Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

16 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

Liczba nowatorskich biomateriałów zaprojektowanych do naprawy dużych uszkodzeń kości stale rośnie, mając na celu przyspieszenie gojenia kości i przezwyciężenie komplikacji związanych z przeszczepem kości. W tym miejscu przedstawiamy multidyscyplinarną strategię przedklinicznych badań biokompatybilności biomateriałów do naprawy kości.

Streszczenie

Duże złamania kości bez zrostu stanowią poważne wyzwanie w chirurgii ortopedycznej. Chociaż auto- i allogeniczne przeszczepy kostne doskonale nadają się do leczenia takich zmian, istnieją potencjalne komplikacje związane z ich stosowaniem. W związku z tym naukowcy zajmujący się materiałami opracowują syntetyczne, biokompatybilne biomateriały, aby przezwyciężyć te problemy. W niniejszej pracy prezentujemy multidyscyplinarną platformę do oceny biomateriałów do naprawy kości. Połączyliśmy wiedzę z zakresu biologii kości i immunologii, aby opracować platformę obejmującą testy in vitro osteoklastów (OC) i osteoblastów (OB) oraz mysie modele in vivo naprawy kości, immunogenności i alergenności. Pokazujemy, jak przeprowadzać eksperymenty, podsumowujemy wyniki i raportujemy o biokompatybilności biomateriałów. W szczególności przetestowaliśmy żywotność, różnicowanie i mineralizację OB oraz żywotność i różnicowanie OC w kontekście krążków fosforanu β-triwapniowego (β-TCP). Przetestowaliśmy również piankę β-TCP/Collagen (β-TCP/C), która jest dostępnym na rynku materiałem stosowanym klinicznie do naprawy kości w mysim modelu ubytku kości łydkowej o krytycznym rozmiarze, aby określić wpływ na wczesną fazę gojenia się kości. W równoległych eksperymentach ocenialiśmy reakcje immunologiczne i alergiczne u myszy. Nasze podejście pozwala na wygenerowanie profilu zgodności biologicznej biomateriału kostnego z szeregiem parametrów niezbędnych do przewidywania biokompatybilności biomateriałów stosowanych do gojenia i naprawy kości u pacjentów.

Wprowadzenie

Naprawa kości to złożony proces, który zaczyna się od powstania krwiaka, stanu zapalnego, tworzenia modzeli, a następnie przebudowy1,2. Jednak potencjał regeneracji kości jest ograniczony do wielkości złamania kości1,3. Na przykład duże złamania kości spowodowane urazem, rakiem lub osteoporozą mogą się nie goić i są określane jako złamania kości bez zrostu. Te zmiany kostne często wymagają leczenia w celu promowania zdrowej fizjologicznej naprawy i regeneracji kości. Obecnie autoprzeszczep i przeszczep allogeniczny jest podejściem z wyboru4 z 2,2 milionami zabiegów wymiany kości rocznie5. Chociaż procedury te mają wysoki wskaźnik sukcesu, mogą wystąpić komplikacje, na przykład ograniczona dostępność kości, infekcja, zachorowalność w miejscu dawczym i odrzucenie4. Poszukuje się nowych alternatyw dla inżynierii tkanki kostnej, aby sprostać tym wyzwaniom.

Projektowanie biomateriałów opartych na naturalnych lub syntetycznych polimerach, bioceramice lub metalach w połączeniu z komórkami i bioaktywnymi cząsteczkami jest na fali wznoszącej6. Nasze obecne rozumienie fizjologicznego gojenia się kości i gojenia w kontekście biomateriałów zależy od wielu czynników, takich jak właściwości mechaniczne oraz wiele czynników lokalnych i ogólnoustrojowych, w tym komórki z miejsca krążenia i złamania7,8,9. Biomateriały do regeneracji kości mają na celu promowanie osteogenności i osteointegracji10 i są idealnie biokompatybilne, biodegradowalne i porowate (sprzyjają migracji komórek, tlenu i składników odżywczych). Muszą być również wystarczająco mocne, aby podeprzeć miejsce złamania w celu złagodzenia bólu. Dodatkowo do zainicjowania procesu gojenia potrzebne są czynniki zapalne. Jeśli jednak biomateriał wywołuje nadmierny stan zapalny i reakcje alergiczne, może to ograniczać lub hamować gojenie się kości11,12. W związku z tym konieczne jest interdyscyplinarne podejście do oceny biomateriałów opracowanych do naprawy kości.

W tym badaniu prezentujemy przedkliniczną ocenę reprezentatywnych materiałów, 1) Pianka Orthovita Vitoss, która jest dostępnym na rynku substytutem przeszczepu kości gąbczastej, składającym się z fosforanu trójwapniowego składającego się z nanometrowych cząstek czystego fosforanu β-triwapniowego (β-TCP) i kolagenu bydlęcego typu 1 (C) (pianka β-TCP/C) oraz 2) krążków β-TCP. W tym miejscu ilustrujemy testowanie biokompatybilności tych biomateriałów za pomocą testów pierwotnego osteoblastów (OB) i osteoklastów (OC), modelu naprawy kości in vivo, oceny immunologicznej obejmującej proliferację limfocytów T in vitro i produkcję cytokin oraz immunogenność i alergenność in vivo, jak wcześniej zgłoszono13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury zostały przeprowadzone na myszach BALB/c zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych austriackiego Ministerstwa Edukacji, Nauki i Badań i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki austriackiego Ministerstwa Edukacji, Nauki i Badań.

