Artykuł metodologiczny

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

DOI:

10.3791/58106

⸱

23 sierpnia 2018

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uważa się, że metabolizm za pośrednictwem karboksyloesterazy odgrywa główną rolę w odporności na insektycydy u różnych owadów. Stwierdzono, że kilka genów karboksyloesterazy jest regulowanych w górę w opornym szczepie muchy domowej, podczas gdy ich rola w nadawaniu odporności na insektycydy pozostaje do zbadania. W tym miejscu opracowaliśmy protokół charakterystyki funkcjonalnej karboksyloesterazy. Przedstawiono trzy przykładowe eksperymenty: (1) ekspresja i izolacja białek karboksyloesterazy za pośrednictwem systemu ekspresji komórek owada Spodoptera frugiperda (Sf9), w którym pośredniczy bakulowirus; (2) komórkowy test cytotoksyczności MTT (bromek 3-[4,5-dimetyktiazol-2-ylo]-2, bromku 5-difenylotetrazoliowego) na bazie komórek w celu zmierzenia tolerancji komórek owadów na różne zabiegi permetryną; oraz (3) badania metaboliczne in vitro w celu zbadania zdolności metabolicznych karboksyloesterazy w kierunku permetryny. Gen karboksyloesterazy MdαE7 został sklonowany z opornego szczepu muchy domowej ALHF i wykorzystany do skonstruowania rekombinowanego bakulowirusa do zakażenia komórkami Sf9. Żywotność komórek w porównaniu z różnymi terapiami permetryną mierzono za pomocą testu MTT. Zwiększona tolerancja komórkowa grupy eksperymentalnej (komórki zakażone rekombinowanym bakulowirusem MdαE7) w porównaniu z grupami kontrolnymi (komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym CAT i komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym GFP) na leczenie permetryną sugerowała możliwości MdαE7 w metabolizowaniu insektycydów, chroniąc w ten sposób komórki przed uszkodzeniami chemicznymi. Poza tym białka karboksyloesterazy uległy ekspresji w komórkach Sf9 owadów i wyizolowano je w celu przeprowadzenia badania metabolicznego in vitro. Nasze wyniki wykazały znaczącą wydajność metaboliczną in vitro MdαE7 w stosunku do permetryny, bezpośrednio wskazując na udział karboksyloesterazy w metabolizowaniu insektycydów, a tym samym nadając odporność na insektycydy u muszek domowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporność na insektycydy jest obecnie głównym problemem zwalczania much domowych na całym świecie1,2. Wysiłki zmierzające do określenia mechanizmu oporności na insektycydy ułatwiają lepsze zrozumienie tego problemu, a tym samym dostarczają nowych strategii skutecznego zapobiegania lub minimalizowania rozprzestrzeniania się rozwoju oporności3. Karboksyloesterazy, jako jeden z głównych enzymów detoksykacyjnych, przyciągnęły wiele uwagi ze względu na ich rolę w sekwestracji i metabolizowaniu insektycydów u różnych owadów4,5,6. Nasze poprzednie badanie zidentyfikowało wiele karboksyloesterazy u muszek domowych, a ich poziomy ekspresji były nie tylko konstytutywnie regulowane w górę w opornym szczepie ALHF, ale także mogą być indukowane do wyższych poziomów w odpowiedzi na leczenie permetryną7. Jednak charakterystyka funkcjonalna tych genów karboksyloesterazy w metabolizowaniu insektycydów pozostaje do zbadania.

