Artykuł metodologiczny

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

DOI:

10.3791/58045

⸱

5 października 2018

1School of Electronic and Electrical Engineering, University of Leeds, 2Leeds Institute of Cancer and Pathology, University of Leeds

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu, plazmoniczne nanocząstki złota były jednocześnie wystawione na działanie pulsacyjnego światła laserowego bliskiej podczerwieni i skoncentrowanych ultradźwięków o wysokiej intensywności (HIFU) w celu kontrolowanego zarodkowania kawitacji w fantomach żelowych naśladujących tkanki. Ten protokół in vitro został opracowany w celu zademonstrowania wykonalności tego podejścia, zarówno w celu poprawy obrazowania, jak i zastosowań terapeutycznych w przypadku raka. Ten sam aparat może być używany zarówno do obrazowania, jak i do zastosowań terapeutycznych, zmieniając czas ekspozycji systemu HIFU. W przypadku krótkotrwałych ekspozycji (10 μs) szerokopasmowe emisje akustyczne zostały wygenerowane poprzez kontrolowane zarodkowanie kawitacji bezwładnościowej wokół nanocząstek złota. Emisje te zapewniają bezpośrednią lokalizację nanocząstek. W przyszłych zastosowaniach cząstki te mogą być funkcjonalizowane przeciwciałami ukierunkowanymi molekularnie (np. anty-HER2 na raka piersi) i mogą zapewnić precyzyjną lokalizację regionów nowotworowych, uzupełniając rutynowe diagnostyczne obrazowanie ultrasonograficzne. W przypadku ekspozycji na fale ciągłe (CW) aktywność kawitacyjna została wykorzystana do zwiększenia miejscowego ogrzewania z ekspozycji na HIFU, co spowodowało większe uszkodzenia termiczne fantomów żelu. Emisje akustyczne generowane przez kawitację inercyjną podczas tych ekspozycji na CW były monitorowane za pomocą systemu pasywnej detekcji kawitacji (PCD) w celu uzyskania informacji zwrotnej o aktywności kawitacji. Zwiększone miejscowe ogrzewanie osiągnięto tylko dzięki unikalnemu połączeniu nanocząstek, światła laserowego i HIFU. Konieczna jest dalsza walidacja tej techniki w przedklinicznych modelach raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU), lub chirurgia skoncentrowanymi ultradźwiękami (FUS), to niejonizująca i nieinwazyjna technika, która jest używana do termicznej ablacji tkanki podskórnej1. Głównym zastosowaniem HIFU jest leczenie nowotworów tkanek miękkich2, ale zaczyna być używany do innych zastosowań, takich jak leczenie nowotworów kości3 lub schorzeń neurologicznych4. Istnieją dwa główne czynniki, które ograniczają powszechne stosowanie HIFU w klinice: po pierwsze, trudności w prowadzeniu leczenia, a po drugie, długi czas leczenia5. Połączenie HIFU, pulsacyjnego oświetlenia laserowego i plazmonicznych nanoprętów złota opisanych tą metodą może zapewnić sposób na przezwyciężenie obecnych ograniczeń dla HIFU6.

Podczas ekspozycji na HIFU, dominującym mechanizmem ablacji tkanek jest uszkodzenie termiczne. Jednak aktywność kawitacyjna może również odgrywać pewną rolę8. Aktywność kawitacyjna, która występuje podczas ekspozycji na HIFU, może składać się zarówno z kawitacji mechanicznej, jak i / lub termicznej. Kawitacja za pośrednictwem mechanicznym jest ogólnie określana jako kawitacja akustyczna7, która jest dalej podkategoryzowana jako pęcherzyki poddawane zachowaniu nieinercyjnemu lub inercyjnemu9. Kawitacja za pośrednictwem termicznym polega na tworzeniu się kieszeni gazowych, poprzez roztwór lub parowanie, i jest powszechnie określana jako "wrzenie"10. Wykazano, że aktywność kawitacyjna, najczęściej kawitacja bezwładnościowa, zwiększa szybkość nagrzewania termicznego osiągalną dzięki ekspozycjach HIFU11, a tym samym pomaga rozwiązać jedno z jego kluczowych ograniczeń. Jednak powstawanie i aktywność kawitacji podczas ekspozycji na HIFU może być nieprzewidywalna i prowadzić do negatywnych skutków, takich jak nadmiernie leczone regiony lub asymetryczna ablacja termiczna12. W celu kontrolowania aktywności kawitacyjnej podczas ekspozycji na HIFU badano wprowadzanie jąder zewnętrznych. Mogą one mieć postać mikropęcherzyków13, nanoemulsji przesunięcia fazowego14 lub nanocząstek plazmonicznych15. Wykazano, że zarówno mikropęcherzyki, jak i nanoemulsje poprawiają stosunek sygnału do szumu na potrzeby obrazowania i ulepszonej ablacji termicznej. Jednak ich przejściowy charakter oznacza, że mają ograniczoną funkcjonalność przy powtarzających się ekspozycjach na HIFU. Monitorowanie aktywności kawitacyjnej podczas ekspozycji na HIFU odbywa się za pomocą aktywnej lub pasywnej detekcji kawitacji (odpowiednio ACD lub PCD). PCD jest preferowaną techniką wykrywania kawitacji, ponieważ może być wykonywana jednocześnie z ekspozycjami HIFU i dostarcza informacji o zawartości spektralnej. Ta zawartość spektralna może być następnie dalej analizowana, aby pomóc w identyfikacji rodzaju występującej aktywności kawitacyjnej16. Wykorzystywane są szerokopasmowe emisje akustyczne, ponieważ są one unikalne dla obecności kawitacji bezwładnościowej10 i są związane ze zwiększonym ogrzewaniem HIFU11.

