Artykuł metodologiczny

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

DOI:

10.3791/58109

⸱

21 września 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centriole to duże zespoły makromolekularne, ważne dla prawidłowego wykonywania podstawowych procesów biologicznych komórek, takich jak podział komórki, ruchliwość komórki czy sygnalizacja komórkowa. Zielone algi Chlamydomonas reinhardtii okazały się wnikliwym modelem w badaniach nad architekturą, funkcją i składem białek centrioli. Pomimo ogromnych postępów w zrozumieniu architektury centriolowej, jednym z obecnych wyzwań jest określenie dokładnej lokalizacji komponentów centriolarnych w obszarach strukturalnych centrioli, aby lepiej zrozumieć ich rolę w biogenezie centrioli. Głównym ograniczeniem jest rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej, która komplikuje interpretację lokalizacji białka w tej organelli o wymiarach zbliżonych do granicy dyfrakcji. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przedstawiamy metodę oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli C. reinhardtii o różnych orientacjach przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej. Technika ta pozwala na dalsze przetwarzanie danych poprzez fluorescencyjne uśrednianie pojedynczych cząstek (Fluo-SPA) ze względu na dużą liczbę pozyskanych centrioli. Fluo-SPA generuje średnie barwionych centrioli C. reinhardtii w różnych orientacjach, ułatwiając w ten sposób lokalizację odrębnych białek w podregionach centrioralnych. Co ważne, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli innych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Centriole to ewolucyjnie zachowana organella, która leży w sercu centrosomu w komórkach zwierzęcych i może działać jako ciało podstawowe (zwane dalej centriolami) do szablonu rzęsek lub wici u wielu eukariontów1,2. W związku z tym centriole mają kluczowe znaczenie dla podstawowych procesów biologicznych komórek, od składania wrzeciona po sygnalizację komórkową. W związku z tym defekty w montażu lub funkcji centrioli są związane z kilkoma ludzkimi patologiami, w tym ciliopatiami i nowotworami3.

Centriole to dziewięciokrotne, symetryczne, oparte na mikrotubulach potrójne struktury cylindryczne, które zazwyczaj mają ~450 nm długości i ~250 nm szerokości4,5,6,7. Konwencjonalna mikroskopia elektronowa i krioelektronowa tomografia centrioli różnych gatunków wykazały, że centriole są spolaryzowane wzdłuż swojej długiej osi z trzema odrębnymi obszarami: obszarem proksymalnym, centralnym jądrem i obszarem dystalnym5,7,8,9,10,11. Co ważne, każdy z tych regionów wykazuje określone cechy konstrukcyjne. Po pierwsze, światło obszaru proksymalnego o długości 100 nm zawiera strukturę koła wozu połączoną z trypletem mikrotubul za pomocą elementu główki szpilki12. Po drugie, obszar centralny o długości 300–400 nm zawiera włókniste gęstości w świetle i cechy strukturalne wzdłuż wewnętrznej powierzchni mikrotubul: łącznik w kształcie litery Y, ogon kanalika C i krąg rurki A9. Wreszcie, obszar dystalny 50–100 nm wykazuje subdystalne i dystalne wyrostki, które otaczają dystalną część centriole5,13.

Ostatnie dwie dekady upłynęły pod znakiem odkrywania coraz większej liczby białek centriolarnych, co doprowadziło do obecnego oszacowania około 100 odrębnych białek będących częścią klasy centriole14,15,16,17. Pomimo tych postępów, dokładna lokalizacja tych białek w centrioli pozostaje nieuchwytna, szczególnie w podregionach strukturalnych. Co ważne, przypisanie precyzyjnej lokalizacji do obszarów strukturalnych centrioli ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji. Pod tym względem centriole C. reinhardtii odegrały zasadniczą rolę w obu aspektach, najpierw wyznaczając granice różnych cech strukturalnych wzdłuż cylindra9,18,19, co następnie pozwoliło naukowcom skorelować lokalizację podzbioru białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z regionem substrukturalnym. Obejmuje to na przykład białka Bld12p i Bld10p, które lokalizują się w regionie proksymalnym, a w szczególności w strukturze koła wozu20,21,22,23. Lista białek zlokalizowanych w podstrukturze obejmuje również POB15 i POC16, dwa nowe białka zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas, które zdobią wewnętrzny centralny region rdzenia C. reinhardtii centrioles17.

Ten artykuł zawiera pełny opis metody opracowanej do izolowania i obrazowania centrioli C. reinhardtii do późniejszej mikroskopii superrozdzielczej i uśredniania pojedynczych cząstek. Aby osiągnąć ten cel, ważne jest nakreślenie ograniczeń technicznych, które należy pokonać. Po pierwsze, oczyszczanie centrioli może mieć wpływ na ogólną architekturę, przy czym struktura koła wozu często jest tracona podczas różnych etapów izolacji9. Po drugie, wymiary centrioli są bardzo zbliżone do granicy dyfrakcji w mikroskopii optycznej. Rzeczywiście, rozdzielczość boczna, którą można uzyskać w mikroskopii konfokalnej, wynosi około 200 nm24, podobnie jak średnica centrioli, a rozdzielczość w osi z jest około 2-3 razy niższa, co prowadzi do objętości anizotropowej. Po trzecie, niejednorodność znakowania przeciwciał i orientacji centrioli może ograniczać interpretację potrzebną do lokalizacji białka w określonym podregionie centriolowym. Wreszcie, centriole występują tylko w dwóch kopiach na komórkę, co utrudnia uzyskanie dużej liczby obrazów i znalezienie jednoznacznej orientacji centrioli. Aby obejść te problemy techniczne, opracowaliśmy metodę, która opiera się na zastosowaniu mikroskopii superrozdzielczej na dużej liczbie izolowanych centrioli, które przyjmują różne orientacje. Najpierw opiszemy protokół oczyszczania centrioli C. reinhardtii, który umożliwia oczyszczanie strukturalnie nienaruszonych centrioli i procentrioli zawierających koło wozu. Następnie opiszemy krok po kroku protokół koncentracji centrioli na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania za pomocą konwencjonalnej lub superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Ten ważny krok pozwala na zwiększenie liczby centrioli obrazowanych w wielu orientacjach. Na koniec opiszemy procedurę uśredniania pojedynczych cząstek na danych uzyskanych na mikroskopach fluorescencyjnych, która ułatwia wykrywanie centrioli w różnych orientacjach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli różnych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża do hodowli C. reinhardtii i izolacja centrioli

