Artykuł metodologiczny

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/58034

⸱

16 sierpnia 2018

 ,  , 
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery, Houston Methodist Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Barierą dla naszego zrozumienia, w jaki sposób różne typy komórek i sygnały przyczyniają się do funkcjonowania obwodów synaptycznych, jest brak odpowiednich modeli do badania ludzkiego mózgu. Jedną z pojawiających się technologii mających na celu rozwiązanie tego problemu jest wykorzystanie trójwymiarowych (3D) hodowli komórek nerwowych, zwanych "organoidami" lub "sferoidami", w celu długoterminowego zachowania interakcji międzykomórkowych, w tym cząsteczek adhezyjnych zewnątrzkomórkowych. Jednak te systemy hodowli są czasochłonne i nie są generowane systematycznie. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę szybkiego i konsekwentnego wytwarzania kokultur 3D neuronów i astrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po pierwsze, wstępnie zróżnicowane astrocyty i progenitory neuronów są dysocjowane i zliczane. Następnie komórki są łączone w naczyniach tworzących kule z inhibitorem kinazy Rho i w określonych proporcjach, aby wytworzyć kule o powtarzalnych rozmiarach. Po kilku tygodniach hodowli jako unoszące się kule, kokultury ("asteroidy") są ostatecznie dzielone na sekcje w celu barwienia immunologicznego lub posiewane na matrycach wieloelektrodowych w celu zmierzenia gęstości i siły synaptycznej. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że ten protokół przyniesie sfery neuronowe 3D, które wyświetlają markery ograniczone do dojrzałych typów komórek, tworzą funkcjonalne synapsy i wykazują spontaniczną aktywność impulsów sieci synaptycznej. Łącznie system ten umożliwia badania przesiewowe leków i badania mechanizmów choroby w bardziej odpowiednim modelu w porównaniu z hodowlami jednowarstwowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocyty to bardzo liczny typ komórek glejowych w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) z różnorodnymi funkcjonalnymi obowiązkami poza wsparciem strukturalnym. Poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników synaptogennych i składników macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), astrocyty pomagają w tworzeniu i grupowaniu dojrzałych synaps podczas rozwoju1. Odgrywają również kluczową rolę w utrzymaniu zdrowia i plastyczności synaps poprzez sygnalizację zewnątrzkomórkową2,3,4,5 i przyczyniają się do długoterminowej stabilności środowisk homeostatycznych poprzez regulację zewnątrzkomórkowego potasu i glutaminianu, a także wydzielanie substratów energetycznych i ATP6,7,8. Wreszcie, mogą przyczyniać się do neurotransmisji poprzez wpływ na prądy pozasynaptyczne9, a także mogą pośrednio wpływać na aktywność poprzez inne typy komórek, takie jak promowanie mielinizacji10. Co ważne, ponieważ nieprawidłowość lub dysfunkcja astrocytów może prowadzić do wielu zespołów neurorozwojowych i neuropatologii dorosłych, istnieje oczywista potrzeba włączenia astrocytów wraz z neuronami do zaprojektowanych sieci neuronowych w celu uzyskania lepszego modelu endogennego środowiska mózgu. Integralną cechą astrocytów jest ich zdolność do tworzenia dynamicznych interakcji z synapsami neuronalnymi1,11,12. W przypadku braku gleju neurony tworzą ograniczoną liczbę synaps, które na ogół również nie mają dojrzałości funkcjonalnej13.

Ludzkie astrocyty wykazują cechy morfologiczne, transkrypcyjne i funkcjonalne — takie jak zwiększony rozmiar i złożoność rozgałęzień, a także geny specyficzne dla gatunku — które nie są rekapitulowane u gryzoni12,14,15. W rezultacie, badania wykorzystujące ludzkie pluripotencjalne komórki neuronalne pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stały się powszechnie akceptowane jako sposób badania chorób związanych z OUN in vitro przy jednoczesnym opracowywaniu nowych terapii, modeli urazów i paradygmatów hodowlanych16,17. Co więcej, hPSC pozwalają na badanie powstawania i funkcjonowania ludzkich synaps bez konieczności stosowania pierwotnych tkanek 18,19.

