Artykuł metodologiczny

Charakterystyka pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie

DOI:

10.3791/58088

⸱

7 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, St. Jude Children's Research Hospital, 2Department of Chemical Biology and Therapeutics, St. Jude Children's Research Hospital, 3Department of Immunology, St. Jude Children's Research Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metody charakterystyki pęknięcia błony plazmatycznej za pośrednictwem MLKL w nekroptozie, w tym konwencjonalne i konfokalne obrazowanie za pomocą mikroskopii żywych komórek, skaningową mikroskopię elektronową i wiązanie lipidów oparte na NMR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nekroptoza to zaprogramowany szlak śmierci komórki wywołany aktywacją kinazy białkowej 3 oddziałującej z receptorem (RIPK3), która fosforyluje i aktywuje pseudokinazę o mieszanej nazwie podobnej do kinazy, MLKL, w celu rozerwania lub przeniknięcia błony plazmatycznej. Nekroptoza jest szlakiem zapalnym związanym z wieloma patologiami, w tym autoimmunizacją, chorobami zakaźnymi i sercowo-naczyniowymi, udarem, neurodegeneracją i rakiem. W tym miejscu opisujemy protokoły, które można wykorzystać do scharakteryzowania MLKL jako wykonawcy pęknięcia błony plazmatycznej w nekroptozie. Wizualizujemy proces nekroptozy w komórkach za pomocą obrazowania żywych komórek za pomocą konwencjonalnej i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz w komórkach utrwalonych za pomocą mikroskopii elektronowej, które razem ujawniły redystrybucję MLKL z cytozolu do błony plazmatycznej przed indukcją dużych w błonie plazmatycznej. Przedstawiamy analizę magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) in vitro z wykorzystaniem lipidów w celu identyfikacji przypuszczalnych modulatorów nekroptozy za pośrednictwem MLKL. Na podstawie tej metody zidentyfikowaliśmy ilościowe preferencje wiązania lipidów i fosforany fosfatydylo-inozytolu () jako krytyczne spoiwa MLKL, które są wymagane do celowania w błonę plazmatyczną i przepuszczalności w nekroptozie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja genetycznych składników nekroptozy ułatwiła wykorzystanie modeli zwierzęcych do testowania wpływu nekroptozy na fizjologię i choroby1,2,3,4,5. Nokaut RIPK3 lub MLKL u myszy miał minimalny wpływ na rozwój i homeostazę dorosłych, co sugeruje, że nekroptoza nie jest niezbędna do życia3,6. Co więcej, niektóre gatunki nie zawierają ani genów RIPK3, ani MLKL, co potwierdza nieistotną rolę nekroptozy u zwierząt7,8. Z drugiej strony, trudne modele zwierzęce z różnymi patologiami wywołanymi w laboratorium ujawniły ważną rolę nekroptozy w stanach zapalnych, odporności wrodzonej i infekcjach wirusowych9,10,11,12.

Nekroptoza może być aktywowana na kilka sposobów poprzez sygnalizację za pomocą różnych czujników odporności wrodzonej, z których wszystkie skutkują aktywacją RIPK31,13,14. Aktywny RIPK3 z kolei fosforyluje i aktywuje MLKL3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Najbardziej zbadany i być może najbardziej złożony sposób prowadzący do aktywacji RIPK3 obejmuje ligację receptora śmierci, która rozdziela się w zależności od dalszego składu kompleksów sygnałowych w celu wywołania apoptozy lub nekroptozy1. Nekroptoza następuje, gdy sygnalizacja przez RIPK1 jest faworyzowana i powoduje zaangażowanie RIPK319,20. Wynik ten jest łatwo korzystny po farmakologicznym zahamowaniu lub genetycznej delecji kaspazy 8, przypuszczalnego endogennego inhibitora nekroptozy, który utrzymuje nekroptozę na dystans. RIPK1 wiąże się z RIPK3 i aktywuje go. Innym sposobem aktywacji nekroptozy jest sygnalizacja TLR3/TLR4 receptorów Toll-podobnych, która angażuje i aktywuje RIPK3 poprzez infekcję interferonu indukującą β z adapterem (TRIF) zawierającą domenę TIR (TRIF)21. Jeszcze innym sposobem na śmierć w wyniku nekroptozy jest aktywacja czujnika DNA DAI, który bezpośrednio angażuje i aktywuje RIPK322.

