Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

21.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58071

⸱

10 lipca 2018

 ,  , 
1Helsinki Institute of Life Science, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2School of Medicine and Institute for Science and Technology in Medicine, Keele University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Streszczenie

Mysia rogówka stanowi doskonały model do badania gojenia się ran. Rogówka jest najbardziej zewnętrzną warstwą oka, a zatem jest pierwszą obroną przed urazem. W rzeczywistości najczęstszym rodzajem urazu oka spotykanym w klinice jest ścieranie rogówki. W tym przypadku wykorzystujemy zadzior oczny, aby wywołać ścieranie, co skutkuje usunięciem nabłonka rogówki in vivo u znieczulonych myszy. Metoda ta pozwala na celowe i powtarzalne przerwanie nabłonka, pozostawiając inne obszary nienaruszone. Ponadto opisujemy wizualizację startego nabłonka za pomocą barwienia fluoresceiną i udzielamy konkretnych porad, jak uwidocznić startą rogówkę. Następnie śledzimy oś czasu gojenia się ran 0, 18 i 72 godziny po otarciu, aż do ponownego nabłonkowania rany. Model abrazji nabłonkowej uszkodzenia rogówki jest idealny do badań nad proliferacją komórek nabłonka, migracją i reepitelializacją warstw rogówki. Jednak ta metoda nie jest optymalna do badania aktywacji zrębu podczas gojenia się ran, ponieważ zadzior oczny nie przenika do warstw komórek zrębu. Metoda ta nadaje się również do zastosowań klinicznych, na przykład do przedklinicznych testów skuteczności leków.

Wprowadzenie

Warstwy nabłonkowe wielu organów są narażone na urazy. Jednak zawierają one również zdolność do kompensowania utraty tkanek poprzez gojenie się ran. Rogówka stanowi doskonały model do badania gojenia się ran. Tworzy zewnętrzną powierzchnię oka i zapewnia warstwę ochronną dla wrażliwej maszynerii oka. W ten sposób rogówka działa jako fizyczna bariera dla patogenów i utraty wody. Składa się z trzech warstw; nabłonek, zrąb i śródbłonek. Nabłonek rogówki tworzy najbardziej zewnętrzną warstwę rogówki. Komórki nabłonkowe utrzymują funkcję barierową rogówki, ściśle przylegając do siebie poprzez ścisłe połączenia1,2,3. Bezkomórkowa błona podstawna rogówki, błona Bowmana, oddziela nabłonek od rozległego zrębu, który zawiera oporne na leczenie keratocyty. Pod zrębem komórki śródbłonka kierują składniki odżywcze, wodę i tlen do górnej warstwy.

Otarcia rogówki są bardzo częste w klinice4. Urazy rogówki są różnorodne, ale w dużej mierze są spowodowane przez małe cząsteczki, takie jak kurz lub piasek, zadrapania lub inne ciała obce. Opisany tutaj protokół ma na celu odtworzenie klinicznie istotnego rodzaju ścierania nabłonka rogówki. W ten sposób protokół ten zapewnia kontrolowaną i przełomową metodę, którą klinicyści i naukowcy zajmujący się rogówką mogą wdrożyć w swoich własnych badaniach. Przeprowadziliśmy test naprawy uszkodzeń in vivo na mysiej rogówce poprzez ścieranie tkanki za pomocą stępionego zadzioru ocznego, Algerbrush II. W tym przypadku celujemy w ścieranie tylko do środkowego nabłonka rogówki i pozostawiamy pozostałe części narządu bez uszkodzeń. W związku z tym protokół jest idealny do badania dynamiki komórek nabłonka rogówki lub błony podstawnej podczas reepitelializacji, migracji komórek, proliferacji i różnicowania in vivo5. Ostatnio model ten został wykorzystany do analizy dynamiki komórek progenitorowych w rogówce myszy, a także do ujawnienia zdolności zróżnicowanych komórek nabłonka rogówki do przywrócenia niszy komórek macierzystych rogówki po urazie6,7. Po ścieraniu rogówka powraca do normalnej przezroczystości i wytrzymałości na rozciąganie. Co ciekawe, badanie in vitro wykazało, że reepitelializacja zachodzi bez zwiększonej proliferacji komórek8. Protokół ten opisuje oś czasu nieprzerwanego gojenia się mysiej rogówki. Metoda ta ma zatem zastosowanie do badania wpływu leków na wzorce i szybkość gojenia.

