Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

29 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Streszczenie

Badania nad dynamicznymi zmianami w translacji białek wymagają specjalistycznych metod. Tutaj zbadaliśmy zmiany w nowo zsyntetyzowanych białkach w odpowiedzi na niedokrwienie i reperfuzję przy użyciu izolowanego perfundowanego serca myszy w połączeniu z profilowaniem polisomów. Aby lepiej zrozumieć dynamiczne zmiany w translacji białek, scharakteryzowaliśmy mRNA, które były obciążone rybosomami cytozolowymi (polirybosomami lub polisomami), a także odzyskaliśmy polisomy mitochondrialne i porównaliśmy dystrybucję mRNA i białek we frakcjach o wysokiej wydajności (liczne rybosomy przyłączone do mRNA), o niskiej wydajności (przyłączonych mniej rybosomów), które obejmowały również polisomy mitochondrialne, oraz frakcje nietranslujące. miRNA mogą również wiązać się z mRNA, które są poddawane translacji, zmniejszając w ten sposób wydajność translacji, zbadaliśmy rozkład miRNA we frakcjach. Rozkład mRNA, miRNA i białek badano w podstawowych warunkach perfuzji, pod koniec 30 minut globalnego niedokrwienia bez przepływu i po 30 minutach reperfuzji. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystane do przeprowadzenia tej analizy – w szczególności podejście do optymalizacji ekstrakcji białek z gradientu sacharozy, ponieważ nie zostało to wcześniej opisane – i przedstawiamy kilka reprezentatywnych wyników.

Wprowadzenie

Serce reaguje na uraz spowodowany niedokrwieniem (I) i reperfuzją (R) w sposób dynamiczny. Jednak niewiele jest wglądu w ostre zmiany w syntezie białek podczas odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystaliśmy sprawdzoną metodę profilowania polisomów1, aby zidentyfikować zmiany w obfitości białek, które odzwierciedlają redystrybucję rybosomów i translacyjnych czynników regulacyjnych od cytozolu do polisomów oraz wzrost nowo zsyntetyzowanych białek (NSP). W ustawieniu I/R wzrost syntezy nowych białek następuje w ramach czasowych, które są niespójne z transkrypcją nowych mRNAs2; ponadto odnotowano niezgodność między poziomami ekspresji mRNA a obfitością białka3. Z tych powodów zdecydowaliśmy się przeanalizować zmiany w dynamicznym proteomie odzwierciedlone przez translację białek. Aby to zrobić, oznaczamy ilościowo mRNA we frakcjach polisomów i analizujemy skład białek we frakcjach polisomów. Wreszcie, ponieważ mikroRNA (miR) regulują dostępność mRNA do translacji i mogą zakłócać wydajność translacji białek4,5, zbadaliśmy rozkład miR we frakcjach polisomów, koncentrując się na odpowiedzi na I/R.

Zdecydowaliśmy się użyć izolowanego mysiego modelu perfuzji Langendorffa i pobraliśmy tkankę w podstawowych warunkach ciągłej perfuzji, po 30 minutach globalnego niedokrwienia bez przepływu, a następnie po 30 minutach niedokrwienia, a następnie 30 minutach reperfuzji. Następnie rozpuściliśmy tkankę serca i oddzieliliśmy polisomy w gradiencie sacharozy, a następnie przeprowadziliśmy analizę proteomiczną i selektywne wykrywanie mRNA i miRNA odpowiednio za pomocą PCR i mikromacierzy. Ta kombinacja metod stanowi potężne podejście do zrozumienia dynamicznego proteomu, umożliwiając jednoczesne wykrywanie mRNA, miRNA i NSP, a także redystrybucję białek regulatorowych, miRNA i mRNA między frakcjami nietranslacyjnymi, polisomami o niskiej wydajności i polisomami o wysokiej wydajności (patrz Rysunek 1). Wgląd w dynamiczną regulację tego procesu zostanie poszerzony o dalszą analizę fosforylacji kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak eIF2α czy mTOR. Te poszczególne kroki są teraz szczegółowo opisane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Medycznym Cedars-Sinai.

