Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Układ odpornościowy jest niezbędnym elementem zdrowego serca. Mięsień sercowy jest domem dla bogatej populacji różnych podzbiorów komórek odpornościowych z funkcjonalnym podziałem zarówno w stanie stacjonarnym, jak i podczas różnych form zapalenia. Do niedawna badanie komórek odpornościowych w sercu wymagało użycia mikroskopii lub słabo opracowanych protokołów trawienia, które zapewniały wystarczającą czułość podczas ciężkiego stanu zapalnego, ale nie były w stanie z pewnością zidentyfikować małych – ale kluczowych – populacji komórek w stanie stacjonarnym. W tym artykule omówiono prostą metodę łączącą trawienie enzymatyczne (kolagenaza, hialuronidaza i DNAza) i mechaniczne trawienie mysich serc poprzedzone donaczyniowym podaniem przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu różnicowania małych, ale nieuniknionych zanieczyszczeń wewnątrznaczyniowych. Metoda ta generuje zawiesinę izolowanych żywotnych komórek, które można analizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu identyfikacji, fenotypowania i kwantyfikacji lub dalej oczyszczać za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją lub separacji kulek magnetycznych do analizy transkrypcyjnej lub badań in vitro. Podajemy przykład analizy cytometrii przepływowej krok po kroku w celu zróżnicowania kluczowych populacji makrofagów i komórek dendrytycznych w sercu. W przypadku średniej wielkości eksperymentu (10 serc) wykonanie zabiegu zajmuje 2–3 godziny.

Wprowadzenie

Różne formy stresu lub uszkodzenia mięśnia sercowego, w tym niedokrwienne (niedokrwienie lub zawał mięśnia sercowego) i nieniedokrwienne (nadciśnienie lub zapalenie mięśnia sercowego), sprzyjają rekrutacji komórek zapalnych o właściwościach naprawczych i ochronnych, ale także patogennych. Już w 1891 roku Romberg po raz pierwszy opisał obecność nacieków komórkowych w mięśniu sercowym pacjentów zakażonych tyfusem plamistym i szkarlatyną¹. Jednak szczegółowe badania komórek odpornościowych serca wymagały opracowania bardziej zaawansowanych technik immunofenotypowania. W związku z tym dopiero niedawno zaczęliśmy rozumieć, że w mięśniu sercowym znajduje się zróżnicowana populacja komórek odpornościowych pełniących niezbędne role podtrzymujące w stanie stacjonarnym.

Histologia była i nadal jest najczęstszą metodą charakteryzowania komórek odpornościowych serca podczas stanu zapalnego. Jednakże, chociaż histologia stanowi cenne narzędzie diagnostyczne, jej zastosowanie w badaniu komórek odpornościowych serca ma istotne ograniczenia. Komórki odpornościowe znajdujące się w mięśniu sercowym stanowią bardzo małą część wszystkich komórek i są mniej więcej równomiernie rozmieszczone na proporcjonalnie ogromnej przestrzeni. Podobnie kilka form zapalenia serca, takich jak wirusowe zapalenie mięśnia sercowego, wykazuje ogniskowe wzorce zapalenia. Oznacza to, że dokładna analiza układu odpornościowego serca często wymaga wyższego stopnia pobierania próbek histologicznych, co zwiększa koszty w celu zmniejszenia błędu systematycznego. Co więcej, histologia dostarcza bardzo ograniczonej ilości użytecznych informacji w identyfikacji komórek (np. liczby parametrów). Przy stale rosnącej liczbie podzbiorów komórek, które wymagają użycia wielu markerów ekspresji (w tym markerów powierzchniowych, czynników transkrypcyjnych lub wydzielanych cząsteczek), cytometria przepływowa stała się najpotężniejszym narzędziem do immunofenotypowania ze względu na niski koszt i wysoką przepustowość.

