Artykuł metodologiczny

Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58109

⸱

21 września 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy strategię oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli w różnych orientacjach, które można poddać mikroskopii superrozdzielczej i uśrednianiu pojedynczych cząstek.

Streszczenie

Centriole to duże zespoły makromolekularne, ważne dla prawidłowego wykonywania podstawowych procesów biologicznych komórek, takich jak podział komórki, ruchliwość komórki czy sygnalizacja komórkowa. Zielone algi Chlamydomonas reinhardtii okazały się wnikliwym modelem w badaniach nad architekturą, funkcją i składem białek centrioli. Pomimo ogromnych postępów w zrozumieniu architektury centriolowej, jednym z obecnych wyzwań jest określenie dokładnej lokalizacji komponentów centriolarnych w obszarach strukturalnych centrioli, aby lepiej zrozumieć ich rolę w biogenezie centrioli. Głównym ograniczeniem jest rozdzielczość mikroskopii fluorescencyjnej, która komplikuje interpretację lokalizacji białka w tej organelli o wymiarach zbliżonych do granicy dyfrakcji. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przedstawiamy metodę oczyszczania i obrazowania dużej liczby centrioli C. reinhardtii o różnych orientacjach przy użyciu mikroskopii superrozdzielczej. Technika ta pozwala na dalsze przetwarzanie danych poprzez fluorescencyjne uśrednianie pojedynczych cząstek (Fluo-SPA) ze względu na dużą liczbę pozyskanych centrioli. Fluo-SPA generuje średnie barwionych centrioli C. reinhardtii w różnych orientacjach, ułatwiając w ten sposób lokalizację odrębnych białek w podregionach centrioralnych. Co ważne, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli innych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

Wprowadzenie

Centriole to ewolucyjnie zachowana organella, która leży w sercu centrosomu w komórkach zwierzęcych i może działać jako ciało podstawowe (zwane dalej centriolami) do szablonu rzęsek lub wici u wielu eukariontów1,2. W związku z tym centriole mają kluczowe znaczenie dla podstawowych procesów biologicznych komórek, od składania wrzeciona po sygnalizację komórkową. W związku z tym defekty w montażu lub funkcji centrioli są związane z kilkoma ludzkimi patologiami, w tym ciliopatiami i nowotworami3.

Centriole to dziewięciokrotne, symetryczne, oparte na mikrotubulach potrójne struktury cylindryczne, które zazwyczaj mają ~450 nm długości i ~250 nm szerokości4,5,6,7. Konwencjonalna mikroskopia elektronowa i krioelektronowa tomografia centrioli różnych gatunków wykazały, że centriole są spolaryzowane wzdłuż swojej długiej osi z trzema odrębnymi obszarami: obszarem proksymalnym, centralnym jądrem i obszarem dystalnym5,7,8,9,10,11. Co ważne, każdy z tych regionów wykazuje określone cechy konstrukcyjne. Po pierwsze, światło obszaru proksymalnego o długości 100 nm zawiera strukturę koła wozu połączoną z trypletem mikrotubul za pomocą elementu główki szpilki12. Po drugie, obszar centralny o długości 300–400 nm zawiera włókniste gęstości w świetle i cechy strukturalne wzdłuż wewnętrznej powierzchni mikrotubul: łącznik w kształcie litery Y, ogon kanalika C i krąg rurki A9. Wreszcie, obszar dystalny 50–100 nm wykazuje subdystalne i dystalne wyrostki, które otaczają dystalną część centriole5,13.

Ostatnie dwie dekady upłynęły pod znakiem odkrywania coraz większej liczby białek centriolarnych, co doprowadziło do obecnego oszacowania około 100 odrębnych białek będących częścią klasy centriole14,15,16,17. Pomimo tych postępów, dokładna lokalizacja tych białek w centrioli pozostaje nieuchwytna, szczególnie w podregionach strukturalnych. Co ważne, przypisanie precyzyjnej lokalizacji do obszarów strukturalnych centrioli ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia ich funkcji. Pod tym względem centriole C. reinhardtii odegrały zasadniczą rolę w obu aspektach, najpierw wyznaczając granice różnych cech strukturalnych wzdłuż cylindra9,18,19, co następnie pozwoliło naukowcom skorelować lokalizację podzbioru białek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z regionem substrukturalnym. Obejmuje to na przykład białka Bld12p i Bld10p, które lokalizują się w regionie proksymalnym, a w szczególności w strukturze koła wozu20,21,22,23. Lista białek zlokalizowanych w podstrukturze obejmuje również POB15 i POC16, dwa nowe białka zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas, które zdobią wewnętrzny centralny region rdzenia C. reinhardtii centrioles17.

Ten artykuł zawiera pełny opis metody opracowanej do izolowania i obrazowania centrioli C. reinhardtii do późniejszej mikroskopii superrozdzielczej i uśredniania pojedynczych cząstek. Aby osiągnąć ten cel, ważne jest nakreślenie ograniczeń technicznych, które należy pokonać. Po pierwsze, oczyszczanie centrioli może mieć wpływ na ogólną architekturę, przy czym struktura koła wozu często jest tracona podczas różnych etapów izolacji9. Po drugie, wymiary centrioli są bardzo zbliżone do granicy dyfrakcji w mikroskopii optycznej. Rzeczywiście, rozdzielczość boczna, którą można uzyskać w mikroskopii konfokalnej, wynosi około 200 nm24, podobnie jak średnica centrioli, a rozdzielczość w osi z jest około 2-3 razy niższa, co prowadzi do objętości anizotropowej. Po trzecie, niejednorodność znakowania przeciwciał i orientacji centrioli może ograniczać interpretację potrzebną do lokalizacji białka w określonym podregionie centriolowym. Wreszcie, centriole występują tylko w dwóch kopiach na komórkę, co utrudnia uzyskanie dużej liczby obrazów i znalezienie jednoznacznej orientacji centrioli. Aby obejść te problemy techniczne, opracowaliśmy metodę, która opiera się na zastosowaniu mikroskopii superrozdzielczej na dużej liczbie izolowanych centrioli, które przyjmują różne orientacje. Najpierw opiszemy protokół oczyszczania centrioli C. reinhardtii, który umożliwia oczyszczanie strukturalnie nienaruszonych centrioli i procentrioli zawierających koło wozu. Następnie opiszemy krok po kroku protokół koncentracji centrioli na szkiełkach nakrywkowych w celu obrazowania za pomocą konwencjonalnej lub superrozdzielczej mikroskopii fluorescencyjnej. Ten ważny krok pozwala na zwiększenie liczby centrioli obrazowanych w wielu orientacjach. Na koniec opiszemy procedurę uśredniania pojedynczych cząstek na danych uzyskanych na mikroskopach fluorescencyjnych, która ułatwia wykrywanie centrioli w różnych orientacjach. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana do obrazowania centrioli różnych gatunków lub innych dużych zespołów makromolekularnych.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża do hodowli C. reinhardtii i izolacja centrioli

