Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Streszczenie

Badania nad dynamicznymi zmianami w translacji białek wymagają specjalistycznych metod. Tutaj zbadaliśmy zmiany w nowo zsyntetyzowanych białkach w odpowiedzi na niedokrwienie i reperfuzję przy użyciu izolowanego perfundowanego serca myszy w połączeniu z profilowaniem polisomów. Aby lepiej zrozumieć dynamiczne zmiany w translacji białek, scharakteryzowaliśmy mRNA, które były obciążone rybosomami cytozolowymi (polirybosomami lub polisomami), a także odzyskaliśmy polisomy mitochondrialne i porównaliśmy dystrybucję mRNA i białek we frakcjach o wysokiej wydajności (liczne rybosomy przyłączone do mRNA), o niskiej wydajności (przyłączonych mniej rybosomów), które obejmowały również polisomy mitochondrialne, oraz frakcje nietranslujące. miRNA mogą również wiązać się z mRNA, które są poddawane translacji, zmniejszając w ten sposób wydajność translacji, zbadaliśmy rozkład miRNA we frakcjach. Rozkład mRNA, miRNA i białek badano w podstawowych warunkach perfuzji, pod koniec 30 minut globalnego niedokrwienia bez przepływu i po 30 minutach reperfuzji. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystane do przeprowadzenia tej analizy – w szczególności podejście do optymalizacji ekstrakcji białek z gradientu sacharozy, ponieważ nie zostało to wcześniej opisane – i przedstawiamy kilka reprezentatywnych wyników.

Wprowadzenie

Serce reaguje na uraz spowodowany niedokrwieniem (I) i reperfuzją (R) w sposób dynamiczny. Jednak niewiele jest wglądu w ostre zmiany w syntezie białek podczas odpowiedzi. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystaliśmy sprawdzoną metodę profilowania polisomów¹, aby zidentyfikować zmiany w obfitości białek, które odzwierciedlają redystrybucję rybosomów i translacyjnych czynników regulacyjnych od cytozolu do polisomów oraz wzrost nowo zsyntetyzowanych białek (NSP). W ustawieniu I/R wzrost syntezy nowych białek następuje w ramach czasowych, które są niespójne z transkrypcją nowych mRNAs²; ponadto odnotowano niezgodność między poziomami ekspresji mRNA a obfitością białka³. Z tych powodów zdecydowaliśmy się przeanalizować zmiany w dynamicznym proteomie odzwierciedlone przez translację białek. Aby to zrobić, oznaczamy ilościowo mRNA we frakcjach polisomów i analizujemy skład białek we frakcjach polisomów. Wreszcie, ponieważ mikroRNA (miR) regulują dostępność mRNA do translacji i mogą zakłócać wydajność translacji białek^4,5, zbadaliśmy rozkład miR we frakcjach polisomów, koncentrując się na odpowiedzi na I/R.

Zdecydowaliśmy się użyć izolowanego mysiego modelu perfuzji Langendorffa i pobraliśmy tkankę w podstawowych warunkach ciągłej perfuzji, po 30 minutach globalnego niedokrwienia bez przepływu, a następnie po 30 minutach niedokrwienia, a następnie 30 minutach reperfuzji. Następnie rozpuściliśmy tkankę serca i oddzieliliśmy polisomy w gradiencie sacharozy, a następnie przeprowadziliśmy analizę proteomiczną i selektywne wykrywanie mRNA i miRNA odpowiednio za pomocą PCR i mikromacierzy. Ta kombinacja metod stanowi potężne podejście do zrozumienia dynamicznego proteomu, umożliwiając jednoczesne wykrywanie mRNA, miRNA i NSP, a także redystrybucję białek regulatorowych, miRNA i mRNA między frakcjami nietranslacyjnymi, polisomami o niskiej wydajności i polisomami o wysokiej wydajności (patrz Rysunek 1). Wgląd w dynamiczną regulację tego procesu zostanie poszerzony o dalszą analizę fosforylacji kluczowych czynników regulacyjnych, takich jak eIF2α czy mTOR. Te poszczególne kroki są teraz szczegółowo opisane.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Centrum Medycznym Cedars-Sinai.