  1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek C. reinhardtii
    UWAGA: Poniższe kroki opisują przygotowanie roztworów podstawowych dla pożywki 1x TAP (fosforan tris-octanu).
    1. Przygotować bufor fosforanowy (pH 7), mieszając 250 ml 1 M K2HPO4 (174,2 g K2HPO4 uzupełnione do 1 l wodą destylowaną) z ~170 ml 1 M KH2PO4 (136,09 g KH2PO4 w 1 L). Dostosuj mieszaninę, aby osiągnąć pH 7.
    2. Przygotować roztwór A (40x) mieszając 96,8 g Tris, 40 ml buforu fosforanowego (pH 7) i 40 ml kwasu octowego, a następnie dostosować roztwór do 1 l wodą destylowaną.
    3. Przygotować roztwór B (40x) używając 16 g NH4Cl, 2 g CaCl2 i 4 g MgSO4 . Należy uważać, aby rozpuścić CaCl2 w wodzie destylowanej oddzielnie przed dodaniem go do innych składników. Roztwór uzupełnić wodą destylowaną do 1 l.
    4. Przygotuj bufor pierwiastków śladowych Hutnera25 w następujący sposób.
      1. Na 1 l buforu rozpuścić każdy związek we wskazanej objętości wody: sól disodowa EDTA (50 g w 250 ml), ZnSO4,7H 2O (22 g w 100 ml), H3BO3 (11,4 g w 200 ml), MnCl2,4H 2O (5,06 g w 50 ml), CoCl2,6H 2O (1,61 g w 50 ml), CuSO4,5H 2O (1,57 g w 50 ml), (NH4)6Mo7O24,4H 2O (1,10 g w 50 ml) i FeSO 4,7H2O (4,99 g w 50 ml).
        UWAGA: EDTA należy rozpuścić we wrzącej wodzie, a FeSO4 należy przygotować na końcu, aby uniknąć utleniania.
      2. Wymieszaj wszystkie roztwory z wyjątkiem EDTA i doprowadź do wrzenia. Następnie dodaj EDTA, a roztwór powinien zmienić kolor na zielony. Po rozpuszczeniu wszystkiego schłodzić roztwór do temperatury 70 °C. W tej temperaturze dodać 85 ml gorącego 20% roztworu KOH (20 g w 100 ml). Roztwór należy uzupełnić do 1 l wodą destylowaną o temperaturze pokojowej (RT).
      3. Dodaj bawełniany korek do kolby i odstaw roztwór na 1 lub 2 tygodnie, potrząsając nim 1x dziennie. Roztwór powinien początkowo być zielony, a następnie zmienić kolor na fioletowy, pozostawiając rdzawobrązowy osad; Usunąć osad za pomocą bibuły filtracyjnej, aż roztwór będzie klarowny. Zamrozić podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotuj 1x pożywkę TAP do hodowli komórek C. reinhardtii, mieszając następujące składniki: 25 ml roztworu A (40x) i 25 ml roztworu B (40x) z 1 ml buforu pierwiastków śladowych Hutnera25, i dostosuj mieszaninę do 1 litra z wodą destylowaną. Wysterylizuj mieszaninę za pomocą filtra 0,4 μm.
  2. Przygotowanie pożywki do oczyszczania centrioli
    1. Przygotować bufor deflagellacyjny przy użyciu 5% sacharozy w 10 mM HEPES (pH 7) w końcowej objętości 500 ml dostosowanej wodą destylowaną.
    2. Przygotuj 250 ml 0,5 M kwasu octowego.
    3. Przygotować 250 ml 1 M roztworu podstawowego K-PIPES (pH 7,2), najpierw dodając 50 ml H2O w celu rozpuszczenia proszku PIPES, a następnie dodając 10 N KOH, aż roztwór zacznie stawać się klarowny. Miareczkować do pH 7,2 za pomocą 10 N i 1 N KOH i dostosować roztwór do końcowej objętości 250 ml za pomocąH2O.
    4. Przygotować 5 roztworów sacharozy (w/w) w następujący sposób.
      UWAGA: Wszystkie roztwory sacharozy muszą być filtrowane po rozpuszczoniu za pomocą filtra 0,4 μm podłączonego do strzykawki. Należy pamiętać, że roztwory sacharozy 60% i 70% są trudne do rozpuszczenia i należy je umieścić w łaźni wodnej wstępnie podgrzanej w temperaturze 60 °C, aby ułatwić solucjonalizację. Mieszaj co 10 minut, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
      1. Aby przygotować 25% sacharozy, zważ 25 g sacharozy i dostosuj wagę do 100 g, dodając 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      2. Aby przygotować 60% sacharozy, odważ 60 g sacharozy i dostosuj wagę do 100 g za pomocą 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      3. Przygotuj roztwory sacharozy dla gradientu sacharozy. Przygotować 40% sacharozy, ważąc 40 g sacharozy i dostosowując roztwór do 100 g za pomocą 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Podobnie przygotuj 50% (w/w) i 70% (w/w) sacharozy.
      4. Roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy uważać, aby roztwory sacharozy po rozmrożeniu zostały prawidłowo podniesione.
    5. Przygotować 100 ml buforu do lizy, mieszając 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2 i 1% NP-40 i utrzymywać w temperaturze 4 °C. Zawsze przygotowuj ten bufor świeży w dniu eksperymentu. Dodać tabletki przeciw proteazie w dniu izolacji centrioli.
    6. Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4) mieszając 8 g NaCl, 2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 800 ml destylowanegoH2O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą HCl. Doprowadzić objętość mieszaniny do 1 l z destylowanym H2O.

2. Izolacja C. reinhardtii Centrioles

UWAGA: Zobacz Rysunek 1.

  1. Hodowla i ekspansja komórek C. reinhardtii
    1. Wieczorem w dniu 1 zaszczepić szczep cw15- z stałej płytki do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml 1x TAP. Hodować komórki pod białymi lampami fluorescencyjnymi (60 μE/m2s) przez 2–3 dni w temperaturze 23 °C.
    2. W 3 dniu rozcieńczyć kulturę 10x (do 100 ml) w 1x TAP i hodować komórki pod światłem przez 2-3 dni w temperaturze 23 °C.
    3. W dniu 6 rozcieńczyć kulturę 10x w 1x TAP, aby uzyskać 1 l kultury. Hoduj komórki pod światłem w temperaturze 23 °C, aż kultura osiągnie ciemnozielony kolor, który wskazuje na przybliżoną gęstość komórek ~1 x 107 komórek/ml26 (dzień 9–10).
  2. Oczyszczanie C. reinhardtii centrioles
    1. Odwirować komórki cw15 przy 600 x g przez 10 minut w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Umyj osad komórek 1x 50 ml 1x PBS i wiruj w temperaturze 600 x g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 ml buforu deflagellacyjnego o temperaturze pokojowej za pomocą pipety.
    2. Deflagelować komórki za pomocą szoku pH, powoli dodając krople 0,5 M kwasu octowego do końcowego pH 4,5–4,7 na mieszadle magnetycznym i inkubować komórki przez 2 minuty. Powoli dodawaj krople 1 N KOH, aby przywrócić pH do 7,0.
    3. Odwirować komórki o masie 600 x g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie oderwane wici. Usunąć supernatant i przechowywać osad na lodzie. Przemyć granulat 2x 50 ml 1x PBS wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C. Następnie wirować granulkę w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Ponownie zawiesić osad w 30 ml 1x PBS i powoli załadować zawiesinę na 25% poduszkę sacharozy o pojemności 20 ml bez mieszania (Rysunek 1B).
    5. Wirować w temperaturze 600 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałą wici z supernatantu; komórki rozprowadza się w 25% sacharozie (Rysunek 1C). Zachowaj tylko najniższe 20 ml (czerwona strzałka, Rysunek 1C), ostrożnie zasysając supernatant za pomocą aspiratora.
    6. Umyj pozostałe 20 ml, dodając 20 ml zimnego 1x PBS. Wirować próbkę w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml zimnego 1x PBS (w temperaturze 4 °C). Upewnij się, że nie ma grudek, aby następująca liza uderzyła we wszystkie komórki jednocześnie.
    7. Przenieść zawieszony osad do nowej butelki o pojemności 250 ml. Dodaj 100 ml buforu do lizy uzupełnionego 5 000 jednostek DNazy do komórek. Ważne jest, aby dodać bufor do lizy do komórek, a nie na odwrót. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i dokładnie wymieszać, odwracając butelkę co 15 minut, nie tworząc żadnych pęcherzyków.
    8. Odwirować zlizowane komórki w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w celu usunięcia wszelkich resztek komórek. Jeśli liza została przeprowadzona prawidłowo, osad komórek powinien być biały (Rysunek 1D). Zebrać supernatant za pomocą pipety i umieścić go na lodzie do probówki okrągłodennej o pojemności 30 ml zawierającej 60% poduszkę sacharozy. Następnie wirować probówkę o masie 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Może być potrzebnych kilka probówek okrągłodennych (Tabela materiałów), w zależności od objętości supernatantu.
    9. Odessać supernatant do wysokości 1 ml powyżej poduszki sacharozy. Zwrócić uwagę na żółtą granicę między 1 ml pozostałego supernatantu a 2 ml poduszki sacharozy. Delikatnie wymieszaj sacharozę i pozostały sklarantysz z odciętą końcówką P1000. Na tym etapie nie wiruj; W przeciwnym razie procentrioles mogą zostać utracone na tym etapie. Zbierz wszystkie poduszki z sacharozą i przechowuj je na lodzie.
    10. Przygotuj gradient sacharozy od 40% do 70% w cienkościennej probówce polipropylenowej o pojemności 38,5 ml, delikatnie dodając 3 ml 70% sacharozy (w 4 °C), następnie 3 ml 50%, a na koniec 3 ml 40% sacharozy. Załaduj interfejsy w puli na gradient sacharozy od 40% do 70%; Rób to powoli, ponieważ zimna sacharoza jest bardzo lepka. Zrównoważyć probówki z buforem 10 mM K-PIPES (pH 7,2) i odwirować je przy 68,320 x g (np. za pomocą rotora SW32Ti) przez 1 godzinę i 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Zebrać 12 frakcji po 500 μl w temperaturze 4 °C, wykonując otwór w dnie probówki za pomocą igły 0,8 mm, nie naruszając różnych warstw sacharozy. Za pomocą przeciętej końcówki pipety P200 przygotuj dodatkowe 10 μl podwielokrotności z każdej frakcji, które zostaną użyte do następnej immunofluorescencji. Błyskawiczne zamrożenie frakcji w ciekłym azocie.
      UWAGA: Izolowane centriole mogą być analizowane za pomocą mikroskopii elektronowej, aby zapewnić zachowanie ogólnej ultrastruktury centrioli.

