Artykuł metodologiczny

Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości fikobiliproteiny w Cyanobacterium synechocystis

DOI:

10.3791/58076

⸱

11 września 2018

 ,  ,  , 
1Department of Adaptive Biotechnologies, Global Change Research Institute, Czech Academy of Sciences, 2Department of Plant Physiology, Faculty of Science, Masaryk University, 3Laboratory of Intracellular Regulation, Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego określania zawartości fikobiliproteiny w cyjanobakterii Synechocystis za pomocą metody spektrofotometrycznej. Procedura ekstrakcji została również z powodzeniem zastosowana do innych szczepów sinic i glonów; Jednak ze względu na różnice w widmach absorpcji pigmentu konieczne jest przetestowanie równań spektrofotometrycznych dla każdego szczepu indywidualnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest prosty protokół do ilościowego oznaczania zawartości fikobiliproteiny w modelu cyjanobakterii Synechocystis. Fikobiliproteiny są najważniejszymi składnikami fikobilisomów, głównych czułków zbierających światło u cyjanobakterii i kilku taksonów glonów. Fikobilisomy Synechocystis zawierają dwie fikobiliproteiny: fikocyjaninę i allofikocyjaninę. Protokół ten opisuje prostą, wydajną i niezawodną metodę ilościowego oznaczania zarówno fikocyjaniny, jak i allofikocyjaniny w tym modelu cyjanobakterii. Porównaliśmy kilka metod ekstrakcji fikobiliprotein i spektrofotometrycznej kwantyfikacji ilościowej. Procedura ekstrakcji opisana w tym protokole została również z powodzeniem zastosowana do innych szczepów sinic, takich jak Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp. i Nostoc sp., a także do krasnorostów Porphyridium cruentum. Jednak współczynniki ekstynkcji określonych fikobiliprotein z różnych taksonów mogą się różnić, dlatego zaleca się walidację metody spektrofotometrycznej kwantyfikacji dla każdego szczepu z osobna. Protokół zajmuje niewiele czasu i może być wykonany w każdym standardowym laboratorium nauk przyrodniczych, ponieważ wymaga tylko standardowego sprzętu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fFikobiliproteiny to rozpuszczalne w wodzie kompleksy pigmentowo-białkowe, które reprezentują główne składniki anten zbierających światło u prokariotycznych cyjanobakterii (Cyanophyta) i kilku taksonów eukariotycznych (Glaucophyta, Rhodophyta, and Cryptophyta)1. Występują głównie jako kompleksy supramolekularne zwane fikobilisomami i są zwykle przyczepione do powierzchni błon fotosyntetycznych po stronie zrębu, z wyjątkiem Cryptophyta, gdzie fikobiliproteiny są zlokalizowane w świetle tylakoidów2. Do tej pory zidentyfikowano cztery typy fikobiliprotein: podstawową allofikocyjaninę oraz obwodową fikocyjaninę, fikoerytrynę i fikoerytrocyjaninę1. Jako główne kompleksy zbierające światło, fikobilisomy stanowią jeden z kluczowych czynników produktywności masowych kultur glonów i sinic. Wykazano, że obcinanie fikobilisomów może zwiększyć akumulację biomasy w silnym świetle3. Z drugiej strony, przy umiarkowanym lub niskim natężeniu promieniowania, obcięcie anteny skutkowało tempem wzrostu i zmniejszeniem akumulacji biomasy3,4. Fikobiliproteiny są komercyjnie stosowane jako barwniki spożywcze, farmaceutyki i dodatki do żywności, w przemyśle kosmetycznym oraz jako sondy fluorescencyjne z zastosowaniami w cytometrii przepływowej, fluorescencyjnych testach immunologicznych i mikroskopii fluorescencyjnej5.

Ten protokół skupia się na ilościowym określaniu fikobiliprotein w modelu cyjanobakterii Synechocystis. Sinice są najwcześniejszymi tlenowymi autotrofami fotosyntetycznymi; tworzą biosferę Ziemi od ponad 2,4 miliarda lat6. Odgrywają kluczową rolę w globalnych cyklach biogeochemicznych azotu, węgla, tlenu i innych pierwiastków. Wśród sinic jednokomórkowy szczep Synechocystis zyskał wyjątkową pozycję, ponieważ był pierwszym cyjanobakterią z całym genomem zsekwencjonowanym7,8, jest naturalnie przekształcany przez egzogenne DNA9, i osiąga stabilny i stosunkowo szybki wzrost10,11. W Synechocystis główny składnik anteny, allofikocyjanina, jest związana z integralnymi białkami błonowymi, a przyłączona fikocyjanina znajduje się na obrzeżach błony tylakoidowej.

