybrać kijankę ze zbiornika i zanurzyć ją w roztworze znieczulającym. Zwierzę przestaje pływać w ciągu 2–4 min i nie reaguje na bodźce mechaniczne przykładane pęsetą na poziomie ogona.
  6. Umieścić znieczuloną kijankę na prostokątnych kawałkach papieru filtrującego. Ułożyć zwierzę grzbietem do góry, aby struktury mózgu były widoczne.
    1. Za pomocą nożyczek typu vanna (patrz Tabela materiałów) przeciąć jeden lub oba nerwy węchowe (w zależności od rodzaju prowadzonego testu). Przeciąć pojedynczy nerw w eksperymentach wymagających wewnętrznej kontroli uszkodzenia nerwu.
    2. W eksperymentach behawioralnych przeciąć oba nerwy, aby zablokować wszystkie informacje o zapachach docierające do opuszki węchowej. Efektywność przecięcia nerwów węchowych można łatwo zaobserwować pod stereomikroskopem; jednak pigmentacja lub pozycja zwierzęcia mogą być czynnikami ograniczającymi.
      UWAGA: (Opcjonalnie) Najlepszym sposobem potwierdzenia poprawności procedury jest użycie transgenicznych kijanek wykazujących ekspresję reporterów fluorescencyjnych w układzie nerwowym (patrz reprezentatywne wyniki). W tym celu konieczne jest użycie stereomikroskopu wyposażonego w fluorescencję (Rysunek 1). Jeśli dostępne są tylko zwierzęta typu dzikiego, można zastosować znakowanie CM-diI. Należy postępować zgodnie z protokołem 2 (patrz poniżej), aby wstrzyknąć do torebki nosowej roztwór CM-diI o stężeniu 0,5 mg/mL przygotowany w 0,3 M sacharozie. Szczegóły dotyczące przygotowania i przechowywania CM-diI znajdują się w pozycji 16. Należy zminimalizować wyciek barwnika poza główną jamą. W tym celu konieczna jest modyfikacja ciśnienia wtrysku oraz otworu mikropipet. Fluorescencja na poziomie warstwy kłębuszkowej opuszki węchowej staje się widoczna 24 h po aplikacji CM-diI. W niniejszej pracy znakowanie CM-diI służy wyłącznie potwierdzeniu procedury przecięcia; metoda ta może być jednak również wykorzystana do uzyskania informacji morfologicznych o kłębuszkach węchowych przy użyciu konwencjonalnych procedur histologicznych.
  7. Przenieść zwierzęta do zbiornika regeneracyjnego. Kijanki powinny odzyskać normalną zdolność pływania w ciągu ~10 min. Przeprowadzić dokładną inspekcję pod kątem występowania krwotoków, które spodziewane są u ~1% zwierząt poddanych zabiegowi.
  8. Uśmiercić uszkodzone zwierzęta w 0,2% roztworze MS-222.