  1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek C. reinhardtii
    UWAGA: Poniższe kroki opisują przygotowanie roztworów podstawowych dla pożywki 1x TAP (fosforan tris-octanu).
    1. Przygotować bufor fosforanowy (pH 7), mieszając 250 ml 1 M K2HPO4 (174,2 g K2HPO4 uzupełnione do 1 l wodą destylowaną) z ~170 ml 1 M KH2PO4 (136,09 g KH2PO4 w 1 L). Dostosuj mieszaninę, aby osiągnąć pH 7.
    2. Przygotować roztwór A (40x) mieszając 96,8 g Tris, 40 ml buforu fosforanowego (pH 7) i 40 ml kwasu octowego, a następnie dostosować roztwór do 1 l wodą destylowaną.
    3. Przygotować roztwór B (40x) używając 16 g NH4Cl, 2 g CaCl2 i 4 g MgSO4 . Należy uważać, aby rozpuścić CaCl2 w wodzie destylowanej oddzielnie przed dodaniem go do innych składników. Roztwór uzupełnić wodą destylowaną do 1 l.
    4. Przygotuj bufor pierwiastków śladowych Hutnera25 w następujący sposób.
      1. Na 1 l buforu rozpuścić każdy związek we wskazanej objętości wody: sól disodowa EDTA (50 g w 250 ml), ZnSO4,7H 2O (22 g w 100 ml), H3BO3 (11,4 g w 200 ml), MnCl2,4H 2O (5,06 g w 50 ml), CoCl2,6H 2O (1,61 g w 50 ml), CuSO4,5H 2O (1,57 g w 50 ml), (NH4)6Mo7O24,4H 2O (1,10 g w 50 ml) i FeSO 4,7H2O (4,99 g w 50 ml).
        UWAGA: EDTA należy rozpuścić we wrzącej wodzie, a FeSO4 należy przygotować na końcu, aby uniknąć utleniania.
      2. Wymieszaj wszystkie roztwory z wyjątkiem EDTA i doprowadź do wrzenia. Następnie dodaj EDTA, a roztwór powinien zmienić kolor na zielony. Po rozpuszczeniu wszystkiego schłodzić roztwór do temperatury 70 °C. W tej temperaturze dodać 85 ml gorącego 20% roztworu KOH (20 g w 100 ml). Roztwór należy uzupełnić do 1 l wodą destylowaną o temperaturze pokojowej (RT).
      3. Dodaj bawełniany korek do kolby i odstaw roztwór na 1 lub 2 tygodnie, potrząsając nim 1x dziennie. Roztwór powinien początkowo być zielony, a następnie zmienić kolor na fioletowy, pozostawiając rdzawobrązowy osad; Usunąć osad za pomocą bibuły filtracyjnej, aż roztwór będzie klarowny. Zamrozić podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotuj 1x pożywkę TAP do hodowli komórek C. reinhardtii, mieszając następujące składniki: 25 ml roztworu A (40x) i 25 ml roztworu B (40x) z 1 ml buforu pierwiastków śladowych Hutnera25, i dostosuj mieszaninę do 1 litra z wodą destylowaną. Wysterylizuj mieszaninę za pomocą filtra 0,4 μm.
  2. Przygotowanie pożywki do oczyszczania centrioli
    1. Przygotować bufor deflagellacyjny przy użyciu 5% sacharozy w 10 mM HEPES (pH 7) w końcowej objętości 500 ml dostosowanej wodą destylowaną.
    2. Przygotuj 250 ml 0,5 M kwasu octowego.
    3. Przygotować 250 ml 1 M roztworu podstawowego K-PIPES (pH 7,2), najpierw dodając 50 ml H2O w celu rozpuszczenia proszku PIPES, a następnie dodając 10 N KOH, aż roztwór zacznie stawać się klarowny. Miareczkować do pH 7,2 za pomocą 10 N i 1 N KOH i dostosować roztwór do końcowej objętości 250 ml za pomocąH2O.
    4. Przygotować 5 roztworów sacharozy (w/w) w następujący sposób.
      UWAGA: Wszystkie roztwory sacharozy muszą być filtrowane po rozpuszczoniu za pomocą filtra 0,4 μm podłączonego do strzykawki. Należy pamiętać, że roztwory sacharozy 60% i 70% są trudne do rozpuszczenia i należy je umieścić w łaźni wodnej wstępnie podgrzanej w temperaturze 60 °C, aby ułatwić solucjonalizację. Mieszaj co 10 minut, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
      1. Aby przygotować 25% sacharozy, zważ 25 g sacharozy i dostosuj wagę do 100 g, dodając 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      2. Aby przygotować 60% sacharozy, odważ 60 g sacharozy i dostosuj wagę do 100 g za pomocą 10 mM K-PIPES (pH 7,2).
      3. Przygotuj roztwory sacharozy dla gradientu sacharozy. Przygotować 40% sacharozy, ważąc 40 g sacharozy i dostosowując roztwór do 100 g za pomocą 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Podobnie przygotuj 50% (w/w) i 70% (w/w) sacharozy.
      4. Roztwory należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Należy uważać, aby roztwory sacharozy po rozmrożeniu zostały prawidłowo podniesione.
    5. Przygotować 100 ml buforu do lizy, mieszając 1 mM HEPES (pH 7), 0,5 mM MgCl2 i 1% NP-40 i utrzymywać w temperaturze 4 °C. Zawsze przygotowuj ten bufor świeży w dniu eksperymentu. Dodać tabletki przeciw proteazie w dniu izolacji centrioli.
    6. Przygotować 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) (pH 7,4) mieszając 8 g NaCl, 2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 i 0,24 g KH2PO4 w 800 ml destylowanegoH2O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą HCl. Doprowadzić objętość mieszaniny do 1 l z destylowanym H2O.

2. Izolacja C. reinhardtii Centrioles

UWAGA: Zobacz Rysunek 1.

  1. Hodowla i ekspansja komórek C. reinhardtii
    1. Wieczorem w dniu 1 zaszczepić szczep cw15- z stałej płytki do kolby Erlenmeyera zawierającej 10 ml 1x TAP. Hodować komórki pod białymi lampami fluorescencyjnymi (60 μE/m2s) przez 2–3 dni w temperaturze 23 °C.
    2. W 3 dniu rozcieńczyć kulturę 10x (do 100 ml) w 1x TAP i hodować komórki pod światłem przez 2-3 dni w temperaturze 23 °C.
    3. W dniu 6 rozcieńczyć kulturę 10x w 1x TAP, aby uzyskać 1 l kultury. Hoduj komórki pod światłem w temperaturze 23 °C, aż kultura osiągnie ciemnozielony kolor, który wskazuje na przybliżoną gęstość komórek ~1 x 107 komórek/ml26 (dzień 9–10).
  2. Oczyszczanie C. reinhardtii centrioles
    1. Odwirować komórki cw15 przy 600 x g przez 10 minut w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Umyj osad komórek 1x 50 ml 1x PBS i wiruj w temperaturze 600 x g przez 10 min. Zawiesić osad w 100 ml buforu deflagellacyjnego o temperaturze pokojowej za pomocą pipety.
    2. Deflagelować komórki za pomocą szoku pH, powoli dodając krople 0,5 M kwasu octowego do końcowego pH 4,5–4,7 na mieszadle magnetycznym i inkubować komórki przez 2 minuty. Powoli dodawaj krople 1 N KOH, aby przywrócić pH do 7,0.
    3. Odwirować komórki o masie 600 x g przez 10 minut, aby usunąć wszelkie oderwane wici. Usunąć supernatant i przechowywać osad na lodzie. Przemyć granulat 2x 50 ml 1x PBS wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C. Następnie wirować granulkę w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Ponownie zawiesić osad w 30 ml 1x PBS i powoli załadować zawiesinę na 25% poduszkę sacharozy o pojemności 20 ml bez mieszania (Rysunek 1B).
    5. Wirować w temperaturze 600 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć pozostałą wici z supernatantu; komórki rozprowadza się w 25% sacharozie (Rysunek 1C). Zachowaj tylko najniższe 20 ml (czerwona strzałka, Rysunek 1C), ostrożnie zasysając supernatant za pomocą aspiratora.
    6. Umyj pozostałe 20 ml, dodając 20 ml zimnego 1x PBS. Wirować próbkę w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml zimnego 1x PBS (w temperaturze 4 °C). Upewnij się, że nie ma grudek, aby następująca liza uderzyła we wszystkie komórki jednocześnie.
    7. Przenieść zawieszony osad do nowej butelki o pojemności 250 ml. Dodaj 100 ml buforu do lizy uzupełnionego 5 000 jednostek DNazy do komórek. Ważne jest, aby dodać bufor do lizy do komórek, a nie na odwrót. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C i dokładnie wymieszać, odwracając butelkę co 15 minut, nie tworząc żadnych pęcherzyków.
    8. Odwirować zlizowane komórki w temperaturze 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w celu usunięcia wszelkich resztek komórek. Jeśli liza została przeprowadzona prawidłowo, osad komórek powinien być biały (Rysunek 1D). Zebrać supernatant za pomocą pipety i umieścić go na lodzie do probówki okrągłodennej o pojemności 30 ml zawierającej 60% poduszkę sacharozy. Następnie wirować probówkę o masie 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Może być potrzebnych kilka probówek okrągłodennych (Tabela materiałów), w zależności od objętości supernatantu.
    9. Odessać supernatant do wysokości 1 ml powyżej poduszki sacharozy. Zwrócić uwagę na żółtą granicę między 1 ml pozostałego supernatantu a 2 ml poduszki sacharozy. Delikatnie wymieszaj sacharozę i pozostały sklarantysz z odciętą końcówką P1000. Na tym etapie nie wiruj; W przeciwnym razie procentrioles mogą zostać utracone na tym etapie. Zbierz wszystkie poduszki z sacharozą i przechowuj je na lodzie.
    10. Przygotuj gradient sacharozy od 40% do 70% w cienkościennej probówce polipropylenowej o pojemności 38,5 ml, delikatnie dodając 3 ml 70% sacharozy (w 4 °C), następnie 3 ml 50%, a na koniec 3 ml 40% sacharozy. Załaduj interfejsy w puli na gradient sacharozy od 40% do 70%; Rób to powoli, ponieważ zimna sacharoza jest bardzo lepka. Zrównoważyć probówki z buforem 10 mM K-PIPES (pH 7,2) i odwirować je przy 68,320 x g (np. za pomocą rotora SW32Ti) przez 1 godzinę i 15 minut w temperaturze 4 °C.
    11. Zebrać 12 frakcji po 500 μl w temperaturze 4 °C, wykonując otwór w dnie probówki za pomocą igły 0,8 mm, nie naruszając różnych warstw sacharozy. Za pomocą przeciętej końcówki pipety P200 przygotuj dodatkowe 10 μl podwielokrotności z każdej frakcji, które zostaną użyte do następnej immunofluorescencji. Błyskawiczne zamrożenie frakcji w ciekłym azocie.
      UWAGA: Izolowane centriole mogą być analizowane za pomocą mikroskopii elektronowej, aby zapewnić zachowanie ogólnej ultrastruktury centrioli.