Rogówka była szeroko wykorzystywana do badań nad gojeniem się ran. Jednak wiele badań opierało się na innych modelach urazów. Dobrze ugruntowanym modelem uszkodzenia rogówki jest oparzenie alkaliczne, które wykonuje się poprzez nałożenie wodorotlenku sodu (NaOH) z bibułą filtracyjną lub bez na powierzchnię rogówki9. Narażenie na alkalia powoduje duże i rozproszone uszkodzenie, które wpływa nie tylko na nabłonek rogówki, ale także na spojówkę i zrąb9,10. Wykazano, że silne roztwory alkaliczne wywołują owrzodzenia rogówki, zmętnienie i neowaskularyzację9. Komórki zapalne atakują zrąb zazwyczaj w ciągu 6 godzin i pozostają tam do 24 godzin11. Dlatego uszkodzenie alkaliczne jest wskazaną metodą w badaniach związanych z aktywacją zrębu. Inny rodzaj urazu chemicznego można spowodować, nakładając dimetylosulfotlenek (DMSO) na rogówkę9,10. Inne powszechnie stosowane modele urazów obejmują rany cięte, które przenikają przez zrąb i rany keratektomii, które są ograniczone do górnej części zrębu 14,15. Metody te są również przydatne, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące gojenia się ran podścieliskowych. Różne modele urazów mają swoje zalety i wady. Ścieranie lub oczyszczanie nabłonka rogówki zostało po raz pierwszy opracowane przy użyciu stępionych skalpeli lub ostrzy na rogówkach ex vivo16. Ta metoda została później użyta in vivo na myszach, szczurach i królikach17,18,19,20,21,22. Za pomocą zadzioru ocznego (Rysunek 1), usuwamy tylko wybrany obszar nabłonka, pozostawiając resztę nabłonka nienaruszoną. W ten sposób możliwe jest precyzyjne ukierunkowanie usunięcia nabłonka na różne części rogówki. Ponadto wielkość ścieralności można ocenić za pomocą barwienia fluoresceiną. Ponadto w tym przypadku przestrzegamy zamknięcia ściernego w okresie gojenia.