1. Langendorff Perfuzja Mysiego Serca

1. Perfuzja Langendorffa serca myszy z niedokrwieniem i reperfuzją
   1. Pentobarbital sodu należy podawać dootrzewnowo w dawce 70 mg/kg dorosłej myszy (8-tygodniowej płci męskiej, C57BL6/j). Potwierdź głębokie znieczulenie przez brak wycofania się do uszczypnięcia palca u nogi.
   2. Przeciwzakrzepowy z heparyną dootrzewnową 500 U/kg.
   3. Otwórz klatkę piersiową przez nacięcie mostka. Otwórz przeponę i przetnij wzdłuż granicy żebrowej do przedniej osi pachowej. Następnie przetnij przednią oś pachową aż do kończyny przedniej, aby całkowicie otworzyć klatkę piersiową. Następnie, wizualizując serce, zaciśnij aortę wstępującą kleszczami i szybko wytnij serce. Śmierć nastąpiła w wyniku wykrwawienia. Umieść serce w zimnym Krebsie (NaCl 6,9 g/L, KCl 0,35 g/L, NaHCO₃ 2,1 g/L, KH₂PO₄ 0,16 g/L, MgSO₄ 0,141 g/L, glukoza 2 g/L i CaCl₂ 0,373 g/L).
   4. Kankaniulować aortę za pomocą igły z końcówką i perfuzjować serce wstecznie roztworem Krebsa w trybie stałego ciśnienia.
   5. Po okresie stabilizacji trwającym 15 minut poddaj serce globalnemu niedokrwieniu bez przepływu przez 30 minut, a następnie reperfuzji przez 30 minut.
   6. Zbierz serca po 15 minutach perfuzji wyjściowej, po 30 minutach niedokrwienia lub po 30 minutach reperfuzji. Odetnij przedsionki i zatrzaskowo zamroź tkankę w ciekłym azocie.
   7. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia

2. Homogenizacja tkanek, solubilizacja i sedymentacja w gradimencie gęstości sacharozy

1. Przygotowanie gradientu
   1. Przygotować 2 roztwory (15% i 50%) 100 ml sacharozy, mieszając 4 ml NaCl 2,5 M;
      0,8 ml MgCl₂ 1,25 M; 1 ml Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 15 g lub 50 g sacharozy (odpowiednio dla 15% i 50%); ultraczysta woda do 100 ml; i cyjanol ksylenu (0,02 mg/ml) do barwienia 15% roztworu
   2. Przefiltruj każdy roztwór (filtry 0,22 μm)
   3. W dniu, w którym ma być zastosowany gradient, należy przygotować 40 ml każdego roztworu sacharozy i dodać cykloheksymid do każdego roztworu, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 μg/ml
      1. Użyj ekspresu do gradientów, aby przygotować mieszankę między 15% i 50% roztworami sacharozy
      2. Wypełnij lewą komorę 5 ml 15% gradientu sacharozy
      3. Wypełnij prawą komorę 50% gradientem sacharozy
      4. Otwórz kran i włącz pompę, aby wymieszać dwie małe komory za pomocą mieszadła magnetycznego
      5. Użyj rurki połączonej z drugim kranem, aby umożliwić przepływ zmieszanego roztworu sacharozy w ultra-wirówce o cienkich ściankach. Ostateczna objętość wyniesie około 10 ml.
   4. Utrzymuj nachylenie na poziomie 4 °C (w razie potrzeby przez noc, ale nie dłużej)
2. Homogenizacja tkanki serca
   1. Homogenizować świeże lub mrożone serce za pomocą polytronu w przefiltrowanym buforze do lizy (zmodyfikowanym do frakcjonowania gradientowego sacharozy) zawierającym 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 0,4% NP-40. Zawiera cykloheksymid 100 μg/ml w celu utrzymania struktury polisomów, inhibitor RNazy 0,1 U i koktajl inhibitorów proteazy (1 tabletka na 50 ml).
   2. Inkubować lizat na lodzie 15 min.
   3. Wirować przy 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i zebrania supernatantu.
   4. Zarezerwuj 50 μl do oznaczania białka, izolacji RNA i analizy integralności RNA (patrz rysunek 2).
   5. Nałożyć supernatant (500–100 μl) na gradienty i zrównoważyć probówki buforem do lizy.
3. Sedymentacja i zbieranie frakcji
   1. Przeprowadzić ultrawirowanie przez 120 minut przy 37 000 obr./min w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Według producenta odpowiada to 228 000 x g przy maksymalnym promieniu.
   2. Zebrać każdy gradient jako 17 frakcji (około 600 μl każdej frakcji) w probówkach do mikrowirówek z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 254 nm (OD₂₅₄).
   3. Zaprogramuj kolektor frakcji w następujący sposób:
      1. Wyrzucić pierwsze 3 minuty zbierania (odpowiadające płynowi zawartemu w probówkach przed gradientem)
      2. Od 4 do 19 min zbieraj frakcje z prędkością 1 ml/min w 17 frakcjach.
   4. Umieść frakcje na lodzie, gdy tylko każda z nich zostanie zebrana. Próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C, jeżeli nie są one przetwarzane natychmiast. Typowy densytometryczny ślad gradientu w promieniowaniu UV w miarę jego zbierania przedstawiono na rysunku 1.

