Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58106

⸱

23 sierpnia 2018

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Streszczenie

Uważa się, że metabolizm za pośrednictwem karboksyloesterazy odgrywa główną rolę w odporności na insektycydy u różnych owadów. Stwierdzono, że kilka genów karboksyloesterazy jest regulowanych w górę w opornym szczepie muchy domowej, podczas gdy ich rola w nadawaniu odporności na insektycydy pozostaje do zbadania. W tym miejscu opracowaliśmy protokół charakterystyki funkcjonalnej karboksyloesterazy. Przedstawiono trzy przykładowe eksperymenty: (1) ekspresja i izolacja białek karboksyloesterazy za pośrednictwem systemu ekspresji komórek owada Spodoptera frugiperda (Sf9), w którym pośredniczy bakulowirus; (2) komórkowy test cytotoksyczności MTT (bromek 3-[4,5-dimetyktiazol-2-ylo]-2, bromku 5-difenylotetrazoliowego) na bazie komórek w celu zmierzenia tolerancji komórek owadów na różne zabiegi permetryną; oraz (3) badania metaboliczne in vitro w celu zbadania zdolności metabolicznych karboksyloesterazy w kierunku permetryny. Gen karboksyloesterazy MdαE7 został sklonowany z opornego szczepu muchy domowej ALHF i wykorzystany do skonstruowania rekombinowanego bakulowirusa do zakażenia komórkami Sf9. Żywotność komórek w porównaniu z różnymi terapiami permetryną mierzono za pomocą testu MTT. Zwiększona tolerancja komórkowa grupy eksperymentalnej (komórki zakażone rekombinowanym bakulowirusem MdαE7) w porównaniu z grupami kontrolnymi (komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym CAT i komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym GFP) na leczenie permetryną sugerowała możliwości MdαE7 w metabolizowaniu insektycydów, chroniąc w ten sposób komórki przed uszkodzeniami chemicznymi. Poza tym białka karboksyloesterazy uległy ekspresji w komórkach Sf9 owadów i wyizolowano je w celu przeprowadzenia badania metabolicznego in vitro. Nasze wyniki wykazały znaczącą wydajność metaboliczną in vitro MdαE7 w stosunku do permetryny, bezpośrednio wskazując na udział karboksyloesterazy w metabolizowaniu insektycydów, a tym samym nadając odporność na insektycydy u muszek domowych.

Wprowadzenie

Odporność na insektycydy jest obecnie głównym problemem zwalczania much domowych na całym świecie1,2. Wysiłki zmierzające do określenia mechanizmu oporności na insektycydy ułatwiają lepsze zrozumienie tego problemu, a tym samym dostarczają nowych strategii skutecznego zapobiegania lub minimalizowania rozprzestrzeniania się rozwoju oporności3. Karboksyloesterazy, jako jeden z głównych enzymów detoksykacyjnych, przyciągnęły wiele uwagi ze względu na ich rolę w sekwestracji i metabolizowaniu insektycydów u różnych owadów4,5,6. Nasze poprzednie badanie zidentyfikowało wiele karboksyloesterazy u muszek domowych, a ich poziomy ekspresji były nie tylko konstytutywnie regulowane w górę w opornym szczepie ALHF, ale także mogą być indukowane do wyższych poziomów w odpowiedzi na leczenie permetryną7. Jednak charakterystyka funkcjonalna tych genów karboksyloesterazy w metabolizowaniu insektycydów pozostaje do zbadania.