Ta metoda ma kilka zalet, w tym precyzyjną lokalizację miejsca ścierania, co nie jest możliwe w przypadku urazów chemicznych, ii) ścieranie jest szybkie do wykonania, oraz iii) jest nieinwazyjne. W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą niekrewniaczą mysz NMRI jako model, jednak można ją zastosować do szerokiej gamy modeli genetycznych myszy, a także do szczura i królika, które są powszechnymi modelami używanymi do badania uszkodzeń ludzkiej rogówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są zatwierdzane przez krajową radę ds. eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj wszystkie roztwory i utrzymuj je w temperaturze pokojowej, chyba że wskazano inaczej. Postępuj zgodnie z przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów, aby pozbyć się zużytych materiałów i roztworów.
  2. Używaj stad niekrewniaczych NMRI i ICR, w wieku od 4 do 12 tygodni i dowolnej płci. W przypadku stosowania szczepu C57BL/6 należy postępować zgodnie z metodą przygotowania ketaminy-medetomidyny opisaną w kroku 1.3.2. W przypadku innych kroków postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w 1.3.3.-1.3.5.
  3. Lek weterynaryjny należy przygotować świeży i na czas przed rozpoczęciem operacji. Karprofen zostanie wykorzystany później, dlatego nie jest konieczne jego przygotowywanie w tym momencie.
    1. Aby przygotować roztwór ketaminy-medetomidyny do znieczulenia, należy zmieszać 0,375 ml (stężenie podstawowe 50 mg/ml) ketaminy (Ketaminol Vet) z 0,25 ml (stężenie podstawowe 1 mg/ml) medetomidyny (Cepetor Vet) i dodać 1,25 ml sterylnego 0,9% NaCl. Podawać 0,15 ml/20 g masy ciała myszy (7,5 mg/kg ketaminy i 1 mg/kg medetomidyny).
    2. Aby przygotować bardziej rozcieńczony roztwór ketaminy-medetomidyny do znieczulenia na myszach C57BL/6, wymieszaj 0,375 ml (stężenie podstawowe 50 mg/ml) ketaminy z 0,25 ml (stężenie podstawowe 1 mg/ml) medetomidyny i dodaj 2,5 ml sterylnego 0,9% NaCl. Podawać 0,15 ml/20 g masy ciała myszy (3,75 mg/kg, ketamina i 0,5 mg/kg medetomidyna).
      UWAGA: Jest to alternatywny krok, tylko dla dorosłych myszy C57BL/6.
    3. Aby przygotować buprenorfinę do analgezji, dodaj 0,1 ml (stężenie podstawowe 0,3 mg/ml) buprenorfiny do 1,9 ml sterylnego 0,9% NaCl. Podawać 0,2 ml/20 g masy ciała myszy (0,15 mg/kg).
    4. Aby przygotować atipamezol do przerwania znieczulenia, należy dodać 0,1 ml (stężenie podstawowe 5 mg/ml) atipamezolu do 4,9 ml 0,9% NaCl. Podawać 0,15 ml/20 g masy ciała myszy (0,75 mg/kg).
    5. Do znieczulenia w okresie po znieczuleniu należy stosować karprofen. Dodaj 0,1 ml (stężenie podstawowe 50 mg/ml) karprofenu do 4,9 ml 0,9% NaCl. Podawać 0,15 ml/20 g masy ciała myszy (7,5 mg/kg).
  4. Przygotuj fluorescencyjny roztwór barwiący
    1. Aby zobrazować ścieranie pod wpływem niebieskiego światła kobaltowego (Rysunek 1), użyj roztworu fluorescencyjnego. Przygotować 0,1% roztwór fluoresceiny, odmierzając najpierw 10 mg soli fluoresceiny za pomocą drobnej skali, a następnie dodać go do 10 ml w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS).
    2. Chronić roztwór fluoresceiny przed światłem i wstrząsać przez 5 minut na shakerze.
      UWAGA: Roztwór fluoresceiny jest wrażliwy na światło; Roztwór należy przykryć przed światłem. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze +4 °C przez 2-3 dni. Do użycia pomocne jest umieszczenie roztworu fluoresceiny w butelce z zakraplaczem, która jest używana do kropli do oczu. Podczas przenoszenia roztworu do butelki z zakraplaczem należy używać sterylnego filtra.
  5. Oczyść końcówkę zadziorów ocznych przed i po użyciu; najpierw za pomocą PBS, a następnie 70% EtOH. Jeśli podczas tej samej operacji robisz otarcie kilku myszy, wykonaj czynności czyszczenia między każdą myszą.
  6. Umieść podgrzaną płytę na (+37 °C) i połóż na niej ręcznik papierowy.

2. Ścieranie rogówki

UWAGA: Używaj odzieży ochronnej (rękawice, fartuch laboratoryjny) podczas obchodzenia się z myszami. Zważ mysz, aby oszacować objętość leku do podawania.

  1. Użyj metody jednoręcznego scruffingu, aby obsłużyć mouse23. Mieszaninę ketaminy i medetomidyny podawać dootrzewnowo (i.p.) do lewej dolnej części brzucha. Umieść mysz w indywidualnej klatce i poczekaj, aż zaśnie. Zwykle zajmuje to mniej niż 5 minut. Następnie należy podać najpierw buprenorfinę, a następnie atipamezol w zastrzykach dożylnych. Użyj tej samej techniki obsługi.
    UWAGA: Po podaniu znieczulenia protokół nie powinien być w żadnym momencie przerywany.
  2. Zanim przejdziesz dalej, sprawdź, czy podgrzewana płyta jest ciepła. Umieść znieczuloną mysz na rozgrzanej płycie. Poziom znieczulenia jest dobry, jeśli odruch ogonowy jest nieobecny, ale odruch palca u nogi jest obecny. Sprawdź te odruchy, szczypiąc ogon i dowolny palec u nogi palcami lub kleszczami. Nie używaj nadmiernej siły. Znieczulenie potrwa 20-25 minut.
  3. Aby wykonać ścieranie, użyj oczyszczonego zadzioru ocznego. Obróć podstawę zadziorów, aby włączyć wibracje, które są niezbędne do ścierania. Poczuj wibracje w dłoni, gdy zadziory działają prawidłowo.
    1. Otwieraj jedno oko na raz, trzymając powieki osobno palcami. Następnie mocno przyłóż zadzior do rogówki i przesuwaj instrument do przodu i do tyłu, a także na boki po powierzchni oka. Wibracje zadziorów wykonają zadrapanie; Nie należy naciskać, potrząsać ani rozrywać rogówki. W centralnej rogówce wystarczy 20 ruchów ścierających na powierzchni, aby wywołać ranę. Nie podnoś zadziorów i staraj się pozostać w okolicy rogówki, która ma być ścierana. Uzyskanie otarć o standardowej wielkości będzie wymagało kilku rund praktyki.