3. Kwantyfikacja izolowanych wirwioli na szkiełkach nakrywkowych: wirowanie i immunofluorescencja

UWAGA: Zobacz Rysunek 2.

  1. Przygotowanie tubek i szkiełek nakrywkowych
    1. Użyj 1 szklanej probówki okrągłodennej (15 ml) na frakcję, aby przeanalizować frakcje dośrodkowe (w sumie 12 probówek).
    2. Umieść niestandardowy adapter podtrzymujący szkiełko nakrywkowe (zwany dalej adapterem) do rurki z okrągłym dnem. Umieścić sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm w probówce z okrągłym dnem.
      UWAGA: Tutaj użyliśmy szkiełek nakrywkowych 12 mm, ale protokół można dostosować do szkiełek nakrywkowych 18 mm za pomocą probówek okrągłodennych o pojemności 30 ml.
    3. Dodać 5 ml wstępnie schłodzonych rur 10 mM K-PIPES (pH 7,2) w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe nie unosi się na wodzie i pozostaje na adapterze. Umieść probówki na lodzie.
  2. Odwirowanie wirówek
    1. Rozcieńczyć każde 10 μl frakcji w 100 μl zimnych 10 mM K-PIPES (pH 7,2). Ponownie zawiesić rozcieńczenie aż do całkowitego zniknięcia sacharozy (Rysunek 2A). Załaduj każdą rozcieńczoną frakcję do probówki z okrągłym dnem.
    2. Obracać rurkę o wymiarach 10 000 x g przez 10 minut (np. za pomocą wahliwego wirnika kubełkowego JS-13.1) w temperaturze 4 °C.
    3. Odzyskaj szkiełko nakrywkowe, wkładając ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie je podnieś.
      UWAGA: Ręcznie robione urządzenie z haczykiem można wykonać za pomocą igły strzykawkowej ręcznie zaczepionej i uformowanej na domowym patyczku (rysunki 2B-2D).
    4. Po dotarciu do górnej części rurki z okrągłym dnem przytrzymaj krawędź adaptera palcem w rękawiczce i usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą. Należy pamiętać, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Przystąp do leczenia szkiełek nakrywkowych pod kątem immunofluorescencji.
  3. Barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie izolowanych centrioles C. reinhardtii
    UWAGA: Zobacz Rysunek 2.
    1. Przygotuj materiał do barwienia immunofluorescencyjnego w następujący sposób.
      1. Przygotuj stojak do barwienia szkła nakrywkowego w krystalicznej skrzynce laboratoryjnej z polistyrenu transmisyjnego (60 mm długości, 50 mm szerokości i 43 mm wysokości). Napełnij go 100% metanolem i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      2. Przygotuj wilgotną komorę. W tym celu zmontuj wilgotną komorę, umieszczając nawilżoną wodą chusteczkę wzdłuż wewnętrznych krawędzi kwadratowej szalki Petriego (Rysunek 2E). Dodać kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej (patrz tabela materiałów) do środka szalki Petriego, na której zostaną umieszczone mieszaniny przeciwciał podczas procedury immunofluorescencji (kroki 3.3.2–3.3.3). Przykryj pokrywę i wilgotną komorę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem.
    2. Wyizolowane centriole należy wybarwić immunologicznie w następujący sposób.
      1. Utrwalić szkiełka nakrywkowe za pomocą centrioli bezpośrednio po odwirowaniu (etap 3.2.4), inkubując je przez 5 minut w pojemniku wypełnionym metanolem o temperaturze -20 °C (etap 3.3.1.1).
      2. Usuń szkiełka nakrywkowe pęsetą i umieść je w przezroczystym pudełku laboratoryjnym (patrz Tabela materiałów) wypełnionym 50 ml 1x PBS i myj je przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Odpipetować 60 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych [przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i 0,05% Tween-20 w PBS] na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej w wilgotnej komorze. Ostrożnie ułożyć szkiełka nakrywkowe na wierzchu mieszaniny przeciwciał z centriolami skierowanymi bezpośrednio w kroplę. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
        UWAGA: Pierwszorzędowymi przeciwciałami, które użyto do wygenerowania reprezentatywnych wyników, są królicza poliklonalna Bld12 (1:300) i mysia α-tubulina (DM1A) (1:300).
      4. Usuń szkiełka nakrywkowe i myj je przez 5 minut w 1x PBS, jak opisano w kroku 3.3.2.2. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 45 minut z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS zawierającymi 1% BSA i 0,05% Tween-20,
        UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe, które użyto do wygenerowania reprezentatywnych wyników, to kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa 488 (1:1,000) i kozie anty-króliki sprzężone z Alexa 568 (1:1,000).
      5. Usuń szkiełka nakrywkowe i myj je przez 5 minut w 1x PBS, jak opisano w kroku 3.3.2.2.
    3. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku podstawowym, dodając 3 μl podłoża montażowego na szkiełko podstawowe i ostrożnie umieszczając szkiełka nakrywkowe na wierzchu (centriole skierowane w stronę medium montażowego). Uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
    4. Zobrazuj izolowane centriole pod mikroskopem konfokalnym przy obiektywie olejowym 63X z NAW 1,4 podczas stosowania dekonwolucji27 (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano następujące ustawienia: 500–545 nm dla Alexa 488 i 580–635 nm dla Alexa 568.