Od pierwszego raportu na początku lat 80. 8, system ekspresji obcych genów za pośrednictwem bakulowirusa jest szeroko stosowany ze względu na wysoką wydajność produkcji białek i możliwości przetwarzania białek eukariotycznych9. Ten system binarny składa się z dwóch zasadniczych elementów: skonstruowanego rekombinowanego bakulowirusa dostarczającego obce geny do komórek gospodarza oraz ekspresji na dużą skalę bakulowirusa przez komórki zakażone rekombinowanym bakulowirusem. W ciągu ostatnich dziesięcioleci system ekspresji komórkowej, w którym pośredniczy bakulowirus, był szeroko stosowany do produkcji tysięcy rekombinowanych białek, począwszy od enzymów cytozolowych, a skończywszy na białkach związanych z błoną w komórkach owadów i ssaków10. Nasze poprzednie badanie z powodzeniem wykazało ekspresję wielu enzymów CYP450 w komórkach Sf9 owadów za pomocą tego systemu11. W tym badaniu skonstruowaliśmy bakulowirusa rekombinowanego karboksyloesterazy do infekowania komórek Sf9 owadów, zbadaliśmy tolerancję komórek na różne terapie permetryną i białka karboksyloesterazy na dużą skalę in vitro do eksploracji funkcjonalnej. Zamiast badać wiele mieszanin izoenzymów karboksyloesterazy z homogenatów owadów, jak przyjęto w poprzednich badaniach12,13, ten system ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, pozwala na specyficzną ekspresję i izolację docelowych białek w celu lepszego scharakteryzowania ich właściwości biochemicznych i strukturalnych.

Test na bazie soli tetrazolowej (MTT) to wysokoprzepustowa metoda kolorymetryczna, opracowana i zoptymalizowana do pomiaru żywotności komórek. Test ten opiera się na mechanizmie, w którym tylko żywe komórki są zdolne do metabolizowania żółtego odczynnika MTT do ciemnofioletowego osadu formazanu, który można analizować kolorymetrycznie po rozpuszczeniu w rozpuszczalnikach organicznych14,15. W ostatnich latach opracowano kilka bardziej dokładnych, ale czasochłonnych metod, takich jak wykluczenie błękitu trypanowego i test miareczkowania tymidyny16,17. Jednak test MTT oparty na komórkach jest nadal uznawany za najszybszą i najłatwiejszą w obsłudze metodę szybkiego wykrywania żywotności komórek. W tym przypadku używamy testu MTT, aby zbadać tolerancję komórek na zabiegi owadobójcze. Zwiększona tolerancja komórek po zakażeniu rekombinowanym bakulowirusem karboksyloesterazy silnie wspiera metaboliczne role karboksyloesterazy wobec insektycydów, co z kolei sugeruje ich udział w oporności na insektycydy.

Dodatkowo, w tym badaniu przeprowadzono również test metaboliczny in vitro. W porównaniu z ogólnymi testami karboksyloesterazy, które wykorzystują powszechne substraty, takie jak octan α-naftylu (α-NA) i octan β-naftylu (β-NA) w celu odzwierciedlenia aktywności hydrolitycznej karboksyloesterazy, badanie metaboliczne in vitro jest uważane za dokładny sposób bezpośredniego pomiaru aktywności karboksyloesterazy w stosunku do insektycydów18. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana u różnych owadów w celu scharakteryzowania wielu cytochromów P450 w połączeniu z odpornością na insektycydy11,19,20. Jednak metoda ta nie została jeszcze zastosowana w badaniach karboksyloesterazy. Dzięki dostępności białek karboksyloesterazy wytwarzanych przez system ekspresji za pośrednictwem bakulowirusa, możemy przeprowadzić badanie metaboliczne in vitro karboksyloesterazy w kierunku permetryny, co może dodatkowo dostarczyć mocnych dowodów na udział karboksyloesterazy w nadawaniu oporności na pyretroidy u muszek domowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja i izolacja białek docelowych z wykorzystaniem systemu ekspresyjnego w komórkach owadów opartego na bakulowirusach