    UWAGA: Asepsę rogówki można osiągnąć przed ścieraniem za pomocą roztworu okulistycznego betadyny.

3. Obrazowanie ścierania

  1. Oświetl starty obszar za pomocą kobaltowego niebieskiego światła pisaka (Rysunek 1) i roztworu fluoresceiny. Powierzchnia oka wydaje się bezbarwna w świetle otoczenia. Po zastosowaniu fluoresceiny starty obszar fluoryzuje na zielono podczas oświetlania oka światłem pióra.
    1. W razie potrzeby otworzyć przetarte oko podobnie jak w ppkt 2.3 i podać jedną kroplę roztworu fluoresceiny z butelki z zakraplaczem. Przemyj oko raz PBS lub 0,9% NaCl, aby zmniejszyć tło fluoresceiny. Do mycia użyj butelki z zakraplaczem lub pipety. Odessaj płyn miękką chusteczką i w razie potrzeby wyczyść rzęsy. Nadmiar płynu zwykle gromadzi się na granicy nosa oka, w pobliżu ujścia kanału łzowego.
      UWAGA: Unikaj dotykania rogówki podczas przycinania, ponieważ może to spowodować drobne otarcia.
  2. Zrób zdjęcia otarcia rogówki.
    1. Aby uzyskać podobne obrazy podczas każdej sesji obrazowania, użyj narzędzi do stałego mocowania niebieskiej lampy pióra Cobalt i lustrzanki jednoobiektywowej (Rysunek 2). Ten protokół zapewnia konfigurację, która jest łatwa do powtórzenia (Rysunek 2).
      1. Aby przymocować latarkę piórkową i aparat, użyj odpowiednio lampy stołowej z elastycznym ramieniem i zaciskiem oraz regulowanego ramienia aparatu z zaciskiem. Przymocuj kablowo lampkę piórkową do lampy stołowej i umieść ją tuż nad okiem myszy. Odmienne ustawienie światła może zmienić wizualizację ścierania. Sugestia dotycząca rozmieszczenia tych narzędzi jest opisana w Rysunek 2.
    2. Użyj lustrzanki, aby zrobić zdjęcia oka. Umieść zwierzę w żądanej odległości i pozycji, a następnie ustaw ostrość aparatu (1:12) na świetle w pomieszczeniu. Następnie zamknij wszystkie inne lampki z wyjątkiem kobaltowego niebieskiego światła pióra.
      UWAGA: Przyklej uchwyt lampy pióra taśmą w dół lub użyj gumowej opaski, aby światło było włączone przez cały czas podczas obrazowania. Może to pomóc, jeśli obraz stanie się rozmazany. Najłatwiej jest wykonać etap obrazowania z kolegą.

4. Pobudka po otarciu rogówki

  1. Podawać najpierw buprenorfinę, a następnie atipamezol w zastrzykach dożylnych. Stosować tę samą technikę obchodzenia się, co w ppkt 2.1.
  2. Umieść kroplę przeciwbakteryjnej maści do oczu z kwasem fucydyny (Isathal) zarówno na starte, jak i niestarte oczy, aby nawilżyć i utrzymać powierzchnię oka w czystości od bakterii po znieczuleniu.
  3. Ponieważ mysz obudzi się w ciągu 5-20 minut na podgrzewanej płycie, obserwuj mysz w okresie budzenia po znieczuleniu. Kiedy stanie się mobilny, umieść go w osobnej klatce.
    UWAGA: Jeśli budzenie się trwa dłużej, umieść mysz w klatce z podgrzewaną podkładką lub umieść całą klatkę na podgrzewanej płycie i regularnie monitoruj mysz. Podczas gdy znieczulenie mija, mysz zazwyczaj trzęsie się i sięga w górę wraz z przednim ciałem. To zachowanie powinno wrócić do normy w ciągu 3-4 godzin, a następnie możesz umieścić mysz z powrotem we wspólnej klatce.
  4. Karprofen i.p. należy podawać w celu znieczulenia i maści do oczu przez dwa kolejne dni po ścieraniu, podobnie jak w krokach 2.2 i 4.2.