4. Koncentracja Centrioles na środku szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Zobacz Rysunek 3.

  1. Przygotowanie materiału
    1. Przygotuj 15 ml szklaną probówkę z okrągłym dnem na lodzie, niestandardowy adapter podtrzymujący szkiełko nakrywkowe (zwany dalej adapterem, plik .stl dostarczony jako plik uzupełniający 1), niestandardowy koncentrator (plik .stl dostarczony jako plik uzupełniający 2) i 10 mM K-PIPES (pH 7,2) w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL). Rozcieńczyć 10 razy roztwór podstawowy PDL o stężeniu 1 mg/ml w roztworze podstawowymH2O. Najpierw umyj szkiełka nakrywkowe 70% EtOH, usuń etanol i pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia. Pokryj szkiełka nakrywkowe PDL i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe 3x wodą i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Pokryj szkiełka nakrywkowe PDL, aby zwiększyć liczbę izolowanych centrioli przymocowanych do szkiełek nakrywkowych.
  2. Wirowania
    1. Umieść sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm na wgłębionym, dolnym końcu koncentratora, trzymając powłokę PDL stroną do dołu. Zakryj szkiełko nakrywkowe, umieszczając adapter bezpośrednio na górze. Odwróć rurkę z okrągłym dnem i umieść ją na koncentratorze, szkiełku nakrywkowym i adapterze.
    2. Delikatnie popchnij zestaw pęsetą, aż dotrze do dna rurki z okrągłym dnem i odwróć rurkę. Dodać bufor 10 mM K-PIPES (PH 7,2) do probówki okrągłodennej, aż dojdzie do górnej części koncentratora. Upewnij się, że w centralnym cylindrze koncentratora nie pozostały żadne pęcherzyki.
    3. Delikatnie dodać 100 μl 10 mM K-PIPES buforu (pH 7,2) do jednej porcji zawierającej wzbogaconą frakcję centrioli i dokładnie wymieszać objętość.
    4. Usunąć 100 μl buforu 10 mM K-PIPES (PH 7,2) z pustego środka koncentratora i dodać 100 μL wzbogaconej frakcji dośrodkowej w buforze 10 mM K-PIPES (PH 7,2) do pustego środka koncentratora, uważając, aby zawartość pozostała w pustym środku.
    5. Wirować przy 10 000 x g przez 10 minut (np. z wahliwym wirnikiem kubełkowym JS-13.1) we wstępnie schłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C.
    6. Wyjmij koncentrator za pomocą pęsety.
    7. Odzyskaj szkiełko nakrywkowe, wkładając ręcznie wykonane haczykowate urządzenie do otworu znajdującego się w szczelinowej krawędzi adaptera i delikatnie je podnieś. Po dotarciu do górnej części rurki z okrągłym dnem przytrzymaj krawędź adaptera palcem w rękawiczce i usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą. Należy pamiętać, po której stronie szkiełka nakrywkowego znajdują się centriole. Przystąp do leczenia szkiełek nakrywkowych pod kątem immunofluorescencji.
      UWAGA: Ręcznie robione urządzenie z haczykiem można wykonać za pomocą igły strzykawkowej ręcznie zaczepionej i uformowanej na domowym patyczku (rysunki 2B-D).
    8. Wykonać utrwalanie i barwienie immunofluorescencyjne skoncentrowanych centrioli, jak wykonano w kroku 3.3.2–3.3.4.

5. Uśrednianie pojedynczych cząstek

UWAGA: Zobacz Rysunek 4.

  1. Obrazowanie do uśredniania pojedynczych cząstek
    1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą zwykłego środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Obrazowanie w mikroskopii oświetlenia strukturalnego (2D SIM) można wykonać za pomocą obiektywu CFI Apochromat TIRF (100X, NA 1,49, WD 0,12 mm) i kamery EM CCD w świetle tylnym.
      UWAGA: Czas akwizycji został ustawiony na 100 ms przy odczycie z kamery z częstotliwością 3 MHz. Do obrazowania SIM użyto obiektywu 2,5x.
      UWAGA: Prezentowany tutaj zestaw danych został uzyskany za pomocą mikroskopu 3-D SIM (patrz Spis materiałów).
    2. Zobrazuj centriole, uzyskując duży stos obrazów składających się na całkowity sygnał centrioli, ustawiając górną i dolną pozycję stosu Z odpowiednio powyżej i poniżej sygnału centrioli. Przystąp do rzutowania stosu i wykonaj uśrednianie pojedynczych cząstek zgodnie z krokami 5.2 i 5.3.
  2. Projekcja stosu
    1. Otwórz stos obrazów za pomocą ImageJ. Następnie kliknij "Stosy obrazów → → Z Project". Ustaw typ projekcji na "Maksymalna intensywność".
    2. Odwróć obraz, klikając "Edytuj → odwróć". Zapisz wygenerowaną projekcję (.tif format).
  3. Wyrównanie pojedynczych cząstek ze Scipion
    1. Utwórz nowy projekt w Scipion, naciskając czerwony przycisk "Utwórz projekt" u góry strony. W lewym panelu kliknij dwukrotnie "Importuje → Importuj mikrofotografie".
    2. Wypełnij pola "Katalog plików" i "Wzorzec" zgodnie z katalogiem danych i nazwami. Zachowaj parametry domyślne. Kliknij "Wykonaj".
    3. Kliknij dwukrotnie "Pobieranie cząstek → → xmipp3 - pobieranie ręczne (krok 1)". Kliknij ikonę lupy znajdującą się obok pola "Wprowadź mikrofotografie" i wybierz zaimportowane mikrofotografie z kroku 5.3.1. Kliknij "Wykonaj".
    4. W nowo otwartym oknie wybierz cząstki z różnych mikrofotografii, klikając na nie. Po zakończeniu każdego mikrorysunku kliknij na czerwony przycisk "+ Współrzędne".
    5. Kliknij dwukrotnie "Cząstki → Extract → xmipp3 - extract particles". Kliknij ikonę lupy obok pola "Wprowadź współrzędne" i wybierz współrzędne wybrane z kroku 5.3.4. Wypełnij "Rozmiar pudełka na cząstki (px)" zgodnie z wymiarami cząstek. W zakładce "Preprocess" ustaw Dust Removal: Nie (może generować artefakty); Odwróć kontrast: Nie (czarne cząstki, białe tło); Odwrócenie fazy: Nie (połączone z korekcją CTF); Normalizacja: Tak.
    6. Następnie kliknij "Wykonaj". Po zakończeniu zadania sprawdź wyekstrahowane cząstki, zaznaczając pole zadania (obramowania stają się grubsze) i kliknij "Analizuj wyniki" (w lewym dolnym rogu menu głównego).
    7. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → xmipp3 - align with cl2d". Kliknij ikonę lupy znajdującą się w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyodrębnione cząstki z kroku 5.3.5. Nie używaj obrazu referencyjnego. Kliknij "Wykonaj".
    8. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → more → xmipp3 - apply alignment 2d". Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.7.
    9. Kliknij "Wykonaj", jak w kroku 5.3.6. Wyniki można sprawdzić, klikając przycisk "Analizuj wyniki" po wybraniu pola pracy.
    10. Kliknij dwukrotnie "Cząsteczki → maskę → xmipp3 - zastosuj maskę 2d".
    11. Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.9. 'Źródło maski' jest ustawione na 'Geometria'. Następnie ustaw parametry maski jako Typ maski: Okrągła; Promień (px): szukając jednej cząstki (centrioli) bez niczego wokół niej, kliknij ikonę "magicznej różdżki" po lewej stronie, która otwiera okno, które pomoże znaleźć idealną wartość; Przesunięcie środka: Nie (jeśli cząstka jest idealnie wyśrodkowana) lub Tak (jeśli cząstka jest przesunięta); Przesunięcie środka X: zgodnie z położeniem cząstek; Przesunięcie środka Y: zgodnie z położeniem cząstek. Kliknij "Wykonaj".
    12. Użyj przycisku "Analizuj wyniki", aby sprawdzić, czy maska została prawidłowo zastosowana. Jeśli nie, kliknij prawym przyciskiem myszy zadanie "Zastosuj maskę 2d" i wybierz "Edytuj". Zmodyfikuj parametry maski (rozmiar i/lub przesunięcia) i uruchom ją ponownie za pomocą przycisku 'Wykonaj'.
    13. Kliknij dwukrotnie "2D → Classify → xmipp3 - cl2d".
    14. Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz zamaskowane cząstki z kroku 5.3.11. Liczba klas powinna wynosić około 50 cząstek w klasie. Kliknij "Wykonaj".
    15. Sprawdź wyniki, klikając przycisk "Analizuj wyniki". W otwartym oknie kliknij ikonę "oka" tuż obok "Co pokazać".
    16. Nowe okno umożliwia inspekcję wygenerowanych klas poprzez wybranie opcji "Classes2D" w menu "Blok". Sprawdź zawartość każdej klasy, wybierając "Class00N_Particles" w tym samym menu. Sprawdź każdą klasę, aby określić, które z nich zawierają tylko złe cząstki. Wróć do widoku 'Classes2D' i wybierz klasy z dobrymi cząstkami, klikając na każdą z nich. Możliwe jest wybranie kilku klas poprzez przytrzymanie "Ctrl" wciśniętego podczas wyboru.
    17. Po wybraniu wszystkich klas z dobrymi cząstkami, kliknij na "+ Cząstki", aby utworzyć podzbiór z tymi cząstkami.
    18. W tym samym oknie wybierz kilka zestawów klas, które reprezentują różne orientacje cząstek. Utwórz nowy podzbiór, klikając "+ Średnie".
    19. Dla każdej wybranej orientacji/średniej wykonaj następujące czynności.
      1. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → xmipp3 - align with cl2d".
      2. Kliknij ikonę lupy znajdującą się w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz dobre cząstki z kroku 5.3.17. Ustaw opcję "Użyj obrazu referencyjnego" na "Tak". Kliknij ikonę lupy obok pola "Obraz referencyjny" i kliknij białą strzałkę w lewo do zadania "Utwórz podzbiór" z kroku 5.3.18 i wybierz obraz, aby użyć go jako odniesienia. Kliknij dwukrotnie na obiekt, aby otworzyć go w osobnym oknie i sprawdzić, który to obiekt. Kliknij "Wykonaj".
      3. Kliknij dwukrotnie "2D → Align → more → xmipp3 - apply alignment 2d". Kliknij ikonę lupy w pobliżu pola "Cząstki wejściowe" i wybierz wyrównane cząstki z kroku 5.3.19.2.
      4. Kliknij "Wykonaj".
      5. Sprawdź wynik wyrównania ("Analizuj wyniki"); pokaże on wyrównane cząstki i średnią tych cząstek.
      6. Jeśli średnia jest dobra, a wszystkie cząstki są zorientowane w ten sam sposób, zapisz średnią, klikając "Zaawansowane → ImageJ" i zapisz obraz za pomocą ImageJ.
      7. Jeśli średnią można poprawić, zaznacz wszystkie dobrze zorientowane obrazy i utwórz nowy podzbiór za pomocą przycisku "+ Cząstki". Powtarzaj kroki 5.3.19.1–5.3.19.4, aż podzbiór zostanie oczyszczony (wszystkie szkodliwe cząstki zostaną usunięte). Za każdym razem, gdy wykonywane jest wyrównanie (krok 5.3.19.2), odniesienie jest ustawiane na ostatnią wygenerowaną średnią (z iteracji na iterację średnia jakość wzrasta).