3. Kwantyfikacja izolowanych wirwioli na szkiełkach nakrywkowych: wirowanie i immunofluorescencja

UWAGA: Zobacz Rysunek 2.

  1. Przygotowanie tubek i szkiełek nakrywkowych
    1. Użyj 1 szklanej probówki okrągłodennej (15 ml) na frakcję, aby przeanalizować frakcje dośrodkowe (w sumie 12 probówek).
    2. Umieść niestandardowy adapter podtrzymujący szkiełko nakrywkowe (zwany dalej adapterem) do rurki z okrągłym dnem. Umieścić sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm w probówce z okrągłym dnem.
      UWAGA: Tutaj użyliśmy szkiełek nakrywkowych 12 mm, ale protokół można dostosować do szkiełek nakrywkowych 18 mm za pomocą probówek okrągłodennych o pojemności 30 ml.
    3. Dodać 5 ml wstępnie schłodzonych rur 10 mM K-PIPES (pH 7,2) w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie unosi się na wodzie i pozostaje na adapterze. Umieść probówki na lodzie.
  2. Odwirowanie wirówek
    1. Rozcieńczyć każde 10 μl frakcji w 100 μl zimnych 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Ponownie zawiesić rozcieńczenie aż do całkowitego zniknięcia sacharozy (Rysunek 2A). Załaduj każdą rozcieńczoną frakcję do probówki z okrągłym dnem.
    2. Obracać rurkę o wymiarach 10 000 x g przez 10 minut (np. za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego JS-13.1) w temperaturze 4 °C.
    3. Odzyskaj szkiełko nakrywkowe, wkładając ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie je podnieś.
      UWAGA: Ręcznie robione urządzenie z haczykiem można wykonać za pomocą igły strzykawkowej ręcznie zaczepionej i uformowanej na domowym patyczku (rysunki 2B-2D).
    4. Po dotarciu do górnej części rurki z okrągłym dnem przytrzymaj krawędź adaptera palcem w rękawiczce i usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą. Należy pamiętać, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Przystąp do leczenia szkiełek nakrywkowych pod kątem immunofluorescencji.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie izolowanych centrioles C. reinhardtii
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2.
    1. Przygotuj materiał do barwienia immunofluorescencyjnego w następujący sposób.
      1. Przygotuj stojak do barwienia szkła nakrywkowego w krystalicznej skrzynce laboratoryjnej z polistyrenu transmisyjnego (60 mm długości, 50 mm szerokości i 43 mm wysokości). Napełnij go 100% metanolem i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      2. Przygotuj wilgotną komorę. W tym celu zmontuj wilgotną komorę, umieszczając nawilżoną wodą chusteczkę wzdłuż wewnętrznych krawędzi kwadratowej szalki Petriego (Rysunek 2E). Dodać kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej (patrz tabela materiałów) do środka szalki Petriego, na której zostaną umieszczone mieszaniny przeciwciał podczas procedury immunofluorescencji (kroki 3.3.2–3.3.3). Przykryj pokrywę i wilgotną komorę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
    2. Wyizolowane centriole należy wybarwić immunologicznie w następujący sposób.
      1. Utrwalić szkiełka nakrywkowe za pomocą centrioli bezpośrednio po odwirowaniu (etap 3.2.4), inkubując je przez 5 minut w pojemniku wypełnionym metanolem o temperaturze -20 °C (etap 3.3.1.1).
      2. Usuń szkiełka nakrywkowe pęsetą i umieść je w przezroczystym pudełku laboratoryjnym (patrz Tabela materiałów) wypełnionym 50 ml 1x PBS i myj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Odpipetować 60 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych [przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i 0,05% Tween-20 w PBS] na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej w wilgotnej komorze. Ostrożnie ułożyć szkiełka nakrywkowe na wierzchu mieszaniny przeciwciał z centriolami skierowanymi bezpośrednio w kroplę. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
        UWAGA: Pierwszorzędowymi przeciwciałami, które użyto do wygenerowania reprezentatywnych wyników, są królicza poliklonalna Bld12 (1:300) i mysia α-tubulina (DM1A) (1:300).
      4. Usuń szkiełka nakrywkowe i myj je przez 5 minut w 1x PBS, jak opisano w kroku 3.3.2.2. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS zawierającymi 1% BSA i 0,05% Tween-20,
        UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe, które użyto do wygenerowania reprezentatywnych wyników, to kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa 488 (1:1,000) i kozie anty-króliki sprzężone z Alexa 568 (1:1,000).
      5. Usuń szkiełka nakrywkowe i myj je przez 5 minut w 1x PBS, jak opisano w kroku 3.3.2.2.
    3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym, dodając 3 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i ostrożnie umieszczając szkiełka nakrywkowe na wierzchu (centriole skierowane w stronę medium montażowego). Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
    4. Zobrazuj izolowane centriole pod mikroskopem konfokalnym przy obiektywie olejowym 63X z NAW 1,4 podczas stosowania dekonwolucji27 (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano następujące ustawienia: 500–545 nm dla Alexa 488 i 580–635 nm dla Alexa 568.