  1. Klonowanie kierunkowe tępokrawędzistych produktów PCR białek docelowych z muszek domowych.
    1. Zaprojektuj startery PCR dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) oraz genu MdαE7 muchy domowej na podstawie ich sekwencji i specjalnych wymagań wybranego wektora (Tabela 1).
    2. Użyj termostabilnej polimerazy DNA o aktywności korektorskiej oraz starterów z kroku 1.1.1, aby przeprowadzić 150 µL reakcja PCR (30 µL buforu reakcyjnego, 3 µL 10 mM dNTP, 1.5 µL polimerazy DNA, 6 µL matrycy DNA muchy domowej, 7.5 µL startera forwardowego, 7.5 µL starteru odwrotnego, uzupełniając wodą do objętości końcowej 150 µL). Podgrzać reakcję PCR do 98 °C przez 30 s, a następnie 35 cykli 98 °C przez 10 s, 53 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 60 s, a następnie końcową elongację w 72 °C przez 2 min).
      1. Przeprowadź elektroforezę w 1% żelu agarozowym z 150 µL produktu PCR.
    3. Wytnij docelowe fragmenty DNA z żelu agarozowego za pomocą ostrego, czystego skalpela: 1317 bp dla MdαE7 oraz 858 bp dla GFP. Oczyść DNA, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do ekstrakcji z żelu, zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów). Rozpuścić oczyszczone DNA w 15 µL wody destylowanej.
    4. Przeprowadź elektroforezę w 1% żelu agarozowym z 1 µL oczyszczonego DNA w celu sprawdzenia jego integralności. Należy użyć innego 1 µL oczyszczonego DNA w celu pomiaru stężeń za pomocą spektrofotometru.
  2. Konstrukcja plazmidu wejściowego dla białek docelowych
    1. Przygotuj reakcję klonowania. Wymieszaj świeżo oczyszczone produkty DNA z kroku 1.1.3 i dostępne komercyjnie wektory wejściowe zawierające atenuacjamiejsca L (Tabela materiałów) w stosunku molowym 1:1 (0,5-2 µL świeżego produktu PCR w ilości 70-200 ng/µL stężenia: 0.5 µL wektor). Następnie dodać 1 µL komercyjnie dostępnego roztworu soli (1,2 M NaCl2 oraz 0,06 M MgCl22) i dodać wodę do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 6 µLDelikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    2. Transfer 4 µL produktów reakcji klonowania z kroku 1.2.1 do 50 µL chemicznie kompetentnych E. coli komórki. Inkubować na lodzie przez 30 min. Poddać komórki szokowi termicznemu przez 30 s w 42 °C łaźnia wodna bez wytrząsania.
    3. Umieść probówkę ponownie w lodzie na kolejne 2 min. Dodaj 250 µL pożywki S.O.C. o temperaturze pokojowej (2% tryptony; 0,5% ekstraktu drożdżowego; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO₄4; 20 mM glukozy). Inkubować w 37 °C przez 1 h przy delikatnym wstrząsaniu.
    4. Rozprowadź 50-200 µL hodowli bakteryjnej z kroku 1.2.3 na selektywnych płytkach LB (1 g tryptonu; 1 g NaCl; 0,5 g ekstraktu drożdżowego; 1,5 g agaru rozpuszczonego w 100 ml wody destylowanej. Autoklawować i dodać 0,1% kanamycyny w stężeniu 50 mg/ml). Inkubować płytki LB przez 16 h w temperaturze 37 °C do wzrostu kolonii.
