Method Article

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

DOI:

10.3791/58089

⸱

November 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty at Rostock University, 3Department of Operative Dentistry and Periodontology, Rostock University Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory, kilka typów komórek macierzystych na różnych etapach rozwoju jest w centrum uwagi w leczeniu chorób zwyrodnieniowych. Jednak niektóre aspekty, takie jak początkowa masowa śmierć komórek i słabe efekty terapeutyczne, upośledzały ich szerokie zastosowanie kliniczne. Inżynieria genetyczna komórek macierzystych przed przeszczepem okazała się obiecującą metodą optymalizacji terapeutycznych efektów działania komórek macierzystych. Wciąż jednak brakuje bezpiecznych i wydajnych systemów dostarczania genów. W związku z tym opracowanie odpowiednich metod może zapewnić podejście do rozwiązania obecnych wyzwań w terapiach opartych na komórkach macierzystych.

Obecny protokół opisuje ekstrakcję i charakterystykę ludzkich komórek macierzystych pęcherzyków zębowych (hDFSC), jak również ich niewirusową modyfikację genetyczną. Pourodzeniowy pęcherzyk zębowy jawi się jako obiecujące i łatwo dostępne źródło pozyskiwania dorosłych multipotencjalnych komórek macierzystych o wysokim potencjale proliferacji. Opisana procedura izolacji przedstawia prostą i niezawodną metodę pobierania hDFSC z zatrzymanych zębów mądrości. Protokół ten zawiera również metody określania charakterystyki komórek macierzystych izolowanych komórek. Na potrzeby inżynierii genetycznej hDFSC przedstawiono zoptymalizowaną strategię transfekcji opartej na kationowych lipidach, która umożliwia wysoce efektywne wprowadzanie mikroRNA bez powodowania efektów cytotoksycznych. MikroRNA są odpowiednimi kandydatami do przejściowej manipulacji komórkami, ponieważ te małe regulatory translacyjne kontrolują los i zachowanie komórek macierzystych bez ryzyka stabilnej integracji genomu. W związku z tym protokół ten stanowi bezpieczną i wydajną procedurę inżynierii hDFSC, która może stać się ważna dla optymalizacji ich skuteczności terapeutycznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki pęcherzyk zębowy to luźna tkanka łączna pochodząca z ektomezenchymalnej tkanki otaczającej rozwijający się ząb1,2. Oprócz funkcji koordynowania osteoklastogenezy i osteogenezy w procesie wyrzynania się zębów, tkanka ta zawiera komórki macierzyste i progenitorowe, szczególnie dla rozwoju przyzębia3,4,5. Dlatego mieszek włosowy jest uważany za alternatywne źródło pozyskiwania ludzkich dorosłych komórek macierzystych6,7.

Kilka badań wykazało, że ludzkie komórki macierzyste pęcherzyków zębowych (hDFSC) są zdolne do różnicowania się w linię przyzębia, w tym osteoblasty, fibroblasty więzadeł i cementoblasty8,9,10. Ponadto wykazano, że komórki te spełniają wszystkie cechy mezenchymalnych komórek zrębu (MSC), w tym zdolność do samoodnawiania, przyleganie do tworzywa sztucznego, ekspresję specyficznych markerów powierzchniowych (np. CD73, CD90, CD105), a także potencjał różnicowania kościogennego, adipogennego i chondrogennego11,12,13. Inne badania wykazały również potencjał różnicowania neuronalnego hDFSCs2,14,15,16,17,18.