Obrazowanie fotoakustyczne (PAI) to nowa technika obrazowania klinicznego17, która łączy selektywność spektralną impulsowego wzbudzenia laserowego z wysoką rozdzielczością obrazowania ultradźwiękowego18. Wcześniej była używana do kierowania ekspozycjami HIFU19, ale ta technika obrazowania jest ograniczona przez głębokość penetracji światła laserowego. Nanocząstki plazmonicznego złota mogą być używane jako "środki kontrastowe" zwiększające miejscową absorpcję światła laserowego, a następnie amplitudę emisji fotoakustycznych20. Przy wystarczająco wysokich fluktuacjach lasera możliwe jest powstawanie mikroskopijnych pęcherzyków pary, które mogą być wykorzystane do wysoce zlokalizowanego obrazowania21. Jednak te poziomy ekspozycji zazwyczaj przekraczają maksymalny dopuszczalny limit ekspozycji dla stosowania światła laserowego u ludzi22, a zatem mają ograniczone zastosowanie. Metoda zastosowana w tym badaniu wykazała wcześniej, że poprzez jednoczesne wystawienie nanocząstek plazmonicznych zarówno na oświetlenie laserowe, jak i HIFU, fluencja lasera i ciśnienie akustyczne potrzebne do zarodkowania tych małych pęcherzyków pary są dramatycznie zmniejszone, a stosunek sygnału do szumu dla obrazowania jest zwiększony23. Opisano tutaj metodę łączenia nanocząstek plazmonicznych zarówno z ekspozycją na laser, jak i HIFU w celu uzyskania wysoce kontrolowanej techniki zarodkowania i aktywności pęcherzyków pary.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja fantomów naśladujących tkanki

UWAGA: Dogłębną analizę właściwości akustycznych optycznie przezroczystego fantomu naśladującego tkankę, użytego do wszystkich ekspozycji w tym badaniu, można znaleźć w Choi, et al.24

UWAGA: Każda forma fantomowa zawiera około 50 ml roztworu, a dla każdej partii wypełnianych jest łącznie pięć form. W ten sposób przygotowuje się w sumie 250 ml roztworu fantomowego.

  1. Dodać 148,2 ml (60% v/v) dejonizowanej, przefiltrowanej i odgazowanej wody do szklanej zlewki o pojemności 500 ml i pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej. Dodać 75 ml 40% (wagowo/objętościowo) roztworu akryloamidu/bis-akryloamidu (30% v/v) do szklanej zlewki, a następnie 25 ml 1 M buforu TRIS o pH 8 (10% v/v) i 2,15 ml 10% nadsiarczanu amonu (APS; 0,86% v/v).
  2. Umieścić szklaną zlewkę w komorze próżniowej umieszczonej na mieszadle magnetycznym i umieścić w niej mieszadło magnetyczne z politetrafluoroetylenu (PTFE) o długości 40 mm. Przy średniej prędkości mieszania (tj. zapewnić dobre wymieszanie bez tworzenia się wiru w wodzie), powoli dodawać 22,5 g (9% w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w proszku.
  3. Po dodaniu całego BSA do roztworu zamknij komorę próżniową i włącz pompę próżniową. Utrzymuj próżnię na poziomie 80 mBar/H i kontynuuj mieszanie przez kolejne 60 minut, po czym zwolnij próżnię. W tym momencie roztwór powinien być klarowny z lekkim żółtym odcieniem.
  4. Powyższa metodologia jest taka sama dla fantomów wykonanych zarówno z nanocząstkami, jak i bez nich. Jeśli wymagane są nanocząstki, dodać 10 μl (stężenie 1x108 np/ml) nanoprętów o powierzchniowym rezonansie plazmonowym (SPR) przy 850 nm i średnicy 40 nm.
  5. Na koniec dodaj 125 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), aby katalizować polimeryzację fantomu. Odczekaj kolejne 5 minut, aby umożliwić wymieszanie, a następnie wlej roztwór fantomowy do 5 pojedynczych foremek i odczekaj 20 minut, aby stężały. Po ustawieniu wyjmij je z uchwytów i przechowuj w hermetycznym pojemniku do czasu użycia. Zużyte fantomy w ciągu 24 godzin od produkcji.