    5. Wybrać od 5 do 10 kolonii i zawiesić każdą z nich osobno w 5 µL wody destylowanej.
    6. Przeprowadź reakcję PCR, dodając 5 µL buforu reakcyjnego, 0.5 µL 10 mM dNTP, 0.25 µL polimerazy DNA, 1 µL zawieszonych kolonii, 1.25 µL z 10 µM starter M13 forward, 1.25 µL z 10 µM odpromiennik genu docelowego oraz wodę do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 25 µLPodgrzać mieszaninę reakcyjną PCR do 98 °C przez 30 s, a następnie 35 cykli 98° C przez 10 s, 53 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 60 s, a następnie końcową elongację w 72 °C przez 2 min (Tabela 1).
    7. Ponowne hodowanie 3 µL zawiesin kolonii z etapu 1.2.5 w pożywce TB (100 ml buforu fosforanowego zawierającego 0,17 M KH2PO4 oraz 0,72 M K2HPO4 w 450 ml podstawowego medium bulionowego zawierającego 6 g tryptony, 12 g ekstraktu drożdżowego i 2 ml glicerolu, wysterylizowanego, z dodatkiem 0,1% kanamycyny (50 mg/ml) przez 16 h. Wyekstrahować ultra-czyste DNA plazmidowe zgodnie z protokołem producenta.
    8. Użyć 200 ng/µL ultraczysty plazmid z kroku 1.2.7 do komercyjnego sekwencjonowania metodą Sangera z użyciem starterów M13 forward i reverse. Zweryfikować poprawność insercji genu docelowego w wektorze na podstawie mapy sekwencji dostarczonej przez producenta.
    9. Próbki ultra-czystego, zweryfikowanego sekwencyjnie plazmidowego DNA MdαE7 oraz GFP należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
      Uwaga: Są to wektory wejściowe DNA plazmidowego dla MdαE7 i GFP.
  3. Skonstruuj rekombinowany bakulowirus poprzez przeprowadzenie reakcji rekombinacji Lambda (LR).
    1. odpowiednio zmieszać 1 µL 300 ng/µL plazmid wejściowy DNA GFP, MdαE7 z kroku 1.2.7 lub plazmid wejściowy DNA genu chloramfenikol acetylotransferazy (CAT) dostarczony w zestawie do transfekcji komórek z 5 µL dostępnych w handlu (zawierających attmiejsca L) liniowe DNA z końcem C (zawierające attmiejsca wiązania R) w 250 µL Probówki do PCR. Dodać bufor TE, aby uzyskać objętość całkowitą wynoszącą 8 µL.
      Uwaga: Reakcje GFP i CAT posłużyły jako grupy kontrolne.
    2. Dodaj 2 µL komercyjnie dostępnej mieszaniny enzymów do rekombinacji Lambda (LR) (Tabela materiałów) do każdej z mieszanin z kroku 1.3.1, aby zakatalizować reakcję LR. Delikatnie wymieszać i inkubować w 25 °C przez noc (≈16 h).
      Uwaga: Reakcja LR umożliwia rekombinację atenuacjaplazmidowy DNA wektora wejściowego zawierający L z attliniowe DNA z końcem C zawierającym R w celu wygenerowania attwirusa wykazującego ekspresję B. Krok ten pozwala na otrzymanie rekombinowanego bakulowirusa dla każdego białka docelowego.
    3. Rozcieńczyć 1 µL produktów reakcji LR z kroku 1.3.2 20X. Przeprowadzić PCR z użyciem prawego primeru Polyhedrin oraz lewego primeru V5 (Tabela 1). Użyj 5 µL produktów PCR w celu przeprowadzenia elektroforezy w 1% żelu agarozowym w celu sprawdzenia ich jakości. Rycina 1 przedstawia przykład produktu reakcji LR dla genu MdαE7.