W ramach tego protokołu porównano kilka metod ekstrakcji i kwantyfikacji fikobiliprotein. Końcowa procedura ekstrakcji została z powodzeniem zastosowana do Synechocystis, a także do innych szczepów sinic, w tym Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp. i Nostoc sp., a także została z powodzeniem zastosowana do krasnorostów Porphyridium cruentum. Dlatego metodę opracowaną w tym protokole można uznać za uniwersalną metodę ekstrakcji fikobiliproteiny. Mimo że niektóre z testowanych metod ekstrakcji skutkowały wyższymi całkowitymi wydajnościami białka, opisana tutaj procedura ekstrakcji zapewniła najwyższą wydajność fikobiliproteiny wraz z najniższą zawartością reszty chlorofilu A w ekstrakcie fikobiliproteiny. Zmniejszenie zawartości chlorofilu a było niezbędne do prawidłowej spektrofotometrycznej kwantyfikacji fikocyjaniny i allofikocyjaniny.

Widma absorpcji fikobiliprotein mogą się znacznie różnić między różnymi gatunkami glonów i sinic12,13,14,15,16,17, a nawet wśród kilku szczepów jednego rodzaju sinic18. W związku z tym określone długości fal i współczynniki absorpcji stosowane do oznaczania fikocyjaniny i allofikocyjaniny w Synechocystis nie mają ogólnego zastosowania do innych szczepów. Dodatkowo Synechocystis nie zawiera fikoerytryny i fikoerytrocyjaniny, które można znaleźć w niektórych innych algach i sinicach. Do celów oznaczania fikobiliprotein w szczepach innych niż Synechocystis zaleca się ocenę równań spektrofotometrycznych dla każdego szczepu indywidualnie.

Chociaż protokół zawiera dwa dłuższe etapy (nocne liofilizację granulek komórkowych i 1-godzinną ekstrakcję białka), całkowity czas pracy nad kwantyfikacją fikobiliprotein nie przekracza 2 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa sinic

  1. Hoduj komórki Synechocystis w kolbach Erlenmeyera lub w fotobioreaktorach10,19 w buforowanym podłożu BG1120, aby utrzymać pH < 10 (np. przy użyciu 17 mM HEPES10).
    UWAGA: Standardowe warunki uprawy wymagają kontrolowanej temperatury (zazwyczaj 30 °C, optymalna temperatura to 35 °C)21, oświetlenia (zazwyczaj białe światło o intensywności do 800 μmol[fotonów]/[m2·s])21, oraz zasilania CO2 (w fotobioreaktorze z płaskim panelem o pojemności 400 ml stężenie CO2 nasycające wzrost wynosi 1,700 ppm)21.
  2. Aby określić gęstość hodowli, należy zmierzyć gęstość optyczną kultury spektrofotometrycznie przy 730 nm (OD730) przy użyciu kuwety o drodze światła 1 cm. Alternatywnie, należy policzyć komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.

2. Przygotowanie próbek

  1. Pracuj przy niskim natężeniu promieniowania, aby zapobiec degradacji fikobiliprotein.
  2. Zebrać 3 x 1 ml zawiesiny hodowlanej do probówek z bezpieczną blokadą. Do oszacowania błędów technicznych w pomiarze należy użyć trzech powtórzeń. Aby pobrać próbkę kultury w sterylnych warunkach, należy zebrać komórki w okapie laminarnym i postępować zgodnie z właściwymi praktykami pracy i bezpieczeństwa.
  3. Odwirować komórki przy 15 000 x g w temperaturze laboratoryjnej przez 5 minut. Zwrócić uwagę na odpowiednio wyważony wirnik wirówki. Po odwirowaniu wyrzucić supernatanty. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
  4. Umieść próbki w zamrażarce. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Jest to konieczne, aby zapobiec degradacji fikobiliproteiny. Do krótkotrwałego przechowywania wystarczy -20 °C.
  5. Próbki należy liofilizować przez noc. Aby proces liofilizacji przebiegał prawidłowo, należy utrzymywać temperaturę skraplacza liofilizatora poniżej -60 °C, a ciśnienie w komorze liofilizatora około 1 hPa.
  6. Po zakończeniu cyklu liofilizacji należy jak najszybciej zamknąć rurkę, aby zapobiec ponownemu wchłonięciu wody z powietrza.