1. Langendorff Perfuzja Mysiego Serca

  1. Perfuzja Langendorffa serca myszy z niedokrwieniem i reperfuzją
    1. Pentobarbital sodu należy podawać dootrzewnowo w dawce 70 mg/kg dorosłej myszy (8-tygodniowej płci męskiej, C57BL6/j). Potwierdź głębokie znieczulenie przez brak wycofania się do uszczypnięcia palca u nogi.
    2. Przeciwzakrzepowy z heparyną dootrzewnową 500 U/kg.
    3. Otwórz klatkę piersiową przez nacięcie mostka. Otwórz przeponę i przetnij wzdłuż granicy żebrowej do przedniej osi pachowej. Następnie przetnij przednią oś pachową aż do kończyny przedniej, aby całkowicie otworzyć klatkę piersiową. Następnie, wizualizując serce, zaciśnij aortę wstępującą kleszczami i szybko wytnij serce. Śmierć nastąpiła w wyniku wykrwawienia. Umieść serce w zimnym Krebsie (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glukoza 2 g/L i CaCl2 0,373 g/L).
    4. Kankaniulować aortę za pomocą igły z końcówką i perfuzjować serce wstecznie roztworem Krebsa w trybie stałego ciśnienia.
    5. Po okresie stabilizacji trwającym 15 minut poddaj serce globalnemu niedokrwieniu bez przepływu przez 30 minut, a następnie reperfuzji przez 30 minut.
    6. Zbierz serca po 15 minutach perfuzji wyjściowej, po 30 minutach niedokrwienia lub po 30 minutach reperfuzji. Odetnij przedsionki i zatrzaskowo zamroź tkankę w ciekłym azocie.
    7. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia

2. Homogenizacja tkanek, solubilizacja i sedymentacja w gradimencie gęstości sacharozy

  1. Przygotowanie gradientu
    1. Przygotować 2 roztwory (15% i 50%) 100 ml sacharozy, mieszając 4 ml NaCl 2,5 M;
      0,8 ml MgCl2 1,25 M; 1 ml Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g lub 50 g sacharozy (odpowiednio dla 15% i 50%); ultraczysta woda do 100 ml; i cyjanol ksylenu (0,02 mg/ml) do barwienia 15% roztworu
    2. Przefiltruj każdy roztwór (filtry 0,22 μm)
    3. W dniu, w którym ma być zastosowany gradient, należy przygotować 40 ml każdego roztworu sacharozy i dodać cykloheksymid do każdego roztworu, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 μg/ml
      1. Użyj ekspresu do gradientów, aby przygotować mieszankę między 15% i 50% roztworami sacharozy
      2. Wypełnij lewą komorę 5 ml 15% gradientu sacharozy
      3. Wypełnij prawą komorę 50% gradientem sacharozy
      4. Otwórz kran i włącz pompę, aby wymieszać dwie małe komory za pomocą mieszadła magnetycznego
      5. Użyj rurki połączonej z drugim kranem, aby umożliwić przepływ zmieszanego roztworu sacharozy w ultra-wirówce o cienkich ściankach. Ostateczna objętość wyniesie około 10 ml.
    4. Utrzymuj nachylenie na poziomie 4 °C (w razie potrzeby przez noc, ale nie dłużej)
  2. Homogenizacja tkanki serca
    1. Homogenizować świeże lub mrożone serce za pomocą polytronu w przefiltrowanym buforze do lizy (zmodyfikowanym do frakcjonowania gradientowego sacharozy) zawierającym 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,4% NP-40. Zawiera cykloheksymid 100 μg/ml w celu utrzymania struktury polisomów, inhibitor RNazy 0,1 U i koktajl inhibitorów proteazy (1 tabletka na 50 ml).
    2. Inkubować lizat na lodzie 15 min.
    3. Wirować przy 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i zebrania supernatantu.
    4. Zarezerwuj 50 μl do oznaczania białka, izolacji RNA i analizy integralności RNA (patrz rysunek 2).
    5. Nałożyć supernatant (500–100 μl) na gradienty i zrównoważyć probówki buforem do lizy.
  3. Sedymentacja i zbieranie frakcji
    1. Przeprowadzić ultrawirowanie przez 120 minut przy 37 000 obr./min w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Według producenta odpowiada to 228 000 x g przy maksymalnym promieniu.
    2. Zebrać każdy gradient jako 17 frakcji (około 600 μl każdej frakcji) w probówkach do mikrowirówek z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 254 nm (OD254).
    3. Zaprogramuj kolektor frakcji w następujący sposób:
      1. Wyrzucić pierwsze 3 minuty zbierania (odpowiadające płynowi zawartemu w probówkach przed gradientem)
      2. Od 4 do 19 min zbieraj frakcje z prędkością 1 ml/min w 17 frakcjach.
    4. Umieść frakcje na lodzie, gdy tylko każda z nich zostanie zebrana. Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C, jeżeli nie są one przetwarzane natychmiast. Typowy densytometryczny ślad gradientu w promieniowaniu UV w miarę jego zbierania przedstawiono na rysunku 1.

