Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58087

⸱

10 września 2018

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Cancer Science Institute of Singapore, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół różnicowania mysich komórek T pomocniczych (THGM) granulocytów, makrofagów, czynników stymulujących tworzenie kolonii od naiwnych limfocytów T CD4+, w tym izolację naiwnych limfocytów T CD4+, różnicowanie THGM i analizę zróżnicowanych komórek THGM. Metoda ta może być stosowana do badań nad regulacją i funkcją komórek THGM.

Streszczenie

Komórka T (THGM) wytwarzająca czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) jest nowo zidentyfikowanym podzbiorem komórek pomocniczych T, który głównie wydziela GM-CSF bez wytwarzania interferonu (IFN)γ lub interleukiny (IL)-17 i odgrywa istotną rolę w autoimmunologicznym zapaleniu nerwów. Metoda izolacji naiwnych limfocytów T CD4 + z jednokomórkowej zawiesiny splenocytów i wytwarzania komórekT HGM z naiwnych limfocytów T CD4 + byłaby przydatną techniką w badaniu odporności za pośrednictwem limfocytów T i chorób autoimmunologicznych. Tutaj opisujemy metodę, która różnicuje naiwne mysie limfocyty T CD4 + w komórki THGM promowane przez IL-7. Wynik różnicowania oceniono poprzez analizę ekspresji cytokin przy użyciu różnych technik, w tym wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową, ilościową reakcją łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) oraz testami immunoenzymatycznym (ELISA). Korzystając z opisanego tutaj protokołu różnicowaniaGM, około 55% komórek wykazywało ekspresję GM-CSF przy minimalnej ekspresji IFNα lub IL-17. Dominująca ekspresja GM-CSF przez komórki THGM została dodatkowo potwierdzona przez analizę ekspresji GM-CSF, IFNα i IL-17 zarówno na poziomie mRNA, jak i białka. W związku z tym metoda ta może być stosowana do różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 + do komórek TH GM in vitro, co będzie przydatne w badaniu biologii komórek THGM.

Wprowadzenie

Komórki pomocnicze T (TH) CD4+ są niezbędnymi składnikami układu odpornościowego, pełniąc kluczową rolę w obronie gospodarza przed patogenami bakteryjnymi, w nadzorze nad rakiem i w autoimmunizacji1,2,3. Po aktywacji receptora limfocytów T (TCR) naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w limfocyty TH1,T H2, TH 17 lub regulatorowe komórki T (Treg) pod wpływem różnych środowisk cytokin2,4,5. Niedawno zidentyfikowano nowy podzbiór komórek TH, który głównie wytwarza GM-CSF, i nazwano go THGM6. Różnicowanie komórekT HGM jest napędzane przez IL-7 poprzez aktywację przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji 5 (STAT5). Komórki te wyrażają dużą ilość GM-CSF, mając jednocześnie niską ekspresję innych cytokin sygnaturowych limfocytówT H, takich jak IFNγ i IL-176. Stwierdzono, że GM-CSF odgrywa kluczową rolę w rozwoju zapalenia nerwów za pośrednictwem limfocytów T CD4 +7,8. W porównaniu z autoreaktywnymi limfocytami T z ekspresją IFNγ lub IL-17, limfocyty T z ekspresją GM-CSF przeniesione do myszy typu dzikiego (WT) powodowały wcześniejszy początek choroby i większe nasilenie choroby. Ponadto limfocyty T Csf2-/- nie indukowały eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) po adoptywnym przeniesieniu do biorców WT, podczas gdy limfocyty T pozbawione IFNγ lub IL-17A zachowały zdolność do pośredniczenia w EAE7. Co więcej, blokada GM-CSF za pomocą przeciwciał neutralizujących złagodziła nasilenie choroby EAE8. Co więcej, niedobór STAT5 w limfocytach T u myszy skutkował zmniejszonym wytwarzaniem THGM, a co za tym idzie, odpornością myszy na rozwój EAE6. Odkrycia te podkreślają znaczenie limfocytówT H eksprymujących GM-CSF w autoimmunologicznej chorobie neurozapalnej. W związku z tym ustalenie metody różnicowania limfocytówT H wykazujących ekspresję GM-CSF od naiwnych limfocytów T CD4 + byłoby ważne w badaniu patogenezy autoimmunologicznego zapalenia nerwów i odpowiedzi immunologicznych za pośrednictwem limfocytów T. Jednak nie ustalono protokołu, który skutecznie generuje komórkiT HGM z mysich naiwnych CD4 +.