3. Homogenizacja komórek i ekstrakcja pigmentów

  1. Dodać cztery kawałki szklanych kulek (o średnicy 2 mm) do każdej probówki z próbką i zamknąć probówki.
    UWAGA: Gdy pokrywka rurki z blokadą bezpieczeństwa używaną do homogenizacji jest zbyt cienka, może pęknąć podczas homogenizacji; Dlatego do tego protokołu zalecane są tylko rurki Safe-lock z mocnymi pokrywkami.
  2. Homogenizować próbki z kulkami szklanymi przez 15 s na homogenizatorze w temperaturze laboratoryjnej.
    UWAGA: Prawidłowo zhomogenizowaną próbkę rozprowadza się na całej wewnętrznej powierzchni probówek z bezpiecznym zamkiem.
  3. Dodać 1 ml buforu PBS (pH 7,4), wstępnie schłodzonego do temperatury 4 °C, do próbek w celu ekstrakcji fikobiliprotein.
    UWAGA: Od tego kroku należy przechowywać próbki na lodzie, aby zapobiec degradacji wyekstrahowanych białek. Ma to kluczowe znaczenie.
  4. Mieszać próbki z PBS przez 5 s na homogenizatorze w temperaturze laboratoryjnej.
    UWAGA: Po wymieszaniu próbki są zielonkawe.
  5. Po wymieszaniu próbki należy przechowywać na lodzie przez 60 minut. Przykryć łaźnię lodową pokrywką, aby zapobiec degradacji pigmentów.
  6. Po 60 minutach ekstrakcji fikobiliproteiny odwirować próbki w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zwrócić uwagę na prawidłowe wyważenie wirnika wirówki.
    UWAGA: Po odwirowaniu supernatant ma niebiesko-niebieską barwę.

4. Kwantyfikacja fikobiliprotein

  1. Przed pomiarem spektrofotometrycznym należy skalibrować spektrofotometr do linii podstawowej, używając buforu PBS jako ślepej próby.
  2. Po skalibrowaniu spektrofotometru należy wyrzucić PBS z jednej kuwety spektrofotometru i odpipetować supernatant z wyekstrahowanymi fikobiliproteinami zamiast z wyrzuconym buforem.
  3. Określić ilościowo stężenie fikobiliproteiny spektrofotometrycznie, używając szczeliny o szerokości 0,5 nm.
    1. Zmierzyć absorbancję fikocyjanobilin w fikocyjaninie i allofikocyjaninie w stosunku do ślepej próby buforowej PBS odpowiednio przy 615 nm (A615) i 652 nm (A652) oraz zmierzyć absorbancję resztek komórkowych przy 720 nm (A720).
    2. Oblicz stężenie fikocyjaniny i allofikocyjaniny zgodnie z równaniami (1) i (2) Bennetta i Bogorad12:
      figure-protocol-1
      figure-protocol-2
      UWAGA: A615, A652 i A720 powinny pasować do liniowego zakresu absorbancji spektrofotometru. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę buforem PBS.
  4. Ponownie obliczyć stężenie pigmentu w oryginalnych próbkach. Stężenie pigmentu w próbce odpowiada bezpośrednio wynikom równań (1) i (2), gdy do analizy używa się 1 ml kultury i 1 ml buforu ekstrakcyjnego. W przypadku stosowania różnych objętości próbek sinic i/lub buforu PBS, końcowe stężenie pigmentu należy obliczyć zgodnie z równaniem (3):
    figure-protocol-3 (3)
    UWAGA: W przypadku normalizującej zawartości fikobiliprotein na suchą masę komórki, końcowe stężenie pigmentu należy obliczyć zgodnie z równaniem (4)figure-protocol-4 (4)