MLKL to białko cytozolowe składające się z N-końcowej domeny wiązki helisy (NB) i C-końcowej domeny pseudokinazy (psKD) połączonych regionem nawiasu regulacyjnego3. W normalnych komórkach MLKL znajduje się w cytozolu, gdzie uważa się, że znajduje się w nieaktywnym kompleksie z RIPK314. Aktywacja nekroptozy wyzwala fosforylację MLKL RIPK3 w pętli aktywacji psKD i potencjalnie dodatkowych miejscach w klasie NB i brace3,15,23. Fosforylacja indukuje zmianę konformacyjną w MLKL, która powoduje dysocjację od RIPK314. Słabo poznane zmiany konformacyjne zwalniają klamrę z klasy psKD24. Klamra, która zawiera 2 helisy, pośredniczy w oligomeryzacji MLKL w przypuszczalnym trimerze przez C-końcowy helix25. N-końcowa helisa ortezy hamuje domenę NB, która jest niezbędna do przepuszczalności błony24,26. W izolacji, domena NB jest wystarczająca do wywołania przepuszczalności błony plazmatycznej i nekroptozy16,24,27. Aktywność pronekroptotyczną NB odtworzono w mysich fibroblastach embrionalnych z niedoborem MLKL (mlkl-/- MEF). NB jest domeną wiążącą lipidy, która preferencyjnie angażuje difosforan fosfolipidu fosfolipidowego fosfatydyloinozytolu (2). Zaproponowaliśmy krokowy mechanizm aktywacji MLKL, w którym oligomeryzacja klamry ułatwia rekrutację MLKL do błony plazmatycznej poprzez słabe oddziaływania NB z grupą głowy polarnej224. Na membranie NB jest poddawany regulowanej ekspozycji dodatkowego miejsca wiązania o wysokim powinowactwie do2, które jest maskowane przez ortezę w nieaktywnym MLKL. Ogólnie rzecz biorąc, wielokrotne interakcje NB z2 destabilizują błonę plazmatyczną, prowadząc do jej pęknięcia, chociaż mechanizm molekularny tych zdarzeń nie został wyjaśniony.

Tutaj ilustrujemy konkretne metody używane do scharakteryzowania funkcji MLKL jako wykonawcy nekroptozy24. W szczególności skupiamy się na najbardziej minimalnej domenie MLKL, NB i ortezie (NBB), która jest regulowana przez hamowanie aparatu ortodontycznego i może być aktywowana przez wymuszoną dimeryzację w celu wywołania pęknięcia błony plazmatycznej i nekroptozy. Opisujemy nasz indukowalny system ekspresji w połączeniu z wymuszoną dimeryzacją za pośrednictwem FKBP indukowaną lekiem do obrazowania żywych komórek oraz mikroskopią elektronową komórek poddawanych nekroptozie. Dodatkowo ilustrujemy naszą analizę NMR in vitro interakcji NBB z fosfatydyloinozytolami ().

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie i generowanie linii komórkowych

  1. PCR amplifikuje region NBB, odpowiadający resztom aminokwasowym 1-140 (NBB140), z ludzkiego cDNA MLKL w celu klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych w ramce z domeną oligomeryzacji 2x białko wiążące FK506 (2xFKBP lub 2xFV) i białko fluorescencyjne Wenus do indukowanego doksycykliną (Dox) wektora retrowirusowego pRetroX-TRE3G w celu uzyskania NBB 140-2xFV-Venus (Tabela 1, rysunki 1A-B).
  2. Unieśmiertelnić pierwotne mlkl-/- lub ripk3-/- mlkl-/- mysie fibroblasty embrionalne (MEF) uzyskane od odpowiednich myszy dostępnych w zielonym laboratorium przez przejściową transfekcję plazmidem eksprymującym duży antygen SV40. Wybierz unieśmiertelnione komórki w ciągu ~ 1-2 tygodni i utrzymuj w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U / ml penicyliny i streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu i nieistotnych aminokwasów w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w standardowych inkubatorach do hodowli tkankowych.
  3. Transdukuj unieśmiertelnione SV40 mlkl-/- MEF z retrowirusem zawierającym odwrócony transaktywator kontrolowany przez tetracyklinę (rtTA) wyrażany z plazmidu zawierającego gen oporności na blastycydynę (nasz zmodyfikowany plazmid) i traktuj przez 1 tydzień blastycydyną 5 μg / ml w celu wyselekcjonowania komórek o stabilnej ekspresji rtTA28.
  4. Transdukować MEF wyrażające rtTA za pomocą indukowanego przez Dox wektora retrowirusowego zawierającego chimeryczny MLKL (pRetroX-NBB 140-2xFV-Venus-puro) i wybrać przy użyciu 4 μg/ml puromycyny przez tydzień, 2 dni po transdukcji.