3. Izolacja i analiza mRNA z frakcji polisomowych i nietranslujących

1. Ekstrakcja mRNA
   1. Rozmrozić frakcje na lodzie, jeśli po zebraniu zostały zamrożone
   2. Przenieść 200 μl każdej frakcji do świeżej probówki
      UWAGA: Na tym etapie można połączyć ze sobą dwie lub więcej kolejnych frakcji. Należy to zrobić ostrożnie po przeanalizowaniu wykresu OD₂₅₄, aby frakcje polisomowe i niepolisomowe nie uległy zmieszaniu.
   3. Dodaj 10 ng RNA lucyferazy jako kontrolę wewnętrzną do każdej próbki w celu normalizacji.
      UWAGA: Startery lucyferazy powinny być stosowane jako kontrola wewnętrzna w celu normalizacji wyników.
   4. Dodać 700 μl odczynnika do ekstrakcji RNA (jednofazowy roztwór fenolu i izotiocyjanianu guanidyny; patrz tabela materiałów) do każdej probówki. Dobrze wymieszać i inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 140 μl chloroformu i wirować przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze smojnej.
   6. Odwirowywać próbki przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
   7. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do nowej probówki.
   8. Ponieważ zawartość RNA we frakcjach nie jest wysoka, do każdej probówki dodać 10 μg glikogenu jako nośnika.
   9. Do każdej probówki dodać 350 μl izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę w celu zwiększenia plonu.
   10. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
   11. Wyrzucić supernatant i dodać 700 μl etanolu 75%, aby przepłukać osad RNA.
   12. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g w temperaturze 4 °C.
   13. Usuń etanol i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 10–15 minut.
       UWAGA: Nadmierne wysuszenie osadu RNA zapobiegnie jego całkowitej rozpuszczalności w wodzie.
   14. Zawiesić osad RNA w 50 μl ultraczystego H₂O wolnego od RNaz.
   15. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 55 °C.
   16. Użyć 2 μl każdej próbki do zmierzenia jakości i ilości wyekstrahowanego RNA, a pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Odwrotna transkrypcja i qPCR
   1. Użyj 4 μl zestawu do syntezy cDNA z odwrotną transkrypcją (patrz tabela materiałów) do reakcji 20 μl. Przygotować supermiks w zależności od liczby próbek. Przenieś wymaganą objętość do każdej probówki i dodaj 5 μl wejściowego RNA do każdej probówki. Objętość tę można skorygować tak, aby była istotna dla zakresu warunków pracy polimerazy Taq.
   2. Inkubować probówki w termocyklerze według następującego programu zalecanego przez producenta: 5 minut w temperaturze 25 °C, 20 minut odwrotnej transkrypcji przez 20 minut w temperaturze 46 °C i inaktywacja odwrotnej transkryptazy przez 1 minutę w temperaturze 95 °C.
   3. Uruchom qPCR ze zoptymalizowanym programem dla każdej pary starterów.
      UWAGA: Aby wykryć obecność niektórych mRNA we frakcjach, do odwrotnej transkrypcji należy użyć równej objętości z każdej frakcji (izolowanego RNA).
3. Analiza wyników
   1. Użyj wartości Ct zainteresowanego genu i lucyferazy, aby obliczyć wartości Ct delta
   2. Wyraź wartość każdej frakcji delta Ct jako procent całkowitej wartości mRNA zawartej we wszystkich frakcjach, aby zobrazować rozkład mRNA w różnych frakcjach (tabela 1)