Ze względu na ich obiecujące właściwości i łatwy dostęp, hDFSC stały się ostatnio istotne dla inżynierii tkankowej19,20,21. Pierwsze badania koncentrowały się na potencjale DFSC do regeneracji korzeni kostnych, przyzębia i zębów19,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Od czasu poznania zdolności neurogennych hDFSC, zbadano ich zastosowanie jako potencjalnego leczenia chorób neurodegeneracyjnych31,32,33. HDFSC zyskały również na znaczeniu w odniesieniu do regeneracji innych tkanek (np. nabłonka rogówki)34,35. Potencjał terapeutyczny hDFSC opiera się nie tylko na ich bezpośrednim potencjale różnicowania, ale także na ich aktywności parakrynnej. Ostatnio wykazano, że hDFSC wydzielają wiele czynników bioaktywnych, takich jak metaloproteinazy macierzy (MMP), insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) i czynnik wzrostu hepatocytów (HGF), które odgrywają kluczową rolę w angiogenezie, immunomodulacji, przebudowie macierzy pozakomórkowej i procesach naprawczych36.

Jednak szerokie kliniczne tłumaczenie terapii komórkami macierzystymi jest nadal utrudnione przez kilka wyzwań, takich jak masowa początkowa śmierć komórek i niskie korzystne efekty komórek macierzystych37,38. Inżynieria genetyczna stanowi obiecującą strategię radzenia sobie z tymi wyzwaniami, a zatem może znacznie zwiększyć skuteczność terapeutyczną komórek macierzystych38,39,40. Do przejściowej manipulacji komórkami odpowiednie są mikroRNA (miR), ponieważ te małe regulatory translacyjne kontrolują los i zachowanie komórek macierzystych bez ryzyka stabilnej integracji genomu41,42,43. Do tej pory zidentyfikowano kilka korzystnych miR promujących proliferację komórek macierzystych, przeżycie, naprowadzanie, aktywność parakrynną, a także ich różnicowanie w kilka linii44. Na przykład, zmodyfikowane przez miR-133a MSCs wykazały zwiększoną przeżywalność i wszczepienie w serca szczurów z zawałem, co skutkowało poprawą funkcji serca w porównaniu z niezmodyfikowanymi MSCs45. Podobnie, wykazano, że MSCs z nadekspresją miR-146a wydzielają większe ilości VEGF, co z kolei doprowadziło do zwiększonej skuteczności terapeutycznej w tkance niedokrwiennej46.

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół selektywnej ekstrakcji i inżynierii genetycznej hDFSC. W tym celu opisaliśmy zbieranie i trawienie enzymatyczne ludzkich mieszków zębowych, a także późniejszą izolację hDFSC. W celu scharakteryzowania izolowanych komórek dołączono ważne instrukcje dotyczące weryfikacji właściwości MSC zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej13. Ponadto przedstawiamy szczegółowy opis wytwarzania hDFSC modyfikowanych miR, stosując strategię transfekcji opartej na kationowych lipidach oraz ocenę skuteczności transfekcji i cytotoksyczności.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HDFSC są izolowane z mieszków włosowych usuniętych zębów mądrości dostarczonych przez Oddział Chirurgii Plastycznej Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku. Uzyskano świadomą zgodę i pisemną zgodę od wszystkich pacjentów. Badanie to zostało autoryzowane przez lokalną komisję etyczną Uniwersytetu w Rostocku (zezwolenie nr A 2017-0158).

1. Izolacja hDFSC

UWAGA: Aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, zęby mądrości nie powinny być wyrzynane przed ekstrakcją