2. Obrazowanie nekroptozy za pośrednictwem MLKL za pomocą mikroskopii żywych komórek

  1. Płytka mlkl-/- MEF eksprymująca NBB 140-2xFV-Venus o gęstości 50 000 komórek na dołek (1 ml / dołek) w 24-dołkowych płytkach i inkubować przez noc (Figura 2 A). Do automatycznego zliczania komórek należy stosować barwienie żywych komórek (patrz Tabela materiałów).
  2. Traktuj komórki przez 12 godzin Dox (0,5 μg/ml), aby indukować ekspresję NBB 140-2xFV-Venus.
  3. Wywołać nekroptozę za pomocą dimeryzatora FKBP 25 nM (Dim) oprócz nieprzepuszczalnego dla błony zielonego barwnika fluorescencyjnego 25 nM (patrz tabela materiałów) w standardowym DMEM (patrz 1.2). Komórki poddawane nekroptozie gromadzą barwnik, ponieważ ich integralność błony plazmatycznej jest naruszona przez pęknięcie, w którym pośredniczy NBB140. Wykonaj testy w trzech lub czterech powtórzeniach.
  4. Aby monitorować nekroptozę za pomocą jedno- lub dwukolorowych systemów obrazowania (patrz Tabela materiałów), należy umieścić naczynia w odpowiednim urządzeniu do obrazowania umieszczonym w inkubatorze do hodowli tkanek ssaków.
  5. Otwórz oprogramowanie (patrz Spis materiałów) i wybierz zakładkę Zaplanuj nadchodzące skany pod listą zadań.
    UWAGA: Ten protokół służy do obrazowania przy użyciu systemów jednokolorowych, ale podobne oprogramowanie jest dostępne dla systemów dwukolorowych.
  6. Wybierz "Tace, Naczynie, Typy skanowania" i "Wzorzec skanowania" w zakładce "Układ fizyczny" oraz "Szybka fluorescencja" w zakładce Właściwości.
  7. Dodaj "Czas skanowania", klikając okno "Oś czasu" oraz całkowitą liczbę punktów czasowych i częstotliwość akwizycji (zwykle 1 akwizycja co 0,5 godziny do 1 godziny przez 6 godzin do 12 godzin lub co 5 minut w przypadku nekroptozy szybkiej kinetycznej) i rozpocznij akwizycję obrazu, wybierając "Zastosuj" (czerwony przycisk).
  8. Określ ilościowo nekroptozę za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (patrz Spis materiałów), wybierając z "Okienka zadań" opcję "Zliczanie obiektów nowej analizy ze stałym progiem segmentacji powyżej poziomu tła", którą można określić, najeżdżając kursorem myszy na obszary tła na kilku obrazach użytych w analizie.
  9. Przyjrzyj się obiektom fluorescencyjnym, wybierając opcję Podgląd przy użyciu bieżącego obrazu i w razie potrzeby doprecyzuj poziomy progowe.
  10. Zintegruj zliczenia zielonej fluorescencji, otwierając zakładkę "Uruchom nową analizę", wybierz "Zakres czasu", wybierz studnie do analizy, wprowadź "Nazwa zadania analizy" i naciśnij "OK".
  11. Dostęp do przeanalizowanych danych z zakładki "Zadania analizy" można uzyskać, klikając dwukrotnie odpowiednią nazwę zadania i eksportując je z okna Wykres/Eksport w celu dodatkowej analizy w zewnętrznym oprogramowaniu do tworzenia wykresów (patrz Tabela materiałów).
  12. Określ ilościowo dane jako liczbę dodatnich wyników zielonej fluorescencji (+ve)/mm2 lub znormalizuj zliczenia przez konfluencję i wyraź dane jako zieloną fluorescencję + ve zliczenia/konfluencję.
  13. Opcjonalnie, w punkcie końcowym doświadczenia, wybarwić komórki 100 nM zielonego barwnika fluorescencyjnego przenikającego błonę (patrz tabela materiałów). Znormalizuj dane do % komórek nekroptotycznych jako stosunek zielonej fluorescencji do zielonej fluorescencji w punkcie końcowym.