4. Izolacja i analiza miRNA z frakcji polisomowych i frakcji nietranslujących

1. Ekstrakcja mRNA i miRNA
   UWAGA: Ten protokół jest zgodny z instrukcjami producenta, z kilkoma zmianami.
   1. Rozmrozić glikogen i kontrolę skoków. Trzymaj na lodzie.
   2. Dodać 700 μl odczynnika do ekstrakcji miRNA do 200 μl próbki zbiorczej.
   3. Dodać 1 μg/μl glikogenu i homogenizować za pomocą pipety. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Dodaj 3,5 μl 1,6 x 10⁸ spike-in control i wymieszaj.
   5. Dodać 200 μl chloroformu i wirować przez co najmniej 15 sekund.
   6. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   7. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
   8. Za pomocą pipety przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Odrzuć środkową i dolną fazę.
   9. Dodaj 1,5x objętość 100% etanolu do supernatantu i wymieszaj.
   10. Przenieść 700 μl tej mieszaniny do kolumny ekstrakcyjnej miRNA i odwirować ją z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ; powtórzyć ten krok z pozostałą próbką.
   11. Dodać 700 μl buforu 1 do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ.
   12. Dodać 500 μl buforu 2 do kolumny i odwirować go z pełną prędkością przez 15 s w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ
   .
   13. Dodać 500 μl 80% etanolu do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 2 minuty w temperaturze pokojowej; odrzucić przepływ
   .
   14. Przenieść kolumnę do nowej probówki bez korka o pojemności 2 ml, otworzyć pokrywkę i odwirować ją w temperaturze pokojowej przez 5 minut z pełną prędkością; odrzucić przepływ
   .
   15. Dodać 16 μl wody wolnej od RNAzy do kolumny i odwirować ją z pełną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Eluat należy przechowywać na lodzie lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
       UWAGA: Do analizy OD można użyć dwóch mikrolitrów każdej próbki.
2. Odwrotna transkrypcja
   1. Przygotuj na lodzie. Na każde 20 μl reakcji RT-PCR dodać 4 μl buforu miRNA RT, 2 μl kwasów nukleinowych, 9 μl całkowitego RNA, 2 μl enzymu i 3 μl wody wolnej od RNAzy; Wymieszaj i krótko odwiruj.
   2. Ustaw termocykler w następujący sposób:
      37 °C przez 60 min;
      95 °C przez 5 min;
      Trzymać w 4 °C.
   3. Wyjmij probówki z termocyklera i dodaj 200 μl wody wolnej od RNAse. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do PCR w czasie rzeczywistym.
3. PCR
   UWAGA: Ten protokół jest zgodny z formatem płytki 96-dołkowej. Przygotuj mieszaninę reakcyjną na lodzie.
   1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR i dodaj cDNA (z powyższych miRNA) zgodnie z zakresem przyjętym przez protokół. Partiami można przygotować wiele reakcji.
   2. Dodaj w sumie 25 μl mieszanki PCR + cDNA do każdej studzienki.
   3. Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej uszczelki płytowej.
   4. Odwirować płytkę przez 1 minutę przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej.
   5. Zaprogramuj cykler w czasie rzeczywistym w następujący sposób:
      Początkowy etap aktywacji w temperaturze 95 °C przez 15 min;
      3-stopniowy cykl: denaturacja w temperaturze 94 °C przez 15 s; wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 30 s; wydłużenie w temperaturze 70 °C przez 30 s (przeprowadzić zbieranie danych fluorescencyjnych); Dodaj 40 cykli;
      Krzywa topnienia zgodnie z domyślnym ustawieniem cyklera.
4. analiza porównawcza
   1. Przykład normalizacji (patrz Tabela 2):
      1. Znajdź minimalną wartość SCM.
      2. Znormalizuj wszystkie wartości SCM do tego minimum.
      3. Odejmij tę wartość od wartości Ct miRNA będących przedmiotem zainteresowania (MOI) i genu referencyjnego (REF).
      4. Analizuj dane przy użyciu wzoru ^2-ΔCt.