Barierą w zrozumieniu, jak różne typy komórek i sygnały przyczyniają się do funkcjonowania obwodów synaptycznych, jest brak odpowiednich modeli ludzkiego mózgu. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiednią platformę, aby podsumować jego sieci synaptyczne z wysoką wiernością i odtwarzalnością. Ostatnio pojawiło się zainteresowanie produkcją systemów hodowli 3D (szeroko znanych jako "organoidy", "sferoidy" lub "mini mózgi")20 do modelowania złożonych trójwymiarowych (3D) struktur na poziomie komórkowym i makro. Systemy hodowli 3D zachowują ECM i interakcje komórka-komórka, które zwykle są nieobecne lub ograniczone podczas typowych paradygmatów kokultury 2D21,22. Istnieje wiele technik hodowli sferoid neuronowych 3D23,24,25; Jednak wiele z nich wymaga długich okresów hodowli (od miesięcy do lat) w celu spontanicznego rozwoju i zachowania warstw, a użytkownik wykazuje bardzo małą kontrolę nad wyjściem.

Tutaj ilustrujemy systematyczną metodę szybkiego i konsekwentnego bioinżynierii interakcji neuronalnych między wieloma typami komórek (wstępnie zróżnicowanymi neuronami i astrocytami) pochodzących z hPSC poprzez składanie komórek w kokultury sferyczne ('asteroidy')26, które podsumowują specyficzne dla człowieka zawiłości morfologiczne w 3D. Ten system neuronowy o dużej gęstości generuje równomiernie rozproszone podtypy neuronów, które z czasem nabierają dojrzałych właściwości i mogą być badane przesiewowo lub testowane w sposób wysokoprzepustowy. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że ludzkie astrocyty indukują aktywność pęknięć sieci synaptycznych w tych kokulturach 3D. Ponadto protokół ten można łatwo dostosować do generowania kul o różnych rozmiarach, wykorzystywania komórek określonych dla różnych tożsamości regionalnych OUN oraz do badania interakcji wielu innych typów komórek zgodnie z potrzebami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie odczynników

UWAGA: Protokoły w tej sekcji są zapisane w kolejności, w jakiej pojawiają się w protokole różnicowania (sekcja 2). Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z materiałami i numerami katalogowymi.

  1. Przygotuj powlekane płytki do hodowli komórkowej.
    1. Rozcieńczyć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) pożywką DMEM/F12 w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Rozcieńczony roztwór podstawowy ECM rozdzielić na 30 stożkowych probówek po 3 ml każda i natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby uzyskać roztwór roboczy, należy ponownie zawiesić 3 ml materiału wyjściowego ECM w 33 ml wstępnie schłodzonego podłoża DMEM/F12, zwiększając całkowitą objętość do 36 ml dla stężenia 80 μg/ml.
    2. Pokryć 1 ml na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej roztworem roboczym ECM. Dodaj dodatkowy 1 ml DMEM/F12 na studzienkę (jeśli to konieczne), aby upewnić się, że powierzchnia studzienki jest w pełni pokryta. Przed użyciem pozostawić powlekane 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godzinę.
      UWAGA: Powlekane płytki można przechowywać w inkubatorze lub w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Przygotuj preparaty pożywek, czynniki wzrostu i małe cząsteczki.
    1. Aby przygotować 500 ml ludzkiego pluripotencjalnego podłoża z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)27, dodaj 20x i 500x suplementów zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Aby przygotować 500 ml pożywki nerwowej (NM), dodaj heparynę do końcowego stężenia 2 mg / ml, 1x roztwór antybiotyku/antybiotyku, 1x suplement B27 lub 1x suplement N2 do 500 ml butelki DMEM/F12 z suplementem L-glutaminy, jak wcześniej szczegółowo opisano28.
    3. Aby przygotować 10 mM (1,000x) roztwór podstawowy inhibitora kinazy Rho Y27632 (Y), dodaj 10 mg proszku do 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Filtrować, sterylizować, porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować w stężeniu roboczym 10 μM w pożywce.
    4. Aby przygotować 20 mM (10 000x) roztwór podstawowy SB431542, dodaj 10 mg proszku do 1,3 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Aby przygotować 2 mM (1,000x) roztwór podstawowy DMH1, dodaj 10 mg proszku do 13,1 ml DMSO. Przefiltrować, wysterylizować, podsycić i przechowywać każdy roztwór w temperaturze -20 °C. Stosować każdy roztwór w stężeniu roboczym 2 μM w pożywce (NM + SB431542 + DMH1).
      UWAGA: Ten protokół zaleca 2 μM stężenia robocze zarówno SB431542, jak i DMH1 w oparciu o nasze obserwacje i raporty od innych29 stwierdzające, że to stężenie skutecznie promuje indukcję neuronalną z hPSC. Odnotowano również wyższe stężenia30. Dodatkowo, w przypadku alternatywnych mediów, wykazano również, że małe cząsteczki nie są niezbędne do wysokiej konwersji neuronalnej31. W związku z tym stężenia robocze będą się różnić w zależności od alternatywnych środowisk hodowli komórkowych, a optymalne stężenia powinny być testowane przez indywidualnych badaczy.
    5. Aby przygotować pojedyncze 100 μg/ml (10 000x) roztworów podstawowych naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i czynnika wzrostu fibroblastów-2 (FGF2), dodaj 1 mg każdego z nich do 10 ml PBS + 0,1% BSA. Podwielokrotne roztwory podstawowe EGF i FGF2 rozdzielić na 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C. Stosować w podłożu o stężeniu roboczym 10 ng/ml; np. dodać 5 μl EGF i 5 μl FGF2 do 50 ml NM (NM + EGF + FGF2).
    6. Aby przygotować roztwór podstawowy chlorowodorku doksycykliny (Dox), należy najpierw rozpuścić proszek w DMSO do 100 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dalej rozcieńczyć go do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml (1000x) w PBS i przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować w stężeniu roboczym 2 μg/ml w pożywce; np. dodać 50 μL Dox do 50 ml NM (NM + Dox).
      Uwaga: Nie zamrażaj ponownie roztworów po rozmrożeniu.