5. Obrazowanie podczas gojenia się ran

  1. W tym protokole należy użyć punktów czasowych 18 h i 72 h po ścieraniu, aby obserwować zamknięcie rany.
    1. W przypadku sekwencyjnego obrazowania należy znieczulić myszy, jak wyjaśniono w 2.2.
    2. Rób zdjęcia zgodnie z opisem w punkcie 3.
    3. Obudź zwierzęta za pomocą atipamezolu i.p. i monitoruj okres budzenia, jak wyjaśniono w 4.3.
      UWAGA: Jeśli kontynuacja nie jest kontynuowana, należy poddać mysz eutanazji zaraz po 5.1.2. Eutanazja jest opisana w 6.1.

6. Pobieranie rogówki i osadzanie parafiny

  1. Po ostatnim punkcie czasowym poświęć zwierzę. Umieść mysz w komorze, którą można napełnić CO2 . Napełnij powietrze w komorze CO2 . Gdy zwierzę jest nieruchome, zwichnij kręgi szyjne, mocno pociągając za podstawę ogona i jednocześnie dociskając okolicę szyi w dół.
    UWAGA: Zawsze postępuj zgodnie z wytycznymi lokalnego organu ds. dobrostanu zwierząt.
  2. Zbierz całą gałkę oczną, wycinając otwór w skórze z boku oka za pomocą nożyczek preparacyjnych. Umieść nożyczki pod gałką oczną i przetnij nerw oczny, aby wyskoczyć gałki ocznej z orbity. Użyj kleszczy, jeśli oko nie wychodzi łatwo.
    1. Wykonaj otwór z tyłu oka, po stronie siatkówki, za pomocą igły 26G, aby umożliwić swobodną penetrację roztworów do wnętrza oka.
      UWAGA: Nie pozwól, aby oko stało się suche, zamiast tego umieść je w PBS, aż do kontynuowania protokołu.
  3. Zebrać gałkę oczną do probówki o pojemności 2 ml z PBS. Nie przerywaj eksperymentu w tym momencie.
  4. Usuń PBS i utrwal gałki oczne w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze +4 °C przez 4-5 godzin.
  5. Przenieś nieruchomą gałkę oczną do kasety na tkanki w celu przetwarzania tkanek. Użyj maszyny do przetwarzania tkanek i następującego programu:
    1. Spłucz PBS.
    2. Inkubować 2 x 45 min w 70% etanolu w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować 2 x 1 h w 94% etanolu w temperaturze pokojowej.
    4. Inkubować 3 x 45 min w absolutnym etanolu w temperaturze pokojowej.
    5. Inkubować 3 x 1 h w ksylenie, w temperaturze pokojowej, a na koniec ksylen w temperaturze 37 °C.
    6. Inkubować 3 x 1 h w wosku parafinowym w temperaturze 60 °C.
  6. Po przetworzeniu tkanki zanurzyć gałkę oczną w ciekłej parafinie (+ 60 °C) za pomocą bloku do zatapiania tkanek. Umieść oko wewnątrz bloku tak, aby patrzyło na boki, a krawędź obwodowa była skierowana do góry. Pozwól blokowi zestalić się na chłodnym talerzu przez 5-10 minut.