Stosowanie technik immunofenotypowania jest ściśle uzależnione od opracowania efektywnych protokołów trawienia, które pozwoliły na analizę pojedynczej liczby komórek. Opracowanie wyczerpujących protokołów ekstrakcji komórek otworzyło nowe okno możliwości w badaniach nad immunologią serca. Dzięki połączeniu trawienia, cytometrii przepływowej i transkryptomiki scharakteryzowano główne populacje makrofagów i komórek dendrytycznych znajdujących się w sercu^2,3. Najliczniejszą populacją komórek odpornościowych serca w stanie stacjonarnym są makrofagi CD64 ⁺ MerTK ⁺, które można dalej podzielić na podstawie ich ekspresji CCR2 lub CD11c². Makrofagi CCR2⁺ pochodzą z hematopoezy dorosłego szpiku kostnego, podczas gdy większość makrofagów CCR2^-, które mogą wyrażać wysoki lub niski poziom MHC-II, jest głównie pochodzenia prenatalnego. Makrofagi pełnią kluczowe funkcje, takie jak naprawa⁴ i usuwanie zanieczyszczeń⁵ podczas urazu lub wspomaganie łączności elektrycznej⁶ w stanie ustalonym. Podczas różnych form zapalenia dochodzi do znacznego napływu monocytów Ly6C^hi MHC-II^lo CD64^int, które później różnicują się w makrofagi Ly6C^hi CCR2^+2,7. Znacznie mniejsza, ale ważna populacja komórek znajdujących się w mięśniu sercowym zdrowych osób składa się z komórek dendrytycznych^8,9. Niedawno scharakteryzowano dwa główne podzbiory konwencjonalnych sercowych DC (cDC): cDC1 (CD103⁺ DCs) i cDC2 (CD11b⁺ DCs). DC odgrywają ważną rolę w obronie przed infekcją⁸, ale mogą również sprzyjać samookaleczeniom podczas stanu zapalnego, szczególnie podczas zawału mięśnia sercowego⁹.

Tutaj opisujemy prostą metodę izolacji żywotnych komórek odpornościowych serca z mięśnia sercowego myszy. Metoda ta łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne z filtracją sitową w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki, która może być analizowana lub dalej oczyszczana przez sortowanie metodą cytometrii przepływowej lub wzbogacanie kulkami magnetycznymi. Dokładne pomiary pozanaczyniowych komórek mięśnia sercowego wymagają perfuzji serca w celu usunięcia ewentualnych zanieczyszczeń z krwiobiegu mikrokrążenia serca. Ponadto przedstawiamy opcjonalny etap wewnątrznaczyniowego znakowania komórek odpornościowych, który można wykorzystać do dalszego różnicowania komórek mięśnia sercowego od zanieczyszczeń wewnątrznaczyniowych, w oparciu o protokół Galkina i wsp. ¹⁰. Na koniec przedstawiamy podstawową analizę cytometrii przepływowej w celu identyfikacji głównych subpopulacji makrofagów i cDC.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia (Toronto, Kanada) i jest zgodny z Kanadyjską Radą ds. Opieki nad Zwierzętami.

1. Przygotowanie bufora

1. Przygotować bufor HBB (Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), 2% inaktywowana termicznie surowica bydlęca, 0,2% albumina surowicy bydlęcej). Dodać 10 ml inaktywowanej termicznie surowicy bydlęcej i 1 g albuminy surowicy bydlęcej do 500 ml HBSS. Filtr wysterylizować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować bufor FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 2% inaktywowana termicznie surowica bydlęca, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, pH 8,0)). Dodać 10 ml inaktywowanej termicznie surowicy bydlęcej i 1 ml 0,5 M EDTA do 500 ml PBS. Filtr sterylizować przez filtr 0,2 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.

2. Etykietowanie krążących leukocytów

1. Przygotować w asepcie wstrzyknięcie CD45 przeciwko myszom z 1 μg przeciwciała rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do uzyskania końcowej objętości wstrzyknięcia 200 μl/mysz. Załaduj objętość do strzykawki insulinowej 28,5 G i trzymaj z dala od światła.
   UWAGA: Użyj dwóch różnych przeciwciał anty-CD45 znakowanych fluorochromem w celu odróżnienia barwienia wewnątrznaczyniowego (wybarwionego przez podanie dożylne) od barwienia wewnątrzsercowego (wybarwionego po trawieniu; patrz krok 4).
2. Myszy (w wieku 8–12 tygodni) należy wstępnie ogrzać, wystawiając ogon na działanie czerwonej lampy grzewczej przez 5 minut.
   UWAGA: Nie przegrzewaj zwierzęcia. Trzymaj lampę w bezpiecznej odległości (>30 cm).
   1. Unieruchomić zwierzę w pozycji mostkowej za pomocą odpowiedniego urządzenia. Odsłoń i ustabilizuj ogon ręką niedominującą, unieruchamiając podstawę ogona palcem wskazującym i środkowym oraz środkową część ogona kciukiem i palcem serdecznym.
      UWAGA: Nie przykładaj zbyt dużej siły do końca ogona, ponieważ skóra może zostać ściągnięta. Wbić igłę skosem skierowanym do góry do żyły. Przez cały czas trzymaj igłę równolegle do żyły, ponieważ łatwo jest przebić żyłę.
      UWAGA: Może dojść do przedostania się krwi do strzykawki, co jest oznaką dobrego wstrzyknięcia. Wygięcie igły pod kątem 90° może ułatwić podawanie dożylne. Potwierdź to w swoim biurze bezpieczeństwa, ponieważ zginanie igieł może stanowić zagrożenie.
   2. Wstrzyknąć dożylnie 200 μl do żyły ogonowej. Płyn powinien łatwo płynąć i tymczasowo oczyścić żyłę.
      UWAGA: Nie wtłaczaj płynu na siłę, jeśli napotkany jest opór. Jest to oznaka niewłaściwego umieszczenia igły.
   3. Pozwól przeciwciałom krążyć przez 5 minut przed humanitarną eutanazją myszy.