2. Znakowanie neuronów receptorowych węchowych fluorescencyjnymi wskaźnikami wapnia

  1. Przygotować roztwór zawierający 12% Calcium Green-1-dextran (patrz Tabela materiałów), 0,1% Triton X-100 oraz 1 mM NaCl17. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C lub -80 °C, jeśli nie zostanie on zużyty w ciągu miesiąca.
  2. Przygotować szklane pipety z otworami końcowymi o średnicy ~1–2 µm (średnica zbliżona do mikroelektrod stosowanych w eksperymentach patch-clamp) do mikroiniekcji, używając wyciągarki do mikropipet (patrz Tabela materiałów).
  3. Zkalibrować objętość mikroiniekcji. Używając wody destylowanej, dostosować ciśnienie i czas iniekcji w celu uzyskania objętości wstrzykiwania rzędu 0,15–0,3 µL.
    UWAGA: Prosta procedura polega na zliczeniu liczby impulsów wymaganych do opróżnienia pipety wypełnionej 1 µL wody. Typowe parametry to ciśnienie 30 psi i czas iniekcji 50 ms.
  4. Umieścić pipetę w mikroinjektorze i napełnić ją ~2 µL roztworem calcium green-1 dextran.
  5. Przygotować kijankę zgodnie z krokami od 1.1 do 1.6.
  6. Wprowadzić końcówkę pipety do głównej jamie torebki nosowej.
    UWAGA: Patrz Rycina 2A przedstawiająca lokalizację dróg węchowych u kijanki Xenopus.
  7. Korzystając z ustawień uzyskanych w punkcie 2.3, podać kilka krótkich dawek. Ograniczyć obecność barwnika do obszaru torebki nosowej.
  8. Pozostawić kijankę do odpoczynku na 2–3 min. Używając pipety Pasteura, wylać krople 0,02% roztworu MS-222 na bardziej kaudalne części zwierzęcia, aby zapobiec wysychaniu.
  9. Przenieść zwierzę do zbiornika regeneracyjnego.
    UWAGA: Normalne pływanie powinno zostać przywrócone w ciągu ~10 min. Manipulacje ze zwierzętami mogą spowodować obrażenia.
  10. Uśmiercić kijanki, które nie odzyskały normalnego zachowania pływackiego 15 min po iniekcji, używając 0,2% roztworu MS-222.
  11. Obserwować fluorescencję na poziomie warstwy kłębuszkowej opuszki węchowej w dniu następującym po iniekcji.