Wynik elektroforezy żelowej; drabinka DNA z rozmiarami prążków, prążek MdaE7; analiza molekularna.
Rycina 1: Przykładowe wyniki reakcji LR MdαE7 w analizie PCR. Rozcieńczyć 2 µL mieszaniny reakcyjnej LR 200-krotnie i użyć 2 µL rozcieńczenia wraz z przednim primerem Polyhedrin oraz odwrotnym primerem V5 do przeprowadzenia reakcji PCR w objętości 25 µL. Użyć 5 µL produktów PCR do elektroforezy w 1% żelu agarozowym w celu sprawdzenia jakości reakcji LR. a

  1. Transfekcja komórek owadzich Sf9
    1. Hodować komórki owadzie Sf9 w 5 mL pełnej pożywki do wzrostu komórek (pożywka bezsurowicza z 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) w traktowanych kolbach T25 w temperaturze 27 ˚C.
    2. Usunąć nadsącz i przepłukać przylegające do dna komórki 3 mL świeżej pełnej pożywki do wzrostu komórek. Przenieść 0,5 mL zawiesiny komórek do nowej traktowanej kolby T25. Dodać 4,5 mL pełnej pożywki wzrostowej. Inkubować w temperaturze 27 °C przez 3-4 dni do czasu następnego przesiewu.
    3. Wysiać 2 mL kultury komórek owadzich Sf9 w fazie logarytmicznego wzrostu (≈3,0-5,0×106 komórek) równomiernie w dołku do hodowli komórkowej. Pozostawić komórki do przytwierdzenia na co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    4. Sprawdzić przytwierdzenie komórek, obserwując je w odwróconym mikroskopie fazowym przy powiększeniu 250X. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowej i zastąpić ją 2 mL pożywki dla owadów Grace'a.
    5. Przygotować w probówkach wirówkowych 1,5 mL odpowiednio: roztwór mieszaniny transfekcyjnej A (8 µL dostępnego komercyjnie odczynnika do infekcji komórek (Tabela materiałów) z 100 µL pożywki dla owadów Grace'a) oraz roztwór mieszaniny transfekcyjnej B dla każdego genu docelowego (9 µL produktów reakcji LR z kroku 1.3 z 100 µL nieuzupełnionej pożywki dla owadów Grace'a).
    6. Delikatnie wymieszać mieszaniny transfekcyjne A i B, opukując probówki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 35 min w dygestorium.
    7. Równomiernie dodać kroplami mieszaninę z kroku 1.4.6 na wysiane komórki z kroku 1.4.4. Uszczelnić dołki taśmą i inkubować w temperaturze 27 °C przez noc.
    8. Zastąpić 2 mL pożywki dla owadów Grace'a 2 mL pełnej pożywki wzrostowej. Dodać 100 µM gancyklowiru do każdego dołka w celu selekcji negatywnej przeciwko nierekombinacyjnemu bakulowirusowi. Uszczelnić dołki taśmą i inkubować w temperaturze 27 °C przez 72 h.
    9. Zebrać pożywkę z hodowli komórkowej z każdego dołka 72 h po infekcji i przenieść do probówek wirówkowych 1,5 mL. Wirować przy 1 500 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby usunąć komórki lub duże zanieczyszczenia.
    10. Przenieść nadsącz do nowych probówek wirówkowych 1,5 mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C z ochroną przed światłem.
      Uwaga: Są to roztwory zapasowe wirusa P1 dla każdego genu docelowego.
    11. Namnożyć zapas wirusa P1 o niskim mianie (1×105-1×106 pfu/mL) do zapasu wirusa P2 o wysokim mianie (5×107-1×108 pfu/mL).
    12. Wysiać 2 mL kultury komórek owadzich Sf9 w fazie logarytmicznego wzrostu (≈3,0-5,0×106 komórek) równomiernie w dołku do hodowli komórkowej. Pozostawić komórki do przytwierdzenia na co najmniej 3 h w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    13. Zaszczepić 5 µL zapasu wirusa P1 otrzymanego w kroku 1.4.10 w odpowiednio wysianym dołku z komórkami z kroku 1.4.12. Następnie dodać 100 µM gancyklowiru do każdego dołka. Uszczelnić dołki i inkubować w temperaturze 27 °C przez 72 h.
    14. Zebrać roztwory zapasowe wirusa P2 72 h po infekcji. Przechowywać w temperaturze 4 °C z ochroną przed światłem.
      Uwaga: Są to roztwory zapasowe wirusa P2 dla każdego genu docelowego.
    15. (Opcjonalnie) Powtórzyć kroki 1.4.12-1.4.14 z użyciem 5 µL zapasu wirusa P2, aby zebrać roztwory zapasowe wirusa P3.
      Uwaga: Są to roztwory zapasowe wirusa P3 dla każdego genu docelowego.
    16. Przechowywać wszystkie skonstruowane bakulowirusy w temperaturze 4 °C z ochroną przed światłem.
      Uwaga: Geny GFP i CAT służyły jako grupa kontrolna. Rycina 2 przedstawia wygląd komórek po infekcji rekombinacyjnym bakulowirusem GFP na różnych etapach namnażania.