Tutaj prezentujemy metodę, która odróżnia mysie komórki THGM od naiwnych limfocytów T CD4+. Protokół ten opisuje całą procedurę, w tym ekstrakcję śledziony od myszy, przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej, selekcję CD4 dodatnią, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) oraz różnicowanie i analizę komórekTH. Zróżnicowane limfocyty pomocnicze T analizuje się za pomocą barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych w połączeniu z cytometrią przepływową w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie pojedynczej komórki, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym w celu określenia ekspresji cytokin na poziomie mRNA oraz ELISA w celu oceny ekspresji cytokin na poziomie białka. Metoda ta może być stosowana do badań biologii komórek THGM w różnych warunkach, takich jak EAE, gdzie GM-CSF odgrywa ważną rolę w patogenezie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy użyte w tym protokole były na tle genetycznym C57BL/6 i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów na Narodowym Uniwersytecie Singapuru. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Singapuru.

1. Przygotowanie odczynnika i materiału

  1. Przygotować 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
    UWAGA: Utrzymuj bufor na lodzie przez cały czas trwania procedury, aby uzyskać optymalne wyniki.
  2. Przygotuj 50 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej RPMI 1640, 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Do różnicowania komórek THGM Użyj kompletnych pożywek RPMI zawierających 50 μM β-merkaptoetanolu. Dodaj β-merkaptoetanol do dygestoria.
  3. Przygotować 7,5 ml mieszaniny przeciwciał anty-CD3e, rozcieńczając skoncentrowany zapas anty-CD3e do 3 μg/ml w PBS. Pokryć płytki 48-dołkowe, dodając 150 μl mieszaniny przeciwciał do każdej studzienki i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Wysterylizuj nożyczki i kleszcze i przechowuj je w 70% etanolu między sekcjami.

2. Przygotowanie mysich splenocytów

  1. Poddaj mysz eutanazji myszy (w wieku 6-8 tygodni) za pomocą instytucjonalnie zatwierdzonego uduszenia CO2 lub zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj mysz 70% etanolem i zamontuj ją na bloku styropianowym z tyłu. Przenieś mysz do szafy bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać następujące kroki.
  2. Przytrzymaj skórę za pomocą kleszczy i przetnij skórę poniżej klatki piersiowej po lewej stronie na około 4 cm, używając nożyczek. Otwórz worek otrzewnowy, aby odsłonić śledzionę i użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć śledzionę.
  3. Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce o pojemności 50 ml i wstępnie zwilż je 2 ml buforu. Umieść śledziony na sitku do komórek (2-3 śledziony na jedno sitko do komórek) i zmaceruj je za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml.
  4. Przepłucz sitko i probówkę kilka razy 1–2 ml buforu do izolacji komórek, aż wszystkie komórki zostaną wypłukane do probówki. Odrzucić sitko do komórek i odwirowywać komórki przy sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad komórkowy z 5 ml zimnego (4 °C) buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK) (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2–7,4) i delikatnie mieszać przez 2 minuty. Dodać 10 ml kompletnej pożywki RPMI, aby zneutralizować bufor ACK i natychmiast odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant po wirowania.

3. Izolacja limfocytów T CD4+ za pomocą magnetycznych mikrokulek CD4 i kolumny do separacji komórek

  1. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu do izolacji komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą filtra wstępnej separacji (30 μm) do nowej probówki o pojemności 15 ml, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
  2. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć 10x, dodając 90 μl buforu. Pobrać 10 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek i wymieszać ją z 10 μl błękitu trypanowego w celu zliczenia komórek. Policz komórki w hemocytometrze, aby określić wydajność żywotnych komórek.
  3. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 90 μl buforu na 10-7 komórek. Dodaj 10 μl magnetycznych mikrokulek CD4 na 107 komórek. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać optymalne wyniki, delikatnie mieszaj zawiesinę komórkową co 5 minut podczas inkubacji.
  5. Podczas inkubacji komórek umieść kolumnę separacyjną na stojaku magnetycznym. Wstępnie zwilżyć kolumnę 2 ml buforu.
  6. Pod koniec inkubacji komórki/kulki przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu, załadować próbkę do kolumny separacji komórek i pozwolić jej przepłynąć. Użyj probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby zebrać frakcję komórek CD4. Dodać 1 ml buforu, aby umyć zbiornik przed wyschnięciem. Powtórz krok prania 2x.
  8. Wyjmij kolumnę do separacji komórek ze stojaka magnetycznego i umieść ją na nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml buforu do izolacji komórek do kolumny do separacji komórek i mocno przyłożyć tłok, aby wypchnąć komórki z kolumny.
  9. Odwirować frakcję o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania komórek CD4+. Odrzucić supernatant.