5. Analiza proteomiczna

1. Ekstrakcja białek z frakcji polisomowych
   1. Połącz zebrane frakcje sacharozy w trzy końcowe frakcje. Oznaczyć frakcje jako ciężkie (wysokosprawne polisomy we wspólnych frakcjach 4, 5, 6 i 7 o najwyższym stężeniu sacharozy; dno rurki gradientowej), lekkie (polisomy o niskiej wydajności we frakcji zbiorczej 8, 9, 10 i 11; środek rurki gradientowej) i nietranslujące (frakcje zbiorcze 12, 13, 14 i 15 o najniższym stężeniu sacharozy; górna część rurki gradientowej). Wykonaj test białka na frakcjach zbiorczych.
   2. Przygotować 100% wywar z kwasu trichlorooctowego (TCA) i przechowywać go w temperaturze 4 °C w ciemności. Zmieszać 0,5 ml próbki z 60 μl 100% TCA i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc w ciemności.
      UWAGA: Użyj probówek o niskiej retencji białka o pojemności 1,5 ml (patrz tabela materiałów).
   3. Po całonocnej inkubacji rozmrozić próbkę na lodzie i odwirować w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 30 min. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: 100 μg białka całkowitego w próbce daje widoczne osadki białkowe na dnie probówki.
   4. Wstępnie schłodzić aceton w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Dodać 0,5 ml zimnego acetonu do osadu białkowego i odwirować w temperaturze 15 000 x g, 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie.
   5. Wysuszyć pelety na powietrzu. Zawiesić osad w 360 μl 50 mM buforu Tris-HCl (pH 8).
      UWAGA: W razie potrzeby użyj sonografu impulsowego, aby ponownie zawiesić osad.
   6. Dodać 40 μl 0,1 M ditiotreitolu (końcowe stężenie 10 mM) i inkubować w temperaturze 55 °C na wytrząsarce przez 45 minut. Dodać 50 μl 0,15 M jodoacetamidu (końcowe stężenie 17 mM) i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 30 minut w ciemności.
   7. Przygotuj roztwór trypsyny: ponownie zamieszaj 20 μg trypsyny w 100 μl 50 mM wodorowęglanu amonu. Dodać odpowiednią objętość roztworu trypsyny do próbki w stosunku trypsyna do białka 1:50 (w/w), upewnić się, że pH wynosi 8 i inkubować na wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Dodaj 1 M wodorowęglan amonu, aby doprowadzić pH do 8.
   8. Po wytrawieniu trypsyną schłodzić próbkę, krótko odwirować w wirówce stołowej, dodać 10% kwasu mrówkowego do pH 2–3 w celu wygaszenia aktywności trypsyny i przystąpić do odsalania próbki.
      UWAGA: Do odsalania próbki należy użyć płytki μ-elucyjnej.
   9. Kondycjonować sorbent w studzienkach na płytce 96-dołkowej za pomocą 200 μl metanolu za pomocą trzykrotnego podciśnienia, a następnie trzykrotnie kondycjonować 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Załadować próbkę i trzykrotnie przepłukać ją przy użyciu 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego. Dwukrotnie wypłukać próbkę za pomocą 100 μl 50% acetonitrylu/0,1% kwasu mrówkowego do probówki o niskiej retencji białka 0,5 ml.
      UWAGA: Na początku eluować próbkę powoli, używając grawitacji, a następnie włączając niską próżnię.
   10. Odparować próbkę, eluować do sucha za pomocą koncentratora i bezpośrednio przeprowadzić analizę metodą spektrometrii mas lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Analiza spektrometrii mas
   1. Każdą osadkę (składającą się z peptydów tryptycznych) rozpuścić w 50–100 μl i wstrzyknąć 1 μl do spektrometru masowego.