2. Kalibracja ciśnienia akustycznego w polu swobodnym przetworników HIFU

UWAGA: Ta sekcja protokołu nie jest konieczna przed każdym eksperymentem z uszkodzeniem/obrazowaniem. Jest to procedura kalibracji, którą należy wykonywać w regularnych odstępach czasu, aby zapewnić prawidłowe wyjście akustyczne systemu.

  1. Napełnij akrylowy zbiornik na wodę (280x141x132 mm) 4,5 l wody dejonizowanej i odgazowanej. Zamontuj przetwornik HIFU na stałym słupku pozycyjnym na jednym końcu zbiornika, skierowany do wewnątrz. Równolegle należy zamontować skalibrowany (wykonany przez National Physical Laboratories) hydrofon membranowy na trzyosiowym ręcznym stoliku mikrometrycznym w przybliżonym punkcie ogniskowym przetwornika HIFU (63 mm).
  2. Podłącz przetwornik HIFU (ostrość geometryczna 63 mm) do obwodu dopasowania impedancji, a następnie wzmacniacza mocy (jak pokazano na Rysunek 1). Następnie podłącz hydrofon membranowy bezpośrednio do systemu akwizycji danych, upewniając się, że sygnał wyzwalający jest dostarczany z generatora funkcyjnego podłączonego do wzmacniacza mocy ( Rysunek 1).
  3. Ustawić napięcie wyjściowe generatora funkcyjnego na 30 mV, z 10-cyklową falą sinusoidalną 3,3 MHz z częstotliwością powtarzania impulsów 100 Hz.
  4. Korzystając z oprogramowania pomiarowego (patrz tabela materiałów) w celu wizualizacji wykrytego sygnału akustycznego i stopnia mikrometrycznego, ustaw wykryty impuls akustyczny we właściwym czasie przelotu (42,5 μm). Używając tylko jednego kierunku promieniowego na raz na stoliku mikrometrycznym, zmaksymalizuj wykryty sygnał akustyczny. Po upewnieniu się, że zostało to osiągnięte, zamknij oprogramowanie i pozostaw hydrofon membranowy w jego aktualnej pozycji.
  5. Zmieniaj napięcie wyjściowe generatora funkcyjnego w zakresie od 20 do 400 mV w krokach co 20 mV. Na każdym poziomie napięcia i za pomocą oprogramowania do akwizycji MatLab rejestruj sygnały hydrofonu. Zdobądź 100 impulsów na każdym poziomie i przekonwertuj dane z napięcia w ciśnieniu, korzystając z dostarczonych danych kalibracyjnych. Uśrednij dane i zmierz zarówno szczytowe wartości dodatnie, jak i ujemne dla wszystkich poziomów napięcia wyjściowego. W ten sposób uzyskuje się dane kalibracyjne dla szczytowego podciśnienia w polu swobodnym, które można wykorzystać zarówno do badań fal impulsowych, jak i ciągłych.