2. Generowanie podtypów neuronalnych z ludzkich indukowanych komórek pluripotencjalnych (hPSC)

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe powinny być utrzymywane w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Kultury te są utrzymywane na poziomie tlenu w pomieszczeniu, chociaż można wykorzystać niższe poziomy.

  1. Generuj i utrzymuj progenitory astrocytów (hAstros) z hPSC.
    UWAGA: Ta sekcja zawiera krótki i uproszczony protokół różnicowania. Szczegółowy opis (z tworzeniem ciała zarodka, wyborem rozety i etapami tworzenia wzorów regionalnych) znajduje się w wcześniej opisanym protokole28 (Rysunek 1A, kropkowane zielone pole).
    1. Klastry nasienne hPSC (Rysunek 1B) na 6-dołkowych płytkach pokrytych ECM (patrz krok 1.1) z 2 ml pożywki hPSC + Y na studzienkę. Karm komórki macierzyste codziennie, aż osiągną około 50% zlewu i podziel się w razie potrzeby.
      1. Aby rozszczepić hPSC, dodaj 1 ml odczynnika pasażującego do studzienek i odessaj po 1 minutach. Inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut, dodaj 1 ml pożywki hPSC i podziel agregaty 1:10 na nowe studzienki pokryte ECM w 2 ml pożywki hPSC + Y na studzienkę.
    2. Utrzymuj komórki macierzyste do momentu, gdy zlewają się w około 50%, a następnie zmień pożywkę na NM + SB431542 + DMH1, aby indukować różnicowanie neuronalne (dzień 0). Gdy komórki są w około 95% zlewne, podziel 1:6 na nowe studzienki pokryte ECM w tym samym podłożu.
    3. W dniu 14 należy zdysocjować komórki roztworem oddzielającym i przenieść do niepowlekanej kolby z Y, aby pobudzić tworzenie agregatów.
      UWAGA: Dodatek Y jest wykorzystywany do wspomagania przetrwania komórek i tworzenia kul, ale nie jest uwzględniany podczas każdego karmienia.
    4. Do generowania neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów (hNeurons) użyj tych komórek dnia 14, jak opisano poniżej. Alternatywnie, wykorzystaj te komórki w późniejszych punktach czasowych z kultur jednowarstwowych lub sferycznych, zanim nastąpi dojrzewanie neuronów lub rozpocznie się glejogeneza.
      UWAGA: Domyślnie ten protokół wytwarza astrocyty grzbietowo-korowe. Jednak podtypy astrocytów mogą być określone regionalnie przez dodanie morfogenów wzorcowych, jeśli jest to pożądane28,32,33. Kwas retinowy (RA) może być dodawany w celu kaudalizacji komórek w fenotypach rdzenia kręgowego, podczas gdy jeż soniczny (SHH), wygładzony agonista (SAG) lub purmorfamina będą wytwarzać fenotypy brzuszne.
    5. W celu wygenerowania progenitorów astrocytów i astrocytów w spontanicznie utworzonych agregatach 3D (hAstrospheres), przełącz się na NM + EGF + FGF2 i podawaj co tydzień (lub w razie potrzeby, aby zapewnić stabilne pH), jak opisano wcześniej34.
      1. Delikatnie rozłącz agregaty hAstro z roztworem odłączającym, gdy pojawią się ciemne centra i usuń kule, które spontanicznie się przyczepiają. Raz w tygodniu delikatnie rozbijaj kule, aby utrzymać je w zdrowiu i uniknąć nekrotycznych rdzeni.
        UWAGA: Nie należy przekraczać 5 minut leczenia roztworem odrywającym.
      2. Po 4-6 miesiącach od ekspansji potwierdź tożsamość komórki i albo zamroź w pożywce do krioprezerwacji (zgodnie z instrukcjami producenta) lub alternatywnych warunkach przechowywania w celu długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie lub natychmiast użyj do eksperymentów.
    6. Aby rozmrozić zamrożony wywar hAstrospheres, należy szybko rozmrozić fiolkę w temperaturze pokojowej, przenieść zawartość do pustej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 1 minutę. Ostrożnie odessać supernatant, przemyć DMEM/F12 i powtórzyć w sumie dwa etapy mycia. Dodać do kolby T25 o całkowitej objętości 6 ml NM + EGF + FGF2 + Y (lub zwiększyć w razie potrzeby).
  2. Generuj i utrzymuj indukowalne neurony (iNeurony) z hPSC.
    1. Nasiona transgenicznych hPSC (ze stabilnym transgenem indukowanym doksycykliną neurogeniną 2 35) na 6-dołkowych płytkach pokrytych ECM z 2 ml pożywki hPSC + Y na dołek (jak opisano powyżej dla linii nietransgenicznych). Karmić codziennie 2 ml pożywki na studzienkę, aż będą gotowe do podniesienia przy 70% zbieganiu. Podziel komórki zgodnie z opisem w kroku 2.1.2.
    2. Gdy komórki są w około 35% zlewane, dodaj NM + Dox, aby wywołać różnicowanie w iNeurons. Utrzymuj jako kulturę jednowarstwową z NM + Dox przez 2 dni przed przejściem do kroku 3.2.
      UWAGA: Komórki przekształcą się w neuronalne komórki progenitorowe, ale nie rozwiną jeszcze neurytów (Rysunek 1C).