4. Koncentracja Centrioles na środku szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Zobacz Rysunek 3.

  1. Przygotowanie materiału
    1. Przygotuj 15 ml szklaną probówkę z okrągłym dnem na lodzie, niestandardowy adapter podtrzymujący szkiełko nakrywkowe (zwany dalej adapterem, plik .stl dostarczony jako plik uzupełniający 1), niestandardowy koncentrator (plik .stl dostarczony jako plik uzupełniający 2) i 10 mM K-PIPES (pH 7,2) w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL). Rozcieńczyć 10 razy roztwór podstawowy PDL o stężeniu 1 mg/ml w roztworze podstawowymH2O. Najpierw umyj szkiełka nakrywkowe 70% EtOH, usuń etanol i pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia. Pokryj szkiełka nakrywkowe PDL i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe 3x wodą i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Pokryj szkiełka nakrywkowe PDL, aby zwiększyć liczbę izolowanych centrioli przymocowanych do szkiełek nakrywkowych.
  2. Wirowania
    1. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na wgłębionym, dolnym końcu koncentratora, trzymając powłokę PDL stroną do dołu. Zakryj szkiełko nakrywkowe, umieszczając adapter bezpośrednio na górze. Odwróć rurkę z okrągłym dnem i umieść ją na koncentratorze, szkiełku nakrywkowym i adapterze.
    2. Delikatnie popchnij zestaw pęsetą, aż dotrze do dna rurki z okrągłym dnem i odwróć rurkę. Dodać bufor 10 mM K-PIPES (PH 7,2) do probówki okrągłodennej, aż dojdzie do górnej części koncentratora. Upewnij się, że w centralnym cylindrze koncentratora nie pozostały żadne pęcherzyki.
    3. Delikatnie dodać 100 μl 10 mM K-PIPES buforu (pH 7,2) do jednej porcji zawierającej wzbogaconą frakcję centrioli i dokładnie wymieszać objętość.
    4. Usunąć 100 μl buforu 10 mM K-PIPES (PH 7,2) z pustego środka koncentratora i dodać 100 μL wzbogaconej frakcji dośrodkowej w buforze 10 mM K-PIPES (PH 7,2) do pustego środka koncentratora, uważając, aby zawartość pozostała w pustym środku.
    5. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut (np. z wahliwym wirnikiem kubełkowym JS-13.1) we wstępnie schłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C.
    6. Wyjmij koncentrator za pomocą pęsety.
    7. Odzyskaj szkiełko nakrywkowe, wkładając ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie je podnieś. Po dotarciu do górnej części rurki z okrągłym dnem przytrzymaj krawędź adaptera palcem w rękawiczce i usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą. Należy pamiętać, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Przystąp do leczenia szkiełek nakrywkowych pod kątem immunofluorescencji.
      UWAGA: Ręcznie robione urządzenie z haczykiem można wykonać za pomocą igły strzykawkowej ręcznie zaczepionej i uformowanej na domowym patyczku (rysunki 2B-D).
    8. Wykonać utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne skoncentrowanych centrioli, jak wykonano w kroku 3.3.2–3.3.4.

5. Uśrednianie pojedynczych cząstek

UWAGA: Zobacz Rysunek 4.