  1. Przygotowanie wymaganych rozwiązań
    1. Przygotować buforowany fosforanami roztwór soli fizjologicznej (PBS)/penicyliny-streptomycyny-glutaminy (P-S-G): zmieszać 495 ml PBS z 5 ml roztworu PSG. Przechowywać podwielokrotności po 50 ml w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować pożywkę hodowlaną hDFSC: wymieszać 445 ml podłoża podstawowego z 5 ml antybiotyku i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy typu I (30 mg/ml): rozcieńczyć 300 mg kolagenazy typu I w 10 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 1% antybiotykiem. Energicznie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać podwielokrotności 500 μl roztworu podstawowego kolagenazy typu I w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotować roztwór podstawowy Dispazy II (40 mg/ml): rozcieńczyć 40 mg Dispazy II w 10 ml podłoża podstawowego uzupełnionego 1% antybiotykiem. Energicznie wymieszaj roztwór. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm. Przechowywać podwielokrotności 500 μl roztworu podstawowego Dispase II w temperaturze -20 °C.
  2. Zabiegu chirurgicznego
    1. Wstrzyknąć odpowiednią ilość (maksymalnie: 2 ml) środka znieczulającego miejscowo.
    2. Utwórz i podnieś trójstronny płat śluzówkowo-okostnowy. Podnoszenie klapki językowej nie jest wymagane.
    3. Chroń aspekt językowy za pomocą windy okostnej.
    4. Delikatnie zmiel kość policzkową i dystalną za pomocą okrągłego zadzioru z twardego metalu.
    5. Poluzuj tkankę mieszków włosowych za pomocą windy okostnej. Ostrożnie usuń cały ząb (zarodek) i mieszek włosowy, wyciągając koronę (i mieszek) za pomocą kleszczyków tylnych (trzecich trzonowców).
    6. Oczyścić i dokładnie przepłukać gniazdo roztworem NaCl.
    7. Zastąp płat śluzówkowo-okostnowy szwami vicryl (patrz tabela materiałów).
    8. Usunąć mieszek włosowy z jamy ustnej i umieścić go w porcji 50 ml roztworu PBS/P-S-G.
      UWAGA: Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.
  3. Trawienie enzymatyczne mieszka włosowego
    1. Wstępnie ogrzej pożywkę hodowlaną hDFSC i roztwór PBS/P-S-G do temperatury pokojowej (RT).
    2. Rozmrozić po jednej porcji każdego roztworu podstawowego kolagenazy typu I i dyspazy II. Przygotować roztwór wytrawiający składający się z 3 mg/ml kolagenazy typu I i 4 mg/ml dypazy II, dodając po 500 μl każdego roztworu podstawowego kolagenazy typu I i dypazy II do 4 ml podłoża podstawowego zawierającego 1% antybiotyku.
    3. Umieść wyekstrahowany pęcherzyk na sterylnej szalce Petriego i dodaj 10 ml roztworu PBS/P-S-G, aby przemyć wyekstrahowaną tkankę. Powtórz ten krok prania dwa razy.
    4. Wyekstrahowany pęcherzyk należy rozdrobnić na kawałki o wymiarach około 1 mm x 1 mm za pomocą sterylnego skalpela na szalce Petriego zawierającej 10 ml roztworu PBS/P-S-G.
    5. Przenieść tkankę mieloną i roztwór PBS/P-S-G z płytki Petriego do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyć szalkę Petriego 10 ml roztworu PBS/P-S-G i przenieść roztwór do tej samej probówki.
    6. Odwirować stożkową probówkę wirówkową przez 10 minut przy 353 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    7. Dodać 5 ml roztworu trawiącego do granulowanej tkanki. Delikatnie wymieszaj roztwór i tkankę. Mieszaninę inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem.
    8. Odwirować przetrawioną zawiesinę komórek/tkanek o stężeniu 353 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić otrzymany osad w 6 ml pożywki hodowlanej hDFSC.
    9. Zawiesina komórek nasiennych w kolbie hodowlanej o średnicy 25cm2 i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 20% O2,
      UWAGA: Jeśli tkanka nie jest całkowicie strawiona, należy również przenieść pozostałą tkankę do kolby do hodowli komórkowej.
    10. Ostrożnie zmień podłoże 24 godziny po wysianiu komórek. Następnie zmieniaj podłoże co trzy dni, aż do zbiegu.
      UWAGA: HDFSC powinny przylegać do tworzywa sztucznego 24 godziny po wysiewie komórek i można je oddzielić od nieprzylegających komórek i składników krwi poprzez prostą zmianę podłoża.
  4. Pobieranie komórek
    1. Wstępnie ogrzej pożywkę hodowlaną hDFSC, roztwór PBS/P-S-G i roztwór trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do RT.
    2. Odrzucić supernatant z kolby hodowlanej i przemyć zlejące się komórki 5 ml roztworu PBS/P-S-G.
    3. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/EDTA do kolby hodowlanej i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C. Zatrzymać proces trawienia, dodając 3 ml pożywki hodowlanej hDFSC do kolby hodowlanej.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę przez 10 minut przy 353 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej ilości pożywki hodowlanej hDFSC.
    5. Policz komórki: delikatnie wymieszaj 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego. Nanieść 10 μl do komory liczącej i obliczyć ilość komórek hDFSC.