3. Obrazowanie w mikroskopii konfokalnej żywych komórek rekrutacji i przepuszczalności błony plazmatycznej za pomocą MLKL

  1. Płytka mlkl-/- MEF eksprymująca NBB 140-2xFV-Venus o gęstości 20 000 komórek na dołek (0,5 ml / dołek) w 4-dołkowej komorze mikroskopowej ze szklanym dnem wstępnie potraktowana fibronektyną 50 μg / ml w PBS w temperaturze 37 °C przez 30 minut i inkubować przez ~ 12 godzin (Rysunek 2 B).
  2. Traktuj komórki Dox (0,5 μg / ml) przez ~ 12 godzin, aby indukować ekspresję NBB 140-2xFV-Venus.
  3. Indukować nekroptozę poprzez inkubację ze świeżą pożywką (1 ml / studzienkę) zawierającą 25 nM Dim w celu wywołania aktywacji i translokacji NBB 140-2xFV-Venus do błony plazmatycznej.
  4. Umieść komorę na laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym z obracającym się dyskiem, zbudowanym na odwróconym statywie wyposażonym w kontrolę warunków środowiskowych i obiektyw 63 1.4 NA i rozpocznij akwizycję obrazowania za pomocą wybranego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
  5. Zainicjuj oprogramowanie, wybierz ikonę "Focus" i konfigurację filtra YFP (długość fali wzbudzenia 515 nm).
  6. Zlokalizuj pole view i płaszczyznę ogniskową, a następnie włącz system utrzymywania ostrości za pomocą zakładki "Definite Focus".
  7. Aby rozpocząć akwizycję, wybierz zakładkę "Przechwytywanie", a następnie przypisz konfigurację filtra, odpowiedni czas ekspozycji kamery EMCCD i wzmocnienie wzmocnienia oraz parametry akwizycji poklatkowej, w tym interwał i długość akwizycji.
  8. Monitoruj redystrybucję komórkową fluorescencyjnego białka NBB 140-2xFV-Venus podczas nekroptozy, pozyskując obrazy co 10 s przez kamerę EMCCD przy użyciu lasera 515 nm (film 1).
    UWAGA: Fotowybielanie jest problemem w przypadku obrazowania białek fluorescencyjnych. Wenus jest jednym z bardziej odpornych białek fluorescencyjnych na fotowybielanie29. Jeśli stosuje się białka fluorescencyjne, które są bardziej podatne na fotowybielanie, należy obrazować co 30 s lub dłużej, aby umożliwić odzyskanie sygnału między punktami czasowymi obrazowania.
  9. Aby monitorować asocjację błony plazmatycznej NBB 140-2xFV-Venus podczas nekroptozy, należy obrazować co 10 s próbkę przygotowaną w 3.3 za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) przy użyciu mikroskopu wyposażonego w automatyczny suwak TIRF i obiektyw 100X 1.4 NA oraz kamerę EMCCD (film 2). Wykonaj kroki 3.5–3.7, ale dostosuj kąt TIRF na zaczepie ostrości TIRF zgodnie z próbką i grubością dolnego szkła komory mikroskopowej.
    UWAGA: Markery błony plazmatycznej, takie jak LCK-C-RFP, mogą być używane jako kontrole lokalizacji błony plazmatycznej w analizie TIRF.
  10. Wykonaj przetwarzanie obrazu w celu poprawy jakości przez splot z ujemną znormalizowaną drugą pochodną funkcji Gaussa (algorytm Marra).