5. Określanie suchej masy komórki (opcjonalnie)

  1. Zważyć trzy puste probówki z zabezpieczoną blokadą na wadze analitycznej.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby rurki safe-lock były suche. W przypadku przechowywania probówek w wilgotnym środowisku, przed ich zważeniem należy wysuszyć probówki przez kilka godzin w liofilizatorze. Manipuluj probówkami delikatnie i tylko rękami w rękawiczkach bezpudrowych, aby uniknąć kontaktu materiału z palcami badacza. Utrzymuj wszystkie uchwyty i wirówkę w czystości, aby uniknąć przeniesienia jakiegokolwiek materiału do probówek.
  2. Próbka 1 x 15 ml zawiesiny hodowlanej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować zawiesinę hodowli w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml przy 4 000 x g w temperaturze laboratoryjnej przez 10 minut. Zrównoważyć rotor wirówki trzema dodatkowymi stożkowymi probówkami o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 15 ml wody. Po odwirowaniu wyrzucić 12 ml supernatantu.
  4. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze i przenieść 3 x 1 ml mieszaniny do trzech probówek o pojemności 1,5 ml z pipetą. W przypadku, gdy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml pozostaną resztki osadu, należy dodać 1,5 ml wody dejonizowanej do stożkowej probówki, przemieszać lub wstrząsnąć probówką w celu ponownego zawieszenia pozostałej osadki i przenieść 3 x 0,5 ml mieszaniny do trzech 1,5 ml probówek z zabezpieczeniem typu safe-lock (zawierających już 3 x 1 ml osadu) za pomocą pipety.
    UWAGA: Podzielenie granulatu na trzy probówki safe-lock o pojemności 1,5 ml pozwoli na oszacowanie wszelkich błędów technicznych pomiaru suchej masy.
  5. Odwirować komórki w probówkach safe-lock o pojemności 1,5 ml przy 15 000 x g w temperaturze laboratoryjnej przez 5 minut. Zrównoważyć rotor wirówki z dodatkową probówką safe-lock o pojemności 1,5 ml zawierającą 1 ml wody. Po odwirowaniu wyrzucić supernatanty.
  6. Umieść próbki w zamrażarce. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C; do krótkotrwałego przechowywania wystarczy -20 °C.
  7. Próbki należy liofilizować przez noc. Aby proces liofilizacji przebiegał prawidłowo, należy utrzymywać temperaturę skraplacza liofilizatora poniżej -90 °C, a ciśnienie w komorze liofilizatora około 1 hPa.
  8. Po liofilizacji zamknąć probówki i zważyć próbki na wadze analitycznej.
    UWAGA: Wartość suchej masy może być wykorzystana do normalizacji zawartości fikobiliprotein w suchej masie komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla wstępnych testów metody, Synechocystis był hodowany jako kultury okresowe w kolbach Erlenmeyera na wytrząsarce w podłożu uprawowym BG1120 (uzupełniony o 17 mM HEPES) w temperaturze 25 °C, w ciepłym białym świetle o intensywności 50 μmol(fotony)/(m2·s) i z 1% CO2 w atmosferze hodowli. Podczas hodowli próbki z kultur pobrano do bezpiecznych probówek i odwirowano (15 000 x g w temperaturze laboratoryjnej przez 5 minut), supe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje prostą, szybką i powtarzalną metodę oznaczania ilościowego zawartości fikobiliproteiny w modelowym cyjanobakterii Synechocystis. Porównano kilka metod homogenizacji komórek, ekstrakcji białek oraz kwantyfikacji fikocyjaniny i allofikocyjaniny, a końcowy protokół stanowi kombinację optymalnych etapów każdej procedury. Jako dane reprezentatywne, zawartość fikobiliprotein określono ilościowo w komórkach Synechocystis pod wpływem rosnącego natężenia światła. Mimo że analiza wymaga podob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zaczerpnięty z poprzedniej publikacji11. T. Z., D. Ch. i J. Č. byli wspierani przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach Narodowego Programu Zrównoważonego Rozwoju I (NPU I), grant numer LO1415. J. Č. był również wspierany przez GA CR, numer grantu 18-24397S. Dostęp do instrumentów i innych udogodnień był wspierany przez czeską infrastrukturę badawczą dla biologii systemowej C4SYS (projekt nr LM2015055). Projekt M. A. S. otrzymał grant z Rosyjskiej Fundacji Naukowej [nr 14-14-00904].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Synechocystis sp. PCC 6803 InstitutPasteur, Paryż, Francja6803Cyanobacterium szczep
Roti-CELL PBSCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Niemcy9143.1Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS), pH 7,4
Probówki Eppendorf safe-lock Eppendorf, Hamburk, Niemcy30120086Probówki Safe-lock 1,5 ml
80-miejscowy system przechowywaniaVWR International, Radnor, Pensylwania, USA30128-282Uchwyt na probówki z blokadą sejfu 
RAININ 100 &mikro; l -1000 &mikro; l Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, Stany Zjednoczone17014382Pipeta
GP-LTS-A-1000µ L-/F-768/8Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, Stany Zjednoczone30389272Końcówki do pipet