Wyniki

C. reinhardtii Izolacja centriolów:
W celu izolacji centriolów komórki C. reinhardtii szczepu cw15 hodowano w kulturze ciekłej przez kilka dni przy naświetlaniu, a następnie osadzano poprzez wirowanie przy 600 x g przez 10 min. Osad z komórek przemyto 1x w PBS i zawieszono w buforze do deflagelacji przed przeprowadzeniem deflagelacji poprzez szok pH z użyciem 0,5 M kwasu octowego do końcowego pH 4,5–4,7 przez 2 min (Rycina 1A). Do przywrócenia pH do poziomu 7,0 zastosowano dodatek 1 N KOH. Aby oddzielić odłączone flagella od ciał komórkowych, komórki po deflagelacji odwirowano najpierw w celu usunięcia głównej części flagell. Osad przemyto 2x w PBS i zawieszono w 30 mL PBS przed powolnym nałożeniem na poduszkę 25%- sacharozy (Rycina 1B). Probówkę wirowano przy 60 x g przez 15 min w 4 °C, aby usunąć większość odłączonych flagell. Po wirowaniu ciała komórkowe rozprzestrzeniono w poduszce sacharozy (Rycina 1C) i odzyskano poprzez usunięcie około 30 mL supernatantu (do czerwonej strzałki na Rycynie 1C). Otrzymane 20 mL przemytych komórek zawieszono następnie w 20 mL zimnego PBS i wirowano przy 60 x g przez 10 min. Następnie odlano supernatant, a komórki całkowicie zawieszono w 10 mL PBS. Komórki przeniesiono do butelki o pojemności 250 mL i do zawiesiny komórkowej dodano jednorazowo bufor do lizy. Do lizatu dodano DNazę i inkubowano przez 1 h w 4 °C. Po etapie wirowania w celu usunięcia szczątków komórkowych (patrz biały osad na Rycynie 1D), zebrano supernatant i ostrożnie nałożono go na 2 mL poduszki 60%- sacharozy przed wirowaniem przy 10 0 x g przez 30 min w 4 °C. Należy zaznaczyć, że dla 100 mL lizatu użyto 8 probówek po 15 mL do wykonania tego kroku, co odpowiadało nałożeniu 12,5 mL buforu do lizy na 2 mL sacharozy w każdej probówce. Po wirowaniu usunięto większość supernatantu do poziomu 1 mL powyżej poduszki. Pozostały 1 mL supernatantu zebrano wraz z 2 mL poduszki, a następnie wymieszano i połączono, aby uzyskać końcową objętość 24 mL. Połączoną próbkę nałożono na gradient sacharozy 40%-, 50%-, 70%- i wirowano przy 68 320 x g przez 1 h i 15 min w 4 °C. Na koniec odizolowane centriole zebrano, wykonując igłą otwór w dolnej części probówki wirowania; krople zbierano w 12 frakcjach po 500 µL. Ze względu na wysoką gęstość różnych stężeń sacharozy, krople tworzyły się bardzo powoli na początku (70% sacharozy), a następnie szybciej (40% sacharozy).

Immunofluorescencja wyizolowanych centrioli
Aby ocenić jakość procedury izolacji, 10 µL każdej zebranej frakcji gradientu poddano wirowaniu na szkiełku nakrywce przy użyciu specjalnego adaptera wspornika do szkiełek nakrywczych (Rysunek 2A-2D). Co ważne, w celu bezpiecznego usunięcia szkiełka nakrywki zaprojektowano specjalne urządzenie z haczykiem (Rysunek 2B). Następnie szkiełka nakrywkowe analizowano metodą immunofluorescencji. W badaniu zastosowano przeciwciała przeciwko CrSAS-6(Bld12p), aby wskazać obecność struktury koła rowerowego (cartwheel), oraz przeciwko α-tubulinie (DMA1), aby uwidocznić ścianę centrioli. Poprzez przeliczenie liczby centrioli wykazujących pozytywny wynik zarówno dla CrSAS-6, jak i α-tubuliny w jednym polu widzenia, a następnie obliczenie całkowitej liczby centrioli w poszczególnych frakcjach, możliwe było ustalenie, które frakcje były wzbogacone w wyizolowane centriole (Rysunek 2F-2H). Co ciekawe, 6 frakcji było wzbogaconych w centriole (Rysunek 2F oraz 2G, frakcje #1–6), z pikiem w frakcji #3, podczas gdy ostatnie frakcje nie były wzbogacone, co świadczy o skuteczności oczyszczania. Należy zauważyć, że w tym konkretnym eksperymencie 95% wszystkich centrioli w frakcji #3 było pozytywnych dla CrSAS-6 i α-tubuliny. Wskazuje to, że większość wyizolowanych centrioli zachowała strukturę koła rowerowego. Jeśli w pierwszych frakcjach nie zaobserwowano wzbogacenia w centriole, oznacza to, że procedura izolacji nie powiodła się i należy ją powtórzyć. Należy zwrócić uwagę, że fragmenty flagel można zaobserwować głównie w frakcjach pozbawionych centrioli.

Następnie, aby obliczyć całkowitą liczbę centriol na µL, liczbę centriol w jednym polu widzenia należy pomnożyć przez przelicznik przedstawiony na Rysunku 2H. Otrzymaną wartość należy następnie podzielić przez objętość frakcji wykorzystanej do immunofluorescencji, aby uzyskać liczbę centriol na µL. W tej konkretnej procedurze izolacji frakcja o największym wzbogaceniu zawierała około 37 centriol na powierzchni 0,0846 mm2 (przy polu widzenia 92 x 92 µm2). Przekrój probówki miał promień 7,5 mm i całkowitą powierzchnię 176 mm2. Odpowiedni przelicznik wynosił zatem 176/0,0846 = 20 803,8, co daje łącznie 769 740 centriol (37x20 803,8) w 10 µL. Zatem liczba centriol w 1 µL wynosiła 76 974.

