Method Article

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

DOI:

10.3791/58106

⸱

August 23rd, 2018

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uważa się, że metabolizm za pośrednictwem karboksyloesterazy odgrywa główną rolę w odporności na insektycydy u różnych owadów. Stwierdzono, że kilka genów karboksyloesterazy jest regulowanych w górę w opornym szczepie muchy domowej, podczas gdy ich rola w nadawaniu odporności na insektycydy pozostaje do zbadania. W tym miejscu opracowaliśmy protokół charakterystyki funkcjonalnej karboksyloesterazy. Przedstawiono trzy przykładowe eksperymenty: (1) ekspresja i izolacja białek karboksyloesterazy za pośrednictwem systemu ekspresji komórek owada Spodoptera frugiperda (Sf9), w którym pośredniczy bakulowirus; (2) komórkowy test cytotoksyczności MTT (bromek 3-[4,5-dimetyktiazol-2-ylo]-2, bromku 5-difenylotetrazoliowego) na bazie komórek w celu zmierzenia tolerancji komórek owadów na różne zabiegi permetryną; oraz (3) badania metaboliczne in vitro w celu zbadania zdolności metabolicznych karboksyloesterazy w kierunku permetryny. Gen karboksyloesterazy MdαE7 został sklonowany z opornego szczepu muchy domowej ALHF i wykorzystany do skonstruowania rekombinowanego bakulowirusa do zakażenia komórkami Sf9. Żywotność komórek w porównaniu z różnymi terapiami permetryną mierzono za pomocą testu MTT. Zwiększona tolerancja komórkowa grupy eksperymentalnej (komórki zakażone rekombinowanym bakulowirusem MdαE7) w porównaniu z grupami kontrolnymi (komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym CAT i komórki zakażone bakulowirusem rekombinowanym GFP) na leczenie permetryną sugerowała możliwości MdαE7 w metabolizowaniu insektycydów, chroniąc w ten sposób komórki przed uszkodzeniami chemicznymi. Poza tym białka karboksyloesterazy uległy ekspresji w komórkach Sf9 owadów i wyizolowano je w celu przeprowadzenia badania metabolicznego in vitro. Nasze wyniki wykazały znaczącą wydajność metaboliczną in vitro MdαE7 w stosunku do permetryny, bezpośrednio wskazując na udział karboksyloesterazy w metabolizowaniu insektycydów, a tym samym nadając odporność na insektycydy u muszek domowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporność na insektycydy jest obecnie głównym problemem zwalczania much domowych na całym świecie1,2. Wysiłki zmierzające do określenia mechanizmu oporności na insektycydy ułatwiają lepsze zrozumienie tego problemu, a tym samym dostarczają nowych strategii skutecznego zapobiegania lub minimalizowania rozprzestrzeniania się rozwoju oporności3. Karboksyloesterazy, jako jeden z głównych enzymów detoksykacyjnych, przyciągnęły wiele uwagi ze względu na ich rolę w sekwestracji i metabolizowaniu insektycydów u różnych owadów4,5,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i izolacja docelowych białek za pomocą systemu ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa

  1. Kierunkowe klonowanie tępo zakończonych produktów PCR docelowych białek z muszek domowych.
    1. Zaprojektuj startery PCR białka zielonej fluorescencji (GFP) i genu MdαE7 muchy domowej w oparciu o ich sekwencje i specjalne wymagania wybranego wektora (Tabela 1).
    2. Użyć termostabilnej, korektorskiej polimerazy DNA i starterów z kroku 1.1.1, aby przeprowadzić 150 μl reakcji PCR (30 μl buforu reakcyjnego, 3 μl 10 mM dNTP, 1,5 μl polimerazy DNA, 6 μl DNA matrycy muchy domowej, 7,5 μl startera przedniego, 7,5 μl pod....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywotność komórek w przypadku różnych terapii permetryną (test MTT)

Cytotoksyczność permetryny została zbadana w komórkach zakażonych rekombinowanym bakulowirusem MdαE7 (grupa eksperymentalna) i rekombinowanym bakulowirusem CAT (dostarczonym przez zestaw zakażony bakulowirusem) (grupy kontrolne). Zwiększona tolerancja komórkowa na permetrynę w komórkach wykazujących ekspresję MdαE7 silnie wspiera metaboliczne role tej karboksyloest.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach heterologiczne systemy ekspresji były szeroko stosowane do ekspresji i izolacji dużych ilości białek, umożliwiając w ten sposób biochemiczne i funkcjonalne oznaczanie i charakteryzowanie enzymów in vitro. Do tej pory kilka różnych systemów modelowych, w tym Escherichia coli, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae i Spodoptera frugiperda, zostało zaadaptowanych do rekombinowanej ekspresji białek, a wybór systemu in vitro ma kluczowe zn.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Q5 Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquick QIAGEN28704
pENTR/D-TOPO zestaw klonowania z One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogen firmy life technologyK240020S.O.C średnie i uniwersalne startery sekwencji M13.
Zestaw miniprzygotowawczy PureLink HiPure PlasmidInvitrogen firmy life technologyK210002
Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymów do zestawów BaculoDirectTMInvitrogen by life technology11791-023
Zestaw do transfekcji DNA BaculoDirect C-TermInvitrogen by life technology12562-019W zestawie zawarto odczynnik do transfekcji celulektyny i gancyklowir
pENTR-CAT plazmidInvitrogen by life technologyZawarte w zestawie do transfekcji DNA BaculoDirect C-Term Linear DNA, stężenie: 0,5 ug/uL
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca, certyfikowanaprzez Gibco przez Life Technologies10082-139
Komórki Sf9 w Sf-900 III SFMGibco firmy Life Technologies12659017
Insect Cell-PE LB Ekstrakcja białek komórek owadów i Bufor do lizyG Biosciences firmy A Geno Technology Inc786-411
Sf-900 III SFM (1 razy) Serum Free Medium CompleteGibco firmy Life Technologies12658-019
Grace's Insect Medium, niesuplementowaneGibco by Life Technologies11595030
Wzorzec analityczny permetryny (izomerów)SUPELCO firmy Solutions WithinTM442748
Metanol (klasa analityczna)Sigma-Aldrich67-56-1
Acetonitryl (klasa analityczna)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm Filtry strzykawkowe o ciśnieniu 0,45 μ m Membrana GHP (certyfikat HPLC)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 System HPLCWody
T100 Cykl termicznyBio-Rad Laboratories Inc.
Nanodrop 2000/2000c SpektrofotometryThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode ReaderBioTek
W tym zestawie znalazł się zestaw do ekstrakcji żelu 1861096

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Carboxylesterase CharacterizationInsecticide ResistanceSf9 Cell ExpressionBaculovirus SystemMTT Cytotoxicity AssayIn Vitro MetabolismPermethrin ToleranceProtein IsolationCell ViabilityGene Cloning

Related Articles