      Uwaga: Zoptymalizuj objętości rozpuszczenia i wstrzyknięcia, aby uzyskać maksymalną intensywność sygnału LC/MS/MS. W naszym przypadku maksymalny sygnał (całkowity prąd jonowy; TIC) w sercu skanu mieścił się w zakresie od 1E8 do 2E9.
   2. Użyj kolumny pułapki C18 (300 μm id x 5 mm, 5 μm, 100A), a następnie oddziel peptydy za pomocą kolumny C18 (75 μm id x 250 mm, 2 μm, 100A) z natężeniem przepływu ustawionym na 300 nL/min. Ustaw temperaturę kapilary nanoźródła na 275 °C, a napięcie natrysku na 2 kV.
   3. Zastosuj gradient liniowy 5–35% B przez 90 minut, 35–95% B przez 3 minuty, utrzymując 95% B przez 7 minut i równowagę przy 5% B przez 25 minut (A: 0,1% kwas mrówkowy/woda i B: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu). Uzyskaj widma MS2 dla 15 jonów o najwyższej intensywności z każdego skanowania MS1 w trybie CID. Dla każdej analizowanej próbki należy użyć 3 powtórzeń spektrometrii mas.
      UWAGA: Zoptymalizuj i wykorzystaj warunki i parametry eksperymentalne, które są odpowiednie dla Twoich próbek na konkretnym przyrządzie do spektrometrii mas. Warunki/parametry wymienione w sekcji 5.2. zostały wykorzystane i zoptymalizowane w naszym laboratorium.
3. Identyfikacja/ocena ilościowa białek
   1. Po analizie spektrometrii mas przekonwertuj surowe pliki widm na kompatybilne pliki mzXML za pomocą oprogramowania MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
   2. Prześlij przekonwertowane pliki do wyszukiwarki SEQUEST z kryteriami wyszukiwania, np. baza danych myszy UniProtKB/Swiss-Prot (najbardziej aktualna sprawdzona kanonicznie); trawienie półenzymatyczne przy użyciu trypsyny (po KR/-); z maksymalnie 2 pominiętymi cięciami; zakres masowy prekursora: 400 do 4 500 amu; modyfikacja statyczna: karbamidometyl (C) 57,021465 amu; tolerancja masy peptydu: 50 ppm; typ masy fragmentu: monoisotopic.
      UWAGA: Można korzystać z innych wyszukiwarek baz danych białek i potoków danych. W przypadku korzystania z bazy danych np. szczurów, która jest mniej kompletna niż bazy danych dla myszy i ludzi, może być konieczne przeszukanie baz danych myszy (i/lub ludzi) w celu zwiększenia pokrycia proteomem. W takim przypadku konieczne będzie usunięcie nadmiarowości w nazwach białek.
   3. Przeprowadź analizę po wyszukiwaniu. Ustaw filtry wyświetlania danych. Na przykład ustaw minimalne prawdopodobieństwo białka (próg białka) na 95% lub 99%, tj. zostaną wyświetlone tylko te białka, dla których analiza statystyczna implikuje 95% lub 99% prawdopodobieństwo obecności w próbce. Ustaw filtr dla progu peptydowego (np. 95%), tj. minimalnego prawdopodobieństwa, które zostanie użyte do określenia, czy widmo identyfikuje peptyd. Wybierz minimalną liczbę peptydów, które określą, czy białko jest obecne (zalecane są minimum 2 peptydy do identyfikacji białka).
   4. Oceń zidentyfikowane białka pod kątem jakości/ilości. Upewnij się, że peptydy proteotypowe są używane do oznaczania ilościowego. Jeśli izoforma zostanie zidentyfikowana, upewnij się, że opiera się na obserwacji peptydu tryptycznego składającego się z sekwencji aminokwasów unikalnej dla danej izoformy. Wszelkie "podobne do" lub hipotetyczne białka powinny zostać porównane, aby sprawdzić, czy obserwowane peptydy odpowiadają znanemu białku.