1. Podstawowa hodowla myszy OB

  1. Izolacja OB z kalwarii nowonarodzonej myszy za pomocą trawienia enzymatycznego
    1. Poddaj eutanazji 1-2 jednodniowe nowonarodzone szczenięta (w sumie 60) przez dekapitację i umieść głowy na szalce Petriego ze sterylną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS).
    2. Chwyć głowę za kark i odetnij skórę sterylnymi nożyczkami. Naciąć kość kalwaryczną, przekłuwając ją (około 0,1–0,3 mm) nożyczkami, które następnie wkłada się pod kródełek z tyłu głowy u podstawy czaszki i przecina wzdłuż krawędzi kości skokowej bocznie od tyłu do przodu nad uszami, a następnie nad grzbietem nosa (ryc. 1).
    3. Inkubować wypreparowaną kalwarię z 8 ml wysterylizowanego z filtrem roztworu wytrawiającego (300 jednostek/ml kolagenazy typu IV i 2,14 jednostki/ml dypazy II rozpuszczonej w α minimum niezbędnej pożywce (α-MEM)) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C przez 10 minut w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 wstrząsach/min.
    4. Odrzucić pierwszy sklarowany osad i powtórzyć procedurę wytrawiania trzy razy z 8 ml roztworu wytrawiającego. Zebrać sklarowany szwadron zawierający komórki po każdym etapie trawienia i dodać go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Stożkową probówkę o pojemności 50 ml z komórkami należy przechowywać w lodowatej łaźni wodnej do czasu zakończenia procedury trawienia (około 40 min).
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant (za pomocą pipety Pasteura podłączonej do pompy próżniowej) i ponownie zawiesić w 40 ml pożywki do wzrostu kości (BGM) zawierającej α-MEM z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny i streptomycyny. Następnie dodać 10 ml zawiesiny komórkowej do 4 płytek do hodowli tkankowych (10 cm).
    6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do konfluencji (2–3 dni).
    7. Przy zbiegu, odessać starą pożywkę i przemyć płytki do hodowli tkankowych raz 1x PBS (37 °C). Następnie odessać PBS i dodać 2 ml 1x roztworu trypsyny zawierającego 0,5% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdej 10 cm płytki do hodowli tkankowej.
    8. Inkubować 4 płytki hodowlane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut, a następnie sprawdzić płytki za pomocą mikroskopu światła odwróconego, aby upewnić się, że komórki są oderwane od tworzywa sztucznego. Następnie przenieś wszystkie zawiesiny komórek (łącznie 8 ml) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml świeżego BGM. Umyj każdą płytkę 5 ml świeżego BGM i przenieś do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    9. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 16 ml świeżego BGM. Przygotuj 16 nowych 10 cm płytek do hodowli tkankowych (rozłupanych 1:4) zawierających 9 ml BGM. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej płytki.
    10. Powtórz kroki od 1.1.6 do 1.1.8.
    11. Odwirować komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml świeżego BGM. Policz komórki i oblicz stężenie komórek.
      UWAGA: Ta procedura generuje około 7,5–8,3 x 105 komórek/pup.
    12. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić w pożywce zamrażającej zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), 40% α-MEM i 50% FBS. Przenieś 1,5 ml zawiesiny komórek do 2 ml kriowialiów, co daje w sumie 2 x 106 komórek na fiolkę.
    13. Błyskawiczne zamrożenie fiolek w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania w zbiorniku z ciekłym azotem. Zużyj ogniwa w ciągu jednego roku, aby zapewnić pełną funkcjonalność. Użyj tych pierwotnych OB do oceny proliferacji (krok 1.2), różnicowania (testy ALP: krok 1.4., 1.5.) i mineralizacji (krok 1.6.) w obecności biomateriałów. Komórki te należy wykorzystać do dojrzewania prekursorów OC pochodzących ze szpiku kostnego we wspólnej hodowli (krok 2.3).
  2. Test proliferacji OB
    1. Przed dodaniem pierwotnych OB należy wstępnie inkubować krążki β-TCP o średnicy 14 mm w 1 ml BGM na 24-dołkowej płytce do hodowli w zawiesinie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Do kontroli należy użyć standardowych płytek do hodowli tkankowych, a do próbek biomateriału płytek do hodowli zawiesinowych, aby uniknąć przyczepiania się komórek do tworzywa sztucznego.
    2. Zassać pożywkę do wstępnej inkubacji, a następnie ponownie zawiesić pierwotne mysie OB w BGM. Dodać 4,4 x 104 OBs/cm2 na wstępnie inkubowane dyski β-TCP na 24-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej i, dla grupy kontrolnej, na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (1 ml/basenik). OB przyczepiają się do płytki hodowli tkankowej lub biomateriału.
    3. Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W okresie inkubacji zmieniaj podłoże co 2-3 dni i dodawaj 1 ml świeżego BGM do każdej studzienki.
    4. Aby ocenić proliferację OB, przenieś dyski β-TCP w dniach 7 i 14 do nowych studzienek, aby wykluczyć sygnały z komórek wyhodowanych na płytce hodowli zawiesiny.
    5. Odessać starą pożywkę, dodać 0,5 ml BGM (37 °C) i inkubować płytki hodowlane przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Następnie dodać 55 μl 10-krotnego odczynnika do proliferacji komórek (rozcieńczenie 1:10) bezpośrednio do dołka hodowlanego. W przypadku ślepej próby przygotuj trzy studzienki zawierające 0,5 ml BGM i 55 μl 10-krotnego odczynnika do proliferacji komórek. Inkubować wszystkie płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Pobrać i przenieść 150 μl supernatantu z każdej studzienki do 96-dołkowej czarnej płytki i odczytać fluorescencję ze wzbudzeniem przy 560 nm i emisją przy 590 nm. Odejmij ślepe odczyty od odczytów próbki.
  3. Testy różnicowania i mineralizacji OB
    1. Przed dodaniem OB należy wstępnie inkubować krążki β-TCP o średnicy 14 mm w 1 ml BGM na 24-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Do kontroli należy użyć standardowych płytek do hodowli tkankowych, a do próbek biomateriału płytek do hodowli zawiesinowych, aby uniknąć przyczepiania się komórek do tworzywa sztucznego.
    2. Zassać pożywkę do wstępnej inkubacji, a następnie ponownie zawiesić pierwotne mysie OB w BGM. Dodać 8,8 x 104 OBs/cm2 na wstępnie inkubowane dyski β-TCP na 24-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej, a dla grupy kontrolnej na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej (1 ml/basenik). OB przyczepiają się do płytki hodowli tkankowej lub próbki biomateriału.