2. Charakterystyka hDFSC

  1. Immunofenotypowanie
    1. Przygotowanie komórek do analizy cytometrii przepływowej
      1. Przygotowanie wymaganych rozwiązań
        1. Przygotować PBS/EDTA (2 mM): zmieszać 996 ml PBS z 4 ml EDTA (0,5 M).
        2. Przygotować bufor do barwienia: zmieszać 995 ml PBS/EDTA (2 mM) z 5 g BSA. Przefiltrować roztwór za pomocą jednostki filtrującej 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
        3. Przygotować roztwór podstawowy paraformaldehydu (PFA) (4%): rozcieńczyć 4 g PFA w 100 ml PBS i podgrzać roztwór do 80 °C. Wymieszać roztwór i dostosować wartość pH do 7,3. Podwielokrotność roztworu PFA w odpowiednich ilościach (1,5 ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
          UWAGA: Ponieważ opary PFA są toksyczne, przygotuj roztwór PFA w wentylowanym dygestorium.
      2. Po pobraniu komórek (1.4) przenieść 14 próbek z 5 x 104 komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Odwirować zawiesiny o stężeniu 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
        UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Przechowuj komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
      3. Ponownie zawiesić komórki w pewnych ilościach buforu barwiącego (4 °C) i dodać odczynnik blokujący FcR (4 °C), jak wskazano w Tabeli 1.
      4. Dodać następujące przeciwciała na wewnętrznej stronie odpowiedniej próbki, jak wskazano w tabeli 1: allofikocyjanina (APC) mysia anty-ludzka CD29; Kontrola izotypu IgG1 κ myszy APC; Białko perydyninowo-chlorofilowe (PerCP)-cyjanina5,5 mysia anty-ludzka CD44; PerCP-Cyjanina5,5 kontrola izotypu IgG2b κ myszy; Mysz V500 anty-ludzka CD45; Mysza kontrola izotypu IgG1 κ V500; Mysza fikoerytryna (PE) anty-ludzka CD73; kontrola izotypu myszy PE IgG1 κ; PerCP-cyjanina5,5 mysz anty-ludzka CD90; PerCP-Cyjanina5,5 kontrola izotypu mysiego IgG1 κ; mysz anty-ludzka CD105: Alexa Fluor (AF)488; mysia kontrola ujemna IgG1: AF488; PE-cyjaninina 7 mysi anty-ludzka CD117; PE-cyjaninina 7 mysia IgG1, kontrola izotypu κ. Po dodaniu przeciwciał do każdej próbki odkręć przeciwciała i delikatnie wymieszaj. Inkubować roztwory przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      5. Dodać 1 ml PBS (4 °C) i odwirować próbki w temperaturze 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      6. Ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS (4 °C) i dodaj 33 μl PFA (4%). Wymieszać roztwory i przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
    2. Pomiar metodą cytometrii przepływowej komórek
      UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Trzymaj komórki na lodzie do czasu pomiaru.
      1. Aby zbadać ekspresję antygenów powierzchniowych, należy przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej.
      2. Zmierz co najmniej 2 x 104 zdarzenia za pomocą cytometru przepływowego. Przeanalizuj tak, jak pokazano w Rysunek 2.
  2. Multipotencjalny potencjał różnicowania hDFSC
    1. Użyj dostępnego na rynku zestawu do identyfikacji funkcjonalnej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, aby potwierdzić potencjał różnicowania adipogennego, osteogennego i chondrogennego hDFSC. Zastosować drugorzędowe przeciwciało anty-kozie AF488 do barwienia białka wiążącego kwasy tłuszczowe 4 (FABP4) i agrekanu, a także przeciwciało drugorzędowe AF488 przeciwko osłom do barwienia osteokalcyny. Do barwienia jąder należy użyć podłoża montażowego z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI).
      UWAGA: Przygotować próbki bez przeciwciał pierwszorzędowych jako kontrole ujemne do analiz mikroskopowych.
    2. Analiza ekspresji białek za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Ustawienia mikroskopii: obiektyw 40x z zanurzeniem w olejku; laser wzbudzający 488 nm (dla AF488) i 405 nm (dla DAPI).