3. Przygotowanie kijanek do obrazowania na żywo odpowiedzi presynaptycznych

  1. Na 24–48 h przed przeprowadzeniem eksperymentu należy pokryć elastomerem silikonowym (np. Sylgard) 4–6 szalek Petriego o średnicy 35 mm. Po spolimeryzowaniu elastomeru należy wykonać prostokątny otwór dopasowany do kijanki.
    UWAGA: Typowe wymiary dla X. tropicalis Kijanki w stadiach NF 48–52 mają wymiary 10 mm x 4 mm.
  2. Przygotuj 100 ml 160 µM 1 mM roztwór aminokwasów służący jako bodziec zapachowy dla kijanek. Roztwór może zawierać mieszaninę kilku aminokwasów: metioniny, leucyny, histydyny, argininy i lizyny. Rozcieńczyć aminokwasy w Xenopus roztwór Ringera, składający się z (w mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl22, 2 MgCl22, 10 glukozy, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Należy upewnić się, że pH utrzymuje się na poziomie 7,8.
  3. Napełnij podniesiony zbiornik 20 ml roztworu aminokwasów. Połącz zbiornik za pomocą rurki polietylenowej z kapilarą o rozmiarze 28 G (patrz Tabela materiałów) umieszczone powyżej torebki nosowej.
    UWAGA: Kapilara jest zamocowana na mikromanipulatorze (patrz Tabela materiałów). W układzie perfuzyjnym nie mogą znajdować się pęcherzyki powietrza.
  4. Precyzję czasową podczas aplikacji roztworu aminokwasów uzyskuje się dzięki sterowaniu zaworami zaciskowymi elektromagnetycznymi za pomocą logiki tranzystor-tranzystor (TTL) (patrz Tabela materiałów). Do generowania impulsów TTL wykorzystuje się stymulator (patrz Tabela materiałów). Sprawdzić precyzję czasową podawania roztworu substancji zapachowej poprzez zmianę czasu trwania impulsów TTL, t.j.., 0,1 do 1 s.
  5. Napełnij kolejny zbiornik podniesiony 100 ml Xenopus Roztwór Ringera.
  6. Zanurz kijankę w środku znieczulającym i umieść ją pod stereomikroskopem (kroki od 1.1 do 1.6).
  7. Przygotuj kijankę do obrazowania. Jeśli dostępne są kijanki albinosy, przejdź do kroku 3.9; w przeciwnym razie usuń skórę nad opuszka węchową, ponieważ zawiera ona melanocyty, które utrudniają obrazowanie (krok 3.8).
    UWAGA: Istnieją dwa sposoby przeprowadzenia eksperymentu, w zależności od pigmentacji zwierzęcia. Zaleca się stosowanie zwierząt albinosów. Szczepy albinosów są dostępne dla X. laevis i albinos X. tropicalis linie zostały niedawno wygenerowane za pomocą CRISPR-Cas9 12 lub TALEN-y18.
  8. Za pomocą nożyc Vannasa należy wykonać nacięcie boczne skóry kijanki na brzegu ośrodkowego układu nerwowego. Nacięcie powinno zostać wykonane na poziomie opuszki węchowej i nie może sięgać obszaru tekton, który można łatwo zidentyfikować po położeniu nerwu wzrokowego.
  9. Chwyć pęsetą naciętą skórę i odciągnij ją znad układu nerwowego. Prawidłowość usunięcia potwierdź brakiem melanocytów nad opuszkiem węchowym. Utrzymuj wilgotność tkanek zwierzęcia, zakraplając roztwór MS-222 o stężeniu 0,02% za pomocą pipety Pasteura.
  10. Umieść kijankę w dołku powlekłej szalki (patrz Tabela materiałów). Umieścić szklaną lamkę pokrywkową pokrytą smarem wysokopróżniowym nad zwierzęciem. Ustawić lamkę tak, aby zakrywała obszar od górnej części tectum do końca ogona.
  11. Należy upewnić się, że opuszka węchowa i placody pozostają wystawione na działanie medium zewnątrzkomórkowego. Podczas obrazowania należy utrzymać kijanka w bezruchu. Napełnić szalkę Petriego za pomocą Xenopus roztwór Ringera zawierający 100 µM tubokuraryna (patrz Tabela materiałów) aby zapobiec skurczom mięśni.
    UWAGA: Tubokurarinę przechowuje się w alikwotach w temperaturze -80 °C nie dłużej niż 6 miesięcy.
  12. Umieść naczynie z kijanką pod mikroskopem pionowym. Podłącz zbiornik zawierający Xenopus roztwór Ringera do naczynia za pomocą rurki polietylenowej (patrz Tabela materiałów) do ciągłej perfuzji Xenopus roztwór Ringera w celu podtrzymania życia zwierzęcia przez >1 h
    UWAGA: Miniaturowe zaciski magnetyczne (patrz Tabela materiałów) są bardzo użyteczne do stabilnego połączenia rurek z szalką. Rurki perfuzyjne i ssące muszą znajdować się w ~180° kąt
  13. Rozpocząć perfuzję Xenopus Roztwór Ringera. Przez cały czas trwania eksperymentu należy utrzymywać stały poziom roztworu w naczyniu. Żywotność kijanek należy stale oceniać poprzez obserwację krążenia krwi w naczyniach.

4. Obrazowanie na żywo zmian stężenia Ca2+ w zakończeniach presynaptycznych w kłębuszkach węchowych

UWAGA: Procedura obrazowania została opisana dla mikroskopii szerokopolowej, ale można ją łatwo dostosować do mikroskopu konfokalnego poprzez zmianę ustawień akwizycji. Obrazowanie należy przeprowadzać przy użyciu mikroskopu pionowego zamontowanego na stole antywibracyjnym.