    3. Zastąp BGM 1 ml pożywki do mineralizacji osteogennej (MM) zawierającej BGM, 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 5 mM β-glicerofosforanu 24 godziny po dodaniu OB i inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni z 1 ml świeżo przygotowanego MM do każdej studzienki.
  4. Różnicowanie OB oceniane na podstawie aktywności fosfatazy alkalicznej (ALP) z lizatów komórkowych
    1. Aby zmierzyć aktywność ALP w 7 dniu po dodaniu MM, należy odessać pożywkę hodowlaną z dołków, a następnie przemyć 1 ml sterylnego 1x PBS (37 °C). Ostrożnie zassać PBS, aby przyłączone komórki pozostały na kulturze tkankowej, plastiku lub biomateriale, a następnie zamrozić płytki w temperaturze -80 °C.
    2. Po 24 godzinach (lub do 2 tygodni) rozmrozić kontrolną płytkę do hodowli tkankowej i płytkę do hodowli zawiesiny biomateriału w temperaturze pokojowej (RT), aby przygotować się do lizy położniczej. W przypadku próbek biomateriału należy przenieść krążki β-TCP do nowej płytki hodowlanej w zawiesinie, aby wykluczyć komórki przyczepione do płytki. Dodaj 75 μl na studzienkę 1x buforu do lizy komórek do obu płytek. Potrząsaj talerzami przez 5 minut na wytrząsarce z prędkością 400 wstrząsów/min.
    3. Przenieś lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml i odwiruj przy 300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zanieczyszczeń. Dodać 50 μl supernatantu lizatu lizatu komórek próbki do 96-dołkowej czarnej płytki, a następnie dodać 50 μl roztworu składającego się z 200 μM substratu fluorogenicznego fosforanu 6,8-difluoro-4-metylomelohliferylu (DiFMUP) rozpuszczonego w 2x buforze ALP (pH 10) na basenik. Ustawić dwie ślepe studzienki ze 100 μl roztworu 1:1 zawierającego 1x bufor do lizy komórek i 2x bufor ALP.
    4. Przygotować 8 wzorców odniesienia w 100 μl/basenik z 6,8-difluoro-7-hydroksy-4-metylokoumaryną (DiFMU) w zakresie od 0,5 do 200 μM rozpuszczonych w roztworze 1:1 zawierającym 1x bufor do lizy komórek i 2x bufor ALP, w celu wygenerowania wzorcowej krzywej odniesienia.
    5. Inkubować czarną płytkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, a następnie odczytać fluorescencję ze wzbudzeniem przy długości fali 358 nm i emisją przy długości fali 455 nm. Odejmij odczyty ślepej próby od wzorców odniesienia i odczytów próbki.
    6. Znormalizuj aktywność enzymu ALP z lizatów komórkowych do całkowitej ilości białka za pomocą testu kolorymetrycznego dla stężenia białka. Przygotować wzorce referencyjne białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zakresie 0,05–2,5 μg/μl rozpuszczone w 1x buforze do lizy komórek, aby wygenerować krzywą wzorcową.
    7. Przygotować próbkę lizatów komórkowych i wzorców białkowych BSA w dwóch egzemplarzach. Dodać 5 μl lizatu komórkowego próbki lub 5 μl wzorca białkowego BSA do płytki 96-dołkowej, a następnie dodać 25 μl odczynnika A' i 200 μl odczynnika B. Ustawić dwie ślepe studzienki z 5 μl 1x buforu do lizy komórek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie odczytać absorbancję przy 690 nm. Odejmij odczyty ślepej próby od wzorców odniesienia i odczytów próbki.
  5. Różnicowanie OB oceniane przez barwienie ALP w hodowli komórkowej
    1. Wybarwić ALP w hodowanych OB w 7 dniu po dodaniu MM na kontrolnej płytce do hodowli tkankowej i biomateriału na płytce do hodowli zawiesiny.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną ze studzienek i zastąpić ją 0,5 ml 1x PBS (37 °C). Odessać PBS i utrwalić komórki, inkubując je w 0,5 ml 10% buforowanej formaliny w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
    3. Odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i dodać 0,5 ml buforu do płukania (0,05% Tween20 w 1x PBS).
    4. Rozpuścić jedną tabletkę substratu 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu/błękitu nitro tetrazolowego (BCIP/NBT) w 10 ml ultraczystej wody i wirować aż do całkowitego rozpuszczenia. Roztwór należy chronić przed światłem i zużyć w ciągu 2 godzin.
    5. Odessać bufor do przemywania i zastąpić go 0,5 ml roztworu substratu BCIP/NBT i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Odessać roztwór barwiący i zastąpić 0,5 ml buforu do płukania.
    6. Przenieś poplamione dyski β-TCP do nowej studzienki i zeskanuj płytki poplamione ALP za pomocą konwencjonalnego skanera płaskiego, aby zarejestrować barwienie ALP.
  6. Mineralizacja OB oceniana przez barwienie czerwienią alizarynową S (ARS)
    1. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków zawierających pierwotne OB 14 dni po dodaniu MM i przepłukać dwukrotnie 0,5 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej. Odessać PBS i utrwalić komórki, dodając 0,5 ml 10% buforowanego roztworu formaliny w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Odessać 10% buforowaną formalinę za pomocą jednorazowej pipety i przemyć dwukrotnie 0,5 ml ultraczystej wody.
    3. Do utrwalonych OB dodać 0,25 ml 40 mM roztworu barwiącego ARS (pH 4,2) rozpuszczonego w ultraczystej wodzie i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
    4. Odessać roztwór barwiący za pomocą jednorazowej pipety i spłukać 1 ml ultraczystej wody. Powtórz ten krok 5–10 razy, aby usunąć niespecyficzne zabarwienie.
      UWAGA: Roztwór do płukania powinien być bez koloru.
    5. Odessać ultraczystą wodę i dodać 1 ml zimnego PBS. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min.
    6. Odessać PBS, przenieść pobarwione dyski β-TCP do nowej studzienki i zeskanować płytki za pomocą skanera płaskiego, aby zarejestrować mineralizację.
    7. Dodać 0,25 ml 10% roztworu chlorku cetylopirydyniowego i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut na wytrząsarce z prędkością 100 wstrząsów/min w celu ekstrakcji barwnika ARS.
    8. Przenieść supernatanty do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Do ekstraktów dodać 10% roztwór chlorku cetylopirydyniowego w stosunku rozcieńczenia 1:10–1:20 i dodać próbki (300 μl) do płytki 96-dołkowej, w tym dwóch studzienek ślepych zawierających tylko 10% chlorku cetylopirydyniowego.
    10. Przygotować 7 wzorców referencyjnych ARS w zakresie od 4 do 400 μM, rozcieńczając 40 mM roztwór barwiący ARS (pH 4,2) 10% roztworem chlorku cetylopirydyniowego w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
    11. Dodać 300 μl wzorca odniesienia w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej.
    12. Odczytać absorbancję próbek, ślepych prób i wzorców odniesienia przy długości fali 520 nm.
    13. Odejmij odczyty ślepej próby od wzorców odniesienia i odczytów próbki.