3. Konfiguracja aparatury eksperymentalnej do badań fal pulsacyjnych i ciągłych

  1. Napełnij akrylowy zbiornik na wodę (280x141x132 mm) 4,5 l wody dejonizowanej i odgazowanej. Zamontuj przetwornik HIFU i współosiowy hydrofon szerokopasmowy na trzyosiowym ręcznym stoliku mikrometrycznym. Następnie całkowicie zanurz przetwornik i hydrofon w zbiorniku na wodę. Schemat tego jest pokazany w Rysunek 1.
  2. Podłącz przetwornik HIFU do obwodu dopasowania impedancji, aby umożliwić jego sterowanie przy trzeciej harmonicznej (3.3 MHz). Obwód ten jest podłączony bezpośrednio do wyjścia wzmacniacza mocy RF. Cyfrowy generator funkcyjny jest podłączony do wejścia wzmacniacza mocy i programowany zdalnie.
  3. Przed ekspozycją w materiale fantomowym należy użyć skalibrowanego hydrofonu membranowego różnicowego, aby zmierzyć szczytowe podciśnienie generowane przez ten system dla danego napięcia wejściowego w generatorze funkcyjnym, jak opisano w 2. Użyj tych wartości napięcia odniesienia, aby ustawić wymagany poziom ciśnienia w cyfrowym generatorze funkcyjnym.
  4. Hydrofon szerokopasmowy (ostrość geometryczna 63 mm), który znajduje się w centralnej aperturze przetwornika HIFU, należy podłączyć bezpośrednio do filtra górnoprzepustowego 5 MHz. Następnie podłącz go do 14-bitowej karty akwizycji danych (DAQ) za pośrednictwem przedwzmacniacza 40 dB. Upewnij się, że filtr górnoprzepustowy jest podłączony do prawidłowego odchylenia.
    UWAGA: Ta karta została zainstalowana w komputerze stacjonarnym i służy do sterowania całym sprzętem (przykłady tego oprogramowania można znaleźć jako pliki dodatkowe) i zapisywania danych do przetwarzania w trybie off-line podczas tego badania.
  5. Podłącz cyfrowy generator impulsów opóźniających tranzystor-tranzystor (TTL) z Bayonet Neill-Concelman (BNC) zarówno do impulsowego systemu laserowego, jak i generatora funkcyjnego, aby zapewnić synchronizację między tymi systemami, co zapewni, że impuls laserowy 7 ns jest zbieżny w obszarze docelowym podczas czwartego piku rozrzedzenia z przetwornika HIFU.
  6. Stosując metodę opisaną w 1, należy pominąć BSA i nanocząstki, aby utworzyć fantom wyrównujący, który jest standardowym materiałem fantomowym, który zawiera sferyczną metalową tarczę o średnicy 1 mm (łożysko kulkowe). W tym celu należy wlać 25 ml materiału fantomowego do formy i dodać 62,5 μl katalizatora TEMED, a następnie odczekać około 20 minut do stężenia. Następnie umieść metalową tarczę centralnie w fantomie i dodaj kolejne 25 ml roztworu fantomowego, a następnie katalizator TEMED o objętości 62,5 μl i odczekać kolejne 20 minut.
  7. Umieść fantom wyrównujący w wydrukowanym w 3D uchwycie6, zamontuj na zautomatyzowanym stoliku 3D i ustaw w przybliżeniu tak, aby metalowy cel znajdował się na szczycie ogniskowym przetwornika HIFU.
  8. Używając przetwornika HIFU do wysyłania krótkotrwałego impulsu w 10 cyklach (3 μs) i hydrofonu do odbioru (podłączonego bezpośrednio do karty DAQ), pozycja względem celu wyrównania jest optymalizowana poprzez lokalizację echa impulsowego. Wykryty sygnał w czasie rzeczywistym zostanie wyświetlony na komputerze. Dostosuj czas lotu i amplitudę sygnału za pomocą ręcznego stolika mikrometrycznego, na którym zamontowany jest przetwornik HIFU i hydrofon. Gdy czas lotu zostanie ustawiony na 85 μs (pojedyncza podróż w obie strony), a amplituda sygnału zostanie zmaksymalizowana w obu kierunkach promieniowych, system ten zostanie wyrównany.
  9. Połącz energię optyczną z optycznego oscylatora parametrycznego (OPO) pompowaną przez laser impulsowy o długości nanosekund 532 nm do fantomu za pomocą wiązki włókien o średnicy 2 mm. Zamontuj to włókno na drugim stopniu mikrometrycznym i ustaw pod kątem 45° od osi akustycznej przed fantomem (Rysunek 1). Długość fali światła laserowego jest ustawiona na 680 nm, aby była widoczna do wyrównania. Po wyświetleniu należy ustawić oświetlenie laserowe za pomocą stolika mikrometrycznego w taki sposób, aby cel wyrównujący znajdował się centralnie w plamce lasera o średnicy 15 mm.
  10. Umieść mikroskop cyfrowy 20-90x (odległość robocza 90 mm) i źródło białego światła po przeciwnych stronach zbiornika na wodę prostopadłe do płaszczyzny propagacji przetwornika HIFU. Mikroskop jest zamontowany na małym stoliku mikrometrycznym. Ustaw go tak, aby metalowe wyrównanie, do którego dąży się, znajdowało się centralnie i było ostre w swoim polu widzenia (5x6 mm).
    UWAGA: Po zakończeniu powyższej procedury wszystkie elementy tego systemu (przetwornik HIFU, hydrofon, oświetlenie laserowe i mikroskop) są teraz ustawione w określonym miejscu. Fantom wyrównania można teraz zastąpić fantomami naśladującymi tkanki używanymi w badaniu. Ponieważ fantom jest zamontowany w uchwycie przymocowanym do systemu pozycjonowania 3D, można celować w różne obszary przy zachowaniu wyrównania.

4. Wykrywanie progu kawitacji za pomocą pulsacyjnych ekspozycji HIFU

UWAGA: Następująca procedura jest taka sama dla fantomów z nanocząstkami lub bez nich i powinna być powtórzona trzy razy.