3. Izolacja i analiza mRNA z frakcji polisomowych i nietranslujących

  1. Ekstrakcja mRNA
    1. Rozmrozić frakcje na lodzie, jeśli po zebraniu zostały zamrożone
    2. Przenieść 200 μl każdej frakcji do świeżej probówki
      UWAGA: Na tym etapie można połączyć ze sobą dwie lub więcej kolejnych frakcji. Należy to zrobić ostrożnie po przeanalizowaniu wykresu OD254, aby frakcje polisomowe i niepolisomowe nie uległy zmieszaniu.
    3. Dodaj 10 ng RNA lucyferazy jako kontrolę wewnętrzną do każdej próbki w celu normalizacji.
      UWAGA: Startery lucyferazy powinny być stosowane jako kontrola wewnętrzna w celu normalizacji wyników.
    4. Dodać 700 μl odczynnika do ekstrakcji RNA (jednofazowy roztwór fenolu i izotiocyjanianu guanidyny; patrz tabela materiałów) do każdej probówki. Dobrze wymieszać i inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Dodać 140 μl chloroformu i wirować przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze smojnej.
    6. Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    7. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki.
    8. Ponieważ zawartość RNA we frakcjach nie jest wysoka, do każdej probówki dodać 10 μg glikogenu jako nośnika.
    9. Do każdej probówki dodać 350 μl izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę w celu zwiększenia plonu.
    10. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
    11. Wyrzucić supernatant i dodać 700 μl etanolu 75%, aby przepłukać osad RNA.
    12. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g w temperaturze 4 °C.
    13. Usuń etanol i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10–15 minut.
      UWAGA: Nadmierne wysuszenie osadu RNA zapobiegnie jego całkowitej rozpuszczalności w wodzie.
    14. Zawiesić osad RNA w 50 μl ultraczystego H2O wolnego od RNaz.
    15. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
    16. Użyć 2 μl każdej próbki do zmierzenia jakości i ilości wyekstrahowanego RNA, a pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Odwrotna transkrypcja i qPCR
    1. Użyj 4 μl zestawu do syntezy cDNA z odwrotną transkrypcją (patrz tabela materiałów) do reakcji 20 μl. Przygotować supermiks w zależności od liczby próbek. Przenieś wymaganą objętość do każdej probówki i dodaj 5 μl wejściowego RNA do każdej probówki. Objętość tę można skorygować tak, aby była istotna dla zakresu warunków pracy polimerazy Taq.
    2. Inkubować probówki w termocyklerze według następującego programu zalecanego przez producenta: 5 minut w temperaturze 25 °C, 20 minut odwrotnej transkrypcji przez 20 minut w temperaturze 46 °C i inaktywacja odwrotnej transkryptazy przez 1 minutę w temperaturze 95 °C.
    3. Uruchom qPCR ze zoptymalizowanym programem dla każdej pary starterów.
      UWAGA: Aby wykryć obecność niektórych mRNA we frakcjach, do odwrotnej transkrypcji należy użyć równej objętości z każdej frakcji (izolowanego RNA).
  3. Analiza wyników
    1. Użyj wartości Ct zainteresowanego genu i lucyferazy, aby obliczyć wartości Ct delta
    2. Wyraź wartość każdej frakcji delta Ct jako procent całkowitej wartości mRNA zawartej we wszystkich frakcjach, aby zobrazować rozkład mRNA w różnych frakcjach (tabela 1)