2. Współkultura myszy OB-OC w celu uzyskania dojrzałych OC

  1. Przygotowanie i sterylizacja wycinków kory mózgowej bydła
    1. Oczyść segmenty kości z otaczającej tkanki i usuń kość beleczkową i szpik kostny.
    2. Suszyć kość w temperaturze 50 °C przez 24 godziny.
    3. Kość pokrój na mniejsze kawałki i pokrój ją na plastry (o grubości około 300–350 μm) za pomocą piły wolnoobrotowej z tarczą diamentową.
    4. Pokrój plastry o grubości 300–350 μm w kwadratowe krążki (1cm2).
    5. Aby oczyścić krążki kostne (1cm2), umieść je w zamykanej szklanej fiolce i napełnij wodą destylowaną. Przenieść napełnioną szklaną fiolkę do łaźni ultradźwiękowej i poddać sonikacji przez 5 minut. Powtórz ten krok trzy razy.
    6. Odlej wodę destylowaną, dodaj 70% etanolu i sonikuj przez 5 minut.
    7. Odlej 70% etanolu i zastąp go 100% etanolem.
      UWAGA: Plastry kości należy przechowywać w 100% etanolu w temperaturze 4 °C przez okres do 4 tygodni.
    8. Naświetlać plastry kości światłem UV przez 15 minut z każdej strony w sterylnych warunkach. Wysterylizowane plastry kości należy przechowywać na sterylnej płytce hodowlanej w temperaturze pokojowej do czasu dalszego użycia.
  2. Izolacja prekursorów OC szpiku kostnego
    1. Eutanazja niedoświadczonych 8-12-tygodniowych myszy BALB/c za pomocą dootrzewnowego (i.p.) wstrzyknięcia roztworu 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny.
    2. Wyizoluj prekursory OC szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy.
    3. Usuń nogi sterylnymi nożyczkami od najbliższego punktu ciała w stawie biodrowym, przetnij kończyny w stawach kolanowych i skokowych i usuń tkankę miękką za pomocą sterylnego skalpela i kleszczy. Odetnij nasady. Wypłukać i zawiesić szpik z 1 ml BGM na sterylnej szalce Petriego o średnicy 6 cm za pomocą igły 27G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml w celu uzyskania zawiesiny komórek.
    4. Dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, umyć 6-centymetrową szalkę Petriego 5 ml BGM i przenieść do tej samej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Ponownie zawiesić komórki w pożywce różnicującej OC (DM) zawierającej BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-witaminę D3 i 1 μM prostaglandynę E2 (1 ml / studzienkę).
      UWAGA: Jedna mysz BALB/c zapewnia wystarczającą liczbę prekursorów OC dla jednej 24-dołkowej płytki hodowlanej.
  3. Przygotowanie kohodowli mysich OB-OC z biomateriałem
    1. Przed dodaniem komórek należy wstępnie inkubować krążki β-TCP o średnicy 14 mm lub plastry kości bydlęcej (1cm2) w 1 ml BGM na 24-dołkowej płytce do hodowli w zawiesinie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.
      UWAGA: Wycinki kości bydlęcej są fizjologiczną grupą kontrolną substratów do badania różnicowania OC w obecności biomateriałów.
    2. Dodać 8,8 x 104 komórki/cm2 pierwotnych OB zawieszonych w BGM na biomateriały lub kość kontrolną na 24-dołkowej płytce do hodowli zawiesinowej lub na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.
      UWAGA: OB przyczepiają się do tworzywa sztucznego, biomateriału lub kości bydlęcej.
    3. Dodać świeżo wyizolowane prekursory OC szpiku kostnego do 24-godzinnych pierwotnych OB i posiewać w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 dni. Podłoże należy wymieniać na świeżo przygotowane OC DM co drugi dzień. Następnie wybarwić OC na kwasową fosfatazę odporną na winian (TRAP), aby ocenić różnicowanie OC.
  4. Zróżnicowanie OC oceniane za pomocą barwienia TRAP
    1. W celu scharakteryzowania dojrzałych wielojądrowych OC, otrzymanych z kroku 2.3.3, należy odessać pożywkę hodowlaną z kontrolnej płytki do hodowli tkankowej i płytki do hodowli zawiesiny biomateriału i dodać 1 ml 1x PBS (37 °C). Odessać PBS i utrwalić komórki, inkubując je w 1 ml 10% buforowanego roztworu formaliny w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Odessać 10% buforowany roztwór formaliny za pomocą jednorazowej pipety i dodać 1 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej. Powtórzyć ten krok trzy razy, następnie odessać PBS, zastąpić 1 ml buforu TRAP (pH 5) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    3. Odessać bufor TRAP i dodać 1 ml acetonu 1:1 i 100% etanolu. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 s. Szybko odessać roztwór acetonu i etanolu za pomocą jednorazowej pipety i całkowicie wysuszyć płytki w temperaturze pokojowej.
    4. Do roztworu barwiącego TRAP należy przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego fosforanu naftol-AS-MX w N,N-dimetyloformamidzie, rozpuścić 0,6 mg/ml szybkiej soli fioletowej w buforze TRAP i dodać 0,1 ml roztworu podstawowego fosforanu naftol-AS-MX do 10 ml szybkiej soli czerwonofioletowej w buforze TRAP.
    5. Dodać 1 ml roztworu barwiącego TRAP i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie zassać roztwór barwiący TRAP i dodać 1 ml ultraczystej wody, aby zatrzymać reakcję.
    6. Przenieść krążki β-TCP i plastry kości bydlęcej po zabarwieniu do nowej studzienki, obserwować zabarwione na czerwono OC za pomocą mikroskopu świetlnego (powiększenie: 10X) i policzyć dojrzałe OC TRAP+ z trzema lub więcej jądrami.