  1. Upewnij się, że system PCD jest podłączony po odłączeniu w celu przeprowadzenia procedury wyrównania opisanej w ppkt 3.8 i dostosuj długość fali lasera do SPR nanocząstek. Korzystając z niestandardowego programu sterującego, ustaw generator funkcyjny tak, aby wytwarzał 10-cyklową (3 μs) serię HIFU, która jest zsynchronizowana z systemem laserowym. Użyj również tego programu, aby ustawić fluencję lasera na 0,4, 1,1, 2,1 lub 3,4 mJ/cm2, zmieniając czas między wyzwoleniem błysku lampy błyskowej a otwarciem przełącznika Q w systemie laserowym.
  2. Celuj w pik ogniskowy systemu HIFU na głębokość 10 mm w głąb fantomu i w 13 unikalnych miejscach, w odstępach 5 mm, w kierunku pionowym. W każdym z tych miejsc należy przeprowadzić ekspozycję przy pojedynczym szczytowym ujemnym ciśnieniu HIFU, z czterema fluencjami lasera określonymi w ppkt 4.2.
  3. Zakres szczytowych podciśnień należy stosować w następujących warunkach ekspozycji: laser włączony w fantomie wolnym od nanocząstek, wyłączony laser w fantomie nanocząstkowym, wyłączony laser w fantomie nanocząstek i włączony laser w fantomie nanocząstek. Aby zasymulować "pozorowaną" ekspozycję lasera, uruchom system zgodnie z opisem, ale wyłącz ręczną migawkę na wyjściu OPO. Takie podejście zapewni, że wszelkie generowane zakłócenia RF będą nadal obecne w systemie PCD.
  4. Zaprogramuj wszystkie ustawienia i pozycje ekspozycji w programie sterującym, a następnie wykonaj, aby wykonać te pomiary. Dane PCD są digitalizowane i przechowywane bezpośrednio za pomocą karty akwizycji danych do przetwarzania końcowego. Dla każdego parametru ekspozycji pobieranych jest 500 powtórzeń ekspozycji6.
  5. Przetwarzanie emisji szerokopasmowych wykrytych przez system PCD z krótkotrwałych ekspozycji na HIFU do fantomów przy użyciu techniki opisanej przez McLaughlana i wsp. (2017)6.

5. Denaturacja termiczna z ekspozycji na HIFU falami ciągłymi

UWAGA: Następująca procedura jest taka sama dla fantomów z nanocząstkami lub bez nich i została powtórzona trzy razy.

  1. Ustaw system laserowy tak, aby dawał fluencję 3,4 mJ/cm2, a generator funkcyjny tak, aby dawał ekspozycję CW (każda seria 330 000 cykli jest synchronizowana z impulsem laserowym). W 11 unikalnych miejscach fantomu wybierz szczytowe podciśnienie 0,20, 0,62, 0,91, 1,19, 1,43, 1,69, 1,92, 2,13, 2,34, 2,53 lub 2,71 MPa.
  2. Użyj całkowitego czasu ekspozycji wynoszącego 17 s, aby uzyskać 1 s linii bazowej przed i po 15 s ekspozycji CW HIFU w fantomie. W tym całkowitym czasie ekspozycji system akwizycji danych rejestruje dane PCD. Mikroskop jest podłączony do komputera sterującego, a klatki obrazu są rejestrowane w tym czasie, aby zapewnić bezpośrednią wizualizację powstawania zmian termicznych.
  3. Powtórzyć proces opisany w ppkt 4.3 dla wszystkich różnych warunków narażenia opisanych w ppkt 4.4.
  4. Przetwarzaj wszystkie dane PCD w trybie off-line, aby obliczyć dawkę kawitacji bezwładnościowej25 dla każdej ekspozycji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie kawitacji z pulsacyjnych ekspozycji HIFU

Pasywny system detekcji kawitacji rejestrował dane dotyczące napięcia/czasu dla zakresu ekspozycji HIFU i laserowej zarówno w fantomach z nanocząstkami, jak i bez nich. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki dla różnych ekspozycji. Skale czasowe na tych powierzchniach są obcięte w celu podkreślenia regionów, w których spodziewane byłyby szerokopasmowe emisje akustyczne ze względu na czas przelotu tych emisji. Rysunek 2 pokazuje, że tylko wtedy, gdy występuje kombinacja nanocząstek, ekspozycji na HIFU i oświetlenia laserowego, wykrywane są emisje szerokopasmowe. Jest to jednak nadal zjawisko progowe, ponieważ przy niższym ciśnieniu akustycznym dla Rysunek 2h nie wykryto emisji szerokopasmowych. Czas trwania tych emisji zazwyczaj odpowiada długości ekspozycji na HIFU, która w tym badaniu wynosiła około 10 μs.

Denaturacja termiczna spowodowana ekspozycją na HIFU CW

Rysunek 3 pokazuje serię klatek uzyskanych z kamery uniwersalnej magistrali szeregowej (USB) podczas pojedynczej ekspozycji HIFU z oświetleniem laserowym, dla trzech różnych typów ekspozycji (z/bez oświetlenia laserowego i/lub nanocząstek). Rysunek ten przedstawia przykład powstawania zmian termicznych w fantomach żelu dla każdego z tych stanów. W tym widoku ekspozycja HIFU odbywa się od lewej do prawej. Dla przykładu pokazanego w Rysunek 3 szczytowe podciśnienie wynosiło 2,53 MPa, co było górną krawędzią tego, co zostało użyte w tym badaniu.