Od pierwszego raportu na początku lat 80. 8, system ekspresji obcych genów za pośrednictwem bakulowirusa jest szeroko stosowany ze względu na wysoką wydajność produkcji białek i możliwości przetwarzania białek eukariotycznych9. Ten system binarny składa się z dwóch zasadniczych elementów: skonstruowanego rekombinowanego bakulowirusa dostarczającego obce geny do komórek gospodarza oraz ekspresji na dużą skalę bakulowirusa przez komórki zakażone rekombinowanym bakulowirusem. W ciągu ostatnich dziesięcioleci system ekspresji komórkowej, w którym pośredniczy bakulowirus, był szeroko stosowany do produkcji tysięcy rekombinowanych białek, począwszy od enzymów cytozolowych, a skończywszy na białkach związanych z błoną w komórkach owadów i ssaków10. Nasze poprzednie badanie z powodzeniem wykazało ekspresję wielu enzymów CYP450 w komórkach Sf9 owadów za pomocą tego systemu11. W tym badaniu skonstruowaliśmy bakulowirusa rekombinowanego karboksyloesterazy do infekowania komórek Sf9 owadów, zbadaliśmy tolerancję komórek na różne terapie permetryną i białka karboksyloesterazy na dużą skalę in vitro do eksploracji funkcjonalnej. Zamiast badać wiele mieszanin izoenzymów karboksyloesterazy z homogenatów owadów, jak przyjęto w poprzednich badaniach12,13, ten system ekspresji komórek owadów, w którym pośredniczy bakulowirus, pozwala na specyficzną ekspresję i izolację docelowych białek w celu lepszego scharakteryzowania ich właściwości biochemicznych i strukturalnych.

Test na bazie soli tetrazolowej (MTT) to wysokoprzepustowa metoda kolorymetryczna, opracowana i zoptymalizowana do pomiaru żywotności komórek. Test ten opiera się na mechanizmie, w którym tylko żywe komórki są zdolne do metabolizowania żółtego odczynnika MTT do ciemnofioletowego osadu formazanu, który można analizować kolorymetrycznie po rozpuszczeniu w rozpuszczalnikach organicznych14,15. W ostatnich latach opracowano kilka bardziej dokładnych, ale czasochłonnych metod, takich jak wykluczenie błękitu trypanowego i test miareczkowania tymidyny16,17. Jednak test MTT oparty na komórkach jest nadal uznawany za najszybszą i najłatwiejszą w obsłudze metodę szybkiego wykrywania żywotności komórek. W tym przypadku używamy testu MTT, aby zbadać tolerancję komórek na zabiegi owadobójcze. Zwiększona tolerancja komórek po zakażeniu rekombinowanym bakulowirusem karboksyloesterazy silnie wspiera metaboliczne role karboksyloesterazy wobec insektycydów, co z kolei sugeruje ich udział w oporności na insektycydy.

Dodatkowo, w tym badaniu przeprowadzono również test metaboliczny in vitro. W porównaniu z ogólnymi testami karboksyloesterazy, które wykorzystują powszechne substraty, takie jak octan α-naftylu (α-NA) i octan β-naftylu (β-NA) w celu odzwierciedlenia aktywności hydrolitycznej karboksyloesterazy, badanie metaboliczne in vitro jest uważane za dokładny sposób bezpośredniego pomiaru aktywności karboksyloesterazy w stosunku do insektycydów18. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana u różnych owadów w celu scharakteryzowania wielu cytochromów P450 w połączeniu z odpornością na insektycydy11,19,20. Jednak metoda ta nie została jeszcze zastosowana w badaniach karboksyloesterazy. Dzięki dostępności białek karboksyloesterazy wytwarzanych przez system ekspresji za pośrednictwem bakulowirusa, możemy przeprowadzić badanie metaboliczne in vitro karboksyloesterazy w kierunku permetryny, co może dodatkowo dostarczyć mocnych dowodów na udział karboksyloesterazy w nadawaniu oporności na pyretroidy u muszek domowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i izolacja docelowych białek za pomocą systemu ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa

  1. Kierunkowe klonowanie tępo zakończonych produktów PCR docelowych białek z muszek domowych.
    1. Zaprojektuj startery PCR białka zielonej fluorescencji (GFP) i genu MdαE7 muchy domowej w oparciu o ich sekwencje i specjalne wymagania wybranego wektora (Tabela 1).
    2. Użyć termostabilnej, korektorskiej polimerazy DNA i starterów z kroku 1.1.1, aby przeprowadzić 150 μl reakcji PCR (30 μl buforu reakcyjnego, 3 μl 10 mM dNTP, 1,5 μl polimerazy DNA, 6 μl DNA matrycy muchy domowej, 7,5 μl startera przedniego, 7,5 μl podkładu odwrotnego, z wodą do końcowej objętości 150 μL). Podgrzewać reakcję PCR do 98 °C przez 30 s, a następnie 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 53 °C przez 30 s i 72 °C przez 60 s, a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty).
      1. Uruchom 1% żel agarozowy ze 150 μl produktu PCR.
    3. Wycinać docelowe fragmenty DNA z żelu agarozowego ostrym, czystym skalpelem: 1317 pz dla MdαE7 i 858 pz dla GFP. Oczyść DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów). Rozpuścić oczyszczone DNA w 15 μl wody destylowanej.
    4. Uruchom 1% żel agarozowy z 1 μl oczyszczonego DNA, aby sprawdzić integralność. Użyj kolejnego 1 μl oczyszczonego DNA do pomiaru stężeń za pomocą spektrofotometru.
  2. Skonstruuj plazmid wejściowy dla białek docelowych
    1. Skonfiguruj reakcję klonowania. Wymieszać świeżo oczyszczone produkty DNA z kroku 1.1.3 i dostępne w handlu wektory wejściowe zawierające miejsca L att(tabela materiałów) w stosunku molowym 1:1 (0,5-2 μl świeżego produktu PCR przy stężeniach 70-200 ng/μl: wektor 0,5 μl). Następnie dodać 1 μl dostępnego w handlu roztworu soli (1,2 M NaCl2 i 0,06 M MgCl2) i dodać wodę do końcowej objętości 6 μL. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    2. Przenieść 4 μl produktów reakcji klonowania w kroku 1.2.1 do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny komórek przez 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C bez wstrząsania.
    3. Włóż probówkę z powrotem do lodu na kolejne 2 minuty. Dodaj 250 μl pożywki S.O.C. o temperaturze pokojowej (2% tryptonu; 0,5% ekstraktu drożdżowego; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM glukozy). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, delikatnie wstrząsając.
    4. Rozprowadzić 50-200 μl kultury bakteryjnej w kroku 1.2.3 na selektywnych płytkach LB (1 g tryptonu; 1 g NaCl; 0,5 g ekstraktu drożdżowego; 1,5 g agaru rozpuszczonego w 100 ml wody destylowanej. Autoklaw i dodać 0,1% z 50 mg/ml kanamycyny). Inkubować płytki LB przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w celu wzrostu kolonii.
    5. Wybierz 5-10 kolonii i ponownie zawiesij je pojedynczo w 5 μl wody destylowanej.
    6. Przeprowadzić PCR dodając 5 μL buforu reakcyjnego, 0,5 μL 10 mM dNTPs, 0,25 μL polimerazy DNA, 1 μL zawieszonych kolonii, 1,25 μL 10 μM startera przedniego M13, 1,25 μL 10 μM startera odwrotnego docelowego genu, i wodą do końcowej objętości 25 μl. Podgrzewać reakcję PCR do 98 °C przez 30 s, następnie 35 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 53 °C przez 30 s i 72 °C przez 60 s, a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty (tabela 1).
    7. Ponowna hodowla 3 μl zawieszonych kolonii z etapu 1.2.5 w pożywce TB (100 ml buforu fosforanowego zawierającego 0,17 M KH2PO4 i 0,72 M K2HPO4 z 450 ml pożywki bulionowej zawierającej 6 g tryptonu, 12 g drożdży i 2 ml glicerolu, sterylizowanej, zawierającej 0,1% 50 mg/ml kanamycyny) przez 16 godzin. Ekstrahować ultraczyste plazmidowe DNA zgodnie z protokołem producenta.
    8. Użyj ultraczystego plazmidu o stężeniu 200 ng/μl z kroku 1.2.7 do komercyjnego sekwencjonowania Sangera ze starterami M13 do przodu i do tyłu. Sprawdź poprawność insercji docelowego genu w wektorze na podstawie mapy sekwencji dostarczonej przez producenta.
    9. Próbki ultraczystego plazmidowego DNA MdαE7 i GFP należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
      Uwaga: Są to wejściowe plazmidowe DNA MdαE7 i GFP.
  3. Skonstruuj rekombinowanego bakulowirusa, przeprowadzając reakcję rekombinacji lambda (LR).
    1. Odpowiednio, zmieszaj 1 μl 300 ng/μL wlotowego plazmidowego DNA GFP, MdαE7 z kroku 1.2.7 lub wejściowego plazmidowego DNA genu acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT) dostarczonego przez zestaw do transfekcji komórek z 5 μl dostępnego w handlu (zawierającego miejsca attL) C-term liniowego DNA (zawierającego miejsca attR) w 250 μl probówkach PCR. Dodać bufor TE, aby uzyskać całkowitą objętość 8 μL.
      Uwaga: Reakcje GFP i CAT wykorzystano jako grupy kontrolne.
    2. Dodać 2 μl dostępnej w handlu mieszaniny enzymów rekombinacji lambda (LR) (tabela materiałów) do każdej mieszaniny w kroku 1.3.1 w celu katalizowania reakcji LR. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 25 °C przez noc (≈16 h).
      Uwaga: Reakcja LR ułatwia rekombinację plazmidowego DNA wejściowego zawierającego attL z liniowym DNA C-termicznym zawierającym attR w celu wytworzenia wirusa wykazującego ekspresję attB. Na tym etapie powstaje rekombinowany bakulowirus dla każdego białka docelowego.
    3. Rozcieńczyć 1 μl produktów reakcji LR z kroku 1.3.2 20X. Przeprowadzić PCR przy użyciu startera wielościennego do przodu i startera wstecznego V5 (Tabela 1). Użyj 5 μl produktów PCR, aby uruchomić 1% żel agarozowy, aby sprawdzić jakość. Rysunek 1 pokazuje przykład produktu reakcji LR z genu MdαE7.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przykładowe wyniki reakcji MdαE7 LR metodą analizy PCR. Rozcieńczyć 2 μl reakcji LR 200-krotnie i użyć 2 μl rozcieńczenia razem ze starterem do przodu polihedryny i starterem wstecznym V5, aby przeprowadzić PCR 25 μl. Użyj 5 μl produktów PCR, aby uruchomić 1% żel agarozowy, aby sprawdzić jakość reakcji LR. ZA