4. Izolacja i analiza miRNA z frakcji polisomowych i frakcji nietranslujących

  1. Ekstrakcja mRNA i miRNA
    UWAGA: Ten protokół jest zgodny z instrukcjami producenta, z kilkoma zmianami.
    1. Rozmrozić glikogen i kontrolę skoków. Trzymaj na lodzie.
    2. Dodać 700 μl odczynnika do ekstrakcji miRNA do 200 μl próbki zbiorczej.
    3. Dodać 1 μg/μl glikogenu i homogenizować za pomocą pipety. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Dodaj 3,5 μl 1,6 x 108 spike-in control i wymieszaj.
    5. Dodać 200 μl chloroformu i wirować przez co najmniej 15 sekund.
    6. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Za pomocą pipety przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odrzuć środkową i dolną fazę.
    9. Dodaj 1,5x objętość 100% etanolu do supernatantu i wymieszaj.
    10. Przenieść 700 μl tej mieszaniny do kolumny ekstrakcyjnej miRNA i odwirować ją z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ; powtórzyć ten krok z pozostałą próbką.
    11. Dodać 700 μl buforu 1 do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ.
    12. Dodać 500 μl buforu 2 do kolumny i odwirować go z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ
      13. .
    13. Dodać 500 μl 80% etanolu do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ
      14. .
    14. Przenieść kolumnę do nowej probówki bez korka o pojemności 2 ml, otworzyć pokrywkę i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 5 minut z pełną prędkością; odrzucić przepływ
      15. .
    15. Dodać 16 μl wody wolnej od RNAzy do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Eluat należy przechowywać na lodzie lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
      UWAGA: Do analizy OD można użyć dwóch mikrolitrów każdej próbki.
  2. Odwrotna transkrypcja
    1. Przygotuj na lodzie. Na każde 20 μl reakcji RT-PCR dodać 4 μl buforu miRNA RT, 2 μl kwasów nukleinowych, 9 μl całkowitego RNA, 2 μl enzymu i 3 μl wody wolnej od RNAzy; Wymieszaj i krótko odwiruj.
    2. Ustaw termocykler w następujący sposób:
      37 °C przez 60 min;
      95 °C przez 5 min;
      Trzymać w 4 °C.
    3. Wyjmij probówki z termocyklera i dodaj 200 μl wody wolnej od RNAse. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do PCR w czasie rzeczywistym.
  3. PCR
    UWAGA: Ten protokół jest zgodny z formatem płytki 96-dołkowej. Przygotuj mieszaninę reakcyjną na lodzie.
    1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR i dodaj cDNA (z powyższych miRNA) zgodnie z zakresem przyjętym przez protokół. Partiami można przygotować wiele reakcji.
    2. Dodaj w sumie 25 μl mieszanki PCR + cDNA do każdej studzienki.
    3. Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej uszczelki płytowej.
    4. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
    5. Zaprogramuj cykler w czasie rzeczywistym w następujący sposób:
      Początkowy etap aktywacji w temperaturze 95 °C przez 15 min;
      3-stopniowy cykl: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 15 s; wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s; wydłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s (przeprowadzić zbieranie danych fluorescencyjnych); Dodaj 40 cykli;
      Krzywa topnienia zgodnie z domyślnym ustawieniem cyklera.
  4. analiza porównawcza
    1. Przykład normalizacji (patrz Tabela 2):
      1. Znajdź minimalną wartość SCM.
      2. Znormalizuj wszystkie wartości SCM do tego minimum.
      3. Odejmij tę wartość od wartości Ct miRNA będących przedmiotem zainteresowania (MOI) i genu referencyjnego (REF).
      4. Analizuj dane przy użyciu wzoru 2-ΔCt.