Rejestrowanie dawki kawitacji inercyjnej (ICD) z ekspozycji na CW HIFU

Rysunek 4 pokazuje reprezentatywne wyniki z obliczeń ICD zarejestrowanych podczas ekspozycji CW HIFU. Dane te zostały przetworzone na podstawie emisji zarejestrowanych przez system PCD podczas ekspozycji. Rysunki 4a, 4c i 4e pokazują, że przy niższym szczytowym ujemnym ciśnieniu nie wykryto żadnych emisji szerokopasmowych, podczas gdy rysunki 4b, d i f pokazują, że ICD było rejestrowane przez cały czas ekspozycji. Najwyższe sygnały ICD zaobserwowano podczas ekspozycji w żelu zawierającym nanocząstki zarówno przy ekspozycji na HIFU, jak i laserową (Rysunek 4f).

figure-results-1
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie aparatury doświadczalnej użytej w tym badaniu. Dla jasności mikroskop USB i źródło światła zostały pominięte, ale obszar widzenia jest zilustrowany niebieską przerywaną ramką. CNC - Komputerowe sterowanie numeryczne, AuNR - Złote nanopręty. Rysunek zaczerpnięty z McLaughlan et al. (2017)6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Przykład śladów napięcia zarejestrowanych za pomocą pasywnego systemu detekcji kawitacji podczas krótkich ekspozycji HIFU, z/bez jednoczesnego oświetlenia laserowego. W przypadku użycia fluencja lasera wynosiła 2,1 mJ/cm2 przy szczytowym podciśnieniu (a-c) 3,0, (d-f) 2,13 i (g-i) 1,43 MPa. LS - Laser, NR - nanocząstki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Pojedyncze klatki w czasie 0, 5, 10 i 15 s podczas ekspozycji HIFU zarejestrowanej przez mikroskop USB. Fluencja lasera wynosiła 3,4 mJ/cm2, a szczytowe podciśnienie 2,53 MPa. Sekwencja (a) była z ekspozycją laserową i w fantomie bez nanocząstek, (b) jest bez ekspozycji laserowej i w fantomie zawierającym nanocząstki, oraz (c) ma zarówno oświetlenie laserowe, jak i fantom zawierający nanocząstki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Obliczona dawka kawitacji bezwładnościowej (ICD) zarejestrowana podczas ekspozycji (a, b, e i f) z i (c i d) bez oświetlenia laserowego. Szczytowe podciśnienie wynosiło (a, c i e) 0,91 lub (b, d i f) 2,53 MPa. Fantom użyty w (a i b) nie zawierał żadnych nanocząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest podzielony na cztery oddzielne sekcje, opisujące wytwarzanie fantomu naśladującego tkanki, aż do ekspozycji na CW w nich w celu wytworzenia denaturacji generowanej termicznie. Ta denaturacja fantomów symuluje termicznie generowaną martwicę krzepnięcia, która występuje w tkankach miękkich narażonych na HIFU1. Przy ich produkcji ważne jest, aby stosunek APS i TEMED był taki, aby proces nie katalizował się zbyt szybko. Ponieważ proces ten jest egzotermiczny, im szybsze tempo, tym wyższa temperatura osiągnęła25 stopni, a tym samym mogła zdenaturować białka BSA przed ekspozycją. Stosunek APS do TEMED w tym protokole został ustawiony w taki sposób, że nie powinno to nastąpić, jednak formy można umieścić w lodowatej wodzie podczas polimeryzacji żelu, aby jeszcze bardziej zminimalizować tę możliwość.

Ponieważ protokół ten koncentruje się na zarodkowaniu kawitacji poprzez połączenie nanocząstek, oświetlenia laserowego i ekspozycji na HIFU, krytycznym krokiem w produkcji fantomów żelowych jest ich odgazowanie w próżni przez co najmniej 30 minut. Po wystawieniu na działanie HIFU (szczególnie ekspozycji na BST), nawet jeśli zmiana termiczna nie była obecna, ważne jest, aby celować w nowe miejsce w fantomach żelu, aby uniknąć wcześniej istniejących jąder. Podczas przesuwania fantomu za pomocą sterowanego komputerowo systemu translacji ważne jest, aby upewnić się, że głębokość ostrości HIFU (a tym samym wyrównany obszar) jest utrzymywana na stałym poziomie. Gwarantuje to, że poziomy ciśnienia HIFU i fluencji lasera są jednakowe dla każdego konkretnego parametru ekspozycji. W przypadku tego protokołu i po początkowym umieszczeniu uchwytu fantomu, jest on następnie przesuwany tylko w osi pionowej.