3. Model defektu kalwarycznego myszy o krytycznym rozmiarze

  1. Wstrzyknąć 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie (s.c.) 8-tygodniowym myszom BALB/c w celu znieczulenia.
  2. Znieczulić myszy mieszaniną 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny i.p., dodać żel lub maść do oczu, aby utrzymać je wilgotne i umieścić mysz na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C podczas całej procedury, aby zapobiec hipotermii. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palców u nóg i ogona.
  3. Ogol sierść na czubku głowy między uszami i oczyść powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.
  4. Wykonaj strzałkowe nacięcie w linii środkowej na szczycie czaszki między uszami za pomocą sterylnego skalpela, aby odsłonić kalwarię i usunąć tkanki łączne okołoczaszkowe powyżej prawej kości ciemieniowej, zeskrobując ją skalpelem.
  5. Stwórz ubytek o krytycznej wielkości w prawej kości ciemieniowej za pomocą sterylnej trepanacji dentystycznej o średnicy 4 mm (2000 obr./min) pod ciągłym nawadnianiem zwykłym roztworem soli fizjologicznej, aby naciąć prawą kość ciemieniową i przeciąć korę okładzinową i część kory wewnętrznej.
  6. Aby zapobiec uszkodzeniu opony twardej, użyj małego podnośnika okostnej, aby przebić się przez pozostałą korę wewnętrzną, ostrożnie podnieś kość nazębną i usuń ją kleszczami. Powstała wada powinna być okrągła i mieć średnicę około 3,5 mm.
  7. Wypełnij ubytek kości kalwarycznej wstępnie nasączoną (sterylną 1x PBS w RT) pianką β-TCP/C za pomocą kleszczy.
  8. Przygotować odpowiednią liczbę dopasowanych wiekowo, pozorowanych kontroli ujemnych z pustą wadą.
  9. Aby utrzymać biomateriał na miejscu, umieść 0,5 μl kleju tkankowego na krawędzi ubytku w dwóch przeciwległych punktach.
  10. Zamknij skórę niewchłaniającym się szwem.
  11. Wyczyść wszystkie narzędzia chirurgiczne zimnym środkiem sterylizującym, aby utrzymać sterylne warunki przed wykonaniem kolejnej operacji na znieczulonej myszy.
  12. W celu leczenia pooperacyjnego należy umieścić zwierzęta na suchej i czystej płycie grzewczej w temperaturze 37 °C w obszarze operacyjnym w celu odpowiedniego monitorowania w okresie rekonwalescencji. Monitoruj częstość oddechów, temperaturę ciała i kolor błon śluzowych i oczu co 10 minut, aż się obudzą.
  13. Przenieś operowane przytomne myszy do klatki z jedzeniem i wodą oddzielonymi od innych zwierząt, aż do pełnego wyzdrowienia. Wstrzykiwać 0,1 mg/kg buprenorfiny s.c. do pooperacyjnej terapii przeciwbólowej dwa razy na dobę przez 72 godziny. Przywróć w pełni wyleczone myszy do ich klatek.
  14. Aby określić skuteczność biomateriału, należy poddać myszy eutanazji roztworem 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny.
  15. Po 8–12 tygodniach od implantacji odetnij głowę uśpionej myszy ostrymi nożyczkami.
  16. Utrwal odciętą głowę myszy w 30 ml 4,5% buforowanego roztworu formaliny przez 1-2 tygodnie, aby zagwarantować pełną penetrację utrwalacza do tkanki.
  17. Przenieść głowice do 70% etanolu w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C przez okres do jednego roku.
  18. Do oceny regeneracji kości należy użyć mikrotomografii komputerowej (microCT) lub standaryzowanych, nieodwapnionych technik histologicznych. Możliwe jest zastosowanie skanowania mikrotomografią komputerową na próbkach pośmiertnych w wysokiej rozdzielczości (90 kV, 4 min) w płaszczyźnie strzałkowej i czołowej 2D i 3D.
  19. W przypadku nieodwapnionej histologii należy odwodnić głowy w rosnących stopniach etanolu i zatopić w glikolu metakrylanu metylu.
  20. Bloki zatopione w glikolu i metakrylanie metylu należy pociąć piłą diamentową i przeszlifować sekcje do grubości około 80–100 μm.
  21. Oceń wybarwione skrawki kości Levai Laczko, aby zidentyfikować nowe formacje kostne14.

4. Odpowiedzi immunologiczne in vitro

  1. Eutanazja niedojrzałych 8-tygodniowych myszy BALB/c i.p. roztworem 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny.
  2. Połóż mysz na prawym boku, ogol futro po lewej stronie i oczyść skórę po lewej stronie brzucha 70% etanolem.
  3. Wykonaj nacięcie o długości 10 mm i głębokości 1 mm w skórze myszy po lewej stronie z tyłu, podążając za żebrami nad brzuchem, używając sterylnych nożyczek.
  4. Otwórz skórę, a następnie odsłoń otrzewną. Wykonaj nacięcie o długości 10 mm i głębokości mniejszej niż 1 mm w otrzewnej za pomocą nożyczek w sterylnych warunkach.
  5. Wypchnij żołądek proksymalnie, aby odsłonić śledzionę.
  6. Delikatnie chwyć śledzionę sterylnymi kleszczami i usuń ją, przecinając tkankę i naczynia przyczepione pod nią.
  7. Umieść nienaruszoną śledzionę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego 1x sterylnego PBS.
  8. Przygotować zawiesinę jednokomórkową, rozdrabniając śledzionę za pomocą 2 sterylnych kleszczyków lub 2 sterylnych szkiełek podstawowych.
  9. Usuń zanieczyszczenia, przepuszczając je przez sterylne sitko komórkowe 40 μm z zimnym 1x PBS za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
  10. Zawiesinę jednokomórkową odwirować o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, odessać i odrzucić supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 5 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC).
  11. Inkubować zawiesinę komórek przez 14 minut w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję, dodając 45 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Odwirować komórki po lizie komórek w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
  13. Zawiesić splenocyty w pożywce RPMI zawierającej 10% inaktywowanego termicznie FBS, 1% roztworu penicyliny i streptomycyny, 0,1% gentamycyny, 0,2% ß-merkaptoetanolu i 1% aminokwasów endogennych.
  14. Wstępnie inkubować pianę β-TCP/C na 96-dołkowej sterylnej płytce hodowlanej zawierającej pożywkę RPMI przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed wysiewem komórek.
  15. Dodać splenocyty o miareczkowanej liczbie, np. 1,25 x 105, 2,5 x 105 i 5 x 105 / basenik do dołków w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej zawierającej pożywkę RPMI i dodatki, z lub bez wstępnie inkubowanej pianki β-TCP/C.
  16. Dodać 10 μg/ml konkanawaliny A (Con A) rozpuszczonej w pożywce, co daje łącznie 100 μl/studzienkę, do odpowiednich studzienek, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny.
  17. Zmierz proliferację komórek za pomocą testu bromodeoksyurydyny (BrdU). Dodać 10 μl/basenik roztworu do znakowania BrdU po 48 godzinach hodowli komórkowej, a następnie inkubować płytkę przez dodatkowe 24 godziny.
  18. Po 72 godzinach zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  19. Dodać 200 μl/studzienkę roztworu utrwalającego do każdej studzienki, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odessać roztwór utrwalający. Dodać 100 μl/basenik roztworu roboczego przeciwciała anty-BrdU i inkubować przez 90 minut.
  20. Odessać roztwór przeciwciała, przepłukać studzienki trzykrotnie 200–300 μl/studzienkę roztworu myjącego i usunąć roztwór myjący.
  21. Dodać 100 μl roztworu substratu i inkubować przez 3–10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zmierzyć absorbancję przy 450 nm.
  22. Zmierzyć interleukinę-1β (IL-1β), interleukinę-2 (IL-2), interleukinę-4 (IL-4) i interferon-γ (IFN-γ) w pobranych supernatantach za pomocą standardowego testu ELISA.