5. Analiza proteomiczna

  1. Ekstrakcja białek z frakcji polisomowych
    1. Połącz zebrane frakcje sacharozy w trzy końcowe frakcje. Oznaczyć frakcje jako ciężkie (wysokosprawne polisomy we wspólnych frakcjach 4, 5, 6 i 7 o najwyższym stężeniu sacharozy; dno rurki gradientowej), lekkie (polisomy o niskiej wydajności we frakcji zbiorczej 8, 9, 10 i 11; środek rurki gradientowej) i nietranslujące (frakcje zbiorcze 12, 13, 14 i 15 o najniższym stężeniu sacharozy; górna część rurki gradientowej). Wykonaj test białka na frakcjach zbiorczych.
    2. Przygotować 100% wywar z kwasu trichlorooctowego (TCA) i przechowywać go w temperaturze 4 °C w ciemności. Zmieszać 0,5 ml próbki z 60 μl 100% TCA i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc w ciemności.
      UWAGA: Użyj probówek o niskiej retencji białka o pojemności 1,5 ml (patrz tabela materiałów).
    3. Po całonocnej inkubacji rozmrozić próbkę na lodzie i odwirować w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 30 min. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: 100 μg białka całkowitego w próbce daje widoczne osadki białkowe na dnie probówki.
    4. Wstępnie schłodzić aceton w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Dodać 0,5 ml zimnego acetonu do osadu białkowego i odwirować w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    5. Wysuszyć pelety na powietrzu. Zawiesić osad w 360 μl 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8).
      UWAGA: W razie potrzeby użyj sonografu impulsowego, aby ponownie zawiesić osad.
    6. Dodać 40 μl 0,1 M ditiotreitolu (końcowe stężenie 10 mM) i inkubować w temperaturze 55 °C na wytrząsarce przez 45 minut. Dodać 50 μl 0,15 M jodoacetamidu (końcowe stężenie 17 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 30 minut w ciemności.
    7. Przygotuj roztwór trypsyny: ponownie zamieszaj 20 μg trypsyny w 100 μl 50 mM wodorowęglanu amonu. Dodać odpowiednią objętość roztworu trypsyny do próbki w stosunku trypsyna do białka 1:50 (w/w), upewnić się, że pH wynosi 8 i inkubować na wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Dodaj 1 M wodorowęglan amonu, aby doprowadzić pH do 8.
    8. Po wytrawieniu trypsyną schłodzić próbkę, krótko odwirować w wirówce stołowej, dodać 10% kwasu mrówkowego do pH 2–3 w celu wygaszenia aktywności trypsyny i przystąpić do odsalania próbki.
      UWAGA: Do odsalania próbki należy użyć płytki μ-elucyjnej.
    9. Kondycjonować sorbent w studzienkach na płytce 96-dołkowej za pomocą 200 μl metanolu za pomocą trzykrotnego podciśnienia, a następnie trzykrotnie kondycjonować 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Załadować próbkę i trzykrotnie przepłukać ją przy użyciu 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Dwukrotnie wypłukać próbkę za pomocą 100 μl 50% acetonitrylu/0,1% kwasu mrówkowego do probówki o niskiej retencji białka 0,5 ml.
      UWAGA: Na początku eluować próbkę powoli, używając grawitacji, a następnie włączając niską próżnię.
    10. Odparować próbkę, eluować do sucha za pomocą koncentratora i bezpośrednio przeprowadzić analizę metodą spektrometrii mas lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  2. Analiza spektrometrii mas
    1. Każdą osadkę (składającą się z peptydów tryptycznych) rozpuścić w 50–100 μl i wstrzyknąć 1 μl do spektrometru masowego.