Obrazy mikroskopowe pokazujące fluorescencję w hodowlach komórkowych; stężenie 0,1 mM; analiza porównawcza.
Rycina 2: Przykład oznak zakażenia komórek Sf9 na różnych etapach amplifikacji bakulowirusa. Na rycinie przedstawiono komórki zrekombinowanym bakulowirusem GFP w świetle naturalnym i świetle fluorescencyjnym. Na etapie zakażenia P1 stopień zakażenia jest niski. Na etapie zakażenia P2 stopień zakażenia uległ znacznemu zwiększeniu. Na etapie zakażenia P3 prawie wszystkie komórki wykazywały objawy odrywania się od płytki hodowlanej, zwiększenie średnicy komórek, a także zahamowanie wzrostu komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Ekspresja docelowych białek na dużą skalę w komórkach owadziej linii Sf9
    1. Hodowlę 10 mL komórek owadziej linii Sf9 w fazie wzrostu logarytmicznego prowadzić w niepowlekanych kolbach T25 z użyciem pełnej pożywki wzrostowej.
    2. Do hodowli komórkowych z etapu 1.5.1 dodać 200 µL roztworu zapasu wirusa P2 (otrzymanego w etapie 1.4.14) i inkubować przez 72 h w celu infekcji.
    3. 72 h po infekcji zebrać pożywkę z hodowli komórkowej. Wirować przy 1,500 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    4. Odlać nadsącz i dwukrotnie przemyć osad 1 mL buforu PBS 0,1 M (pH 7.5).
    5. Całkowicie rozpuścić osad komórkowy w 1 mL buforu do lizy i ekstrakcji białek z komórek owadzich (Tabela materiałów). Do buforu do lizy komórek dodać 10% glicerolu. Natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
    6. Powtórzyć etapy 1.5.1–1.5.5, używając roztworu zapasu wirusa P2 z białkami CAT w celu utworzenia grupy kontrolnej.
      Uwaga: Powtórzyć etap 1.5 w trzech powtórzeniach dla różnych preparatów białek.

2. Komórkowy test cytotoksyczności MTT

  1. Hodowlę 5 mL komórek owadziech Sf9 w fazie wzrostu logarytmicznego (1,5-2,5×106 komórek/mL) prowadzić w niepowlekanych kolbach T25 w pełnej pożywce wzrostowej.
  2. W celu zainfekowania kultur komórek z kroku 2.1, dodać 25 µL roztworu zapasowego wirusa P1 (otrzymanego w kroku 1.4.14) i inkubować przez 48 h w temperaturze 27 ˚C przy delikatnym wytrząsaniu.
  3. Przygotować 100 mM roztwory zapasowe standardu permetryny w acetonitrylu. Rozcieńczyć acetonitrylem do stężeń 50 mM, 25 mM, 12,5 mM i 6,25 mM, dodając odpowiednio 500 µL, 250 µL, 125 µL i 62,5 µL roztworu zapasowego permetryny do całkowitej objętości 1 000 µL.
  4. Równomiernie zasiać 200 µL zainfekowanych kultur komórek z kroku 2.2, uzupełnionych o 300 µL pełnej pożywki wzrostowej, do płytki 24-dołkowej z gęstością 2×105 komórek/mL.
  5. Do każdego dołka dodać 4 µL roztworów standardowych permetryny (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM i 50 mM), aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 50 µM, 100 µM, 200 µM i 400 µM. Do dołków przeznaczonych do obliczeń żywotności komórek dodać jedynie 4 µL acetonitrylu (Rycina 3).
  6. Uszczelnić płytki taśmą i inkubować w temperaturze 27 °C przez 48 h, chroniąc przed światłem.
  7. Przygotować odczynnik MTT (bromek tetrazoliu tiazolylonebieski) w stężeniu 5 mg/mL, rozpuszczony w buforze (2,0 g NaCl, 0,05 g KCl, 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0,05 g KH2PO4 rozpuszczone w 200 mL wody destylowanej, pH 7,5).
  8. Po 48 h inkubacji usunąć pożywkę z kultur komórek z kroku 2.6, uważając, aby nie naruszyć przytwierdzonej do dna warstwy komórek. Do każdego dołka dodać 200 µL odczynnika MTT z kroku 2.7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h, aż w każdym dołku utworzą się ciemnofioletowe osady formazanu (Rycina 3).
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 h, aż w każdym dołku utworzą się ciemnofioletowe osady formazanu. Dodać 500 µL DMSO, aby całkowicie rozpuścić osady (Rycina 3).