3. Przygotowanie i utrzymanie kokultur sfer 3D

  1. Oddziel hAstros od agregatów 3D w zawieszeniu (zgodnie z opisem w kroku 2.1.5.1).
  2. Dysocjacja hNeurons lub iNeurons od monowarstwy 2D.
    1. Usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej i dodać 500 μl roztworu oddzielającego do każdej studzienki zawierającej kultury jednowarstwowe. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Delikatnie dodaj 2-3 ml DMEM/F12, aby usunąć przyczepione komórki.
    2. Zebrać komórki i pożywkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 1 min. Odessać supernatant, dodać 1 ml świeżej pożywki i delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
  3. Formuj kule 3D za pomocą płytek do hodowli mikrostudzienek.
    1. Przygotować płytkę, dodając 0,5 ml roztworu płuczącego zapobiegającego przyleganiu do każdej studzienki płytki mikrodołkowej. Płytka wirówkowa o masie 2 000 x g przez 5 min. Odessać roztwór do płukania, dodać 1 ml DMEM/F12 do każdej studzienki w celu umycia i ponownie odssać.
      UWAGA: Zawsze upewnij się, że wirówka jest wyważona podczas użytkowania.
    2. Policz każdy typ komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Dodaj żądany stosunek zdysocjowanych hAstros i hNeurons lub iNeurons do każdej studzienki w całkowitej objętości 2 ml NM + Y (w tym Dox, jeśli wykorzystywane są iNeurons). Odwirować płytkę o masie 100 x g przez 3 minuty i ponownie umieścić w inkubatorze.
      UWAGA: 24-dołkowe płytki mikrodołkowe (patrz Tabela materiałów) zawierają 300 mikrostudzienek na studzienkę. Dodać minimum 6 x 105 komórek (dla kulek po 2 x 10 po3 komórki każda) i maksymalnie 6 x 106 komórek (dla kulek po 2 x 104 komórki każda) w 2 ml pożywki na basenik. W przypadku żywotnych sfer o określonej gęstości w tym zakresie, użyj określonej liczby komórek i podziel przez 300, aby obliczyć liczbę komórek na kulę. W razie potrzeby można również zastosować alternatywne metody i narzędzia do formowania kul. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać dopuszczalne zakresy gęstości komórek.
    3. Pozwól komórkom samoorganizować się w gęsto upakowane kulki w płytkach mikrodołkowych w ciągu następnych 2 dni (Rysunek 2A). Wymień 50% pożywki, jeśli kultura żółknie.
      UWAGA: Podczas wyjmowania i dodawania mediów należy delikatnie wymieniać tylko połowę nośnika i pipetę, aby nie przeszkadzać kulom. Kule mogą unosić się z mikrostudzienek i łączyć się ze sobą z większą siłą.
    4. Po 2 dniach delikatnie wyjmij kulki z mikrostudzienek za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 1D). Lekko przyłóż siłę do dna mikrostudzienek z mediami, aby usunąć wszelkie dodatkowe przylegające kulki. Pozwól kulkom osiąść w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odessaj stare podłoże i dodaj świeże podłoże.