4. Oczyszczanie naiwnych limfocytów T CD4+ (CD4+CD25-CD44loCD62Lhi) przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i różnicowanie THGM

  1. Otrzymany osad komórek CD4+ zawiesić ponownie w 500 μl buforu. Wymieszaj komórki z mieszaniną przeciwciał sprzężonych z fluorescencją zawierającą CD4-PerCp (2,8 μg/ml), CD44-APC (2,4 μg/ml), CD25-PE (2 μg/ml) i CD62L-FITC (10 μg/ml) (Tabela 1). Inkubuj komórki na lodzie przez 20–30 minut, chroniąc je przed światłem.
    UWAGA: Stężenia przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium. Podana liczba przeciwciał dotyczy komórek od 1 do 2 myszy.
  2. Po inkubacji przemyć komórki 5 ml buforu i odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu. Ponownie przefiltruj komórki za pomocą nylonowej siatki.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki FACS w celu sortowania komórek. Wstępnie pokryj probówki z kolekcją FACS 500 μl buforu.
  5. Uzyskaj populacjęhi CD4 + CD25-CD44loCD62L (naiwnych limfocytów T CD4 +) przez sortowanie FACS. Najpierw należy wziąć bramkę na CD4 + CD25-, a następnie wybrać komórkihi CD44loCD62L z tej populacji.
  6. Zbierz naiwne frakcje limfocytów T CD4 + do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  7. Ponownie zawiesić naiwne limfocyty T CD4 + w stężeniu 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI zawierającej 50 μM β-merkaptoetanolu.
  8. Odessać przeciwciała anty-CD3e używane do wstępnego powlekania w płytce 48-dołkowej. Zasiaj 0,25 miliona (250 μl) komórek w każdym dołku z IL-7 (2 ng / ml), anty-CD28 (1 μg / ml) i anty-IFNγ (10 μg / ml) (tabela 1).
    UWAGA: Stężenia cytokin i przeciwciał zostały wcześniej zoptymalizowane w laboratorium pod kątem różnicowania komórekT HGM.
  9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 dni. Nie zmieniaj pożywki podczas inkubacji.