Eksperyment na płytce mikrotitracyjnej; wyniki testu kolorymetrycznego, różne stężenia, analiza reakcji próbek.
Rycina 3: Przykład wyników testu MTT. Po 48 h od zakażenia roztworem zapasowym wirusa P1 rekombinowanego bakulowirusa CAT, równomiernie wysiano 500 µL komórek wykazujących ekspresję genu CAT na 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej. Odpowiednio, do każdego rzędu dodano 4 µL permetryny w różnych dawkach (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM i 50 mM), aby uzyskać stężenia końcowe 50 µM, 100 µM, 200 µM i 400 µM. Rząd kontrolny traktowano wyłącznie acetonitrylem i oznaczono na płytce jako CK. (A) Po 48 h inkubacji w 27 °C usunięto medium hodowlane z górnej warstwy i zastąpiono je 200 µL żółtego odczynnika MTT. Następnie inkubowano w 37 °C przez 48 h. W każdym dołku utworzyły się ciemnofioletowe osady redukcyjne, co wskazuje, że żywe komórki są zdolne do metabolizowania żółtego odczynnika MTT do ciemnofioletowego osadu. (B) Do każdego dołka dodano 500 µL rozpuszczalnika DMSO w celu rozpuszczenia powstałego osadu. Wartość absorbancji każdego dołka zmierzono spektrofotometrem przy 540 nm. Wraz ze wzrostem stężenia permetryny kolor stopniowo zmienia się z ciemnoczerwonego na jasnoczerwony, co sugeruje stopniowy spadek żywotności komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Przenieść 200 µL rozpuszczonego roztworu do płytki 96-dołkowej. Pomiar wartości absorbancji przeprowadzić przy 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek (Tabela materiałów).
  2. Obliczyć żywotność komórek, porównując wartości absorbancji komórek traktowanych permetryną z wartościami dla komórek traktowanych wyłącznie acetonitrylem.
  3. W przypadku grupy kontrolnej powtórzyć wszystkie etapy, używając zapasu wirusa P2 rekombinowanego baculowirusa chloramfenikol acetylotransferazy (CAT) otrzymanego w kroku 1.4.
  4. Powtórzyć czynność 4 razy dla różnych preparatów wirusowych.

3. Analiza metaboliczna in vitro

  1. Przygotować 100 mM roztwory zapasowe standardu permetryny w acetonitrylu. Użyć acetonitrylu do rozcieńczenia do stężeń 50 mM, 25 mM, 12,5 mM oraz 6,25 mM. Wyznaczyć odpowiadającą powierzchnię piku dla każdego stężenia za pomocą HPLC. Wykreślić i obliczyć krzywą wzorcową permetryny na podstawie powierzchni piku dla różnych stężeń permetryny.
  2. Zmierzyć stężenia białek z etapu 1.5 metodą Bradforda21.
  3. Przygotować 700 µL mieszaniny reakcji metabolicznej zawierającej 40 µM standardu permetryny oraz 1 mg białek otrzymanych w etapie 1.5 rozpuszczonych w 0,2 M buforze Tris-HCl (pH 7.4). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 h przy łagodnym wstrząsaniu. Chronić przed światłem.
  4. Przerwać reakcję poprzez dodanie 700 µL lodowatego acetonitrylu. Inkubować w temperaturze 30 ˚C przez kolejne 30 min przy łagodnym wstrząsaniu. Chronić przed światłem.
  5. Odwirować mieszaninę reakcyjną przy 16,000 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej. Zebrać nadsącz i przefiltrować przez membranę 0,45 µm. Przenieść przefiltrowany roztwór do ultraczystych brązowych fiolek szklanych do analizy HPLC.
  6. Przeprowadzić analizę HPLC w optymalnych warunkach chromatograficznych (Faza ruchoma A: 90% acetonitrylu i 10% wody; Faza ruchoma B: 5% acetonitrylu z pH dostrojonym do 2,3 za pomocą 85% kwasu fosforowego). Eluować gradientowo przy szybkości przepływu 1 mL/min i mierzyć przy długości fali 232 nm.
  7. Obliczyć procentowy spadek stężenia permetryny poprzez porównanie z reakcjami bez dodatku próbki białka.
  8. Użyć białka CAT otrzymanego w etapie 1.5.6 jako kontroli.
  9. Powtórzyć wszystkie etapy z różnymi preparatami białek z etapu 1.5.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Żywotność komórek w odpowiedzi na różne stężenia permetryny (test MTT)