5. Wysokoprzepustowy model dootrzewnowy

  1. Znieczulić samice 6-8 tygodniowych myszy BALB/c mieszaniną 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny domięśniowo i dodać żel lub maść do oczu, aby utrzymać je wilgotne i umieścić mysz na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C podczas całej procedury, aby zapobiec hipotermii. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palców u nóg i ogona.
  2. Ogol sierść na brzuchu i oczyść ją 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.
  3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 8 mm przez skórę wzdłuż kresy białej. Wykonaj małe nacięcie w otrzewnej za pomocą skalpela.
  4. Umieść sterylne przeszczepy piankowe nasączone PBS β-TCP/C (2x2x2 mm3) w jamie otrzewnej lub bez dodatków materiałów dla myszy kontrolnych w tym samym wieku.
  5. Zszyj otrzewną i skórę odpowiednio szwem wchłanialnym i niewchłanialnym.
  6. Wyczyść wszystkie narzędzia chirurgiczne zimnym środkiem sterylizującym, aby utrzymać sterylne warunki przed wykonaniem kolejnej operacji na znieczulonej myszy.
  7. W celu leczenia pooperacyjnego należy umieścić zwierzęta na suchej i czystej płycie grzewczej w temperaturze 37 °C w obszarze operacyjnym w celu odpowiedniego monitorowania w okresie rekonwalescencji. Monitoruj częstość oddechów, temperaturę ciała i kolor błon śluzowych i oczu co 10 minut, aż się obudzą.
  8. Przenieś operowane przytomne myszy do klatki z jedzeniem i wodą oddzielonymi od innych zwierząt, aż do pełnego wyzdrowienia. Wróć w pełni wyleczone myszy do ich klatek.
    UWAGA: Ta procedura wywołuje minimalny ból. Pooperacyjna terapia przeciwbólowa zwykle nie jest konieczna. Jeśli operowane zwierzęta wykazują oznaki bólu, należy wstrzyknąć 0,1 mg/kg buprenorfiny s.c. lub innego odpowiedniego leku przeciwbólowego w celu złagodzenia bólu.
  9. Poddaj myszy eutanazji 7 dni po implantacji roztworem 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny i.p.
  10. Po 7 dniach od implantacji przepłukać jamę otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G, aby uzyskać łącznie 3 ml zimnego PBS, przytrzymując głowę myszy w dół i wkładając igłę w lewy dolny kwadrant brzucha i celując proksymalnie.
    UWAGA: Płyn otrzewnowy powinien być wolny od erytrocytów.
  11. Odwirować płyn z płukania otrzewnej o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zebrać płyn otrzewnowy do przechowywania w temperaturze -20 °C do pomiarów ELISA cytokin IL-1β, IL-2 i IL-4.
  12. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS i policzyć komórki otrzewnej za pomocą błękitu trypanowego na hemocytometrze.
  13. Cytocentrifufować zawiesinę komórek w proporcjach 5 x 105 komórek na szkiełkach szkiełkowych, pozostawić szkiełka do wyschnięcia i zabarwić w celu uzyskania różnicowej liczby komórek.
  14. Za pomocą mikroskopu świetlnego policz w sumie co najmniej 300 komórek i rozróżnij makrofagi, eozynofile, neutrofile i limfocyty.