Koncentracja wyizolowanych centrioli na szkiełkach nakrywkowych:
Zwiększenie liczby centrioli w polu widzenia zwiększa szansę na wykrycie jednoznacznej orientacji centrioli, a także zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia podobnych orientacji, które mogą zostać wykorzystane w dalszych procedurach uśredniania cząstek. Ponieważ centriole z frakcji skoncentrowanych są nadal rzadko rozmieszczone na szkiełku nakrywkowym, opracowaliśmy akcesorium do wirowania służące do koncentracji centrioli w środkowej części szkiełka (Rysunek 3A), nazwane koncentratorem. Należy pamiętać, że wraz z niniejszym manuskryptem dostarczono plik .stl z dokładnymi wymiarami do druku 3D.

Najpierw na koncentratorze zamontowano jedną szkiełko nakrywkę o średnicy 12 mm (Ryc. 3B). Na wierzchu szkiełka nakrywki umieszczono adapter, a następnie odwrócono probówkę z okrągłym dnem i nałożono ją na zmontowany adapter i koncentrator. Następnie delikatnie odwrócono probówkę z okrągłym dnem, umożliwiając w ten sposób załadowanie próbki (Protokół, krok 4.2). Centriole odwirowano następnie przy 10,0 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Po tym czasie centriole poddano immunofluorescencji i barwiono na CrSAS-6/Bld12p oraz α-tubulinę (Ryc. 3C-3E). Co istotne, bez użycia koncentratora w jednym polu widzenia obserwowano około 30 centrioli (Ryc. 3C), natomiast przy zastosowaniu koncentratora w jednym polu widzenia zaobserwowano 183 centriole (Ryc. 3D-3F). Należy zauważyć, że centriole pokrywały jedynie obszar o średnicy 4 mm na środku szkiełka nakrywki. Wynik ten dowodzi, że etap koncentracji jest skuteczny i pozwala na 6-krotne wzbogacenie centrioli w określonym obszarze szkiełek nakrywek, co ułatwia ich detekcję i obrazowanie.

Fluorescencyjna średnia z pojedynczych cząsteczek izolowanych centrioli C. reinhardtii:
W niniejszej pracy, przy użyciu mikroskopii SIM, która pozwala na osiągnięcie rozdzielczości około 120 nm, obrazowano centriole barwione na monoglutamylowaną tubulinę (GT35, Rycina 4), będącą modyfikacją tubuliny występującą w mikrotubulach centriolarnych24. Centriole C. reinhardtii mają około 500 nm długości, zawsze występują w parach i często towarzyszą im powiązane, nowo zduplikowane ciała probazalne (zwane w dalszej części procentriolami) oraz prążkowane włókna związane z mikrotubulami19. Zatem ten końcowy kompleks miał rozmiar około 1 µm. Z tego powodu, aby obrazować centriole w całości, zalecamy wykonanie stosu Z (Z-stack) izolowanych centrioli.

W tym przypadku po akwizycji wygenerowano obraz końcowy poprzez wykonanie projekcji maksymalnej intensywności przy użyciu programu ImageJ28 (image/Stacks/Z project/max intensity projection, Rysunek 4B). Na podstawie takich obrazów przeprowadzono analizę pojedynczych cząsteczek przy użyciu oprogramowania do kriomikroskopii elektronowej, aby stworzyć klasy centriol o podobnej orientacji, a następnie wykonano uśrednianie. W tym celu najpierw odwrócono kolory obrazu, aby lepiej zwizualizować obiekty (Rysunek 4C). Centriole wybierano ręcznie w ramce wycentrowanej na każdej cząsteczce, korzystając z bezpłatnego oprogramowania Scipion29, które integruje kilka programów do mikroskopii elektronowej, takich jak Xmipp3 (Rysunek 4D). Należy pamiętać, że rozmiar ramki musi zostać zdefiniowany przez użytkownika. W tym przypadku zastosowano ramki o wymiarach 50 x 50 pikseli przy rozmiarze piksela wynoszącym 31.84 nm. Następnie wszystkie cząsteczki zostały wyekstrahowane (Rysunek 4E) i wyrównane przy użyciu Xmipp3 (Rysunek 4F). Kolejno zastosowano okrągłą maskę o promieniu 12 pikseli, aby odizolować każdy centriol od pary centriolarnych (Rysunek 4G). Następnie cząsteczki zostały sklasyfikowane za pomocą Xmipp3 w celu wygenerowania kilku średnich. Zachowano jedynie homogeniczne średnie klas, co oznacza, że cząsteczki odbiegające od średnich klas zostały usunięte ręcznie. Krok ten powtarzano, aby uzyskać niemal idealną średnią dla każdej wybranej orientacji. Po pięciu iteracjach wygenerowano dwie klasy średnich: widok z góry z 63 obiektów (Rysunek 4H) oraz widok z boku z 98 cząsteczek (Rysunek 4I) monoglutamylowanych centrioli. Wymiary obiektu określono poprzez pomiar odległości między szczytami profilu wykresu intensywności wzdłuż sygnału monoglutamylacji.

Co istotne, długość średniej dla klasy widoku bocznego wynosi 260 nm przy średnicy 250 nm, co jest porównywalne z zmierzonym sygnałem monoglutamylowanej tubuliny, który lokalizował się w obszarze o długości 286 ± 3 nm wewnątrz rdzenia centriola17.