      Uwaga: Zoptymalizuj objętości rozpuszczenia i wstrzyknięcia, aby uzyskać maksymalną intensywność sygnału LC/MS/MS. W naszym przypadku maksymalny sygnał (całkowity prąd jonowy; TIC) w sercu skanu mieścił się w zakresie od 1E8 do 2E9.
    2. Użyj kolumny pułapki C18 (300 μm id x 5 mm, 5 μm, 100A), a następnie oddziel peptydy za pomocą kolumny C18 (75 μm id x 250 mm, 2 μm, 100A) z natężeniem przepływu ustawionym na 300 nL/min. Ustaw temperaturę kapilary nanoźródła na 275 °C, a napięcie natrysku na 2 kV.
    3. Zastosuj gradient liniowy 5–35% B przez 90 minut, 35–95% B przez 3 minuty, utrzymując 95% B przez 7 minut i równowagę przy 5% B przez 25 minut (A: 0,1% kwas mrówkowy/woda i B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu). Uzyskaj widma MS2 dla 15 jonów o najwyższej intensywności z każdego skanowania MS1 w trybie CID. Dla każdej analizowanej próbki należy użyć 3 powtórzeń spektrometrii mas.
      UWAGA: Zoptymalizuj i wykorzystaj warunki i parametry eksperymentalne, które są odpowiednie dla Twoich próbek na konkretnym przyrządzie do spektrometrii mas. Warunki/parametry wymienione w sekcji 5.2. zostały wykorzystane i zoptymalizowane w naszym laboratorium.
  3. Identyfikacja/ocena ilościowa białek
    1. Po analizie spektrometrii mas przekonwertuj surowe pliki widm na kompatybilne pliki mzXML za pomocą oprogramowania MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. Prześlij przekonwertowane pliki do wyszukiwarki SEQUEST z kryteriami wyszukiwania, np. baza danych myszy UniProtKB/Swiss-Prot (najbardziej aktualna sprawdzona kanonicznie); trawienie półenzymatyczne przy użyciu trypsyny (po KR/-); z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami; zakres masowy prekursora: 400 do 4 500 amu; modyfikacja statyczna: karbamidometyl (C) 57,021465 amu; tolerancja masy peptydu: 50 ppm; typ masy fragmentu: monoisotopic.
      UWAGA: Można korzystać z innych wyszukiwarek baz danych białek i potoków danych. W przypadku korzystania z bazy danych np. szczurów, która jest mniej kompletna niż bazy danych dla myszy i ludzi, może być konieczne przeszukanie baz danych myszy (i/lub ludzi) w celu zwiększenia pokrycia proteomem. W takim przypadku konieczne będzie usunięcie nadmiarowości w nazwach białek.
    3. Przeprowadź analizę po wyszukiwaniu. Ustaw filtry wyświetlania danych. Na przykład ustaw minimalne prawdopodobieństwo białka (próg białka) na 95% lub 99%, tj. zostaną wyświetlone tylko te białka, dla których analiza statystyczna implikuje 95% lub 99% prawdopodobieństwo obecności w próbce. Ustaw filtr dla progu peptydowego (np. 95%), tj. minimalnego prawdopodobieństwa, które zostanie użyte do określenia, czy widmo identyfikuje peptyd. Wybierz minimalną liczbę peptydów, które określą, czy białko jest obecne (zalecane są minimum 2 peptydy do identyfikacji białka).
    4. Oceń zidentyfikowane białka pod kątem jakości/ilości. Upewnij się, że peptydy proteotypowe są używane do oznaczania ilościowego. Jeśli izoforma zostanie zidentyfikowana, upewnij się, że opiera się na obserwacji peptydu tryptycznego składającego się z sekwencji aminokwasów unikalnej dla danej izoformy. Wszelkie "podobne do" lub hipotetyczne białka powinny zostać porównane, aby sprawdzić, czy obserwowane peptydy odpowiadają znanemu białku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza mRNA