Wyniki

analiza mRNA
Wyniki mRNA można wyrazić jako rozkład określonego mRNA w każdej frakcji ( Rysunek 3A); w celu oceny ilościowej połącz polirybosomalne frakcje translacyjne i porównaj z frakcją nietranslującą (Rysunek 3B), przedstawiając stosunek obfitości mRNA w translacji do frakcji nietranslujących. Dodatkowe informacje uzyskuje się, badając wysokowydajne frakcje polisomów oddzielnie od frakcji polisomu o niskiej wydajności (i oddzielnie...

Dyskusja

Analiza profilu polisomowego pozwala na badanie translacji białek poprzez analizę stanu translacyjnego określonego mRNA lub całego transkryptomu ^6,7. Jest to również bardzo pomocne, gdy trzeba zbadać translację lokalną, taką jak synaptosomy⁸. Tradycyjnie, metoda ta polega na rozdzieleniu mono- i polirybosomów oraz związanych z nimi mRNA na gradiencie sacharozy, który można połączyć z technikami genomicznymi lub proteomicznymi w celu uzyska...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pentobarbital	Vortech Phamaceuticals	9373	do eutanazji
Heparyna	Sagent	103424	preparatycznych Langendorff
	Fine Science Tools	91110-10	służy do zawieszania serca
System Langendorffa	Radnoti + domowej roboty	nie dotyczy	System "czterech serc" składający się z niestandardowego dmuchanego szkła, rurek i kąpieli wodnych
NaCl	Sigma	S7653-5KG	Bufor Krebsa i gradient sacharozy
KCl	Sigma	P5405	Bufor Krebsa i bufor do lizy
KH2PO42	Sigma	P-5504	Bufor Krebsa
MgSO4	Sigma	M7774-500G	Bufor Krebsa
Glukoza	Sigma	G5767	Bufor Krebsa
CaCl2	Sigma	C1016-500G	Bufor Krebsa
Sacharoza w proszku	Sigma	S0389-1KG	Gradient sacharozy
MgCl2	Sigma	208337	Gradient sacharozy i bufor do lizy
Tris-base	Sigma	T1503-1KG	Bufor gradientu sacharozy i bufor do lizy
Ksylen Cyanole	Sigma	X-4126	Gradient sacharozy
Cykloheksymid	Sigma-aldrich	239763	Gradient sacharozy i bufor lizy
RNaseOUT	Life Technologies	C00019	Inhibitor RNAzy do buforu lizy
Igepal CA-360 (NP40)	Sigma	I3021	Bufor do lizy
Inhibitor proteazy Tabletki koktajlowe, bez EDTA	Roche	5056489001
Probówka, cienkościenna, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Ultrawirówka	Beckman	LE-80K	Ultrawirowanie gradientów
Rotor	Beckman	SW41	Ultrawirowanie gradientów
Biologic LP (pompa)	Biorad	731-8300	Frakcjonowanie gradientów
BioFrac	Biorad	741-0002	Frakcjonowanie gradientów
Probówki do mikrowirówek Eppendorf RNA/DNA LoBind, probówka 2 ml	Sigma	Z666513-100EA	Frakcja gradientowa i ekstrakcja RNA
Odczynnik TRIzol	Technologie życia Ekstrakcja	RNA	AM9738
Lucyferazy Kontrola RNA	Ekstrakcja RNA	Promega	L4561
Chloroform	Fisher Scientific	C606-4	RNA ekstrakcja
Glikogen, klasa RNA	Thermo Fisher Scientific	R0551	Ekstrakcja RNA
Izopropanol	Sigma	I9516	Ekstrakcja RNA
Etanol	Sigma	E7023-1L	Ekstrakcja RNA
iScript Zestaw do syntezy cDNA	BioRad	170-8891	Odwrotna transkrypcja
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	175-5122	Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	Kit do całkowitej izolacji RNA
miScript II RT Kit (50)	Qiagen	218161	Kit do odwrotnej transkrypcji miRNA