7. Parafinowe przekroje rogówki

  1. Przygotować mikrotom do cięcia zgodnie z instrukcjami instytucji lub producenta.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z ostrym ostrzem mikrotomu.
  2. Umieść jedną łaźnię wodną z ultraczystą wodą o temperaturze pokojowej obok mikrotomu, a drugą z wodą ultraczystą podgrzaną do +50 °C.
  3. Wykonaj skrawki gałki ocznej o grubości 5 μm.
    UWAGA: Soczewka łatwo pęka podczas cięcia. Aby tego uniknąć, przetrzyj powierzchnię cięcia wilgotną chusteczką za każdym razem, gdy rozpoczyna się nowy rząd sekcji. Użyj wody z kranu, aby zwilżyć chusteczkę.
  4. Umieść sekcje obok siebie w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, a następnie przenieś je do łaźni wodnej z gorącą wodą za pomocą szkiełka podstawowego. Rozciągnij skrawki w gorącej kąpieli wodnej, aż wszystkie zmarszczki się rozluźnią, a skrawki staną się matowe.
  5. Szkiełka podstawowe z sekcjami wysuszyć przez noc w temperaturze +37 °C.
  6. Przymocuj sekcje do szkiełek, trzymając szkiełko przez 1 minutę na podgrzewanej płycie w temperaturze +60 °C. Następnie skrawki można bezpośrednio przetworzyć do barwienia, metod immunohistologicznych lub przechowywać w temperaturze +4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje model wywoływania urazu ściernego rogówki myszy oraz sugeruje sposób monitorowania i wizualizacji procesu gojenia po takim urazie. Niedawno wykorzystaliśmy tę metodę do badania roli komórek progenitorowych nabłonka rogówki podczas gojenia ran6. Wykorzystanie sprawdzonych narzędzi jest kluczem do sukcesu eksperymentu z uszkodzeniem ściernym. My, podobnie jak inni badacze, stosowaliśmy wiertarkę okulistyczną Algerbrush II (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody ranienia są popularnymi narzędziami do badania różnych aspektów homeostazy i patologii rogówki. Model abrazyjny oferuje dobrze kontrolowaną metodę rozwiązywania istotnych problemów w okulistyce. Warto jednak podkreślić pewne krytyczne punkty w protokole. Warto zauważyć, że szczegółowe informacje dotyczące medycyny weterynaryjnej, harmonogramu gojenia się ran i wyników są zoptymalizowane do stosowania z niekrewnymi stadami NMRI i ICR, ale mogą się różnić w zależności od szczepu myszy26. Dzię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Kaisie Ikkala za jej nieocenioną pomoc techniczną i wnikliwą pomoc podczas aktualizowania tej metody, jak również później podczas implementacji naszych głównych pytań badawczych. Dziękujemy również Zwierzętom Laboratoryjnym oraz Annie Meller za pomoc w zaplanowaniu wytycznych pracy weterynaryjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysz NMRIEnvigo275
0,9% NaClużywać sterylnej
MedetomidineVetmedicVnr087896Nazwa rynkowa: Cepetor
Vet KetamineIntervetVnr511485Nazwa rynkowa: Ketaminol Vet
BuprenorfinInvidior3015248Nazwa rynkowa: Temgesic
AtipamezolOrion PharmaVnr471953Nazwa rynkowa: Antisedan Vet
CarprofenNorbrookVnr027579Nazwa rynkowa: Norocarp Vet
1% maść do oczu z kwasem fucidynyDechraVnr080899Nazwa handlowa: Sól izosalowa
FluoresceinaSigma-AldrichF6377
RoztwórPBS
Zadziory do oczu Algerbrush ii ( Końcówka 0,5 mm)Algerbrush6.39768E+11
Cobalt Blue pen lightSP ServicesDE/003
Płyta grzejnaKunz Instruments2007-0217
Lustrzanka cyfrowaNikonD80
Regulowane ramię i zacisk aparatuNeewer10086132Wysokość 28 cm
Lampa stołowa z elastycznym ramieniem i zaciskiemPrisma
Miękka chusteczkaKimtechScience7552
Komora
Zestaw narzędzi do preparowanianarzędziami
Beckton Dickinson303172
26GBeckton Dickinson303800
2 ml Probówka EppendorfSarstedt689
Kaseta na tkankiSakura Finetech4118F
Maszyna do przetwarzania tkanek ASP200SLeica
XyleneVWRUN1307
Wosk parafinowyMilliporeK95523361
Forma do zatapiania tkanek 32 x 25 x 6 mmSakura Finetech4123
MicrotomMicromHM355
Kąpiel wodna do cięciaOrthex60591
Kąpiel wodna do cięciaLeicaHI1210
Ostrze mikrotomuFeatherS35
Szkiełkoszklane Th.Geyer GmbH & Co.7,695,019
Woda ultraczystaMilliporeMPGP04001MilliQ
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127PFA
soli fizjologicznej buforowany fosforanem CO2 Strzykawki z do nauki Igły

Bibliografia

  1. Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
  2. Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
  3. Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
  4. Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713(1960).
  5. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  6. Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
  7. Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
  8. Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936(2012).
  9. Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  10. Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
  11. Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  12. Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370(2015).
  13. Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505(2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262(2013).
  16. Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
  17. Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
  18. Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
  19. Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776(2015).
  20. Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
  21. Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
  22. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  23. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
  24. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  25. Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
  26. Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
  27. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
  28. Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).
  29. Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
  30. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zdarta rogówkabarwienie fluoresceinąnabłonek rogówkireepitelializacjamodel zwierzęcyrana rogówkiuszkodzenie nabłonkaobrazowanie fluorescencyjne
Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.