  4. Skonfiguruj system bioreaktora z kolbą obrotową do formowania kul 3D.
    1. Oczyść powierzchnię mieszadła magnetycznego 70% etanolem, umieść go w inkubatorze do hodowli komórkowych. Autoklaw poszczególnych kolb obrotowych do sterylizacji.
    2. Dodaj kulki z co najmniej 50–60 ml pożywki do każdej kolby obrotowej (Rysunek 1D, wstawka). Umieścić kolbę na magnetycznej płytce mieszającej ustawionej na 60 obr./min. Kulki hodowlane w kolbach obrotowych, aż będą gotowe do zbierania danych.
      UWAGA: Do utworzenia synaps potrzebne są co najmniej 3 tygodnie w hodowli. Jeśli system bioreaktora z kolbą obrotową nie jest pożądany, kulki mogą być hodowane w warunkach stacjonarnych w kolbach lub szalkach do hodowli komórkowych. Kulki mogą być również zatopione w ECM lub hydrożelu.

4. Pomiar żywej fizjologii synaptycznej za pomocą układów wieloelektrodowych (MEA)

  1. Przygotuj MEA do hodowli komórkowej.
    1. Oczyść powierzchnię każdego MEA 1 ml detergentu przez 1 godzinę. Spłucz sterylną wodą dejonizowaną (DI), spłucz 70% etanolem w celu sterylizacji, a następnie wysusz na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego w świetle UV.
      UWAGA: MEA można przechowywać w wodzie DI o temperaturze 4 °C w sterylnych warunkach do momentu użycia.
    2. Przygotować roztwór poliornityny (PLO) o stężeniu 0,5 mg/ml, rozpuszczając 50 mg PLO w 100 ml buforu kwasu borowego. Pokryć powierzchnię każdego MEA 1 ml PLO, aby nadać powierzchni właściwości hydrofilowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny. Usunąć PLO, przemyć powierzchnię wodą demineralizowaną, dodać 1 ml ECM (patrz krok 1.1.1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.
    3. Wyjmij ECM i umieść kulki w 1.5 ml pożywki na powierzchni MEA, upewniając się, że kulki są umieszczone na górze układu elektrod (rysunki 3A, 3A'). Pozostawić do przylegania na 2 dni. Zmieniaj połowę podłoża co 2-3 dni (lub częściej, jeśli to konieczne), upewniając się, że sfery nie są zakłócone.
      UWAGA: Dodanie czynników wzrostu może poprawić przeżywalność i dojrzewanie kultur.
  2. Mierz aktywność elektryczną sfer neuronowych.
    1. Skonfiguruj system z matrycą wieloelektrodową (MEA) ze sceną czołową o kontrolowanej temperaturze. Utwórz program z filtrem górnoprzepustowym 5 Hz i filtrem dolnoprzepustowym 200 Hz oraz progiem skoku 5x odchylenia standardowego (SD).
    2. Umieść MEA na scenie głównej i zarejestruj spontaniczną aktywność elektryczną (Rysunek 3B, B'). Zapisuj surowe dane, w tym częstotliwość i amplitudę skoków, do analizy statystycznej.
      UWAGA: System perfuzyjny może być używany z MEA w celu dodania środków farmakologicznych lub zwiększenia przepływu świeżych nośników do długotrwałego nagrywania. Dodatkowe przetwarzanie końcowe spajków może być wykonane zgodnie z życzeniem36,37.