Wyniki analizy mRNA można przedstawić jako rozkład konkretnego mRNA w każdej frakcji (Rysunek 3A); w celu kwantyfikacji należy połączyć frakcje polirybosomalne translacyjne i porównać je z frakcją nietranslacyjną (Rysunek 3B), prezentując stosunek obfitości mRNA w frakcjach translacyjnych do nietranslacyjnych. Dodatkowe informacje uzyskuje się poprzez oddzielne badanie frakcji polisomów o wysokiej wyda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analiza profilu polisomowego pozwala na badanie translacji białek poprzez analizę stanu translacyjnego określonego mRNA lub całego transkryptomu 6,7. Jest to również bardzo pomocne, gdy trzeba zbadać translację lokalną, taką jak synaptosomy8. Tradycyjnie, metoda ta polega na rozdzieleniu mono- i polirybosomów oraz związanych z nimi mRNA na gradiencie sacharozy, który można połączyć z technikami genomicznymi lub proteomicznymi w celu uzyska...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), Barbra Streisand Women's Heart Center (RAG, JVE), Dorothy and E. Phillip Lyon Chair in Molecular Cardiology (RAG), Erika Glazer Endowed Chair in Woman's Heart Health (JVE) oraz Wsparcie Instytucjonalne Czeskiej Akademii Nauk RVO: 68081715 (MS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373do eutanazji
HeparynaSagent103424preparatycznych Langendorff
Fine Science Tools91110-10służy do zawieszania serca
System LangendorffaRadnoti + domowej robotynie dotyczySystem "czterech serc" składający się z niestandardowego dmuchanego szkła, rurek i kąpieli wodnych
NaClSigmaS7653-5KGBufor Krebsa i gradient sacharozy
KClSigmaP5405Bufor Krebsa i bufor do lizy
KH2PO42SigmaP-5504Bufor Krebsa
MgSO4SigmaM7774-500GBufor Krebsa
GlukozaSigmaG5767Bufor Krebsa
CaCl2SigmaC1016-500GBufor Krebsa
Sacharoza w proszkuSigmaS0389-1KGGradient sacharozy
MgCl2Sigma208337Gradient sacharozy i bufor do lizy
Tris-baseSigmaT1503-1KGBufor gradientu sacharozy i bufor do lizy
Ksylen CyanoleSigmaX-4126Gradient sacharozy
CykloheksymidSigma-aldrich239763Gradient sacharozy i bufor lizy
RNaseOUTLife TechnologiesC00019Inhibitor RNAzy do buforu lizy
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021Bufor do lizy
Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe, bez EDTARoche5056489001
Probówka, cienkościenna, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mmBeckman Coulter344059
UltrawirówkaBeckmanLE-80KUltrawirowanie gradientów
RotorBeckmanSW41Ultrawirowanie gradientów
Biologic LP (pompa)Biorad731-8300Frakcjonowanie gradientów
BioFracBiorad741-0002Frakcjonowanie gradientów
Probówki do mikrowirówek Eppendorf RNA/DNA LoBind, probówka 2 mlSigmaZ666513-100EAFrakcja gradientowa i ekstrakcja RNA
Odczynnik TRIzolTechnologie życia EkstrakcjaRNAAM9738
Lucyferazy Kontrola RNAEkstrakcja RNAPromegaL4561
ChloroformFisher ScientificC606-4RNA ekstrakcja
Glikogen, klasa RNAThermo Fisher ScientificR0551Ekstrakcja RNA
IzopropanolSigmaI9516Ekstrakcja RNA
EtanolSigmaE7023-1LEkstrakcja RNA
iScript Zestaw do syntezy cDNABioRad170-8891Odwrotna transkrypcja
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit do całkowitej izolacji RNA
miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit do odwrotnej transkrypcji miRNA