3. Transfekcja hDFSC

  1. Po pobraniu komórek (1.4) wysiać hDFSC na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej na 24 godziny przed transfekcją.
    UWAGA: Początkowa gęstość komórek wynosi około 4 x 104 komórek na studzienkę. Komórki powinny osiągnąć ~80% konfluencji w dniu transfekcji.
    Uwaga: Zasiej jedną dodatkową próbkę komórkową jako kontrolę do analizy cytometrii przepływowej.
  2. Przygotowanie kompleksów transfekcyjnych
    UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami, należy oczyścić przestrzeń roboczą bezpośrednio przed przygotowaniem kompleksów transfekcyjnych za pomocą roztworu do dekontaminacji RNazy. Używaj wyłącznie materiałów i roztworów wolnych od RNaz.
    UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu.
    1. Przygotować roztwór podstawowy miR (50 μM): ponownie zawiesić miR (5 nmol) znakowany Cy3 w 100 μl wody wolnej od nukleaz. Podwielokrotność roztworu podstawowego miR w odpowiednich ilościach (5 μl) i przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    2. Rozcieńczyć 40 pmol miR (0,8 μl 50 μM roztworu podstawowego miR) w 66,7 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszaj roztwór
    3. Rozcieńczyć 0,67 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów kationowych w 66,7 μl zredukowanej pożywki surowicy. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Po inkubacji dodać wstępnie rozcieńczony odczynnik do transfekcji do wstępnie rozcieńczonego miR. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotowane kompleksy transfekcyjne dodawać kroplami bezpośrednio do pożywki hodowlanej na komórkach. Delikatnie wymieszaj, kołysząc 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej w przód iw tył.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 20%O2 przez 24 godziny.

4. Analiza transfekcji

UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu.

  1. Pobieranie komórek po transfekcji
    UWAGA: Zebrać wszystkie roztwory komórkowe jednej próbki w tej samej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
    1. 24 godziny po transfekcji zebrać sklarowany sklarent próbek do odpowiednich probówek wirówkowych.
    2. Umyj komórki 1 ml PBS, przenieś PBS do odpowiedniej probówki wirówkowej i dodaj 500 μl trypsyny/EDTA (RT) do komórek. Inkubować roztwory przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
    3. Zatrzymaj trypsynizację, dodając 1 ml pożywki hodowlanej (RT) do komórek i przenieś roztwór do odpowiedniej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Od tego czasu należy przechowywać komórki i odczynniki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
  2. Przygotowanie komórek do analizy cytometrii przepływowej
    1. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu barwiącego (4 °C) i przenieść roztwór komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 0,5 μl barwnika reagującego z aminami do próbek, aby odróżnić żywe i martwe komórki. Delikatnie wymieszać roztwór i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 1 ml PBS (4 °C) do komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS (4 °C) i dodaj 33 μl PFA (4%). Wymieszać roztwory i przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
  3. Pomiar metodą cytometrii przepływowej komórek
    UWAGA: Wykonaj następujące prace w raczej zacienionym pomieszczeniu. Trzymaj komórki na lodzie do czasu pomiaru.
    1. Przenieść próbki do probówek odpowiednich do pomiarów cytometrii przepływowej.
    2. Zbadaj żywotność komórek i wydajność wychwytu miR za pomocą cytometru przepływowego. Zmierz co najmniej 2 x 104 zdarzenia. Użyj strategii bramkowania przedstawionej w Rysunek 4.
      UWAGA: Użyj nietransfekowanych komórek jako kontroli negatywnej, aby zorganizować bramkowanie dla komórek Cy3-dodatnich i obliczyć śmierć komórki spowodowaną transfekcją.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółową instrukcję izolacji, jak pobrać hDFSC z ludzkiej tkanki mieszków zębowych. Ze względu na łatwy dostęp do mieszków zębowych podczas rutynowych zabiegów chirurgicznych, jest to obiecujące źródło ekstrakcji dorosłych komórek macierzystych.