5. Pomiar gęstości synaptycznej za pomocą immunocytochemii

  1. Przygotować odczynniki.
    1. Aby przygotować 500 ml roztworu podstawowego 4% paraformaldehydu (PFA), dodaj 400 ml 1x PBS do szklanej zlewki lub płytki mieszającej w wentylowanym okapie. Dodaj mieszankę i podgrzej do 60 °C, mieszając; Nie gotować. Dodać 20 g proszku PFA do podgrzanego roztworu PBS i podnieść pH do 6,9, powoli dodając kroplami 1 N NaOH.
      UWAGA: 4% roztwór PFA można podasumować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    2. Dodaj 20 g lub 30 g sacharozy do 100 ml PBS, aby uzyskać odpowiednio 20% i 30% roztwory sacharozy.
    3. Dodaj 1 ml detergentu do 10 ml PBS, aby przygotować 10% roztwór podstawowy. Odwróć kilka razy do homogenizacji.
    4. Dodać 250 μl 10% roztworu podstawowego detergentu (końcowe stężenie 0,25%) i po 500 μl surowicy koziej i oślej (końcowe stężenie 5% każda) do 10 ml PBS, aby przygotować podstawowy bufor blokujący.
    5. Dodać po 100 μl surowicy koziej i oślej (końcowe stężenie 1% każda) do 10 ml PBS, aby przygotować wtórny bufor blokujący.
  2. Przygotuj próbki.
    1. Przenieś kulki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, pozwól im osiąść na dnie probówki i odessać stare podłoże. Przepłucz kulki 500 μl PBS, pozostaw do osadzenia i odessaj PBS. Dodać 500 μl 4% PFA (lub tyle, aby pokryć kulki) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Odessać PFA i delikatnie przemyć dwukrotnie PBS. Dodać 20% roztwór sacharozy i inkubować w temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez noc. Ostrożnie przypiąć, dodać 30% roztwór sacharozy i inkubować w temperaturze 4 °C przez kilka godzin lub przez noc.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w PBS lub sacharozie przez okres do 1 tygodnia przed przejściem do następnego etapu. Jeśli nie kroisz, zachowaj jako kule 3D (Rysunek 4A-C) w probówce o pojemności 1,5 ml i przejdź do kroku 5.3.
    3. Podczas krojenia kulek ostrożnie przenieś kulki do osadzonej formy kriogenicznej na wierzchu suchego lodu. Zassać 30% roztwór sacharozy i powoli wlewać roztwór do zatapiania tkanek do formy, aż całkowicie pokryje próbkę, unikając pęcherzyków powietrza. Poczekaj, aż roztwór zamarznie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu pokrojenia kriostatu.
    4. Używając kriostatu w temperaturze -20 °C, pokrój osadzone bloki na sekcje 30 μm (lub według uznania) i przenieś na szkiełka podstawowe. Przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będzie gotowy do barwienia.
  3. Barwienie immunologiczne kulek.
    1. Obrysuj krawędzie szkiełek hydrofobowym pisakiem PAP, aby zapobiec rozlaniu płynu. Przygotować pierwszorzędowe i wtórne roztwory blokujące z przeciwciałami (patrz tabela materiałów). Dodać 500 μl pierwotnego buforu blokującego do każdego szkiełka lub probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Usunąć płyn, dodać 500 μl świeżego pierwszorzędowego buforu blokującego z rozcieńczonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi do każdego szkiełka lub probówki i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i przemywać 3x PBS przez 10 minut każdy.
    3. Dodać 500 μl wtórnego buforu blokującego z rozcieńczonymi przeciwciałami drugorzędowymi do każdego szkiełka lub probówki i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Usunąć roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemywać 3x PBS przez 10 minut każdy.