  1. Obrazowanie do uśredniania pojedynczych cząstek
    1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą zwykłego środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Obrazowanie w mikroskopii oświetlenia strukturalnego (2D SIM) można wykonać za pomocą obiektywu CFI Apochromat TIRF (100X, NA 1,49, WD 0,12 mm) i kamery EM CCD w świetle tylnym.
      UWAGA: Czas akwizycji został ustawiony na 100 ms przy odczycie z kamery z częstotliwością 3 MHz. Do obrazowania SIM użyto obiektywu 2,5x.
      UWAGA: Prezentowany tutaj zestaw danych został uzyskany za pomocą mikroskopu 3-D SIM (patrz Spis materiałów).
    2. Zobrazuj centriole, uzyskując duży stos obrazów składających się na całkowity sygnał centrioli, ustawiając górną i dolną pozycję stosu Z odpowiednio powyżej i poniżej sygnału centrioli. Przystąp do rzutowania stosu i wykonaj uśrednianie pojedynczych cząstek zgodnie z krokami 5.2 i 5.3.
  2. Projekcja stosu
    1. Otwórz stos obrazów za pomocą ImageJ. Następnie kliknij "Stosy obrazów → → Z Project". Ustaw typ projekcji na "Maksymalna intensywność".
    2. Odwróć obraz, klikając "Edytuj → odwróć". Zapisz wygenerowaną projekcję (.tif format).
  3. Wyrównanie pojedynczych cząstek ze Scipion
    1. Utwórz nowy projekt w Scipion, naciskając czerwony przycisk "Utwórz projekt" u góry strony. W lewym panelu kliknij dwukrotnie "Importuje → Importuj mikrofotografie".
    2. Wypełnij pola "Katalog plików" i "Wzorzec" zgodnie z katalogiem danych i nazwami. Zachowaj parametry domyślne. Kliknij "Wykonaj".
    3. Kliknij dwukrotnie "Pobieranie cząstek → → xmipp3 - pobieranie ręczne (krok 1)". Kliknij ikonę lupy znajdującą się obok pola "Wprowadź mikrofotografie" i wybierz zaimportowane mikrofotografie z kroku 5.3.1. Kliknij "Wykonaj".
    4. W nowo otwartym oknie wybierz cząstki z różnych mikrofotografii, klikając na nie. Po zakończeniu każdego mikrorysunku kliknij na czerwony przycisk "+ Współrzędne".
    5. Kliknij dwukrotnie "Cząstki → Extract → xmipp3 - extract particles". Kliknij ikonę lupy obok pola "Wprowadź współrzędne" i wybierz współrzędne wybrane z kroku 5.3.4. Wypełnij "Rozmiar pudełka na cząstki (px)" zgodnie z wymiarami cząstek. W zakładce "Preprocess" ustaw Dust Removal: Nie (może generować artefakty); Odwróć kontrast: Nie (czarne cząstki, białe tło); Odwrócenie fazy: Nie (połączone z korekcją CTF); Normalizacja: Tak.
    6. Następnie kliknij "Wykonaj". Po zakończeniu zadania sprawdź wyekstrahowane cząstki, zaznaczając pole zadania (obramowania stają się grubsze) i kliknij "Analizuj wyniki" (w lewym dolnym rogu menu głównego).
    7. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → xmipp3 - align with cl2d". Kliknij ikonę lupy znajdującą się w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyodrębnione cząstki z kroku 5.3.5. Nie używaj obrazu referencyjnego. Kliknij "Wykonaj".
    8. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → more → xmipp3 - apply alignment 2d". Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.7.
    9. Kliknij "Wykonaj", jak w kroku 5.3.6. Wyniki można sprawdzić, klikając przycisk "Analizuj wyniki" po wybraniu pola pracy.
    10. Kliknij dwukrotnie "Cząsteczki → maskę → xmipp3 - zastosuj maskę 2d".
    11. Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.9. 'Źródło maski' jest ustawione na 'Geometria'. Następnie ustaw parametry maski jako Typ maski: Okrągła; Promień (px): szukając jednej cząstki (centrioli) bez niczego wokół niej, kliknij ikonę "magicznej różdżki" po lewej stronie, która otwiera okno, które pomoże znaleźć idealną wartość; Przesunięcie środka: Nie (jeśli cząstka jest idealnie wyśrodkowana) lub Tak (jeśli cząstka jest przesunięta); Przesunięcie środka X: zgodnie z położeniem cząstek; Przesunięcie środka Y: zgodnie z położeniem cząstek. Kliknij "Wykonaj".
    12. Użyj przycisku "Analizuj wyniki", aby sprawdzić, czy maska została prawidłowo zastosowana. Jeśli nie, kliknij prawym przyciskiem myszy zadanie "Zastosuj maskę 2d" i wybierz "Edytuj". Zmodyfikuj parametry maski (rozmiar i/lub przesunięcia) i uruchom ją ponownie za pomocą przycisku 'Wykonaj'.
    13. Kliknij dwukrotnie "2D → Classify → xmipp3 - cl2d".
    14. Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz zamaskowane cząstki z kroku 5.3.11. Liczba klas powinna wynosić około 50 cząstek w klasie. Kliknij "Wykonaj".
    15. Sprawdź wyniki, klikając przycisk "Analizuj wyniki". W otwartym oknie kliknij ikonę "oka" tuż obok "Co pokazać".
    16. Nowe okno umożliwia inspekcję wygenerowanych klas poprzez wybranie opcji "Classes2D" w menu "Blok". Sprawdź zawartość każdej klasy, wybierając "Class00N_Particles" w tym samym menu. Sprawdź każdą klasę, aby określić, które z nich zawierają tylko złe cząstki. Wróć do widoku 'Classes2D' i wybierz klasy z dobrymi cząstkami, klikając na każdą z nich. Możliwe jest wybranie kilku klas poprzez przytrzymanie "Ctrl" wciśniętego podczas wyboru.
    17. Po wybraniu wszystkich klas z dobrymi cząstkami, kliknij na "+ Cząstki", aby utworzyć podzbiór z tymi cząstkami.
    18. W tym samym oknie wybierz kilka zestawów klas, które reprezentują różne orientacje cząstek. Utwórz nowy podzbiór, klikając "+ Średnie".
    19. Dla każdej wybranej orientacji/średniej wykonaj następujące czynności.
      1. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → xmipp3 - align with cl2d".
      2. Kliknij ikonę lupy znajdującą się w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz dobre cząstki z kroku 5.3.17. Ustaw opcję "Użyj obrazu referencyjnego" na "Tak". Kliknij ikonę lupy obok pola "Obraz referencyjny" i kliknij białą strzałkę w lewo do zadania "Utwórz podzbiór" z kroku 5.3.18 i wybierz obraz, aby użyć go jako odniesienia. Kliknij dwukrotnie na obiekt, aby otworzyć go w osobnym oknie i sprawdzić, który to obiekt. Kliknij "Wykonaj".
      3. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → more → xmipp3 - apply alignment 2d". Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.19.2.
      4. Kliknij "Wykonaj".
      5. Sprawdź wynik wyrównania ("Analizuj wyniki"); pokaże on wyrównane cząstki i średnią tych cząstek.
      6. Jeśli średnia jest dobra, a wszystkie cząstki są zorientowane w ten sam sposób, zapisz średnią, klikając "Zaawansowane → ImageJ" i zapisz obraz za pomocą ImageJ.
      7. Jeśli średnią można poprawić, zaznacz wszystkie dobrze zorientowane obrazy i utwórz nowy podzbiór za pomocą przycisku "+ Cząstki". Powtarzaj kroki 5.3.19.1–5.3.19.4, aż podzbiór zostanie oczyszczony (wszystkie szkodliwe cząstki zostaną usunięte). Za każdym razem, gdy wykonywane jest wyrównanie (krok 5.3.19.2), odniesienie jest ustawiane na ostatnią wygenerowaną średnią (z iteracji na iterację średnia jakość wzrasta).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. reinhardtii Izolacja centriolowa:
Aby wyizolować centriole, komórki cw15-C. reinhardtii hodowano w płynnej kulturze przez kilka dni pod światłem, a następnie granulowano przez odwirowanie przy 600 x g przez 10 minut. Granulowane komórki przemyto 1x PBS i ponownie zawieszono w buforze deflagellacyjnym przed deflagellacją, wykonując szok pH przy użyciu 0,5 M kwasu octowego do końcowego pH 4,5-4,7 przez 2 minuty (Rysunek 1A). Dodatek 1 N KOH zastosowano w celu przywrócenia pH do 7,0. Aby oddzielić oderwane wici od ciał komórkowych, zdeflagellowane komórki zostały najpierw odwirowane w celu usunięcia większości wici. Granulat został następnie przemyty 2x PBS i ponownie zawieszony w 30 ml PBS przed powolnym załadowaniem go na 25% poduszkę sacharozową (Rysunek 1B). Probówkę wirowano w temperaturze 600 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia większości oderwanej wici. Po odwirowaniu ciała komórkowe rozprowadzono w poduszce sacharozowej (Rysunek 1C) i odzyskano przez usunięcie około 30 ml supernatantu (aż do czerwonej strzałki w Rysunek 1C). Otrzymane 20 ml przemytych komórek następnie zawieszono ponownie w 20 ml zimnego PBS i odwirowano przy 600 x g przez 10 minut. Następnie supernatant został odrzucony, a komórki zostały całkowicie ponownie zawieszone w 10 ml PBS. Komórki przeniesiono do butelki o pojemności 250 ml, a bufor do lizy dodano do zawieszonych komórek jednocześnie. Do lizy dodano DNazę i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po etapie wirowania w celu usunięcia resztek komórek (patrz biały granulat w Rysunek 1D), supernatant został zebrany i ostrożnie załadowany na 2 ml 60% sacharozy poduszki przed odwirowaniem w 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Należy zauważyć, że na 100 ml lizy użyto 8 probówek po 15 ml do wykonania tego etapu, odpowiada 12,5 ml buforu do lizy załadowanego na 2 ml sacharozy na probówkę. Po odwirowaniu większość supernatantu usunięto do 1 ml powyżej poduszki. 1 ml pozostałego supernatantu zebrano następnie z poduszką o pojemności 2 ml, a następnie zmieszano i połączono, aby uzyskać końcową objętość 24 ml. Basen został następnie załadowany na gradient sacharozy 40%, 50%, 70% i wirowany z prędkością 68 320 x g przez 1 godzinę i 15 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec izolowane centriole zebrano poprzez wykonanie otworu w dolnej części probówki wirówkowej za pomocą igły, a krople zebrano we frakcjach 12 x 500 μL. Ze względu na dużą gęstość różnych sacharoz, kropla tworzyła się na początku bardzo powoli (70% sacharozy), a następnie szybciej (40% sacharozy).

Immunofluorescencja izolowanych centrioli
Aby ocenić jakość procedury izolacji, 10 μl każdej zebranej frakcji gradientowej odwirowano następnie na szkiełku nakrywkowym za pomocą adaptera do wspornika szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2A-2D). Co ważne, aby bezpiecznie usunąć szkiełko nakrywkowe, zaprojektowano niestandardowe urządzenie haczykowe (Rysunek 2B). Następnie szkiełka nakrywkowe analizowano metodą immunofluorescencji. W tym badaniu zastosowano przeciwciała przeciwko CrSAS-6 (Bld12p), aby wskazać na obecność struktury koła wozu i α-tubuliny (DMA1) w celu podkreślenia ściany środkowej. Licząc liczbę centrioli, które były dodatnie zarówno dla CrSAS-6, jak i α-tubuliny na pole widzenia, a następnie obliczając całkowitą liczbę centrioli na frakcje, można było określić, które frakcje zostały wzbogacone dla izolowanych centrioli (Rysunek 2F-2H). Co ciekawe, 6 frakcji zostało wzbogaconych dla centrioli (Rysunek 2F i 2G, frakcje #1–6), z pikiem dla frakcji #3, podczas gdy ostatnie frakcje nie były, co wskazuje, że oczyszczanie zadziałało. Należy zauważyć, że w tym konkretnym eksperymencie 95% wszystkich centrioli było dodatnich dla CrSAS-6 i α-tubuliny we frakcji #3. Wskazuje to, że większość izolowanych centrioli zachowała swoje koła wozu. Jeżeli w pierwszych frakcjach nie zaobserwuje się wzbogacenia centrioli, oznacza to, że procedura izolacji nie zadziałała i należy ją powtórzyć. Należy zauważyć, że niektóre fragmenty wiciowców można zaobserwować głównie we frakcjach pozbawionych centrioli.