4. Mikroskopia elektronowa

  1. Płytka mlkl-/- MEF eksprymująca NBB 140-2xFV-Venus o gęstości 5 milionów komórek w pokrytej plazmą naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 150 mm i inkubować przez 12 godzin (Rysunek 3).
  2. Potraktuj komórki doksycykliną (0,5 μg/ml), aby indukować ekspresję NB 1-140-2xFV-Venus przez 12 godzin.
  3. Indukować aktywację i translokację NBB 140-2xFV-Venus do błony plazmatycznej za pomocą 25 nM homodimeryzatora przez 5 minut. Czas ten ustala się na podstawie kinetyki nekroptozy obserwowanej w obrazowaniu żywych komórek.
  4. Usunąć pożywkę i utrwalić komórki za pomocą 10 ml 2,5% aldehydu glutarowego, 2% paraformaldehydu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu o pH 7,4 (bufor kakodylowy) wstępnie podgrzanym w temperaturze 37 °C.
  5. Pobrać próbkę przez zeskrobanie i obracać próbki przez 10 minut przy masie 500 x g. Odrzucić supernatant.
  6. Utrwalać próbkę przez 1,5 godziny w zredukowanym 2% tetratlenku osmu z 1,5% żelazocyjankiem potasu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu. Tetroksynek osmu jest środkiem barwiącym szeroko stosowanym w TEM w celu zapewnienia kontrastu. Użyliśmy TEM jako wstępnej analizy przed SEM komórek poddawanych nekroptozie.
  7. Przepłukać próbkę 5 razy w ultraczystej wodzie przez 5 minut każdy o sile 500 x g, a następnie przepłukać w buforze (patrz 4.6), wodzie i etanolu na automatycznym procesorze. Odrzucić supernatant.
  8. W przypadku SEM zabarwić wcześniej utrwalone próbki 1% octanem uranylu i barwnikiem metali ciężkich asparaginianu ołowiu31.
  9. Odwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii roztworów alkoholu i tlenku propylenu.
  10. Osadź próbkę w hard resin32, aby uzyskać blok żywicy.
  11. Wytnij grube odcinki o grubości 0,5 μm, aby określić prawidłowy obszar analizy.
  12. Pokryj próbki ultracienką warstwą metalu przewodzącego prąd elektryczny (iryd).
  13. Zobrazuj i przeanalizuj próbki (Rysunek 3). W celu oceny ilościowej za pomocą mikroskopu elektronowego skanuje się obraz o małym powiększeniu powierzchni bloku żywicy z naświetlonymi ogniwami przy naświetlonym napięciu 5 keV.
  14. Wizualizacja komórek na poszczególnych obrazach przechwyconych przez SEM lub oprogramowanie do obrazowania może być wykorzystane do połączenia wielu pól widzenia w jeden ciągły obraz30. Około 100 komórek można wykorzystać do oceny frakcji komórek poddawanych nekroptozie w ten sposób, generując montaż w wysokiej rozdzielczości w wybranym oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Ocena morfologii nekrotycznej za pomocą SEM porównuje normalne cechy komórek z progresją fenotypów przednekrotycznych lub nekrotycznych. Cechy te obejmują zmiany błony plazmatycznej, w tym zanik mikrokosmków, spłaszczenie, pęknięcia komórek o wielkości od 10 nm do 1 μm lub utratę struktury organelli na co najmniej 30-40% powierzchni komórek cytozolowych.