      UWAGA: Lista zalecanych przeciwciał znajduje się w Tabeli materiałów. W razie potrzeby można stosować inne przeciwciała lub barwniki. Nie wystawiać próbek fluorescencyjnych na działanie światła (krok 5.3.3 i następne).
    4. Dodać kroplami 50 μl roztworu montażowego, aby pokryć powierzchnię i ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe na szkiełku, unikając pęcherzyków. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Zobrazuj slajdy.
    1. Użyj konfokalnego lub dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 63X zanurzonym w olejku, aby zobrazować obfitość białek pre- i postsynaptycznych oraz kolokalizację w wycinkach kuli (Rysunek 4D). Użyj obiektywu 20X lub 40X, aby zobrazować cechy morfologiczne hAstros.
    2. Otwórz pliki obrazów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania ImageJ. Policz pre- i postsynaptyczne puncta ręcznie za pomocą wtyczki Cell Counter, używając bezstronnej metody liczenia, jak poprzednio detailed38, lub za pomocą metod alternatywnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli zostanie prawidłowo przeprowadzony, protokół ten stworzy zdefiniowane populacje funkcjonalnych kokultur astrocytów28,33,34 i neurons35 wygenerowane z hPSC (Rysunek 1A-1C), jak opisano wcześniej26 i opisane tutaj w krokach 2.1–2.2. Oczekuje się, że ta stopniowa procedura, z wykorzystaniem płytek mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy systematyczną metodę produkcji sfer 3D kokultur neuronowych. Kule składają się z astrocytów i neuronów, które pochodzą niezależnie od hPSC. Chociaż nie jest to przedmiotem tego protokołu, generowanie czystych populacji astrocytów z hPSC28 jest krytycznym krokiem i może być technicznie trudne, jeśli zostanie przeprowadzone bez wcześniejszego doświadczenia. Ten pierwszy krok w generowaniu tych mikroukładów synaptycznych powinien być wykonany z drobiazgowym wyczuciem czasu i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Dr. Erikowi Ullianowi (UCSF) za intelektualny wkład w projektowanie tych procedur, Dr. Michaelowi Wardowi (NIH) za porady techniczne dotyczące różnicowania iNeuron oraz Sabie Barlasowi za wstępną analizę obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowaFisher Scientific08-772-1B
Probówki stożkowe 15 mlOlympus Plastics28-101
AccutaseSigmaA6964-100MLRoztwór do oddzielania
Płytka AggreWellStemcell Technologies34850
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniuStemcell Technologies7010Zapobiegaj komórkom przyczepność do płytek mikrodołkowych
Anty/antyThermofisher15240062
B27Thermofisher17504044Suplement mediów
Podłoże neuronalne BrainPhysTechnologie komórek macierzystych5790Neurofizjologiczna alternatywa dla podłoża podstawowego
Okrągłe szklane szkiełka nakrywkoweNeuvitroGG-12-oz
Cryostor CS10Stemcell Technologie7930Pożywka do kriokonserwacji z 10% DMSO
DMEM/F12Thermofisher10565-042Z suplementem GlutaMAX
DMH-1Stemcell Technologies73634ZAGROŻENIE: Toksyczny po połknięciu. Stężenie robocze: 2 i mu; M
Surowica osłaLampire Biological Laboratories7332100Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym
Chlorowodorek doksycykliny (Dox)SigmaD3072-1mlZAGROŻENIE: Toksyczne dla kobiet w ciąży. Stężenie robocze: 2 i mu; g / ml
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)PeprotechAF-100-15Stężenie robocze: 10 ng / ml
Czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF)Peprotech100-18BStężenie robocze: 10 ng / ml
Roztwór montażowy Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Szkiełkaszklane Fisherbrand22-037-246
Kozia surowicaLaboratoria Biologiczne Lampire7332500Stężenie robocze: 5% w pierwotnym buforze blokującym, 1% w wtórnym buforze blokującym