6. Podprzewlekły model podskórny

  1. Znieczulenie samic 6-8 tygodniowych myszy BALB/c mieszaniną 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny i.p., dodaj żel lub maść do oczu, aby były wilgotne i umieść mysz na płycie grzewczej w temperaturze 37 °C podczas całej procedury, aby zapobiec hipotermii. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palców u nóg i ogona.
  2. Połóż mysz na grzbiecie, ogol sierść na brzuchu i oczyść ogoloną powierzchnię 7,5% roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.
  3. Wykonaj nacięcie linii środkowej o długości 8 mm przez skórę wzdłuż linii białej brzucha za pomocą skalpela, a następnie wszczepij pod skórę biomateriał nasączony PBS (2x2x2 mm3) lub nie dodawaj żadnych materiałów dla pozorowanych myszy kontrolnych o dopasowanym wieku.
  4. Zszyj skórę niewchłanialnym szwem.
  5. Wyczyść wszystkie narzędzia chirurgiczne zimnym środkiem sterylizującym, aby utrzymać sterylne warunki przed wykonaniem kolejnej operacji na znieczulonej myszy.
  6. W celu leczenia pooperacyjnego należy umieścić zwierzęta na suchej i czystej płycie grzewczej w temperaturze 37 °C w obszarze operacyjnym w celu odpowiedniego monitorowania w okresie rekonwalescencji. Monitoruj częstość oddechów, temperaturę ciała i kolor błon śluzowych i oczu co 10 minut, aż się obudzą.
  7. Przenieś operowane przytomne myszy do klatki z jedzeniem i wodą oddzielonymi od innych zwierząt, aż do pełnego wyzdrowienia. Wróć w pełni wyleczone myszy do ich klatek.
    UWAGA: Ta procedura wywołuje minimalny ból. Pooperacyjna terapia przeciwbólowa zwykle nie jest konieczna. Jeśli operowane zwierzęta wykazują oznaki bólu, należy wstrzyknąć 0,1 mg/kg buprenorfiny s.c. lub inny odpowiedni środek przeciwbólowy.
  8. Gdy myszy będą gotowe do zbadania miejsca implantacji, należy je poddać eutanazji roztworem 200 mg/kg ketaminy i 24 mg/kg ksylazyny.
  9. Osiem tygodni po implantacji należy wyciąć miejsce implantacji wraz z otaczającą tkanką (1cm2).
  10. Utrwal tkankę w 4,5% buforowanym roztworze formaliny na noc, zanurz w parafinie i pokrój na odcinki 4 μm.
  11. Wybarwieć skrawki tkanek zatopionych w parafinie 4 μm hematosyliną i eozyną (H&E) w przypadku zapalenia lub trichromem Massona w celu odkładania kolagenu i zwłóknienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić skuteczność β-TCP jako biomateriału do regeneracji kości, zastosowaliśmy metody przesiewowe in vitro oraz in vivo. W pierwszej kolejności zmierzyliśmy odpowiedzi OB w kontakcie z dyskami β-TCP w porównaniu z kontrolą w samym medium bazowym. Rycina 2 przedstawia żywotność OB w odpowiedzi na dyski β-TCP po 7 i 14 dniach hodowli. Żywotność komórek, mierzona na podstawie aktywności metabolicznej komórek w dołkach hodowlanych, była tak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu pokazujemy multidyscyplinarne podejście do przedklinicznej oceny biokompatybilności reprezentatywnych biomateriałów opracowanych do regeneracji i naprawy kości. Przetestowaliśmy odpowiedzi OB, OC i odpowiedź na gojenie in vivo w krytycznym modelu ubytku kości u myszy, a także odpowiedzi immunologiczne in vitro i in vivo . Naszym celem było pokazanie, jak działają testy oraz podsumowanie danych i wniosków wynikających z badania biomateriałów. Pokazujemy, że nasza strategia generuje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt badawczy otrzymał dofinansowanie z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 263363.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm)Krążki spiekano w piecu muflowym w temperaturze 1150 °C. Szczegółowy opis produkcji można znaleźć w Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Próbki naświetlano promieniami UV (15 minut z każdej strony) przed użyciem w hodowlach komórkowych.
Pianka Orthovita Vitoss (β-TCP/C)Orthovita2102-1405
Hodowla osteoblastów myszy
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP bufor do oznaczania (2x) pH 10,4Rozpuść 200 mM glicyny, 2 mM chlorku magnezu, 2 mM chlorku w ultraczystej wodzie i dostosuj do pH 10.
Pożywka do wzrostu kości (BGM)i alfa-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina/streptomycyna
Bufor do lizy komórek: Bufor do lizy komórek CyQuant 20x koncentratThermo ScientificC7027Rozcieńczyć skoncentrowany bufor do lizy komórek 20-krotnie w ultraczystej wodzie. 
Odczynnik do oznaczania żywotności komórek: Odczynnik do oznaczania żywotności komórek Presto BlueInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Kolagenaza typu IV z clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
Zestaw do oznaczania białek DC IIBio Rad5000112Zestaw do oznaczania białek DC zawiera odczynnik A, odczynnik B, odczynnik S i BSA dla wzorca odniesienia. Dla odczynnika A' dodać 20 &mikro; L odczynnik S do 1000 &mikro; L odczynnik A. 
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418Filtr sterylny DMSO przed użyciem. 
Dyspaza II (proteaza obojętna, stopień II)Roche4942078001
EnzCheck Zestaw do oznaczania fosfatazy alkalicznej pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit zawiera fosforan 6,8-difluoro-4-metylobelokliferylu (DiFMUP), N,N-dimetyloformamid i 6,8-difluoro-7-hydroksy-4-metylokumarynę (DiFMU). 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524
Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%Sigma-AldrichHT501128
GlicynaSigma-AldrichG8898
Monohydrat chlorku heksadecylopiryny (cetylopirydyniowy)Sigma-AldrichC9002
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydratSigma-AldrichA8960
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-AldrichM2670
MEM alfa medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Pożywka do mineralizacji osteogennej (MM)&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 50 &mikro; g/ml kwas askorbinowy + 5 mM β-glicerofosforan
Penicylina-streptomycyna   Sigma-AldrichP4333
Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Rozcieńczyć stężony roztwór podstawowy 10-krotnie w 1x PBS. 
Tween20Sigma-AldrichP1379
Woda ultraczysta: Woda do hodowli komórkowych wolna od pirogenówVWRL0970-500
BuforDodaj  0,05% Tween20 do 1x PBS.
ChlorekSigma-Aldrich1.08816
β-glicerofosforan sól disodowa hydratSigma-AldrichG5422
24-dołkowa płytka do hodowli zawiesinowejGreiner bio-one662102
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejGreiner bio-one662160
50 ml rurka stożkowaGreiner bio-one227261
96-dołkowa płytkaGreiner bio-one655076
96-dołkowa przezroczysta płytkaGreiner bio-one655001
Wirówka: VWR Mega Star 600RInkubator CO2 VWR
: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Jednorazowa jednostka filtrująca FP30/0,2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Do sterylnej filtracji roztworu enzymatycznego.
Skaner płaski: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro Czytnik mikropłytekTecan
Probówka do mikrowirówek: Probówka Eppendorfa safe-lock 0,5 mlVWR20901-505
Probówka do mikrowirówek: Probówka Eppendorf safe-lock 1,5 mlVWR21008-959
Shaker Swip (orbitalna i pozioma) Edmund Buehler 
Inkubator z potrząsaniem GFL3032GFL 3032
Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicyGreiner bio-one612301
Sterylne narzędzia (nożyczki, pęseta, kleszcze zakrzywione)
Płytka do hodowli tkankowej (10 cm)Greiner bio-one664960
Kosia kokultura osteoblastów i osteoklastów
1α,25- Dihydroksywitamina D3Sigma-Aldrich179361000x skoncentrowany bulion (10 &mikro; M w etanolu 100%)
AcetonVWR Chemicals22065.327
Pożywka do wzrostu kości (BGM)&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna
Woda destylowanaCarl Roth3478.4
Etanol (100% obj./obj.)VWR Chemicals20821.365
Etanol (70% obj./obj.)VWR Chemicals93003.1006
Szybka czerwonofioletowa sól LBSigma-AldrichF3381
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF7524