  1. Transfekcyjne komórki Sf9 owadów
    1. Hodować komórki Sf9 owadów z 5 ml kompletnej pożywki do wzrostu komórek (pożywka bez surowicy z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS)) w kolbach poddanych działaniu T25 w temperaturze 27 °C.
    2. Usunąć supernatant i przepłukać przyłączone od dołu komórki 3 ml świeżej, kompletnej pożywki do wzrostu komórek. Przenieść 0,5 ml ponownie zawieszonych komórek do nowej kolby poddanej działaniu T25. Dodać 4,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Inkubować w temperaturze 27 °C przez 3-4 dni do następnego transferu.
    3. Wysiew 2 ml hodowli komórek Sf9 owadów w fazie logarytmicznej wzrostu (≈3,0-5,0×106 komórek) równomiernie na dobrze osadzonej hodowli komórkowej. Pozwól ogniwom przyczepić się przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej w okapie.
    4. Sprawdź przyczepienie komórek, obserwując za pomocą mikroskopu z odwróconymi fazami przy 250X. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i zastąp ją 2 ml pożywki dla owadów Grace.
    5. Przygotować roztwór mieszaniny A mieszaniny transfekcyjnej (8 μl dostępnego w handlu odczynnika do zakażeń komórek (tabela materiałów) ze 100 μl pożywki dla owadów Grace) i mieszaniny transfekcji B roztworu każdego docelowego genu (9 μl produktów reakcji LR z kroku 1.3 ze 100 μl nieuzupełnionej pożywki dla owadów Grace) w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, odpowiednio.
    6. Delikatnie wymieszaj ze sobą mieszaninę transfekcji A i B, stukając w rurki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 35 minut w kapturze.
    7. Równomiernie dodaj mieszaninę z kroku 1.4.6 kroplami na wysiane komórki z kroku 1.4.4. Uszczelnić studzienki taśmami i inkubować w temperaturze 27 °C przez noc.
    8. Zastąp 2 ml pożywki dla owadów Grace 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Dodaj 100 μM gancyklowiru do każdej studzienki, aby dokonać negatywnej selekcji przeciwko nierekombinowanemu bakulowirusowi. Uszczelnić studzienki taśmą i inkubować w temperaturze 27 °C przez 72 godziny.
    9. Zebrać 72 godziny po zakażeniu pożywkę do hodowli komórek z każdej studzienki i przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek lub dużych zanieczyszczeń.
    10. Przenieść supernatant do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      Uwaga: Są to roztwory podstawowe wirusa P1 dla każdego genu docelowego.
    11. Amplifikować zapas wirusa P1 o niskim mianie (1×105-1×106 pfu/ml) do szczepu wirusa P2 o wysokim mianie (5×107-1×108 pfu/ml).
    12. Wysiew 2 ml hodowli komórek Sf9 owadów w fazie logarytmicznej wzrostu (≈3,0-5,0×106 komórek) równomiernie na dobrze osadzonej hodowli komórkowej. Pozwól ogniwom przyczepić się przez co najmniej 3 godziny w temperaturze pokojowej w okapie.
    13. Zaszczepić 5 μl zapasu wirusa P1 uzyskanego w kroku 1.4.10 w dołku z nasionami komórek w kroku 1.4.12. Następnie dodaj 100 μM gancyklowiru do każdego dołka. Uszczelnić studzienki i inkubować w temperaturze 27 °C przez 72 godziny.
    14. Zbierz roztwory podstawowe wirusa P2 z 72 godzin po zakażeniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
      Uwaga: Są to roztwory podstawowe wirusa P2 dla każdego genu docelowego.
    15. (Opcjonalnie) Powtórz kroki 1.4.12-1.4.14 z 5 μl zapasu wirusa P2, aby zebrać roztwory podstawowe wirusa P3.
      Uwaga: Są to roztwory podstawowe wirusa P3 dla każdego genu docelowego.
    16. Przechowywać cały zbudowany bakulowirus w temperaturze 4 °C, chroniąc go przed światłem.
      Uwaga: Gen GFP i CAT podawano jako grupę kontrolną. Rysunek 2 pokazuje oznaki komórek zainfekowanych bakulowirusem rekombinowanym GFP na różnych etapach amplifikacji.