5. Analiza mysich komórek G G wygenerowanych in vitro

  1. Za pomocą mikroskopu sprawdź różnicowanie komórek 3 dni po różnicowaniu. Zebrać komórki i odwirować je przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Umyć komórki 2x za pomocą kompletnej pożywki RPMI.
    UWAGA: Zróżnicowane komórki są większe niż naiwne limfocyty T CD4 +.
  2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj ją z 10 μl błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Podziel zróżnicowane komórki na trzy mikstury w celu ponownej stymulacji i analizy.
    UWAGA: Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych i testy ELISA wymagają ≥0,5 miliona komórek, a analiza qPCR wymaga ≥ 1 miliona komórek.
  3. W celu barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych należy ponownie stymulować komórki 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA) (100 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) w obecności inhibitora transportu białek (1 μl/ml) przez 4–6 godzin.
    1. Zbierz komórki i wybarwić je przeciwciałem anty-CD4 (sprzężonym z PerCP, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; lub sprzężonym z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut.
    2. Utrwalić komórki za pomocą 200 μl buforu utrwalającego przez 20–60 minut. Po utrwaleniu przemyć komórki 2x 1 ml buforu do permeabilizacji.
    3. Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe przeciwciałami przeciwko GM-CSF (sprzężony z PE, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-17A (sprzężony z FITC, 0,5 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; APC-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100), IL-4 (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) i IFNγ (sprzężony APC, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100; PE-sprzężony, 0,2 mg/ml, rozcieńczenie 1:100) przez 30 minut w ciemności.
  4. W celu analizy qPCR ekspresji genu cytokin przez zróżnicowane komórki, aktywuj komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) (wstępnie powlekając płytkę, jak opisano w kroku 1.3). Po 3 godzinach od stymulacji zbierz komórki, aby wyizolować całkowite RNA za pomocą odczynnika do ekstrakcji fenolowego RNA w celu przygotowania cDNA do qPCR. Startery i program używane do qPCR są wymienione odpowiednio w tabelach 2 i 3.
  5. W celu analizy wydzielania białka cytokiny przez zróżnicowane komórki, należy ponownie stymulować komórki za pomocą związanego z płytką anty-CD3e (3 μg/ml) przez 24 godziny (wstępne powlekanie płytki zgodnie z opisem w kroku 1.3). Pobrać supernatant hodowli komórkowej dla IL-17 i GM-CSF ELISA, aby określić ich stężenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Naiwne limfocyty T CD4+ wyizolowane z dwóch 8-tygodniowych samców myszy C57BL/6 podzielono na trzy części. Jedną część komórek zróżnicowano do komórek THGM zgodnie z opisanym protokołem. Inną część hodowano w warunkach różnicowania do THGM w obecności przeciwciała anty-IL-4 (10 µg/mL), aby zbadać wpływ blokady IL-4 na różnicowanie THGM. Ostatnią część hodowano w warunkach różnicowania do TH17 (3 µg/mL anty-CD3e, 1 µg/mL anty-CD28, 10 ng/mL TGFβ,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy protokół różnicowania in vitro THGM z naiwnych komórek CD4 + myszy, a następnie analizę zróżnicowanych komórek w celu walidacji metody. Warto zauważyć, że zarówno śledziona, jak i węzły chłonne mogą być wykorzystywane do naiwnego oczyszczania limfocytów T CD4 + i różnicowania THGM. Ekspresja cytokin określona przez wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin w połączeniu z cytometrią przepływową wykazała, że około 55% komórek zostało nakłonionych do stania się komórkami wyrażającym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z National University Health System of Singapore (T1-2014 Oct-12 i T1-2015 Sep-10).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640BiowestL0500-500
FBS Inaktywowany termicznieKoziorożecFBS-HI-12A
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
10x PBS1. bazaBUF-2040-10Rozcieńczony do 1x PBS w sterylnej wodzie
EDTA1. bazaBUF-1053-100ml-pH8.0
10x buforACKBiolegend420301rozcieńczony w sterylnej wodzie
Sitko do komórekSPL Nauki Przyrodnicze93070
Mikrogranulki CD4Miltenyi Biotec130-049-201
2-merkaptoetanolSigmaM7522
Kolumna LSMiltenyi Biotec130-042-401
stojak magnetycznyMiltenyi Biotec130-042-303
Strzykawka 1 mlTerumoSS+01T
EppendorfEppendorf 5810R
Sortownik komórek Sony SY3200komórek Sony Sony SY3200
Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml Stożkowa probówkaGreiner Bio-One210261
15 ml
FACSCorning352054
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejGreiner Bio-One662160
anty-mysi CD4 PerCP-eFluor 710eBioscience46-0041-82
PE sprzężona anty-mysia CD25 (IL-2Ra, p55)eBioscience12-0251-82
anty-człowiek/mysz CD44 APCeBioscience17-0441-82
anty-mysz CD62L FITCeBioscience11-0621-85
Ulepszona przez Neubauera komora liczącaMarienfeld640010
Hyclon Trypan Blue SolutionGE healthcare Nauki przyrodniczeSV30084.01
mikroskop NikonNikon Elipse TS100
Oczyszczony  anty-mysz CD3e  przeciwciałoBiolegend100314
Oczyszczony chomik anty-mysz CD28BD Biosciences553295
Oczyszczony szczur  anty-mysie IFNγ  eBioscience16-7312-85
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie IL-4Biolegend504102
Rekombinowane mysie białko IL-7R& System D407-ML
rekombinowany ludzki TGF-betaR& System D240-B-010
PMAMerck Millipore19-144
JonomycynaSigmaI0634
Inhibitor transportu białek GolgiPlugBD Biosciences51-2301KZ
Utrwalanie wewnątrzkomórkowe i Zestaw permeabilizacjieBioscience88-8824-00
anty-mysi GM-CSF PEeBioscience12-7331-82
FITC anty-mysie IL-17ABiolegend506908
APC anty-mysie IFN-gammaBiolegend505810
GO Taq qPCR master mixMysz PromegaA6002
GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!invitrogen88-7334-88
Mysz IL-17A Uncouted ELISAinvitrogen88-7371-22
Wirówka Sortownik wirówkowa Probówka Greiner Bio-One 188271

Bibliografia

  1. Zhu, J., Paul, W. E. CD4 T cells: fates, functions, and faults. Blood. 112, 1557-1569 (2008).
  2. Kara, E. E., et al. Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity. PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).
  3. Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells. Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).
  4. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).
  5. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).
  6. Sheng, W., et al. STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation. Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).
  7. Codarri, L., et al. RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation. Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).
  8. El-Behi, M., et al. The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF. Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).
  9. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126, 1121-1133 (2006).
  10. Zhang, J., et al. A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF. Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).
  11. Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage. Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki T pomocnicze GMnaiwne limfocyty T CD4r nicowanie indukowane GM CSFwewn trzkom rkowe barwienie cytokincytometria przep ywowailo ciowy PCR w czasie rzeczywistymtest immunoenzymatyczny ELISAbufor do izolacji kom rekseparacja przy u yciu kulek magnetycznychsortowanie kom rek aktywowane fluorescencj FACS
In vitro Różnicowanie mysich komórek T Helper (THGM) wytwarzających czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.