Następnie, aby obliczyć całkowitą liczbę centrioli na μL, liczbę centrioli na pole widzenia należy pomnożyć przez stosunek przedstawiony w Rysunek 2H. Otrzymaną liczbę należy następnie podzielić przez objętość frakcji użytej do immunofluorescencji, aby uzyskać liczbę centrioli na μl. W tej konkretnej procedurze izolacji najbardziej wzbogacona frakcja zawierała około 37 centrioli na powierzchni 0,00846mm2 (o polu widzenia 92 x 92μm2). Powierzchnia przekroju rury miała promień 7,5 mm przy powierzchni całkowitej 176mm2. Analogiczny stosunek wynosił wówczas 176/0,00846 = 20 803,8, a więc w sumie 769 740 centrioli (37x20 803,8) w 10 μl. W związku z tym liczba centrioli w 1 μl wynosiła 76 974.

Koncentracja izolowanych centrioli na szkiełkach nakrywkowych:
Zwiększenie liczby centrioli na pole zwiększa szansę na wykrycie jednoznacznej orientacji centrioli, a także zwiększa szansę na wykrycie podobnych orientacji, które można wykorzystać do dalszych procedur uśredniania cząstek. Ponieważ centriole z zagęszczonych frakcji są nadal rzadkie na szkiełku nakrywkowym, opracowaliśmy akcesorium do wirowania do zagęszczania wirówek w środku szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3A) o nazwie koncentrator. Należy pamiętać, że do tego rękopisu dołączony jest plik .stl z dokładnymi miarami do druku 3D.

Najpierw, na koncentratorze zamontowano jedno szkiełko nakrywkowe o grubości 12 mm (Rysunek 3B). Adapter umieszczono na szkiełku nakrywkowym, a rurkę z okrągłym dnem odwrócono i umieszczono nad zmontowanym adapterem i koncentratorem. Rurka z okrągłym dnem została następnie delikatnie odwrócona, co umożliwiło załadowanie próbki (krok 4.2 protokołu). Centriole były następnie odwirowywane przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie centriole poddano immunofluorescencji i wybarwiono na obecność CrSAS-6/Bld12p i α-tubuliny (Rysunek 3C-3E). Co ważne, bez koncentratora zaobserwowano około 30 centrioli na pole widzenia (Rysunek 3C), podczas gdy 183 centriole były widoczne na pole widzenia, gdy koncentrator był używany (Rysunek 3D-3F). Należy zauważyć, że centriole pokrywały tylko krążek o średnicy 4 mm w środku szkiełka nakrywkowego. Wynik ten pokazuje, że etap koncentracji działa i pozwala na 6-krotne wzbogacenie centrioli w określonym obszarze szkiełek nakrywkowych, ułatwiając w ten sposób ich wykrywanie i obrazowanie.

Fluorescencyjne uśrednianie pojedynczych cząstek izolowanych centrioli C. reinhardtii:
Tutaj, przy użyciu mikroskopii SIM, która może osiągnąć rozdzielczość około 120 nm, zobrazowano centriole wybarwione na obecność tubuliny monoglutamylowanej (GT335, Ryc. 4), modyfikacji tubuliny obecnej w mikrotubulach centriolarnych, zobrazowano 24. Centriole C. reinhardtii mają około 500 nm długości, zawsze w parach i często znajdują się z powiązanymi, nowo zduplikowanymi ciałami podstawnymi (zwanymi dalej procentriolami) i prążkowanymi włóknami związanymi z mikrotubulami19. W związku z tym ten końcowy montaż miał rozmiar około 1 μm. Z tego powodu, a także w celu zobrazowania centrioli w całości, zalecamy nabycie stosu Z na izolowanych centriolach.

Tutaj, po przejęciu, ostateczny obraz został wygenerowany poprzez wykonanie projekcji maksymalnej intensywności za pomocą ImageJ28 (image/Stacks/Z project/max intensity projection, Rysunek 4B). Na podstawie takich obrazów przeprowadzono analizę pojedynczych cząstek za pomocą oprogramowania do mikroskopii krioelektronowej, aby stworzyć klasy centrioli o podobnych orientacjach, a następnie przeprowadzono uśrednianie. Aby to zrobić, najpierw odwrócono kolor obrazu, aby lepiej zobrazować obiekty (Rysunek 4C). Centriole zostały pobrane ręcznie w pudełku wyśrodkowanym nad każdą cząstką za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania Scipion29, które integruje kilka programów do mikroskopii elektronowej, takich jak Xmipp3 (Rysunek 4D). Należy pamiętać, że rozmiar pola musi być zdefiniowany przez użytkownika. Tutaj zastosowano pudełka o wymiarach 50 x 50 pikseli dla rozmiaru piksela 31,84 nm. Następnie wszystkie cząstki zostały wyekstrahowane (Rysunek 4E) i wyrównane za pomocą Xmipp3 (Rysunek 4F). Następnie zastosowano okrągłą maskę o promieniu 12 pikseli, aby odizolować każdą centriolę od pary dośrodkowej (Rysunek 4G). Cząstki zostały następnie sklasyfikowane za pomocą Xmipp3 w celu wygenerowania kilku średnich. Zachowano tylko jednorodne średnie klasowe, co oznacza, że cząstki, które odbiegają od średnich klasowych, zostały ręcznie wykluczone. Ten krok został powtórzony w celu wygenerowania niemal idealnej średniej dla każdej wybranej orientacji. Po pięciu iteracjach wygenerowano dwie klasy średnich: widok z góry z 63 obiektów (Rysunek 4H) oraz widok z boku z 98 cząstek (Rysunek 4I) monoglutamylowanych centrioli. Wymiary obiektu wyznaczono poprzez pomiar odległości między pikami profilu wykresu intensywności wzdłuż sygnału monoglutamylacji.

Co ważne, średnia długość klasy widoku z boku wynosi 260 nm przy średnicy 250 nm, co jest porównywalne do zmierzonego sygnału monoglutamylowanej tubuliny, który okazał się zlokalizowany w obszarze o długości 286 ± 33 nm w obrębie rdzenia centriole17.