Izolowane hDFSC wykazały wszystkie cechy opisane w definicji MSCs13. W rzeczywistości komórki przylegały do plastiku w opisanych warunkach h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe komórki macierzyste są obecnie wykorzystywane w leczeniu kilku chorób zwyrodnieniowych. W szczególności komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (BM), w tym hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) i MSC, są przedmiotem intensywnych badań klinicznych47. Jednak pobieranie BM jest zabiegiem inwazyjnym, powodującym ból w miejscu pobrania i może prowadzić do zdarzeń niepożądanych48. Ostatnio tkanka zęba po urodzeniu stała się nowym i łatwo dostępnym źródłem ko...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program FORUN Centrum Medycznego Uniwersytetu w Rostocku (889018) oraz Fundację DAMP (2016-11). Ponadto P.M. i R.D. są wspierane przez BMBF (VIP+ 00240).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mysie przeciwciało anty ludzkie CD105: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA1557A488Clone SN6, monoklonalne
mysie przeciwciało kontroli ujemnej IgG1: Alexa Fluor 488Bio-RadMCA928A488monoklonalne
mysie przeciwciało antyludzkie CD29 APC559883klon MAR4, monoklonalne
APC Mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences555751Klon MOPC-21, monoklonalne
mysie przeciwciało antyludzkie CD73PE BD Biosciences550257klon AD2, monoklonalne
PE mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences555749klon MOPC-21, monoklonalne
mysie przeciwciało anty-ludzkie PE-Cy7 CD117BD Biosciences339217klon 104D2, monoklonalne
mysie przeciwciało PE-Cy7 IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences557872klon MOPC-21, monoklonalne
mysie przeciwciało anty-ludzkie PerCP-Cy5.5BD Biosciences560531klon G44-26, monoklonalne
Mysz PerCP-Cy5.5 IgG2b, κ Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences558304klon 27-35, monoklonalny
PerCP-Cy5.5 Mysz anty-ludzka CD90  PrzeciwciałoBD Biosciences561557klon 5E10, monoklonalny
PerCP-Cy5.5 Mysia IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences55095Klon MOPC-21, monoklonalne
mysie przeciwciało anty-ludzkie V500 CD45BD Biosciences560777Klon HI30, monoklonalny
V500 Mysz IgG1 i kappa; Przeciwciało kontrolujące izotypBD Biosciences560787Clone X40, monoklonalny
odczynnik blokujący FcR, ludzkiMiltenyi Biotec130-059-901
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific15575-0200,5M, pH 8,0
SteritopMerck MilliporeSCGPT05RE0,22 i mikro; m, sterylizowany radiologicznie, polieterosulfon
BSASigma-AldrichA7906
PFAMerck Millipore1040051000
Zestaw do identyfikacji funkcjonalnej ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystychR& D SystemsSC006
Roztwór do dekontaminacji RNazy; RNaseZap RNaza Roztwór do dekontaminacjiThermo Fisher ScientificAM9780
Prekursor miR znakowany Cy3; Cy3 Znakowana barwnikiem kontrola ujemna Pre-miR #1Thermo Fisher ScientificAM171205 nmol
Pre-miR prekursor miRNA kontrola ujemna #1Thermo Fisher ScientificAM171105 nmol
Kationowy odczynnik do transfekcji na bazie lipidów; Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher Scientific11668019
Zredukowana pożywka surowicy; Opti-MEM I Obniżona pożywka surowicyThermo Fisher Scientific31985070
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko koziej IgG (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055poliklonalne
przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21202poliklonalne
podłoże montażowe; Fluoroshield zpodłożem montażowymSigma-AldrichF6057-20ML
konfokalny ELYRA PS.1 LSM 780Cytometr przepływowy Zeiss
BD FACS LSRII BDBiosciences
FACSDiva Oprogramowanie 6.1.2Oprogramowanie ZEN2011 BD Biosciences
Zeiss
(0,05%/ 0,02%)BiochromL2143w PBS, w/o: Ca2+, Mg2+
Barwnik reaktywny aminy; ŻYWY/MARTWY&handel; Zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieniThermo Fisher ScientificL10119
PBS (1x)Thermo Fisher Scientific10010023pH: 7,4; w/o: Ca i Mg
P-S-G (100x)Thermo Fisher Scientific10378016
Podłoże podstawowe; Dulbecco's Modified Eagle Podłoże i Mieszanka Składników Odżywczych F-12Thermo Fisher Scientific11039021
Antybiotyk, ZellShieldBiochromW 13-0050
FBSThermo Fisher Scientific10500064
Kolagenaza typu IThermo Fisher Scientific17100017
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Filtr, filtr strzykawkowy Sterifix 0,2 i mikro; mBraun4099206
50  stożkowa probówka wirówkowa w mlSarstedt62,547,254
15 ml stożkowa probówka wirówkowaSarstedt62,554,502
Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2Sarstedt833,910,002
Kolba do hodowli komórkowych, 25 cm2Sarstedt833,911,002
Podłoże zamrażające, BiofreezeBiochromF 2270
CryotubesThermo Fisher Scientific3772671,8 ml
roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT81540,4 %
Komora liczącaPaul Marienfeld
Znieczulenie miejscowe, Ksylozytyna (chlorowodorek lidokainy) 2% z epinefryną (adrenalina) 0,001%Mibe
roztwór NaClBraun0.9 %
Vicryl nasycone, Vicryl rapideEthicon3 - 0