Wrażliwe na temperaturę żele naśladujące tkanki są szeroko stosowane przez społeczność badawczą HIFU25, ponieważ zapewniają wizualny mechanizm monitorowania powstawania zmian termicznych. Badanie to było pierwszym przykładem połączenia ich z nanocząstkami i zademonstrowania poprawy powstawania zmian chorobowych poprzez kontrolowaną aktywność kawitacyjną. Jednak, chociaż są klasyfikowane jako naśladujące tkanki ze względu na ich reakcję na temperaturę, zarówno ich tłumienie optyczne, jak i akustyczne nie jest. Ze względu na konieczność uwidocznienia powstawania zmian w żelach, fantomy są prawie przezroczyste, z lekkim żółtym odcieniem. Ponieważ fluencja lasera jest dostosowywana do tego, oznacza to, że światło lasera oświetlające obszar docelowy jest skolimowane, a nie dyfuzyjne, jak w przypadku normalnej tkanki. W związku z tym, aby umożliwić translację kliniczną, potrzebnych byłoby wiele źródeł oświetlenia, aby zapewnić wystarczającą płynność na powierzchni. Obecnie prace te są zgodne z wytycznymi22 dotyczącymi bezpiecznego stosowania laserów w przypadku kontaktu ze skórą. Ograniczyłoby to maksymalną fluencję lasera osiągalną na głębokości; W związku z tym technika ta początkowo byłaby odpowiednia do leczenia powierzchownych nowotworów, takich jak rak piersi lub głowy i szyi. Co więcej, nanocząstki plazmoniczne ukierunkowane na receptory powierzchniowe dla tego typu nowotworów mogą zapewnić zwiększoną selektywność w leczeniu. Jednak, mimo że jest to bardzo aktywny obszar badań, żadne takie cząstki nie są obecnie zatwierdzone do użytku klinicznego.

Zmierzono tłumienie akustyczne fantomów z nanocząstkami na poziomie 0,7±0,2 dB/cm6, a w porównaniu z wartością dla tkanek miękkich wynoszącą 3-4 dB/cm jest ono istotnie niższe. W związku z tym ogrzewanie spowodowane ekspozycją na HIFU w tych żelach byłoby niższe niż obserwowane w tkankach miękkich. Wykazano, że dodanie kulek szklanych do żelu zwiększa poziom tłumienia podobnie jak w przypadku tkanek miękkich25. Jednak w tym zastosowaniu takie podejście nie jest możliwe, ponieważ kulki te działałyby jako źródło zarodkowania dla aktywności kawitacyjnej nawet przy braku nanocząstek, a tym samym fałszywie przedstawiałyby próg kawitacji. Porównując efektywność grzewczą dla z wynikami badania przeprowadzonego przez Choi i wsp. (2013)25, zmiany termiczne powstawały w szczytowych zakresach ciśnienia 14 - 23 MPa (nie podano, czy było to szczytowe nadciśnienie czy ujemne ciśnienie). Ponieważ przeprowadzono to na częstotliwości 1,1 MHz, tłumienie fantomów było mniejsze niż w tym badaniu. Niemniej jednak podejście jądrkowane nanocząstkami w tym badaniu było w stanie wygenerować zmiany termiczne w tych fantomach przy ciśnieniach w zakresie od 1,19 do 3,19 MPa, wykazując w ten sposób zwiększoną wydajność w porównaniu z obecnymi metodologiami.

Przyszłe badania tej metodologii powinny być prowadzone w modelu in vivo , aby uwzględnić redukcję guza, perfuzję tkanek, ukierunkowanie molekularne nanocząstek i odpowiednie parametry tłumienia akustycznego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez grant EPSRC EP/J021156/1. Autor chciałby podziękować za wsparcie ze strony stypendium Leverhulme na wczesnym etapie kariery (ECF-2013-247).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednoelementowy przetwornik HIFUSonic ConceptsH-102
55dB Wzmacniacz mocyE& IA300
Generator funkcyjnyKeysight Technologies33250A
Hydrofon z membraną różnicowąPrecision Acoustics Ltd
Generator impulsów TTLQuantum Composers9524
Nd:YAG Laser impulsowyContinuumSurelite I-10
OPO PlusContinuumSurelite
Fibre BundleThorlabs IncBF20LSMA01
Czujnik energiiThorlabs IncES145C
NanoprętyNanopartzA12-40-850
Detektor szerokopasmowySonic ConceptsY-102
Filtr górnoprzepustowy 5 MHzAllen Avionics
40dB przedwzmacniaczSpectrum GmbHSPA.1411
14-bitowa karta akwizycji danychSpectrum GmbHM4i.4420x8
Dejonizowana filtrowana wodaMilliQ
Roztwór akrylamidu/bis-akrylamiduSigmaAldrich A9927
1 mol/L Bufor TRISSigma AldrichT2694
Nadsiarczan amonuSigma AldrichA3678
Surowica bydlęca albuminaSigma AldrichA7906
TEMEDSigma AldrichT9281
Drukarka 3DCEL-UK CEL-UKRobox
3-osiowy system pozycjonowaniaMikroskop cyfrowy Zolix
Dino-liteAM4113TL
ZbiornikakrylowyMuji
ElementyoptyczneThorlabs IncRóżne
komponenty optomechaniczneThorlabs IncRóżne
BNCRS
Desktop PCNiestandardowe
mieszadło z płytą grzejnąFisher
SBench6Spectrum GmbHOprogramowanie pomiarowe
Zbiornik na wodę