  1. Obserwuj kijankę przy użyciu obiektywu o małym powiększeniu, na przykład 5x.
  2. Przesuń osie mikromanipulatora tak, aby kapilara podająca roztwór substancji zapachowej znalazła się nad jedną z torebek nosowych, tworząc 90° kąt względem nerwu węchowego. Należy unikać przepływu roztworu substancji zapachowej nad opuszkiem węchowym, ponieważ może to spowodować turbulencje zakłócające obrazowanie.
  3. Za pomocą obiektywu imersyjnego w wodzie o dużym powiększeniu i długim odstępie roboczym (60x, 0,9 N.A.) zlokalizuj opuszki węchowe znajdujące się po stronie ipsilateralnej względem torebki nosowej (podlegającej stymulacji).
  4. Sprawdzić wzrokowo emisję fluorescencji. Struktury kłębuszkowe powinny być wyraźne (Rycina 2B).
  5. Przeprowadź akwizycję na żywo przy użyciu kamery odpowiedniej do obrazowania wapnia. Zdefiniuj obszar zawierający całą opolchową cebulkę, zazwyczaj o wymiarach 256 x 256 lub 512 x 512 pikseli. Ustaw częstotliwość próbkowania obrazu na 20–40 Hz. Dostosuj wzmocnienie tak, aby wartości fluorescencji bazowej stanowiły ok. 20% nasycenia. Nagraj 5-sekundowe wideo.
  6. Przejrzyj film. Sprawdź ostrość obrazu, brak artefaktów ruchowych oraz obszary zawierające nasycone piksele. Typowe wartości fluorescencji w obrębie kłębuszków powinny wynosić od 5 000 do 20 000 j.a. w przypadku zastosowania kamery 16-bitowej. Jeśli warunki obrazowania są optymalne, przejdź do następnego kroku. W razie potrzeby powtórz krok 4.6, aby poprawić jakość obrazu lub dostosować ustawienia wzmocnienia.
  7. Uruchom akwizycję time-lapse, aby zarejestrować odpowiedzi wywołane bodźcami węchowymi.
    UWAGA: Precyzyjne podawanie roztworu substancji zapachowej jest kontrolowane za pomocą stymulacji TTL. Typowy eksperyment obejmuje 4 s okresu bazowego, po którym następują czasy stymulacji w zakresie od 0,1 do 0,5 s oraz okres regeneracji trwający od 6 do 10 s.
  8. Wykonaj powtarzalne stymulacje substancjami zapachowymi w określonych odstępach czasu >2 min. Ustawić szybkość przepływu na 1–1,5 mL·min⁻¹-1Ponieważ podczas wszystkich eksperymentów prowadzona jest perfuzja globalna, miejscowo podane aminokwasy są wypłukiwane.
    UWAGA: Objętość roztworu w naczyniu wynosi ok. 3 mL.
  9. Analiza obrazu
    1. Wykrywanie odpowiedzi
      1. Eksportuj filmy do programu ImageJ.
        UWAGA: Celem jest wykrycie obecności obszarów kłębuszkowych reagujących na bodźce.
      2. Przekształć surową sekwencję obrazów fluorescencyjnych na ΔF/F0 film. Pomiar względnych zmian fluorescencji podstawowej zgodnie z następującą zależnością: (F-F0)/F0, gdzie F0 oznacza podstawowy poziom fluorescencji.
      3. Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) wokół regionów wykazujących domniemany wzrost fluorescencji podczas stymulacji i zapisz ich pozycje w menedżerze ROI (Rysunek 2E). Wyznacz obszar zainteresowania (ROI), aby zmierzyć poziom fluorescencji tła w obszarze pozbawionym struktur kłębuszkowych.
    2. Ilościowe określenie odpowiedzi.
      1. Wyznacz obszary zainteresowania (ROI) na surowej sekwencji obrazów fluorescencyjnych. Oblicz średnią wartość szarości dla wybranych obszarów ROI dla każdej klatki. Przenieś uzyskaną sekwencję wartości do programu analitycznego (np.., Igor Pro).
      2. Odejmij fluorescencję tła, a następnie oblicz ΔF/F0 zmiany dla każdego ROI (Rycina 2F). Wykreśl przyrosty ΔF/F0 dla każdego z wybranych obszarów zainteresowania (ROI). Oblicz odchylenie standardowe bazowego ΔF/F0 (przed stymulacją).
        UWAGA: Za odpowiedź pozytywną uznaje się wzrost wartości ΔF/F0 uzyskane podczas stymulacji są większe niż dwa odchylenia standardowe wartości bazalnych.

5. Test zachowania kierowanego węchem

UWAGA: Schematyczny rysunek układu do przeprowadzenia analizy przedstawiono na Rysunku 3.