Cytotoksyczność permetryny zbadano w komórkach Sf9 zainfekowanych rekombinowanym bakulowirusem MdαE7 (grupa eksperymentalna) oraz w komórkach zainfekowanych rekombinowanym bakulowirusem CAT (dołączonym do zestawu do infekcji bakulowirusem) (grupy kontrolne). Zwiększona tolerancja komórek ekspresujących MdαE7 na permetrynę silnie potwierdza metaboliczną rolę tej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ostatnich dziesięcioleciach heterologiczne systemy ekspresji były szeroko stosowane do ekspresji i izolacji dużych ilości białek, umożliwiając w ten sposób biochemiczne i funkcjonalne oznaczanie i charakteryzowanie enzymów in vitro. Do tej pory kilka różnych systemów modelowych, w tym Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae i Spodoptera frugiperda, zostało zaadaptowanych do rekombinowanej ekspresji białek, a wybór systemu in vitro ma kluczowe zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquick QIAGEN28704
pENTR/D-TOPO zestaw klonowania z One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogen firmy life technologyK240020S.O.C średnie i uniwersalne startery sekwencji M13.
Zestaw miniprzygotowawczy PureLink HiPure PlasmidInvitrogen firmy life technologyK210002
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów do zestawów BaculoDirectTMInvitrogen by life technology11791-023
Zestaw do transfekcji DNA BaculoDirect C-TermInvitrogen by life technology12562-019W zestawie zawarto odczynnik do transfekcji celulektyny i gancyklowir
pENTR-CAT plazmidInvitrogen by life technologyZawarte w zestawie do transfekcji DNA BaculoDirect C-Term Linear DNA, stężenie: 0,5 ug/uL
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, certyfikowanaprzez Gibco przez Life Technologies10082-139
Komórki Sf9 w Sf-900 III SFMGibco firmy Life Technologies12659017
Insect Cell-PE LB Ekstrakcja białek komórek owadów i Bufor do lizyG Biosciences firmy A Geno Technology Inc786-411
Sf-900 III SFM (1 razy) Serum Free Medium CompleteGibco firmy Life Technologies12658-019
Grace's Insect Medium, niesuplementowaneGibco by Life Technologies11595030
Wzorzec analityczny permetryny (izomerów)SUPELCO firmy Solutions WithinTM442748
Metanol (klasa analityczna)Sigma-Aldrich67-56-1
Acetonitryl (klasa analityczna)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Filtry strzykawkowe o ciśnieniu 0,45 μ m Membrana GHP (certyfikat HPLC)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 System HPLCWody
T100 Cykl termicznyBio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c SpektrofotometryThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTek
W tym zestawie znalazł się zestaw do ekstrakcji żelu 1861096

Bibliografia

  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803(2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771(2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533(2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587(2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211(2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka karboksylesterazyoporno na insektycydyekspresja w kom rkach Sf9system bakulowirusowytest cytotoksyczno ci MTTmetabolizm in vitrotolerancja na permetrynizolacja bia ekywotno kom rekklonowanie gen w
Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.