5. Wiązanie lipidowe MLKL za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)

  1. Przygotuj 15znakowanych N NBB1-156 przez standardową ekspresję białka i oczyszczanie, jak opisano wcześniej24.
  2. Rozpuścić 500 μg soli amonowej 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoinozytolu amonowej (18:0 PI) i soli amonowej 1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfo-(1'-mio-inozytolu) amonowej (18:1 PI) w 500 μl lodowatego CHCl3 każdy, aby uzyskać końcowe stężenia 1 mg/ml.
  3. Sonikować 1 mg/ml 18:0 i 18:1 PI w kąpieli wodnej sonikacyjnej przez 1 minutę w temperaturze pokojowej lub do 5 minut w mieszaninie lodu i wody.
  4. Podwielokrotność 1 mg/ml 18:0 i 18:1 PI do fiolek z czystego szkła do poszczególnych serii miareczkowania NMR (Rysunek 4). Przenieś lipidy w rozpuszczalnikach organicznych za pomocą szklanych, hermetycznych strzykawek.
    1. Podwielokrotność 132 μl z 1 mg/ml 18:1 PI (masa molowa = 880,137 g/mol) w CHCl3 dla końcowej objętości zawiesiny 1,200 μL przy stężeniu 125 μM.
      UWAGA: W przypadku probówek NMR o średnicy 5 mm należy przygotować objętości seryjnego rozcieńczania >1,000 μl, a końcowe objętości próbki NMR >500 μl. W przypadku probówek NMR o średnicy 3 mm należy przygotować objętości seryjnego rozcieńczania >300 μl, a końcowe objętości próbki NMR >150 μl.
  5. Podwielokrotność 1 mg/ml soli L-α-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforanu amonu w 20:9:1 CHCl3/MeOH/H2O (mózg PI(4,5)P2) do czystych szklanych fiolek.
  6. Umieścić fiolki pod strumieniem gazowym argonu (Ar) lub azotu (N2) o umiarkowanym przepływie w celu odparowania rozpuszczalnika organicznego bez rozpryskiwania się na szklane ścianki fiolki. Pięć do trzydziestu minut jest zwykle wystarczające dla objętości 10–200 μl rozpuszczalnika organicznego.
  7. Ułóż szklaną fiolkę (fiolki) na dnie Büchnera lub termosu za pomocą dużej pęsety, zamknij gumowym korkiem i przymocuj plastikową rurkę podłączoną do przewodu próżniowego. Opróżnij kolbę pod łagodną próżnią przez noc, aby usunąć resztki substancji organicznych.
  8. Nałożyć podwielokrotności filmu lipidowego gazem obojętnym, zamknąć hermetyczną pokrywką i przechowywać w temperaturze -20 °C do użycia w ciągu jednego miesiąca lub -80 °C do dłuższego przechowywania.
  9. Przygotować do próbek NMR bez detergentu (-Det) zawierającego 20 mMNa xHyPO4 pH 6,8, 10% D2O i z detergentem (+Det) zawierającym 20 mM NaxHyPO4 pH 6,8, 10% D2O, 0,34 mM n-dodecylo-β-D-maltopiranozydu (DDM).
  10. Dodać bufor +Det do szklanej fiolki z filmem lipidowym, aby osiągnąć pożądane stężenie i sonikować w łaźni wodnej przez maksymalnie 30 minut, naprzemiennie sonikować przez 10 minut, a następnie przeprowadzić oględziny.
    UWAGA: Sonikacja może ogrzać próbkę. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej na 15 minut przed rozpuszczeniem końcowej próbki białka.
  11. Wykonać seryjne rozcieńczanie miceli lipidowo-detergentowych w buforze +Det za pomocą sonikacji mieszanin 1:1 dla żądanej serii stężeń. Zaczynając od stężenia lipidów 125 μM, trzy powtórzenia dadzą 62,5 μM, 31,3 μM i 15,6 μM lipidów w 0,34 mM DDM.
  12. Przygotować kontrolne i referencyjne próbki NMR białka i dodatków odpowiednio w -Det i +Det. Dodać białko i dodatki do każdego rozcieńczenia lipidów w +Det buffer.
    UWAGA: W przypadku 15N NBB156 białko dodaje się do końcowego stężenia 40 μM i uzupełnia 2 mM deuterowanym ditiotreitolem w celu utrzymania redukcji reszt Cys.
  13. Przenieść odpowiednią objętość próbek do probówek NMR o średnicy 5 mm lub 3 mm (zob. uwaga w kroku 5.4).
  14. Ręcznie załaduj próbki do urządzenia NMR lub ułóż je na platformie automatyzacji, takiej jak ładowarka SampleCase.
  15. Pozyskiwanie złożonych widm NMR przy użyciu standardowych programów impulsowych dla widm protonów 1H jako kontroli jakości, a następnie widm korelacji 2D 1 H-15N jako spektroskopii zoptymalizowanej pod kątem relaksacji poprzecznej (TROSY) lub heterojądrowej wielokrotnej koherencji kwantowej (SOFAST-HMQC)33.