Roztwór formaliny neutralny buforowany 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alfa Medium (&alfa;-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N,N-dimetyloformamidSigma-AldrichD4551
Naftol AS-MX fosforanSigma-AldrichN4875
Pożywka do różnicowania osteoklastów (DM)&alfa;-MEM + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% penicylina-streptomycyna + 1 nM 1,25-(OH)2-witamina D3 + 1 &mikro; M prostaglandyna E2 
Penicylina-streptomycyna Sigma-AldrichP4333
Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandyna E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x skoncentrowany bulion (1 mM w etanolu 100%)
Octan sodu trójwodnySigma-AldrichS7670
Winian sodu dwuwodnySigma-AldrichS8640
Sterylne narzędzia (nożyczki, kleszcze, skalpel)
TRAP bufor pH 5,0Rozpuść 40 mM octanu sodu, 10 mM winianu sodu w ultraczystej wodzie i dostosuj do pH 5.
Woda ultraczysta: Woda do hodowli komórkowych wolna od pirogenówVWRL0970-500
24-dołkowa płytka do hodowli zawiesinowejGreiner bio-one662102
24-dołkowa rurka do hodowli tkankowejGreiner bio-one662160
50 ml WirówkaGreiner bio-one227261
VWR Mega Star 600RVWR
Inkubator CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
Diamentowe ostrze do wafli (10,2 cm x 0,3 cm)Buehler
IsometBuehler
(6 cm)Greiner bio-one628,161
Zakrętka szklana butelka 20 mlCarl RothEXY4.1
Sterylna strzykawka jednorazowego użytku 1 mlHenry Schein Animal Health9003016
Pipeta jednorazowa: pipeta do surowicyGreiner bio-one612301
Sterylna igła: Igła podskórna RW 27 G x 3/4''Henry Schein Animal Health9003340
Model wady kalwarii myszy
Analgezja: Buprenorfina (Bupaq)Richter Pharma AG
Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Środek sterylizujący na zimno: SafeSept MaxHenry Schein Zdrowie zwierząt9882765
Etanol (70% obj./obj.)VWR Chemicals93003.1006
Maść do oczu: VitA POS 5 gUrsapharm
Normalny roztwór soli fizjologicznej (0,9% roztwór chlorku sodu)Fresenius Kabi
Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 mlB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% buforowana formalinaCarl Roth2213.6
Klej tkankowy: Histoacryl 5 x 0,5 mL B. Braun Chirurgiczne1050060
Środki ochrony indywidualnej: rękawice chirurgiczne, czepek i maska, fartuchHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterylne narzędzia (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt
Sterylne igły: Igły podskórne RW 27 G x 3/4'' i 30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health9003340, 9003630
Jednorazowa sterylna strzykawka 1 mlHenry Schein Animal Health9003016
Płyta grzewcza: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sterylne waciki z gazyHenry Schein Animal Health220192
Sterylny jednorazowy skalpel (Figur 20)Henry Schein Animal Health9008957
Wiertło chirurgiczne/dentystyczne: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
Rękojeść typ S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trephine, średnica 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Zestaw rurek do nawadniania 2,2 mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Podnośnik okostnej 2 mm / 3 mmHenry Schein Zdrowie zwierząt472683
Szew niewchłanialny: Zielony poliester, DS19, met. 1,5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Zdrowie zwierząt300715
In vitro odpowiedzi immunologiczne
Znieczulenie do eutanazji: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Proliferacja komórek ELISA, BrdU (kolorymetryczny) Zestaw testowySigma-Aldrich11647229001Zestaw zawiera roztwór do znakowania BrdU, roztwór utrwalający (FixDenat), roztwór przeciwciała anty-BrdU, bufor płuczący i roztwór substratu. 
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
Pożywka hodowlana splenocytyPożywka RPMI + 10% inaktywowany termicznie FBS + 1% roztwór penicyliny-streptomycyny + 0,1% gentamycyna + 0,2% ß-merkaptoetanol + 1% aminokwasów endogennych
Etanol (70% obj./obj.)VWR Chemicals93003.1006
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
GentamycynaGibco, Thermo Fisher Scientific 
Mysz IL-1β ELISA Gotowy do działania!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mysz IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mysz IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mysz INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
Roztwór aminokwasów endogennychGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penicylina-streptomycyna Gibco, Thermo Fisher Naukowy 
Solanka buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 podłoże, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MerkaptoetanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
Probówka stożkowa 50 mlGreiner bio-one227261
96-dołkowa płytka do hodowli tkankowychGreiner bio-one655180
Wirówka: VWR Mega Star 600RVWR
40 &mikro; mBD Bioscience352340
Czytnik mikropłytek Infinite M200 ProTecan
Jednorazowa sterylna strzykawka 1 mlHenry Schein Animal Health9003016
Sterylne narzędzia chirurgiczne (kleszcze, szkiełka podstawowe)
Model dootrzewnowy o wysokiej przepustowości
Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Sterylizator na zimno: SafeSept MaxHenry Schein Zdrowie zwierząt9882765
Etanol (70% obj./obj.)VWR Chemicals93003.1006
Maść do oczu: VitA POS 5 gUrsapharm
Mysz IL-1β ELISA Gotowy do działania!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mysz IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mysz IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 mlB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining KitThermo Scientific9990700Do różnicowego zliczania komórek.
Płyta grzewcza: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hemocytometr: komora NeubaueraCarl RothPC72.1
Szew niewchłanialny: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Szew wchłanialny: PolysorbCovidienSL-5628
Wirówka Shandon do cytopsynyThermo Scientific
Jednorazowa sterylna strzykawka 1 mlHenry Schein Animal Health9003016
Sterylne waciki z gazyHenry Schein Animal Health220192
Sterylne igły: Igły podskórne RW 27 G x 3/4'' i 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Sterylne narzędzia chirurgiczne (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt na igłę)
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Podprzewlekły model podskórny
Znieczulenie: Ketamina (Ketamidor), Ksylazyna (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Środek sterylizacyjny na zimno: SafeSept MaxHenry Schein Zdrowie zwierząt9882765
Etanol (70% obj./obj.)VWR Chemicals93003.1006
Maść do oczu: VitA POS 5 gUrsapharm
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Roztwór jodu powidonu: Braunol 1000 mlB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% buforowana formalinaCarl Roth2213.6
Płyta grzewcza: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Szew niewchłanialny: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Środki ochrony indywidualnej: chirurgiczne rękawiczki, czepek i maska, fartuchHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Jednorazowa sterylna strzykawka 1 mlHenry Schein Animal Health9003016
Sterylne waciki z gazyHenry Schein Animal Health220192
Sterylne narzędzia (skalpel, nożyczki, kleszcze, uchwyt na igły)
Sterylna igła: Igły podskórne RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health9003340, 420939
10010023 do płukania 10010023: Piła wolnoobrotowa szalka Petriego 10010023 na igłę)105000641575003711140050151401221001002331350010 Sitko do komórek 1001002310010023

Bibliografia

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Biomateria yregeneracja ko ciywotno osteoblast wr nicowanie osteoklast wbarwienie alizaryn czerwon Skrytyczny defekt kalwarialnybeta fosforan tr jwapniowytesty in vitromodele mysie in vivobadanie immunogenno ciocena alergenno ci
Profil zgodności biologicznej biomateriałów do regeneracji kości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.