figure-protocol-2
Rycina 2: Przykład zakażonych objawów komórek Sf9 na różnych etapach amplifikacji bakulowirusa. Rysunek przedstawia komórki bakulowirusa rekombinowane przez GFP w świetle naturalnym i fluorescencyjnym. Na etapie zakażenia P1 współczynnik infekcji jest niski. Na etapie zakażenia P2 współczynnik zakażeń uległ znacznemu zwiększeniu. Na etapie zakażenia P3 prawie wszystkie komórki wykazywały objawy oderwania się od płytki hodowli komórkowej, zwiększenia średnicy komórki, a także zatrzymania wzrostu komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ekspresja białek docelowych na dużą skalę w komórkach Sf9 owadów
    1. Hodowla 10 ml komórek Sf9 owadów wzrostu w fazie logarytmicznej z kompletną pożywką wzrostową w kolbach T25 niepoddanych działaniu substancji.
    2. Dodać 200 μl roztworu podstawowego wirusa P2 (otrzymanego w kroku 1.4.14) w celu zakażenia kultur komórkowych w kroku 1.5.1 przez 72 godziny.
    3. Zebrać 72 godziny po zakażeniu pożywkę do hodowli komórek. Wirować przy 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odrzucić sklarat nadpokojowy i dwukrotnie przemyć granulki 1 ml 0,1 M buforu PBS (pH 7,5).
    5. Całkowicie rozpuść granulki komórkowe za pomocą 1 ml buforu do ekstrakcji i lizy białek komórek owadów (tabela materiałów). Dodaj 10% glicerolu w lizie komórek. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    6. Powtórzyć kroki 1.5.1-1.5.5 z roztworem podstawowym wirusa P2 białek CAT, aby posłużył jako grupa kontrolna.
      Uwaga: Powtórzyć krok 1.5 w trzech powtórzeniach dla różnych preparatów białkowych.