miScript Sybr Green PCR Kit (200)	Qiagen	218073	Kit do analizy ekspresji miRNA PCR w czasie rzeczywistym
Wirówka 5424R	Eppendorf		Do wirowania probówek o pojemności 1,5 ml lub 2,0 ml w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 21130 x g
Wirówka 5810R	Eppendorf		Do wirowania płytek PCR w czasie rzeczywistym w różnych temperaturach. Maksymalna prędkość - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler	Bio-Rad		Do odwrotnej transkrypcji
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad		Do analizy PCR w czasie rzeczywistym
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610	Do kontroli jakości izolacji RNA
96-dołkowe płytki PCR Hard-Shell, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczyste	Bio-Rad	HSP9641	Do analizy PCR w czasie rzeczywistym
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optyczna	Bio-Rad	MSB1001	Do uszczelniania płytek PCR w czasie rzeczywistym
Badania plus pipeta jednokanałowa, szara; 0,5-10 i mikro; L	Eppendorf	UX-24505-02	Do pipetowania
pipet PIPETMAN Classic, P20	Gilson	F123600G	Do pipetowania
pipet PIPETMAN Classic, P200	Gilson	F144565	Do pipetowania
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipeta 100-1000 µ L	Gilson	17011782	Do pipetowania
glikogenu, klasa RNA	Thermo Fisher Scientific	R0551	Poprawia całkowitą skuteczność izolacji RNA
Probówki Posi-Click 1,7 ml, naturalny kolor	Denville	C2170	Izolacja i przechowywanie RNA; mieszanka odczynników
Termiczne probówki rowerowe -0,2 ml Indywidualne nakrętki, standardowe probówki 0,2 ml z optycznie	Denville	C18098-4 (1000910)	Reakcja odwrotnej transkrypcji
Sharp 10 Precyzyjne końcówki barierowe	Denville	P1096-FR	Do pipetowania
Sharp 20 Precyzyjne końcówki barierowe	Denville	P1121	Do pipetowania
Sharp 200 Precyzyjne końcówki barierowe	Denville	P1122	Do pipetowania
Końcówki LTS 1 mL Filter	Rainin	RT-L1000F	Do pipetowania
miScript Primer Test ( 200)	Qiagen	(zmienia się w zależności od miRNA)	Do analizy PCR w czasie rzeczywistym
Gradient Master ver 5.3 Model 108	BioComp Instruments		Do przygotowania gradientów sacharozy
kwas trichlorooctowy	Sigma Aldrich	T6399
aceton	Sigma Aldrich	650501
Tris chlorowodorek	Amresco	M108
ditiotreitol	Fisher Scientific	BP172
jodoacetamid	Gbiosciences	RC-150
stopień sekwencjonowania zmodyfikowana trypsyna, świnia	Promega	V5111
wodorowęglan amonu	BDH	BDH9206
kwas mrówkowy, Optima LC/MS	Fisher Chemical	A117
metanol, Optima LC/MS	Fisher Chemical	A454
acetonitryl, Optima LC/MS	Fisher Chemical	A996
Probówki białkowe LoBind 0,5 ml	Eppendorf AG	22431064
Probówki białkowe LoBind 1,5 ml	Eppendorf AG	22431081
HLB µ Płytka elucyjna 30 &mikro; m	Oasis	186001828BA
Koncentrator SpeedVac	Thermo Scientific	Savant SPD2010
sonikator	Wirówka Qsonica	Oasis180
	Thermo Scientific	Sorvall Legend micro 21R
pułapkowa PepMap 100 C18	Kolumna	160454
LC PepMap RSLC C18	Spektrometr masowy Thermo Scientific	164536
	Thermo Scientific	Orbitrap Elite spektrometr
Oprogramowanie MSConvert	Zestaw narzędzi ProteoWizard
Sorcerer-SEQUEST	Sage-N Research, Inc.