    UWAGA: Użycie probówek NMR 3 mm wymaga wykonania 64 skanów dla 1H-15 N TROSY (~3 h) lub 1 H-15N SOFAST-HMQC (~90 min). Numery skanów są zmniejszone o połowę w przypadku probówek NMR 5 mm.
  16. Przetworzone widma 2D NMR mogą być dodawane do repozytorium CARA34 w celu analizy lub innego oprogramowania wybranego przez użytkownika.
  17. Analizuj oprogramowanie, dodając adnotacje do rezonansów 2D NMR dla trzech dobrze rozproszonych i rozdzielczych pików dla każdego stanu białka. Zapisz amplitudy pików dla każdego z sześciu pików dla każdego warunku buforowego zawierającego NBB156 (Rysunek 5A).
    1. Użyj CARA, aby przygotować listę integracji wsadowej (kliknij w menu głównym, nagłówek "Spectrum | Ustaw listę wsadów"...) wszystkich zebranych widm i przeanalizuj je za pomocą jednego pliku przypisania pików (kliknij nagłówek menu głównego "Piki | Importuj listę szczytów" ...i wybierz zdefiniowany przez użytkownika plik .peaks z 6 całkowitymi pikami, po 3 dla każdego stanu białka, zdefiniowanymi w środku).
    2. Dostosuj ustawienia ("Integrator | Tune Peak Model" ...) o szerokości X 0,06 ppm i szerokości Y 0,30 ppm (Kliknij nagłówek menu głównego "Integrator | Tune Peak Model" ...) przed nagraniem końcowego wyjścia w dwóch opcjach menu (1. Kliknij nagłówek Menu główne "Integrator | Zintegruj listę partii") (2. Kliknij Nagłówek menu głównego "Szczyty | Eksportuj tabelę integracji") (Rysunek 5B).
      UWAGA: Rezonanse amidów szkieletu dla reszt M21, V53 i L105 zostały przypisane do stanu zamkniętego nawiasu klamrowego NBB156. Stan otwartej klamry przypisano rezonansom amidowym szkieletu reszt G130 i A141 oraz rezonansowi łańcucha bocznego protonu epsilon W133 przy użyciu eksperymentów 3D NMR24.
  18. Znormalizuj próbki do bezpośredniego porównania z różnych magnesów lub warunków próbki, uśredniając trzy amplitudy otwartych nawiasów klamrowych próbek odniesienia i obliczając współczynnik normalizacji odnoszący się do tych dwóch odniesień. Oblicz wyskalowane amplitudy dla rezonansów NBB156, używając współczynnika normalizacyjnego i ustawiając ujemne amplitudy na zero (tabela 2).
    Przykłady: 1) Porównanie próbek z różnych magnesów: Magnes A, NBB156+DDM i Magnes B, NBB156+DDM. 2) Porównanie detergentów: 0,34 mM DDM i 1,7 mM DDM.
  19. Obliczyć dla każdego rezonansu wyskalowaną frakcję zamkniętego lub otwartego nawiasu, dzieląc przez zakres od minimalnej do maksymalnej amplitudy wszystkich zebranych widm zawierających odpowiednie odniesienia dla wolnego NBB156 i całkowicie otwartego stężenia NBB156 w detergencie
    20. .
  20. Wykreślić znormalizowane amplitudy NMR w funkcji stężenia lipidów i porównać frakcję NBB156 w różnych warunkach (ryc. 5C).
    UWAGA: Alternatywnie można przeprowadzić analizę frakcji konformacji zamkniętej w stosunku do stężenia lipidów w celu porównania wiązania lipidów z NBB156. Preferujemy tę pierwszą analizę, ponieważ jest szybsza i lepiej informuje o frakcji w pełni zaangażowanej przez lipidy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja regulowanego wykonywania nekroptozy w żywych komórkach była możliwa dzięki indukowalnej ekspresji minimalnie skróconego konstruktu MLKL, NBB 140-2xFV-Venus. Konstrukt ten zachowuje zdolność do indukowania przepuszczalności błony plazmatycznej i jest aktywowany przez indukowaną przez Dim oligomeryzację kasety FKBP (2xFV). Obserwujemy i określamy ilościowo nekroptozę za pomocą obrazowania pod mikroskopem żywych komórek, monitorując kinetycznie (co 5 minut) wychwyt ni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy protokoły dla technik, które połączyliśmy, aby zadomowić MLKL jako domniemanego wykonawcę pęknięcia błony plazmatycznej24. Oprócz rozszyfrowania sieci regulacyjnej, która reguluje nekroptozę, w której pośredniczy MLKL, techniki te mogą być stosowane niezależnie do scharakteryzowania innych odpowiednich systemów biologicznych. Praktycznie rzecz biorąc, techniki te są narzędziami do wykrywania o średniej i niskiej przepływności.