  1. W górnej części każdego dołka płytki 6-dołkowej wykonaj małe otwory dopasowane do rurek o średnicy zewnętrznej 1,57 mm i średnicy wewnętrznej 1,14 mm. Włóż rurki i uszczelnij je za pomocą kleju epoksydowego (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Modyfikowana płytka może być wielokrotnie wykorzystana po dokładnym przemyciu wodą destylowaną.
  2. Przygotuj 50 mL roztworu aminokwasów zawierającego metioninę, leucynę, histydynę, argininę i lizynę (szczegóły w kroku 3.2). Stężenia mogą wynosić od 160 µM do 1 mM. Umieść 20 mL roztworu w podniesionym zbiorniku.
  3. Nie karm kijanek przez co najmniej 12 h przed badaniem. Pobierz 6 kijanek z akwarium hodowlanego i umieść je w 2 L czystej wody dla kijanek, aby zminimalizować ekspozycję na substancje zapachowe.
  4. Umieść zmodyfikowaną płytkę 6-dołkową na białym transiluminatorze LED (Rysunek 3).
  5. Połącz wloty perfuzyjne ze zbiornikiem zawierającym roztwór aminokwasów za pomocą rozdzielacza (patrz Tabela materiałów). Sprawdź system perfuzji i usuń pęcherzyki powietrza. Napełnij 6 dołków jednocześnie. Dostosuj wysokość zbiornika tak, aby umożliwić podanie ≥5 mL roztworu zapachowego w czasie ok. 30 s.
    UWAGA: Po ekspozycji na roztwór zapachowy przemyj każdy dołek 4 razy wodą dwukrotnie destylowaną.
  6. Napełnij każdy dołek 10 mL wody dla kijanek. Umieść 1 kijankę na dołek. Pozostaw do odpoczynku przez >3 min.
  7. Skonfiguruj akwizycję obrazu. Użyj konwencjonalnej kamery CCD, która może rejestrować obrazy z częstotliwością ≥5 Hz. Podłącz kamerę do komputera. W tym przypadku użyto kamery Zeiss MRC5 sterowanej oprogramowaniem Zen, ale można zastosować inne równoważne konfiguracje. Jeśli konieczne jest zwiększenie liczby klatek na sekundę, zastosuj binning pikseli. Obrazy powinny obejmować całą płytkę 6-dołkową.
  8. Rozpocznij akwizycję obrazu w taki sposób, aby nagrania zawierały okres bazowy (30 s), okres stymulacji (25–35 s) oraz okres regeneracji (30–60 s).
  9. Po obrazowaniu przenieś zwierzęta z płytki 6-dołkowej z powrotem do akwariów.
  10. Przeanalizuj nagrania w programie ImageJ, korzystając z wtyczek takich jak wrMTrck19,20, które dostarczają wiele parametrów związanych z motylością.
  11. Aby przygotować obrazy do analizy, najpierw wybierz dołek, rysując prostokątny obszar ROI o wymiarach 35 mm x 35 mm (Rysunek 4A). Uzyskaj obraz tła, obliczając maksymalną projekcję całej sekwencji. Powinien on przedstawiać obraz dołka bez kijanki.
  12. Odejmij maksymalną projekcję od surowego nagrania. Przeprowadź progowanie wygenerowanego filmu 32-bitowego i zastosuj wtyczkę wrMTrck. Dostosuj parametry WrMTrck, aby niezawodnie śledzić ruchy zwierząt. Przenieś uzyskane współrzędne X,Y do programu analitycznego.
  13. Wykorzystując współrzędne X-Y, oblicz odległość euklidesową do źródła zapachu (wlotu perfuzyjnego w dołku), stosując następujące równanie:
    Równanie wzoru na odległość, obliczanie odległości euklidesowej na schemacie matematycznym.
    gdzie os oznacza pozycję źródła zapachu, a tad pozycję kijanki w danym czasie. Szczegóły znajdują się na Rysunku 4A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy połączenie dwóch komplementarnych podejść do badania in vivo funkcjonalności układu węchowego kijanek Xenopus: i) metody obrazowania zmian presynaptycznego stężenia Ca2+ w kłębuszkach żywych kijanek przy użyciu fluorescencyjnego wskaźnika wapnia oraz ii) behawioralnego testu sterowanego zapachami, który może być wykorzystany do zbadania reakcji na konkretne wodne substancje zapachowe. Ponieważ podejścia te zostały zastosowane d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano techniki, które są przydatne do badania funkcjonalności szlaków węchowych u żyjących kijanek Xenopus. Obecny protokół jest szczególnie przydatny dla tych laboratoriów, które pracują lub mają dostęp do Xenopus; Jest to jednak również interesujące dla tych badaczy, którzy badają komórkowe i molekularne podstawy regeneracji i naprawy neuronów. Wyniki uzyskane w ramach projektu Xenopus można połączyć z danymi zebranymi w innych modelach kręgowców w celu zidentyfikowania zachowany...