DAPI do histologii mikroskop BD Roztwór trypsyny/EDTA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
  2. Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
  3. Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
  4. Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
  5. Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D'Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
  6. Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
  7. Park, B. -W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
  8. Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
  9. Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
  10. Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
  11. Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096(2016).
  12. Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015(2017).
  13. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  14. Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
  15. Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
  16. Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
  17. Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin - promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, Suppl 7. 167-175 (2009).
  18. Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
  19. Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
  20. Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), Dayton, Ohio. 627-638 (2015).
  21. Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
  22. Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
  23. Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
  24. Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
  25. Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
  26. Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
  27. Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix - based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
  28. Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig's epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
  29. Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
  30. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114(2015).
  31. Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183(2015).
  32. Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005(2017).
  33. Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326(2017).
  34. Sung, I. -Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
  35. Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
  36. Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300(2017).
  37. Lee, S., Choi, E., Cha, M. -J., Hwang, K. -C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902(2015).
  38. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
  39. Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
  40. Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063(2016).
  41. Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. , Springer International Publishing. (2016).
  42. Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
  43. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
  44. Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
  45. Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
  46. Seo, H. -H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
  47. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
  48. Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406(2009).
  49. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Andrades, J. A. , InTech. (2013).
  50. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  51. Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
  52. Seo, B. -M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
  53. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  54. Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
  55. Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
  56. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761(2016).
  57. Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154(2014).
  58. Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
  59. Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), London, England. 295-312 (2014).
  60. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  61. Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
  62. Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
  63. Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879(2016).
  64. Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113(2017).
  65. Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
  66. Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
  67. Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , Chapter 27, Unit 27.1.1-28 (2010).
  68. Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dental Follicle Stem CellsStem Cell IsolationEnzymatic DigestionMicroRNA TransfectionCationic Lipid TransfectionFlow Cytometry AnalysisStem Cell CharacterizationMesenchymal Stromal CellsCell Culture ProtocolGenetic Modification

Related Articles