miScript Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit do analizy ekspresji miRNA PCR w czasie rzeczywistym
Wirówka 5424REppendorfDo wirowania probówek o pojemności 1,5 ml lub 2,0 ml w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 21130 x g
Wirówka 5810REppendorfDo wirowania płytek PCR w czasie rzeczywistym w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 2039 x g
My Cycler Thermal CyclerBio-RadDo odwrotnej transkrypcji
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal CyclerBio-RadDo analizy PCR w czasie rzeczywistym
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610Do kontroli jakości izolacji RNA
96-dołkowe płytki PCR Hard-Shell, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczysteBio-RadHSP9641Do analizy PCR w czasie rzeczywistym
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optycznaBio-RadMSB1001Do uszczelniania płytek PCR w czasie rzeczywistym
Badania plus pipeta jednokanałowa, szara; 0,5-10 i mikro; LEppendorfUX-24505-02Do pipetowania
pipet PIPETMAN Classic, P20GilsonF123600GDo pipetowania
pipet PIPETMAN Classic, P200GilsonF144565Do pipetowania
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ LGilson17011782Do pipetowania
glikogenu, klasa RNAThermo Fisher ScientificR0551Poprawia całkowitą skuteczność izolacji RNA
Probówki Posi-Click 1,7 ml, naturalny kolorDenvilleC2170Izolacja i przechowywanie RNA; mieszanka odczynników
Termiczne probówki rowerowe -0,2 ml Indywidualne nakrętki, standardowe probówki 0,2 ml z optycznieDenvilleC18098-4 (1000910)Reakcja odwrotnej transkrypcji
Sharp 10 Precyzyjne końcówki barieroweDenvilleP1096-FRDo pipetowania
Sharp 20 Precyzyjne końcówki barieroweDenvilleP1121Do pipetowania
Sharp 200 Precyzyjne końcówki barieroweDenvilleP1122Do pipetowania
Końcówki LTS 1 mL FilterRaininRT-L1000FDo pipetowania
miScript Primer Test ( 200)Qiagen(zmienia się w zależności od miRNA)Do analizy PCR w czasie rzeczywistym
Gradient Master ver 5.3 Model 108BioComp InstrumentsDo przygotowania gradientów sacharozy
kwas trichlorooctowySigma AldrichT6399
acetonSigma Aldrich650501
Tris chlorowodorekAmrescoM108
ditiotreitolFisher ScientificBP172
jodoacetamidGbiosciencesRC-150
stopień sekwencjonowania zmodyfikowana trypsyna, świniaPromegaV5111
wodorowęglan amonuBDHBDH9206
kwas mrówkowy, Optima LC/MSFisher ChemicalA117
metanol, Optima LC/MSFisher ChemicalA454
acetonitryl, Optima LC/MSFisher ChemicalA996
Probówki białkowe LoBind 0,5 mlEppendorf AG22431064
Probówki białkowe LoBind 1,5 mlEppendorf AG22431081
HLB µ Płytka elucyjna 30 &mikro; mOasis186001828BA
Koncentrator SpeedVacThermo ScientificSavant SPD2010
sonikatorWirówka QsonicaOasis180
Thermo ScientificSorvall Legend micro 21R
pułapkowa PepMap 100 C18Kolumna160454
LC PepMap RSLC C18Spektrometr masowy Thermo Scientific164536
Thermo ScientificOrbitrap Elite spektrometr
Oprogramowanie MSConvertZestaw narzędzi ProteoWizard
Sorcerer-SEQUESTSage-N Research, Inc.
stosowany w kleszczach LC kolumna separacyjna Thermo Scientific masowy z pułapką jonową Oprogramowanie

Bibliografia

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303(2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie polisom wekstrakcja bia ekwytr canie TCAgradient sacharozyultrawirowanieanaliza mRNAniedokrwienie i reperfuzja
Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.