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty od El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) współfinansowane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (EFRR), konkurencyjne nagrody badawcze z M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura and Arthur Colwin Endowed Summer Research Fellowship Fund, Fischbach Fellowship oraz Great Generation Fund of the Marine Biological Laboratory i National Xenopus Resource RRID: SCR_013731 (Woods Hole, MA), gdzie przeprowadzono część tych prac. Dziękujemy również programowi CERCA / Generalitat de Catalunya za wsparcie instytucjonalne. A.L. jest stypendystą Serra Húnter.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sole do akwariów (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)Pęseta Sigma-AldrichE10521
#5 (końcówka 0,025 x 0,005 mm)World Precision Instruments501985
Vannas Nożyczki (końcówka 0,015 x 0,015)World Precision Instruments501778
Whatman jakościowa bibuła filtracyjnaFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPEuropejskie Centrum Zasobów Xenopus (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Dekstran Calcium Green, sól potasowa, 10 000 MW, Anionoweborokrzemianowe ThermoFisher ScientificC-3713
do mikroiniekcjiSutter InstrumentB100-75-10O.D.=1,0 mm., ID=0,75 mm.
ŚciągaczSutter InstrumentP-97
MikrowtryskiwaczParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Mikropipety WorldPrecision InstrumentsMF28G-5
Mikroskop pionowyStymulator ZeissAxioImager-A1
Master-8A.M.P.I.
Kamera CCDHamamatsuImage EM
Zawory elektromagnetyczneWarner InstrumentsVC-6 System sześciokanałowy
GreaseVWR Scientific636082B
Chlorowodorek tubokurarynySigma-AldrichT2379
Kamera CCDZeissMRC-5 Kamerasterowana przez Zen oprogramowanie
obiektywu aparatuThorlabsMVL8ML3Istnieje wiele możliwości, które należy dostosować do zastosowanego modelu kamery
Żywica epoksydowaRS Komponenty
KolektorperfuzyjnyWarner Instruments
Mikromanipulator do lokalnego dostarczania roztworówNarishigeMN-153
Mini zaciski magnetyczneWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Rurka polietylenowaWarner Instruments64-0755OD=1,57 mm., ID = 1,14 mm.
kapilary Dow Corning High Vacuum MP-6

Bibliografia

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  4. Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
  5. Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
  6. Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
  7. Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
  8. Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
  9. Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
  10. Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
  11. Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91(2006).
  12. Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  13. Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
  16. Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
  17. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  18. Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
  19. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321(2015).
  21. Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
  22. Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
  23. Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
  24. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
  25. Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14(2016).
  26. Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
  27. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
  28. Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
  29. McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
  30. Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
  31. Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
  32. Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
  33. Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
  34. Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie in vivoopolcha cebulowaobrazowanie wapniatesty behawioralneprzerwanie nerwureportery GFPreorganizacja synaptycznabodźce aminokwasowe
Ocena funkcjonalna szlaków węchowych u żyjących kijanek ksenopusa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.