figure-results-1
Rysunek 1: Oczyszczanie centrioli C. reinhardtii.(A) Jest to schematyczne przedstawienie każdego etapu prowadzącego do wyizolowania centrioli C. reinhardtii. Obejmuje on reprezentatywne etapy protokołu (B) przed i (C) po odwirowaniu na 25% gradiencie sacharozy. Czerwona strzałka w panelu C wskazuje minimalną objętość, jaką należy zachować po odwirowaniu. (D) Ten panel pokazuje białe osady zlizowanych komórek po odwirowaniu. strzałka wskazuje kulkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja wirowania do przeprowadzania immunofluorescencji na izolowanych centriolach. (A) 10 μL każdej zebranej frakcji rozcieńcza się najpierw w 100 μL 10mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Jest to schematyczne przedstawienie urządzeń wirujących, obejmujące probówkę okrągłodenną o pojemności 15 ml, szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm, adapter do szkiełka nakrywkowego oraz wykonane na zamówienie urządzenie haczykowe do odzyskiwania szkiełka nakrywkowego po odwirowaniu. Na tablicach C i D przedstawiono rysunki wyjaśniające, w jaki sposób odzyskać szkiełko nakrywkowe po odwirowaniu. (C) Umieść zaczepione narzędzie w otworze znajdującym się w szczelinowej krawędzi adaptera i (D) delikatnie pociągnij. (E) Są to zdjęcia wilgotnej komory potrzebnej do wykonania obrazowania immunofluorescencyjnego. Strzałka wskazuje szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm. (F) Są to reprezentatywne obrazy konfokalne z 63X (zoom 2) frakcji gradientu #1-8, zebrane podczas procedury oczyszczania i wybarwione na CrSAS-6 (czerwony) i α-tubulinę (zielony). Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu przez białą ramkę w widokach dolnego powiększenia. Podziałka liniowa = 10 μm. (G) Jest to wykres przedstawiający liczbę centrioli dodatnich zarówno dla CrSAS-6, jak i α-tubuliny na pole widzenia w każdej frakcji. Zwróć uwagę na wzbogacenie w ułamki #1-6. Średnia liczba centrioli na polu w każdej frakcji: #1 = 16,3 ± 4,7, #2 = 24,0 ± 4,6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14,3 ± 2,1, #6 = 13,7 ± 9,3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = 0,0 ± 0,0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0,0 ± 0,0. Dla każdej frakcji zobrazowano 3 losowe pola. Zauważ, że licząc najbardziej wzbogaconą frakcję #3, stwierdziliśmy, że 95% centrioli jest dodatnich dla CrSAS-6 i α-tubuliny (n = 205 centrioli). (H) Stosunek liczby centrioli obecnych w zmierzonej powierzchni mikrofotografii służy do obliczenia całkowitej liczby centrioli obecnych w obszarze probówki. Liczbę centrioli na μl można obliczyć na podstawie 10 μl pierwotnie odwirowanych frakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Izolowane wirówki są odwirowywane za pomocą koncentratorów. (A) Ten panel pokazuje urządzenia do wirowania potrzebne do zagęszczenia wirówek na szkiełkach nakrywkowych przed immunofluorescencją, w tym probówkę okrągłodenną o pojemności 15 ml, koncentrator, szkiełko nakrywkowe 12 mm i adapter podtrzymujący. (B) Ten panel pokazuje kroki montażu urządzenia wirówkowego. Panele C-E pokazują obrazy konfokalne centrioli wybarwionych na obecność CrSAS-6 (czerwony) i α-tubuliny (zielony) (C) bez lub (D-E) z koncentratorem. Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu przez białą ramkę w widokach dolnego powiększenia. Podziałka wynosi 10 μm. Należy zauważyć, że centriole są wzbogacone w środku szkiełka nakrywkowego (przerywana linia reprezentuje granicę zagęszczonego obszaru). (F) Wykres ten przedstawia liczbę centrioli na pole widzenia bez koncentratora i z koncentratorem. Przeanalizowano pięć losowych pól widzenia. Średnia liczba centrioli wynosi bez koncentratora 29,8 ± 2,9, a z koncentratorem 182,6 ± 11,5, P <0,0001. Istotność statystyczną oceniano za pomocą niesparowanego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Uśrednianie pojedynczych cząstek na izolowanych centrioles C. reinhardtii.(A) Ten panel pokazuje obrazy stosu Z centrioli barwionych GT335 i uzyskanych za pomocą mikroskopu SIM. (B) Panele te pokazują maksymalną intensywność projekcji Z ułożonych obrazów. Podziałka liniowa = 1 μm. (C) Te panele pokazują reprezentatywny obraz z odwróconym kontrastem. Wstawka reprezentuje powiększenie, aby lepiej uwidocznić centriole. (D) Panele te pokazują wybieranie cząstek. Wstawka wskazuje, w jaki sposób cząstki zostały pobrane. (E) Są to przykłady 5 wyekstrahowanych cząstek. (F) Ten panel pokazuje cząstki po wyrównaniu. (G) Ten panel pokazuje cząsteczki po nałożeniu maski. Panele H i I pokazują dwie średnie klasowe: (H) widok z góry (63 cząstki) i (I) widok z boku (98 cząstek). Podwójne strzałki wskazują wymiary sygnału GT335. Podziałka = 250 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z wyzwań w biologii jest rozszyfrowanie dokładnej lokalizacji białek w kontekście architektonicznym. Centriole są idealną strukturą do zastosowania tych metod, ponieważ ich architektura została zbadana za pomocą tomografii krioelektronowej, ujawniając interesujące cechy ultrastrukturalne na całej jej długości. Jednak ze względu na jego wymiary bliskie granicy rozdzielczości w mikroskopii optycznej, trudno jest precyzyjnie zlokalizować białko za pomocą immunofluorescencji w strukturalnym podregionie centrioli przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów30.

Rozdzielczość w mikroskopii optycznej jest ograniczona przez dyfrakcję światła, która daje w przybliżeniu maksymalną rozdzielczość boczną 200 nm w mikroskopii optycznej24. Ograniczenie to zostało jednak ominięte przez jeden z największych przełomów ostatnich 20 lat w mikroskopii optycznej: wynalezienie metod superrozdzielczych. Podejścia te mogą obrazować poza granicami dyfrakcji w różnych rozdzielczościach: 120 nm dla SIM, około 50 nm dla wymuszonego zubożenia emisji (STED) i 20–40 nm dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)24. Dzięki tym nowym osiągnięciom mikroskopii superrozdzielczej możliwe jest uzyskanie strukturalnych podregionów centrioli. Jednak w praktyce nadal trudno jest dokładnie określić lokalizację białka w elemencie strukturalnym z głównego powodu, że dojrzałe centriole występują tylko w 2 kopiach na komórkę i mają losowe orientacje, co utrudnia interpretację lokalizacji. Z tego powodu stworzono protokół, który umożliwia naukowcom obrazowanie w superrozdzielczości dużej liczby centrioli, zwiększając szansę na zaobserwowanie jednoznacznych orientacji. Co ważne, ponieważ metoda ta opiera się na użyciu izolowanych centrioli, zapewniamy metodę oczyszczania nienaruszonych centrioli C. reinhardtii , które zawierają dojrzałe centriole i procentriole.

Wreszcie, ze względu na szereg orientacji centrioli, które można obrazować za pomocą tego protokołu, analiza pojedynczych cząstek może być stosowana za pomocą oprogramowania do mikroskopii elektronowej. Powoduje to generowanie średnich klas centrioli w określonej orientacji. Co ważne, uzyskane obrazy 2D można następnie wykorzystać do oceny lokalizacji określonego białka wzdłuż centrioli. Rzeczywiście, metodę tę można zastosować do dwukolorowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, a jeden kolor może być użyty do odsłonięcia szkieletu centrioli (np. tubuliny), podczas gdy drugi kolor można przypisać określonemu białku dośrodkowej. Odejmując uzyskane średnie za pomocą jednego lub dwóch kolorów, łatwiej jest zarejestrować białko wzdłuż centrioli (proksymalnie, centralnie lub dystalnie). Należy pamiętać, że oba kanały powinny być dokładnie wyrównane, aby zapobiec wprowadzającym w błąd interpretacjom. Co więcej, średnie widoków z góry pomogą rozszyfrować, czy białko lokalizuje się wewnątrz światła centriorów, wzdłuż ściany mikrotubul, czy na zewnątrz centrioli.

Zaletą tej metody jest ustalenie lokalizacji określonych białek, które w inny sposób mogłyby być trudne do zlokalizowania ze względu na heterogeniczne znakowanie. Należy zauważyć, że inne metody mapowania białek w centriolach zostały opisane w korelacyjnym 3-D SIM/SMLM, na przykład z oceną specyficznej orientacji centrioli poprzez określenie eliptycznego profilu markera tworzącego torus wokół centrioli za pomocą obrazowania SIM. Za pomocą tego parametru możliwa jest lokalizacja białka z dokładnością do 4–5 nm30. Należy również zauważyć, że opisana tutaj metoda wykorzystuje izolowane centriole z nienaruszonymi procentriolami, co oznacza, że architektura centrioli jest najprawdopodobniej w dużej mierze zachowana. Nie możemy jednak wykluczyć, że niektóre cechy architektoniczne są zaburzone podczas oczyszczania, takie jak średnica centrioli zmieniająca się wraz ze stężeniem kationów dwuwartościowych, wzmocniona izolacją ludzkiego centrosomu5.