Schemat procesu wirowania w celu oczyszczania białek z wykorzystaniem gradientu sacharozy; metoda i wyniki.
Rysunek 1: Oczyszczanie C. reinhardtii centriole (A) Jest to schematyczne przedstawienie każdego etapu prowadzącego do izolacji C. reinhardtii centriole. Obejmuje ono reprezentatywne etapy protokołu (B) przed i (C) po wirowaniu w gradiencie 25% sacharozy. Czerwona strzałka na panelu C oznacza minimalną objętość, którą należy zachować po wirowaniu. (D) Na tym panelu widoczny jest biały osad z lizowanych komórek po wirowaniu. Czarna strzałka wskazuje osad. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu wirowania i wyniki; wykres ilościowy gradientu; konfiguracja mikroskopu.
Rycina 2: Konfiguracja wirowania w celu przeprowadzenia immunofluorescencji na wyizolowanych centriolach. (A) 10 µL każda zebrana frakcja jest najpierw rozcieńczana w 100 µL 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Jest to schematyczne przedstawienie urządzeń do wirowania, obejmujące probówkę z okrągłym dnem o objętości 15 ml, szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm, adapter do szkiełka nakrywkowego oraz wykonany na zamówienie zaczep do wyjmowania szkiełka nakrywkowego po wirowaniu. Panele C i D przedstaw rysunki wyjaśniające, jak odzyskać szkiełko nakrywkę po wirowaniu. (C) Włóż narzędzie z haczykiem do otworu znajdującego się w naciętej krawędzi adaptera i (D) delikatnie pociągnąć. (ESą to zdjęcia komory wilgotnościowej niezbędnej do wykonania obrazowania immunofluorescencyjnego. Strzałka wskazuje szkiełko cover-slip o średnicy 12 mm.F) Są to reprezentatywne obrazy konfokalne przy powiększeniu 63X (zoom 2) frakcji gradientu nr 1–8, pobranych podczas procedury oczyszczania i barwionych na CrSAS-6 (czerwony) oraz $\alpha$-tubulinę (zielony). Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu białą ramką na widokach o mniejszym powiększeniu. Pasek skali = 10 µm. (GWykres przedstawia liczbę centrioli wykazujących pozytywną reakcję zarówno na CrSAS-6, jak i α-tubulinę w jednym polu widzenia dla każdej frakcji. Zwrócono uwagę na wzbogacenie we frakcjach nr 1–6. Średnia liczba centrioli na pole w każdej frakcji: nr 1 = 16,3 ± 4,7, nr 2 = 24,0 ± 4,6, nr 3 = 37,0 ± 17,0, nr 4 = 23,3 ± 1,4, nr 5 = 14,3 ± 2,1, nr 6 = 13,7 ± 9,3, nr 7 = 2,7 ± 1,2, nr 8 = 1,0 ± 0,0, nr 9 = 1,0 ± 0,0, nr 10 = 0,0 ± 0,0, nr 11 = 0,3 ± 0,6, nr 12 = 0,0 ± 0,0. Dla każdej frakcji obrazowano 3 losowe pola. Odnotowano, że podczas liczenia w najbardziej wzbogaconej frakcji nr 3 ustalono, iż 95% centrioli wykazuje pozytywną reakcję na CrSAS-6 oraz α-tubulinę (n = 205 centrioli). (H) Do obliczenia całkowitej liczby centrioli obecnych w obszarze probówki wykorzystuje się stosunek liczby centrioli znajdujących się w zmierzonym obszarze mikrografii. Liczba centrioli na µL można obliczyć na podstawie 10 µL pierwotnie odwirowane frakcje. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat wirówki z konfiguracją koncentratora, obrazy mikroskopowe, analiza białek i wykres danych.
Rycina 3Wyizolowane centriole są wirowane przy użyciu koncentratorów. (A) Na tym panelu przedstawiono urządzenia do wirowania niezbędne do koncentracji centrioli na szkiełkach nakrywkowych przed przeprowadzeniem immunofluorescencji, w tym probówkę o okrągłym dnie o pojemności 15 ml, koncentrator, szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm oraz aparat wspierający w postaci adaptera. (B) Na tym panelu przedstawiono etapy montażu urządzenia do wirowania. Panele C-E prezentuj obrazy konfokalne centrioli barwionych na CrSAS-6 (czerwony) i α-tubulinę (zielony) (C) bez lub (D-E) z koncentratorem. Wstawki odpowiadają obszarowi wskazanemu białą ramką na widokach przy niższym powiększeniu. Pasek skali wynosi 10 µmNależy zauważyć, że centriole są skoncentrowane w środkowej części szkiełka nakrywki (linia przerywana wyznacza granicę obszaru zagęszczenia).FWykres ten przedstawia liczbę centrioli w jednym polu widzenia bez i z zastosowaniem koncentratora. Przeanalizowano pięć losowych pól widzenia. Średnia liczba centrioli wynosi 29,8 ± 2,9 bez koncentratora oraz 182,6 ± 1,5 z koncentratorem. P <0,001. Istotność statystyczną oceniano za pomocą niepowiązanych t-test. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu monoglutamylacji obejmujący ekstrakcję cząsteczek, wyrównanie, maskowanie i uśrednianie klas.
Rycina 4: Uśrednianie pojedynczych cząstek na izolowanych C. reinhardtii centriole (A) Ten panel przedstawia obrazy serii Z (Z-stack) centrioli barwionych przeciwciałem GT335, uzyskane przy użyciu mikroskopu SIM. (BPanele te przedstawiają maksymalną projekcję intensywności (MIP) stosu obrazów. Pasek skali = 1 µm. (C) Panele te przedstawiają reprezentacyjny obraz z odwróconym kontrastem. Wstawka stanowi powiększenie, które pozwala na lepszą wizualizację centrioli. (D) Panele te przedstawiają proces wyboru cząstek. Wstawka wskazuje sposób, w jaki wybrano cząstki. (E) Są to przykłady 5 wyekstrahowanych cząstek. (F) Ten panel przedstawia cząstki po dopasowaniu. (G) Ten panel przedstawia cząstki po zastosowaniu maski. Panele H i I wyświetl średnie dla dwóch grup: (H) widok z góry (63 cząsteczki) oraz (I) widok z boku (98 cząsteczek). Podwójne strzałki wskazują wymiary sygnału GT35. Pasek skali = 250 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Plik uzupełniający 1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jednym z wyzwań w biologii jest rozszyfrowanie dokładnej lokalizacji białek w kontekście architektonicznym. Centriole są idealną strukturą do zastosowania tych metod, ponieważ ich architektura została zbadana za pomocą tomografii krioelektronowej, ujawniając interesujące cechy ultrastrukturalne na całej jej długości. Jednak ze względu na jego wymiary bliskie granicy rozdzielczości w mikroskopii optycznej, trudno jest precyzyjnie zlokalizować białko za pomocą immunofluorescencji w strukturalnym podregionie centrioli przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów30.

Rozdzielczość w mikroskopii optycznej jest ograniczona przez dyfrakcję światła, która daje w przybliżeniu maksymalną rozdzielczość boczną 200 nm w mikroskopii optycznej24. Ograniczenie to zostało jednak ominięte przez jeden z największych przełomów ostatnich 20 lat w mikroskopii optycznej: wynalezienie metod superrozdzielczych. Podejścia te mogą obrazować poza granicami dyfrakcji w różnych rozdzielczościach: 120 nm dla SIM, około 50 nm dla wymuszonego zubożenia emisji (STED) i 20–40 nm dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM)24. Dzięki tym nowym osiągnięciom mikroskopii superrozdzielczej możliwe jest uzyskanie strukturalnych podregionów centrioli. Jednak w praktyce nadal trudno jest dokładnie określić lokalizację białka w elemencie strukturalnym z głównego powodu, że dojrzałe centriole występują tylko w 2 kopiach na komórkę i mają losowe orientacje, co utrudnia interpretację lokalizacji. Z tego powodu stworzono protokół, który umożliwia naukowcom obrazowanie w superrozdzielczości dużej liczby centrioli, zwiększając szansę na zaobserwowanie jednoznacznych orientacji. Co ważne, ponieważ metoda ta opiera się na użyciu izolowanych centrioli, zapewniamy metodę oczyszczania nienaruszonych centrioli C. reinhardtii , które zawierają dojrzałe centriole i procentriole.

Wreszcie, ze względu na szereg orientacji centrioli, które można obrazować za pomocą tego protokołu, analiza pojedynczych cząstek może być stosowana za pomocą oprogramowania do mikroskopii elektronowej. Powoduje to generowanie średnich klas centrioli w określonej orientacji. Co ważne, uzyskane obrazy 2D można następnie wykorzystać do oceny lokalizacji określonego białka wzdłuż centrioli. Rzeczywiście, metodę tę można zastosować do dwukolorowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, a jeden kolor może być użyty do odsłonięcia szkieletu centrioli (np. tubuliny), podczas gdy drugi kolor można przypisać określonemu białku dośrodkowej. Odejmując uzyskane średnie za pomocą jednego lub dwóch kolorów, łatwiej jest zarejestrować białko wzdłuż centrioli (proksymalnie, centralnie lub dystalnie). Należy pamiętać, że oba kanały powinny być dokładnie wyrównane, aby zapobiec wprowadzającym w błąd interpretacjom. Co więcej, średnie widoków z góry pomogą rozszyfrować, czy białko lokalizuje się wewnątrz światła centriorów, wzdłuż ściany mikrotubul, czy na zewnątrz centrioli.

Zaletą tej metody jest ustalenie lokalizacji określonych białek, które w inny sposób mogłyby być trudne do zlokalizowania ze względu na heterogeniczne znakowanie. Należy zauważyć, że inne metody mapowania białek w centriolach zostały opisane w korelacyjnym 3-D SIM/SMLM, na przykład z oceną specyficznej orientacji centrioli poprzez określenie eliptycznego profilu markera tworzącego torus wokół centrioli za pomocą obrazowania SIM. Za pomocą tego parametru możliwa jest lokalizacja białka z dokładnością do 4–5 nm30. Należy również zauważyć, że opisana tutaj metoda wykorzystuje izolowane centriole z nienaruszonymi procentriolami, co oznacza, że architektura centrioli jest najprawdopodobniej w dużej mierze zachowana. Nie możemy jednak wykluczyć, że niektóre cechy architektoniczne są zaburzone podczas oczyszczania, takie jak średnica centrioli zmieniająca się wraz ze stężeniem kationów dwuwartościowych, wzmocniona izolacją ludzkiego centrosomu5.