Rutynowo stosowaliśmy obrazowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klonowanie i generowanie linii komórkowych
pRetroX-TRE3GClontech631188
Transaktywator Transaktywator Tet-On plazmidLlambi et al., 2016
Fibroblasty embrionalne myszy (MEF) mlkl-/-Dillonet al., 2014
Chlorowodorek blastycydyny SThermo Fisher ScientificBP2647100 CAS # 3513-03-9
Kwantyfikacja śmierci komórek i mikroskopia żywych komórek
DoxycycyclineClontech631311 CAS # 24390-14-5
Homodimeryzator B / B AP20187Takara635059 CAS # 195514-80-8
SYTOX ZielonyThermo Fisher ScientificS7020
Syto16Thermo Fisher ScientificS7578
NMR
15 N Chlorek amonuIsotope LaboratoriesNLM-467-10 CAS# 12125-02-9
Deuterowany DTTCambridge Isotope LaboratoriesDLM-2622-1
Tlenek deuteruSigma Aldrich617385-1 CAS# 7789-20-0
n-dodecyl-β-D-maltopiranozydAnatraceD310 CAS # 69227-93-6
L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (mózg, świnia) (sól amonowa)Avanti Polar Lipids840046X CAS # 383907-42-4
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoinozytol (sól amonowa) (18:0 PI)Avanti Polar Lipids850143 CAS # 849412-67-5
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inozytol) (sól amonowa) (18:1)Avanti Polar Lipids850149 CAS # 799268-53-4
Specjalistyczny sprzęt
IncuCyte FLR lub ZOOMEssen BioScience, Inc.Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek
Helios NanoLab 660 DualBeam elektronowyThermo Fisher Scientific
Software
IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)Essen BioScience, Inc.http://www.essenbioscience.comAnaliza obrazowa
FEI MAPSThermo Fisher Scientifichttps://www.fei.com/software/maps/EM analiza
TopSpin v3.2Bruker BioSpinhttp://www.bruker.comZbieranie danych NMR
CARA v1.9.1.7http://cara.nmr.ch/ Analiza danych NMR
Slidebook3i (Innowacje w zakresie inteligentnego obrazowania)https://www.intelligent-imaging.com/slidebookMikroskopia konfokalna
Cambridge Mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. Necroptosis in development, inflammation and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).
  2. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).
  3. Murphy, J. M., et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).
  4. Oberst, A., et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).
  5. Zhang, H., et al. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).
  6. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  7. Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. An evolutionary perspective on the necroptotic pathway. Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).
  8. Newton, K., Manning, G. Necroptosis and Inflammation. Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).
  9. Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. Viral modulation of programmed necrosis. Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).
  10. Newton, K., et al. RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury. Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).
  11. Kearney, C. J., Martin, S. J. An Inflammatory Perspective on Necroptosis. Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).
  12. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  13. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).
  14. Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview. Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).
  15. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  16. Wang, H., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3. Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).
  17. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).
  18. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).
  19. Dillon, C. P., et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).
  20. Rickard, J. A., et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).
  21. Kaiser, W. J., et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL. Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).
  22. Upton, J. W., Kaiser, W. J. DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection. Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).
  23. Tanzer, M. C., et al. Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop. Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).
  24. Quarato, G., et al. Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis. Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).
  25. Davies, K. A., et al. The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  26. Su, L., et al. A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL. Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).
  27. Dondelinger, Y., et al. MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates. Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).
  28. Llambi, F., et al. BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation. Cell. 165 (2), 421-433 (2016).
  29. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), 18586(2011).
  30. Perez, A. J., et al. A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).
  31. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  33. Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. 15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins. Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).
  34. Keller, R. The computer aided resonance assignment tutorial. Cantina Verlag. , (2004).
  35. Chen, W., et al. Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling. Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).
  36. Tanzer, M. C., et al. Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL. Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MLKL NecroptosisPlasma Membrane RuptureLive cell ImagingNuclear Magnetic ResonanceLipid Binding AnalysisConfocal MicroscopyElectron MicroscopyNecroptosis InductionMLKL TranslocationPhosphatidyl inositol Phosphates

Powiązane artykuły