Hemacytometr lub automatyczny licznik komórekTechnologie życiaAMQAX1000
HeparynaSigmaH3149-50KUStężenie robocze: 2 mg/ml
Płyta magnetycznaDLAB8030170200
Matrigel MatrycamembranowaRoztwór powłokowy Corning354230ECM. Stężenie robocze: 80 μ g/ml. Przygotuj na lodzie i upewnij się, że pipety, probówki i media są wstępnie schłodzone.
System MEA 2100Systemy wielokanałoweMEA2100
Rozwiązanie montażowe
N2Thermofisher17502048Suplement mediów
OCTTissue-Tek4583Roztwór do zatapiania tkanek do kriosekcji
Pap Pen (Aqua Hold)Laboratorium urządzeń naukowych9804-02
Paraformaldehyd ( PFA)Acros Organics169650025ZAGROŻENIE: Działa toksycznie w przypadku wdychania. Stężenie robocze: 4% w PBS
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Stemcell TechnologiesCA008-300
Poli-l-ornityna (PLO)SigmaP3655-100MGStężenie robocze: 0,5 mg/ml
Szkiełka nakrywkowe prostokątneFisherfinest Premium Superslip12-545-88
ReLeSRStemcell Technologies5872Odłączanie i pasażowanie odczynnik
Inhibitor kinazy Rho Y27632- (Y)Tocris1254Stężenie robocze: 10 uM
SB431542Stemcell Technologies72234Stężenie robocze: 2 i mu; M
Kolby obrotoweFisher Scientific4500-125
SacharozaFisher ChemicalS5-3Stężenie robocze: 20% lub 30% w PBS
T25 KolbaOlympus Plastics25-207Nasadki wentylowane
T75 Kolba hodowlanaOlympus Plastics25-209Nasadki wentylowane
Terg-A-zymeSigmaZ273287-1EADetergent. Stężenie robocze: 1%
TeSR-E8 podłoże podstawoweStemcell Technologies5940Pożywka dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC)
TeSR-E8 SuplementyStemcell Technologies5940Suplementy dla pożywki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
TritonX-100SigmaX100-500MLDetergent do przenikania komórek. Stężenie robocze: 0,25% w buforze blokującym
błękit trypanowyInvitrogenT10282
Przeciwciała
AlexaFluor 488ThermofisherA-11029Przeciwciało drugorzędowe
AlexaFluor 594ThermofisherA-11037Przeciwciało drugorzędowe
EzrinThermofisherMA5-13862Przeciwciało pierwszorzędowe; astrocyty perisynaptyczne
GFAPChemiconMAB360Przeciwciało pierwszorzędowe; astrocyty
GFPAvesGFP-1020Przeciwciało pierwotne; astrocyty
Glt1Dar od dr Jeffreya RothsteinabrakPrzeciwciało pierwotne; astrocyty
synaptyczneHomera160 011Przeciwciało pierwotne; neurony postsynaptyczne
MAP2Systemy synaptyczne188 004Przeciwciało pierwotne; neurony
PSD95Abcamab2723Przeciwciało pierwotne; neurony, postsynaptyczne
S100Abcamab868Przeciwciało pierwotne; astrocyty
Synapsyna 1Systemy synaptyczne106 103Przeciwciało pierwotne; neurony presynaptyczne
TuJ1/β 3-tubulina (TUBB3)CovanceMMS-435PPrzeciwciało pierwszorzędowe; neurony
hodowlana Systemy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106(2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474(2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain? Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscience. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Developmental Biology. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626(2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286(2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181(2016).
  41. Bardy, C., Hurk,, et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423(2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe kokultury neuronalnekokultura astrocyt w i neuron wtworzenie obwod w synaptycznychanaliza za pomoc matrycy wieloelektrodowejprotok indukcji neuronalnejtechnika dysocjacji kom rekmetoda tworzenia sferanaliza immunobarwieniaspontaniczne wy adowania sieciowe

Powiązane artykuły