Jednym z kluczowych etapów przedstawionego tutaj protokołu jest uzyskanie wystarczająco skoncentrowanych izolowanych centrioli w różnych orientacjach podatnych na Fluo-SPA. W tym celu należy najpierw upewnić się, że procedura izolacji centrioli jest czysta i skuteczna. Niskie stężenie izolowanych centrioli uniemożliwi prawidłowe obrazowanie i dalszą obróbkę obrazu. W tym celu udostępniamy metodę wzbogacania liczby centrioli na pole widzenia. W zależności od liczby centrioli w użytej frakcji, objętość załadowaną do koncentratora powinna być dostosowana, przy maksymalnej objętości 250 μL.

Co ważne, metoda ta została opracowana dla ściany komórkowej minus komórki cw15-C. reinhardtii . W tym szczepie kruchość ściany komórkowej pozwala na prawidłową lizę komórek, a tym samym uwolnienie jej zawartości. Protokół ten nie jest skuteczny w przypadku komórek C. reinhardtii typu dzikiego, ponieważ ściana komórkowa uniemożliwia prawidłową lizę. Alternatywne strategie, takie jak sonikacja lub wstępna inkubacja komórek z autolizyną, enzymem, który może degradować ścianę komórkową31, musiałyby zostać wprowadzone w celu zmiany ściany komórkowej przed zastosowaniem przedstawionego tutaj protokołu izolacji.

Ta konfiguracja może być używana z różnymi typami mikroskopów, począwszy od konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych, a skończywszy na dedykowanych mikroskopach o wysokiej rozdzielczości. Należy pamiętać, że podczas wykonywania SMLM do prawidłowego obrazowania wymagany jest specjalny bufor, a zatem należy użyć komory przystosowanej do szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm z buforem umieszczonym na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Kolejne obrazowanie zostanie wykonane za pomocą mikroskopów odwróconych. Jeśli konfiguracja mikroskopu nie pozwala na wykonanie szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm, przedstawiony tutaj protokół można zastosować do szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm za pomocą probówki o okrągłym dnie o pojemności 30 ml oraz zmodyfikowanego adaptera i koncentratora. Ważne jest również, aby pamiętać, że jakość końcowej rekonstrukcji w SMLM będzie zależeć od jakości barwienia i użytego pierwotnego przeciwciała, a także metody utrwalenia.

Podsumowując, dostarczamy metodę, którą można zastosować do obrazowania wielu centrioli, a następnie Fluo-SPA, która wygeneruje średnie centrioli w różnych orientacjach, pomagając w ten sposób z precyzją zlokalizować białko centrioralne. Co ważne, metoda ta może być stosowana bardziej ogólnie do izolowanych centrioli innych gatunków, do innych organelli lub do dużych zespołów makromolekularnych. Wreszcie, przedstawione tutaj podejście do przygotowania próbek, w połączeniu z niedawnym opracowaniem algorytmu do analizy pojedynczych cząstek fluorescencyjnych danych SMLM32, może przyczynić się do dalszego doskonalenia kartografii molekularnej dużych zespołów makromolekularnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Pierre'owi Gönczy i BioImaging & Optics Platform (BIOP) w École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lozanna, Szwajcaria, gdzie uzyskano obrazy SIM centrioli. Nikolai Klena i Davide Gambarotto są wspierani przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach grantu dla początkujących naukowców (StG) 715289 (ACCENT), a Maeva Le Guennec, Paul Guichard i Virginie Hamel przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers jest wspierana przez Uniwersytet Genewski.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysia monoklonalna tubulina anty-apha (klon DM1A)Abcamab7291 Rozcieńczenie 1:300
Szkiełka nakrywkowe DNaseIRoche10104159001
12 mmRothYX03.1
Szkiełka nakrywkowe 18 mmRothLH23.1
K2HPO4Fluka60355
KH2PO4Fluka60230
Tris baseBiosolve Chimie SARL0020092391BS
kwas octowyCarlo Erba Odczynniki524520
NH4ClSigmaA-4514
CaCl2SigmaC-7902
MgSO4Sigma63140-500G-F
filtr steritopMillipore
sacharozaSigmaS7903-1KG
HEPESAppliChem PanReacA3724,0250
RURYSigmaP6757-500G
MgCl2ACROS ORGANICS197530010
NP-40AppliChem PanReacA1694,0250
Probówki okrągłodenne (Kimble) 15 mlFisherscientific09-500-34
Probówki okrągłodenne (Kimble) 30 mlFisherscientific09-500-37
stojak do barwienia szkła nakrywkowegoThomas scientific8542E40
skrzynka laboratoryjna z krystalicznego polistyrenuFISHERS11712944
MetanolVWR20864.32
BSARoche
Triton X100Roth3051.3
kozioł anty-mysz sprzężony z Alexa 488 invitrogenA11029rozcieńczenie 1:1,000
kozia anty-królik sprzężona z Alexa 568invitrogenA11036rozcieńczenie 1:1,000
podłoże montażoweabcamab188804
Rurka, cienkościenna polipropylenBeckman Coulter326823
Poli-D-Lizyna 1 mg/mlSIGMA A-003-E
Mysia monoklonalna modyfikacja anty-poliglutamylacji mAb (GT335)AdipogenAG-20B-0020rozcieńczenie 1:1,000
podłoże montażowe glicerolu z DAPI i DABCOAbcamab188804
50 ml probówki stożkoweFalcon14-432-22
Eppendorf 5810R wirówkaEppendorf5811000622
Beckman JS-13.1 wahliwy wirnikkubełkowy Beckman Coulter346963
Beckman SW 32Ti rotorBeckman Coulter369694
parafilmBemis 13-374-10
Leica TCS SP8 z trybem HyvolutionLeica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX Luxe Daylight/ OSRAM
WhatmanSigma 
Rozcieńczenie przeciwciała1:300 (Hamel el al., 2014)
Kamera CCD Scipionhttp://scipion.i2pc.es/
EM (Andor iXON DU897)Andor
SCGPT05RE10735086001Bibuła filtracyjna WHA1001325 CrSAS-6/Bld12

Bibliografia

  1. Bornens, M. The centrosome in cells and organisms. Science. 335 (6067), 422-426 (2012).
  2. Nigg, E. A., Holland, A. J. Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).
  3. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  4. Gönczy, P. Towards a molecular architecture of centriole assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).
  5. Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).
  6. Winey, M., O'Toole, E. Centriole structure. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  7. Dippell, R. V. The development of basal bodies in paramecium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461(1968).
  8. Allen, R. D. The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).
  9. Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography. The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).
  10. Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography. The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).
  11. Guichard, P., et al. Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry. Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).
  12. Hirono, M. Cartwheel assembly. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).
  13. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. Structural and chemical characterization of isolated centrosomes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).
  14. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).
  15. Kilburn, C. L., et al. New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure. The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).
  16. Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).
  17. Hamel, V., et al. Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis. Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).
  18. Cavalier-Smith, T. basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii. Journal of Cell Science. 16 (3), 529(1974).
  19. Geimer, S., Melkonian, M. The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body. Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).
  20. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).
  21. Hamel, V., et al. Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy. Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326(2014).
  22. Guichard, P., et al. Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms. Nature Communications. 8, 14813(2017).
  23. Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole. Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).
  24. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  25. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).
  26. Keller, L. C., Marshall, W. F. Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles. Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).
  27. Borlinghaus, R. T., Kappel, C. HyVolution-the smart path to confocal super-resolution. Nature Methods. 13 (3), (2016).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  30. Gartenmann, L., et al. A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm. Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).
  31. Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases. European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).
  32. Salas, D., et al. Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie centrioliwirowanie w gradiencie sacharozymikroskopia konfokalnamikroskopia superrozdzielczaanaliza Fluo SPAizolacja centriolibarwienie immunofluorescencyjne
Izolacja i obrazowanie fluorescencyjne do rekonstrukcji pojedynczych cząstek Chlamydomonas Centrioles
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.