2. Test cytotoksyczności MTT na bazie komórek

  1. Hodowla 5 ml komórek Sf9 owadów w fazie logarytmicznej wzrostu (1,5-2,5×106 komórek/ml) z kompletną pożywką wzrostową w kolbach T25 niepoddanych działaniu substancji.
  2. Dodać 25 μl roztworu podstawowego wirusa P1 (otrzymanego w kroku 1.4.14) w celu zakażenia kultur komórkowych w kroku 2.1 przez 48 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 27 °C.
  3. Przygotować 100 mM roztwory podstawowe wzorca permetryny w acetonitrylu. Za pomocą acetonitrylu rozcieńczyć odpowiednio do 50 mM, 25 mM, 12,5 mM i 6,25 mM przez dodanie odpowiednio 500 μl, 250 μl, 125 μl i 62,5 μl roztworu podstawowego permetryny w całkowitej objętości 1,000 μl.
  4. Równomiernie wysiewać 200 μl zakażonych kultur komórkowych z kroku 2.2 uzupełnionych 300 μl kompletnej pożywki wzrostowej na 24-dołkową płytkę o gęstości 2×105 komórek/ml.
  5. Dodać 4 μl roztworów wzorcowych permetryny (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM i 50 mM) do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie odpowiednio 50 μM, 100 μM, 200 μM i 400 μM. Dodaj tylko 4 μl acetonitrylu do studzienek w celu obliczenia żywotności komórek (Rysunek 3).
  6. Uszczelnić płytki taśmami i inkubować w temperaturze 27 °C przez 48 godzin, chroniąc je przed światłem.
  7. Przygotować 5 mg/ml odczynnika MTT (bromek tetrazolium błękitu tiazolylowego) rozpuszczony w buforze (2,0 g NaCl, 0,05 g KCl, 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0,05 g KH2PO4 rozpuszczony w 200 ml wody destylowanej, pH 7,5).
  8. Po 48 godzinach inkubacji usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z kroku 2.6, nie dotykając warstwy komórek przymocowanej od dołu. Dodać 200 μl odczynnika MTT w kroku 2.7 do każdego dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, aż w każdej studzience wytrącą się ciemnofioletowe osady formazanu (Rysunek 3).
  9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, aż w każdym studzience wytrąci się ciemnofioletowy formazan. Dodaj 500 μl DMSO, aby całkowicie rozpuścić osady (Rysunek 3).

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przykładowe wyniki MTT. Po 48 godzinach od zakażenia roztworem podstawowym wirusa P1 rekombinowanego roztworu bakulowirusa CAT, równomiernie wysiewaj 500 μl komórek eksprymujących gen CAT na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. Odpowiednio dodać 4 μl permetryny w różnych dawkach (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM i 50 mM) w każdym rzędzie, aby uzyskać końcowe stężenie do 50 μM, 100 μM, 200 μM i 400 μM. Rząd kontrolny potraktowano wyłącznie acetonitrylem i oznaczono jako CK na płytce. (A) Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 27 °C odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych na górnej warstwie i zastąpić 200 μl żółtych odczynników MTT. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. W każdym dołku tworzą się ciemnofioletowe osady redukcyjne, co wskazuje, że komórki przetrwania są zdolne do metabolizowania odczynników MTT koloru żółtego do osadu o ciemnofioletowym kolorze. (B) Do każdej studzienki dodano 500 μl rozpuszczalnika DMSO w celu rozpuszczenia powstałego osadu. Wartość absorbancji każdego dołka wykryto za pomocą spektrofotometru przy długości fali 540 nm. Wraz ze wzrostem stężenia permetryny kolor będzie się stopniowo zmieniał z ciemnoczerwonego na jasnoczerwony, co sugeruje, że żywotność komórek była stopniowo zmniejszana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przenieść 200 μl rozpuszczonego roztworu na płytkę 96-dołkową. Zmierzyć wartości absorbancji przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek (tabela materiałów).
  2. Obliczyć żywotność komórek, porównując wartości absorbancji komórek traktowanych permetryną z wartościami tylko komórek traktowanych acetonitrylem.
  3. Dla grupy kontrolnej powtórzyć wszystkie kroki z roztworem podstawowym wirusa P2 rekombinowanego bakukulowirusa acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) otrzymanym w kroku 1.4.
  4. Powtórz 4 razy dla różnych preparatów wirusowych.