Jednym z kluczowych etapów przedstawionego tutaj protokołu jest uzyskanie wystarczająco skoncentrowanych izolowanych centrioli w różnych orientacjach podatnych na Fluo-SPA. W tym celu należy najpierw upewnić się, że procedura izolacji centrioli jest czysta i skuteczna. Niskie stężenie izolowanych centrioli uniemożliwi prawidłowe obrazowanie i dalszą obróbkę obrazu. W tym celu udostępniamy metodę wzbogacania liczby centrioli na pole widzenia. W zależności od liczby centrioli w użytej frakcji, objętość załadowaną do koncentratora powinna być dostosowana, przy maksymalnej objętości 250 μL.

Co ważne, metoda ta została opracowana dla ściany komórkowej minus komórki cw15-C. reinhardtii . W tym szczepie kruchość ściany komórkowej pozwala na prawidłową lizę komórek, a tym samym uwolnienie jej zawartości. Protokół ten nie jest skuteczny w przypadku komórek C. reinhardtii typu dzikiego, ponieważ ściana komórkowa uniemożliwia prawidłową lizę. Alternatywne strategie, takie jak sonikacja lub wstępna inkubacja komórek z autolizyną, enzymem, który może degradować ścianę komórkową31, musiałyby zostać wprowadzone w celu zmiany ściany komórkowej przed zastosowaniem przedstawionego tutaj protokołu izolacji.

Ta konfiguracja może być używana z różnymi typami mikroskopów, począwszy od konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych, a skończywszy na dedykowanych mikroskopach o wysokiej rozdzielczości. Należy pamiętać, że podczas wykonywania SMLM do prawidłowego obrazowania wymagany jest specjalny bufor, a zatem należy użyć komory przystosowanej do szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm z buforem umieszczonym na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Kolejne obrazowanie zostanie wykonane za pomocą mikroskopów odwróconych. Jeśli konfiguracja mikroskopu nie pozwala na wykonanie szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm, przedstawiony tutaj protokół można zastosować do szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm za pomocą probówki o okrągłym dnie o pojemności 30 ml oraz zmodyfikowanego adaptera i koncentratora. Ważne jest również, aby pamiętać, że jakość końcowej rekonstrukcji w SMLM będzie zależeć od jakości barwienia i użytego pierwotnego przeciwciała, a także metody utrwalenia.

Podsumowując, dostarczamy metodę, którą można zastosować do obrazowania wielu centrioli, a następnie Fluo-SPA, która wygeneruje średnie centrioli w różnych orientacjach, pomagając w ten sposób z precyzją zlokalizować białko centrioralne. Co ważne, metoda ta może być stosowana bardziej ogólnie do izolowanych centrioli innych gatunków, do innych organelli lub do dużych zespołów makromolekularnych. Wreszcie, przedstawione tutaj podejście do przygotowania próbek, w połączeniu z niedawnym opracowaniem algorytmu do analizy pojedynczych cząstek fluorescencyjnych danych SMLM32, może przyczynić się do dalszego doskonalenia kartografii molekularnej dużych zespołów makromolekularnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Pierre'owi Gönczy i BioImaging & Optics Platform (BIOP) w École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lozanna, Szwajcaria, gdzie uzyskano obrazy SIM centrioli. Nikolai Klena i Davide Gambarotto są wspierani przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach grantu dla początkujących naukowców (StG) 715289 (ACCENT), a Maeva Le Guennec, Paul Guichard i Virginie Hamel przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers jest wspierana przez Uniwersytet Genewski.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysia monoklonalna tubulina anty-apha (klon DM1A)Abcamab7291 Rozcieńczenie 1:300
Szkiełka nakrywkowe DNaseIRoche10104159001
12 mmRothYX03.1
Szkiełka nakrywkowe 18 mmRothLH23.1
K2HPO4Fluka60355
KH2PO4Fluka60230
Tris baseBiosolve Chimie SARL0020092391BS
kwas octowyCarlo Erba Odczynniki524520
NH4ClSigmaA-4514
CaCl2SigmaC-7902
MgSO4Sigma63140-500G-F
filtr steritopMillipore
sacharozaSigmaS7903-1KG
HEPESAppliChem PanReacA3724,0250
RURYSigmaP6757-500G
MgCl2ACROS ORGANICS197530010
NP-40AppliChem PanReacA1694,0250
Probówki okrągłodenne (Kimble) 15 mlFisherscientific09-500-34
Probówki okrągłodenne (Kimble) 30 mlFisherscientific09-500-37
stojak do barwienia szkła nakrywkowegoThomas scientific8542E40
skrzynka laboratoryjna z krystalicznego polistyrenuFISHERS11712944
MetanolVWR20864.32
BSARoche
Triton X100Roth3051.3
kozioł anty-mysz sprzężony z Alexa 488 invitrogenA11029rozcieńczenie 1:1,000
kozia anty-królik sprzężona z Alexa 568invitrogenA11036rozcieńczenie 1:1,000
podłoże montażoweabcamab188804
Rurka, cienkościenna polipropylenBeckman Coulter326823
Poli-D-Lizyna 1 mg/mlSIGMA A-003-E
Mysia monoklonalna modyfikacja anty-poliglutamylacji mAb (GT335)AdipogenAG-20B-0020rozcieńczenie 1:1,000
podłoże montażowe glicerolu z DAPI i DABCOAbcamab188804
50 ml probówki stożkoweFalcon14-432-22
Eppendorf 5810R wirówkaEppendorf5811000622
Beckman JS-13.1 wahliwy wirnikkubełkowy Beckman Coulter346963
Beckman SW 32Ti rotorBeckman Coulter369694
parafilmBemis 13-374-10
Leica TCS SP8 z trybem HyvolutionLeica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX Luxe Daylight/ OSRAM
WhatmanSigma 
Rozcieńczenie przeciwciała1:300 (Hamel el al., 2014)
Kamera CCD Scipionhttp://scipion.i2pc.es/
EM (Andor iXON DU897)Andor
SCGPT05RE10735086001Bibuła filtracyjna WHA1001325 CrSAS-6/Bld12

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bornens, M. The centrosome in cells and organisms. Science. 335 (6067), 422-426 (2012).
  2. Nigg, E. A., Holland, A. J. Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).
  3. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  4. Gönczy, P. Towards a molecular architecture of centriole assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).
  5. Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).
  6. Winey, M., O'Toole, E. Centriole structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  7. Dippell, R. V. The development of basal bodies in paramecium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461(1968).
  8. Allen, R. D. The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).
  9. Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography. The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).
  10. Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography. The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).
  11. Guichard, P., et al. Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry. Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).
  12. Hirono, M. Cartwheel assembly. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  13. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).
  14. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).
  15. Kilburn, C. L., et al. New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure. The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).
  16. Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).
  17. Hamel, V., et al. Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis. Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).
  18. Cavalier-Smith, T. basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. Journal of Cell Science. 16 (3), 529(1974).
  19. Geimer, S., Melkonian, M. The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).
  20. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).
  21. Hamel, V., et al. Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326(2014).
  22. Guichard, P., et al. Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms. Nature Communications. 8, 14813(2017).
  23. Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).
  24. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  25. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).
  26. Keller, L. C., Marshall, W. F. Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles. Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).
  27. Borlinghaus, R. T., Kappel, C. HyVolution-the smart path to confocal super-resolution. Nature Methods. 13 (3), (2016).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  30. Gartenmann, L., et al. A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm. Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).
  31. Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases. European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).
  32. Salas, D., et al. Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie centrioliwirowanie w gradiencie sacharozymikroskopia konfokalnamikroskopia superrozdzielczaanaliza Fluo SPAizolacja centriolibarwienie immunofluorescencyjne

Powiązane artykuły