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ter Haar, G. Ultrasound focal beam surgery. Ultrasound in Medicine and Biology. 21 (9), 1089-1100 (1995).
  2. Kennedy, J. E. High-intensity focused ultrasound in the treatment of solid tumours. Nature Reviews Cancer. 5 (4), 321-327 (2005).
  3. Rodrigues, D. B., Stauffer, P. R., Vrba, D., Hurwitz, M. D. Focused ultrasound for treatment of bone tumours. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 260-271 (2015).
  4. Wang, T. R., Dallapiazza, R., Elias, W. J. Neurological applications of transcranial high intensity focused ultrasound. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 285-291 (2015).
  5. Ebbini, E. S., Ter Haar, G. Ultrasound-guided therapeutic focused ultrasound: current status and future directions. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 77-89 (2015).
  6. McLaughlan, J. R., Cowell, D. M., Freear, S. Gold nanoparticle nucleated cavitation for enhanced high intensity focused ultrasound therapy. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015004(2017).
  7. Neppiras, E. A. Acoustic cavitation series: part one: Acoustic cavitation: an introduction. Ultrasonics. 22 (1), 25-28 (1984).
  8. Shaw, A., Martin, E., Haller, J., ter Haar, G. Equipment measurement and dose-a survey for therapeutic ultrasound. Journal of Therapeutic Ultrasound. 4 (1), 7(2016).
  9. Leighton, T. The Acoustic Bubble. , Academic Press. (2012).
  10. McLaughlan, J., Rivens, I., Leighton, T., Ter Haar, G. A study of bubble activity generated in ex vivo tissue by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (8), 1327-1344 (2010).
  11. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound in Medicine and Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  12. Meaney, P. M., Cahill, M. D., Haar, ter, R, G. The intensity dependence of lesion position shift during focused ultrasound surgery. Ultrasound in Medicine and Biology. 26 (3), 441-450 (2000).
  13. Blum, N. T., Yildirim, A., Chattaraj, R., Goodwin, A. P. Nanoparticles formed by acoustic destruction of microbubbles and their utilization for imaging and effects on therapy by high intensity focused ultrasound. Theranostics. 7 (3), 694-702 (2017).
  14. Zhao, L. Y., Zou, J. Z., Chen, Z. G., Liu, S., Jiao, J., Wu, F. Acoustic cavitation enhances focused ultrasound ablation with phase-shift inorganic perfluorohexane nanoemulsions: an in vitro study using a clinical device. BioMed Research International. 2016, 7936902(2016).
  15. Devarakonda, S. B., Myers, M. R., Lanier, M., Dumoulin, C., Banerjee, R. K. Assessment of gold nanoparticle-mediated-enhanced hyperthermia using mr-guided high-intensity focused ultrasound ablation procedure. Nano Letters. 17 (4), 2532-2538 (2017).
  16. Coussios, C., Farny, C. H., Ter Haar, G., Roy, R. A. Role of acoustic cavitation in the delivery and monitoring of cancer treatment by high-intensity focused ultrasound (HIFU). International Journal of Hyperthermia. 23 (2), 105-120 (2007).
  17. McNally, L. R., Mezera, M., Morgan, D. E., Frederick, P. J., Yang, E. S., Eltoum, I. E., Grizzle, W. E. Current and emerging clinical applications of multispectral optoacoustic tomography (MSOT) in oncology. Clinical Cancer Research. 22 (14), 3432-3439 (2016).
  18. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs. Science. 338 (6075), 1458-1462 (2012).
  19. Cui, H., Yang, X. In vivo imaging and treatment of solid tumor using integrated photoacoustic imaging and high intensity focused ultrasound system. Medical Physics. 37 (9), 4777-4781 (2010).
  20. Li, W., Chen, X. Gold nanoparticles for photoacoustic imaging. Nanomedicine. 10 (2), 299-320 (2015).
  21. Lukianova-Hleb, E. Y., Kim, Y. S., Belatsarkouski, I., Gillenwater, A. M., O'Neill, B. E., Lapotko, D. O. Intraoperative diagnostics and elimination of residual microtumours with plasmonic nanobubbles. Nature Nanotechnology. 11 (6), 525-532 (2016).
  22. ANSI. Z136. 1. American national standard for the safe use of lasers. , American National Standards Institute, Inc. New York. (2007).
  23. McLaughlan, J. R., Roy, R. A., Ju, H., Murray, T. W. Ultrasonic enhancement of photoacoustic emissions by nanoparticle-targeted cavitation. Optics Letters. 35 (13), 2127-2129 (2010).
  24. Choi, M. J., Guntur, S. R., Lee, K. I., Paeng, D. G., Coleman, A. A tissue mimicking polyacrylamide hydrogel phantom for visualizing thermal lesions generated by high intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (3), 439-448 (2013).
  25. Chen, W. S., Brayman, A. A., Matula, T. J., Crum, L. A. Inertial cavitation dose and hemolysis produced in vitro with or without Optison. Ultrasound in Medicine and Biology. 29 (5), 725-737 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nukleacja kawitacyjnaultrad wi ki laserowefantomy imituj ce tkankipasywna detekcja kawitacjitworzenie zmian termicznychszerokopasmowe emisje akustycznefunkcjonalizacja nanocz steczekzwi kszanie skuteczno ci leczenia nowotwor w

Powiązane artykuły