3. Test metaboliczny in vitro

  1. Przygotować 100 mM roztwory podstawowe wzorca permetryny w acetonitrylu. Użyć acetonitrylu do rozcieńczenia do 50 mM, 25 mM, 12,5 mM i 6,25 mM. Wykryć odpowiedni obszar piku przy każdym stężeniu za pomocą HPLC. Utwórz i oblicz krzywą standardową permetryny na podstawie powierzchni piku o różnych stężeniach permetryny.
  2. Zmierz stężenie białka w kroku 1.5 za pomocą metod Bradforda21.
  3. Przygotować 700 μl reakcji metabolicznej z 40 μM wzorcem permetryny i 1 mg białek otrzymanych w kroku 1.5 rozpuszczonych w 0,2 M buforze Tris-HCl (pH 7,4). Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 godziny, delikatnie wstrząsając. Chronić przed światłem.
  4. Ugasić reakcję, dodając 700 μl lodowatego acetonitrylu. Inkubować w temperaturze 30 °C przez kolejne 30 minut, delikatnie wstrząsając. Chronić przed światłem.
  5. Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 16 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant i przefiltrować przez membranę o grubości 0,45 μm. Przenieść filtrację do ultraczystych fiolek z brązowego szkła w celu analizy HPLC.
  6. Uruchomić HPLC w optymalnych warunkach chromatograficznych (faza ruchoma A: 90% acetonitrylu i 10% wody; Faza ruchoma B: 5% acetonitryl dostosowany do pH 2,3 z 85% kwasem fosforowym). Elucja gradientowa o natężeniu przepływu 1 ml/min i pomiar przy długości fali 232 nm.
  7. Obliczyć procent zubożenia permetryny, porównując z reakcjami bez dodatku próbki białka.
  8. Użyć białka CAT uzyskanego w kroku 1.5.6, aby służyło jako kontrola.
  9. Powtórz wszystkie kroki z różnymi preparatami białkowymi w kroku 1.5.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotność komórek w przypadku różnych terapii permetryną (test MTT)

Cytotoksyczność permetryny została zbadana w komórkach zakażonych rekombinowanym bakulowirusem MdαE7 (grupa eksperymentalna) i rekombinowanym bakulowirusem CAT (dostarczonym przez zestaw zakażony bakulowirusem) (grupy kontrolne). Zwiększona tolerancja komórkowa na permetrynę w komórkach wykazujących ekspresję MdαE7 silnie wspiera metaboliczne role tej karboksyloest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach heterologiczne systemy ekspresji były szeroko stosowane do ekspresji i izolacji dużych ilości białek, umożliwiając w ten sposób biochemiczne i funkcjonalne oznaczanie i charakteryzowanie enzymów in vitro. Do tej pory kilka różnych systemów modelowych, w tym Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae i Spodoptera frugiperda, zostało zaadaptowanych do rekombinowanej ekspresji białek, a wybór systemu in vitro ma kluczowe zn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquick QIAGEN28704
pENTR/D-TOPO zestaw klonowania z One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogen firmy life technologyK240020S.O.C średnie i uniwersalne startery sekwencji M13.
Zestaw miniprzygotowawczy PureLink HiPure PlasmidInvitrogen firmy life technologyK210002
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów do zestawów BaculoDirectTMInvitrogen by life technology11791-023
Zestaw do transfekcji DNA BaculoDirect C-TermInvitrogen by life technology12562-019W zestawie zawarto odczynnik do transfekcji celulektyny i gancyklowir
pENTR-CAT plazmidInvitrogen by life technologyZawarte w zestawie do transfekcji DNA BaculoDirect C-Term Linear DNA, stężenie: 0,5 ug/uL
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, certyfikowanaprzez Gibco przez Life Technologies10082-139
Komórki Sf9 w Sf-900 III SFMGibco firmy Life Technologies12659017
Insect Cell-PE LB Ekstrakcja białek komórek owadów i Bufor do lizyG Biosciences firmy A Geno Technology Inc786-411
Sf-900 III SFM (1 razy) Serum Free Medium CompleteGibco firmy Life Technologies12658-019
Grace's Insect Medium, niesuplementowaneGibco by Life Technologies11595030
Wzorzec analityczny permetryny (izomerów)SUPELCO firmy Solutions WithinTM442748
Metanol (klasa analityczna)Sigma-Aldrich67-56-1
Acetonitryl (klasa analityczna)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Filtry strzykawkowe o ciśnieniu 0,45 μ m Membrana GHP (certyfikat HPLC)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 System HPLCWody
T100 Cykl termicznyBio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c SpektrofotometryThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTek
W tym zestawie znalazł się zestaw do ekstrakcji żelu 1861096

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803(2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771(2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533(2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587(2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211(2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Charakterystyka karboksylesterazyoporno na insektycydyekspresja w kom rkach Sf9system bakulowirusowytest cytotoksyczno ci MTTmetabolizm in vitrotolerancja na permetrynizolacja bia ekywotno kom rekklonowanie gen w

Powiązane artykuły