Rotina 420RHettich, Kirchlengern, Niemcy4701Wirówka z chłodzeniem do probówek Safe-lock 1,5 ml i stożkowych probówek wirówkowych 15 ml
LCexv 4010Liebherr, Bulle, Szwajcaria9005382197172Lodówka i zamrażarka -20  ° C
Revco ExF -86° C Pionowa zamrażarka niskotemperaturowaThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAEXF24086V Zamrażarka -80  ° C
CoolSafeLaboGene, Liller & oslash; d, Dania7.001.000.615Liofilizator 
SpektrofotometrUV-2600Shimadzu, Kioto, JaponiaUV-2600
Kuwety absorpcyjne Hellma, semi MicroSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAZ600288 Kuwety półmikro VIS/UV-VIS 0,75-1,5 ml, zakres spektralny 200-2500 nm 
Silamat S6Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein602286WUHomogenizator 
Koraliki szklaneSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAZ273627Koralik szklany o średnicy 2  mm
CPA225D-0CESartorius AG, Gö ttingen, NiemcySECURA225D-1OBRWagi analityczne
C-fikocyjanina firmy Spirulina sp. Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAP2172Standard fikocyjaniny
AllofikocyjaninaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAA7472we wzorcu allofikocyjaniny
 Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany ZjednoczoneBCA1, B9643Kompletny zestaw do oznaczania białek całkowitych
AlgaeTron Photon System Instruments Sp. z o.o., Drá sov, Republika CzeskaAG 130-ECO Komora uprawowa dla kolb E., z regulowanym oświetleniem i atmosferą
FotobioreaktorPhoton System Instruments Ltd., Drá sov, Republika CzeskaFMT-150Sprzęt do uprawy sinic i glonów z całkowicie kontrolowanym środowiskiem
Wiolonczemiernik Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USAAuto M10Licznik komórek
Probówki wirówkowe Corning 15 mlSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USACLS430791 15 ml Probówka wirówkowa do pobierania próbek na sucho
Herasafe KSThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone51024579Okap z przepływem laminarnym
  Zestaw kwasu bicynchoninowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. , Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
  2. Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25 (3), 412-419 (1989).
  3. Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837 (10), 1653-1664 (2014).
  4. Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78 (17), 6349-6351 (2012).
  5. Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 100(2016).
  6. Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. , Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
  7. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
  8. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
  9. Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13 (4), 367-370 (1982).
  10. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), (2015).
  11. Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12 (12), e0189130(2017).
  12. Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
  13. Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24 (8), 598-603 (2001).
  14. Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. , Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
  15. Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19 (2), 123-129 (2007).
  16. Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11 (3), 89-94 (2004).
  17. Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. , Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
  18. Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8 (12), (2007).
  19. Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162 (1), (2012).
  20. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  21. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15 (1), 122-132 (2015).
  22. Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2 (1), 30-51 (2011).
  23. Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76 (12), 1273-1280 (2001).
  24. Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (16), 8683-8690 (2011).
  25. Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100 (5), 902-910 (2008).
  26. Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  28. Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23 (5), 865-871 (2011).
  29. Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165 (2), 705-714 (2014).
  30. Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1778-1787 (2013).
  31. Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 133(2015).
  32. Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1333-1341 (2016).
  33. Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148 (1), 660-670 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie fykobiliproteinmetoda spektrofotometrycznaoznaczanie fikocyjaninyanaliza allofikocyjaninyekstrakcja z cyjanobakteriiprotok liofilizacjiekstrakcja w PBSwirowanie 15000 Gpomiar absorbancji 615 652 720 nmr wnanie Bennetta Bogorada

Powiązane artykuły