3. Izolacja serca i trawienie

1. Eutanazja myszy przy użyciu CO₂ lub innej instytucjonalnie akceptowanej procedury eutanazji.
   1. W przypadku eutanazji CO₂ umieść mysz w komorze CO₂ i ustaw szybkość napełniania na 20% objętości komory na minutę (tj. jeśli komora ma 10 l, napełnij z prędkością 2 l/min). Biegaj przez 2 minuty i monitoruj mysz, aż ustanie oddychanie.
   2. Wyłącz CO₂ i pozostaw mysz na dodatkowe 1-2 minuty. Upewnij się, że oddychanie ustało przed otwarciem komory i wykonaj uszczypnięcie palca, aby potwierdzić, że mysz jest martwa przed przystąpieniem do przetwarzania myszy.
2. Spryskaj mysz 70% etanolem. Podnieś skórę na brzuchu i przeprowadź sekcję myszy, przecinając wzdłuż brzusznej linii środkowej, zaczynając od poziomu bioder aż do mostka. Otwórz brzuch i poruszaj wątrobą, aby odsłonić przeponę.
3. Przetnij przeponę, a następnie żebra po obu stronach linii środkowej, uważając, aby nie przebić płuc i serca.
   1. Odsłoń serce, odrywając żebra, a następnie odetnij najpierw lewe przedsionki, a następnie prawe przedsionki.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przecinania przedsionków, upewniając się, że żadne tętnice ani żyły nie są uszkodzone, ponieważ może to zmniejszyć skuteczność wypłukiwania krwi zawartej w narządach.
   2. Ukrwić serce 15-20 ml zimnego PBS za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml wyposażonej w igłę 21 G i zimnego PBS. Delikatnie chwyć podstawę serca kleszczami i włóż igłę do lewej komory w pobliżu wierzchołka. Powtórz procedurę w prawej komorze. Prawidłowe wstrzyknięcie powoduje białe płuca i bladość wątroby.
      UWAGA: Perfuzję należy przeprowadzić w ciągu 5 minut po eutanazji, aby uniknąć krzepnięcia krwi, które może zanieczyścić narządy będące przedmiotem zainteresowania krążącymi komórkami.
4. Przytrzymaj podstawę serca kleszczami i delikatnie pociągnij serce do góry, a następnie odłącz serce, przecinając główne tętnice i żyły płucne, aortę i worek osierdziowy.
   1. Oczyść serce, delikatnie trzymając serce między kciukiem a palcem wskazującym w czystym, niestrzępiącym się ręczniku papierowym i usuń przedsionki i resztki głównych tętnic i żył oraz wszelkie inne zanieczyszczenia za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Upewnij się, że całe przedsionki zostały usunięte i nie ma żadnych innych tkanek, takich jak płuca lub naczynia krwionośne, ponieważ tkanki te mają własne rezydujące komórki odpornościowe. W szczególności płuca mają dużą populację komórek odpornościowych, które mogą maskować mniejsze populacje tych w mięśniu sercowym.
5. Umieść serce w 5 cm plastikowym naczyniu z 50 μl zimnego PBS.
   1. Zmiel serce za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych, aż nie będzie żadnych widocznych kawałków i będzie miało gładką konsystencję.
      UWAGA: Staraj się trzymać serce w zamkniętym obszarze naczynia podczas siekania, aby zminimalizować utratę tkanki.
   2. Przenieś tkankę serca za pomocą zakrzywionych kleszczy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z 800 μl zimnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco.
6. Do każdej próbki dodać 450 j./ml kolagenazy I, 60 j./ml hialuronidazy typu I-S i 60 j./ml DNazy-I.
   1. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce kołyszącej z prędkością 50 obr./min przez 45–60 minut.
7. Po roztrawieniu próbki należy na krótko zwirować (20 s) i natychmiast umieścić na lodzie, aby utrzymać próbki w temperaturze 4 °C.
   1. Za pomocą pipetora o pojemności 1 ml pipetuj próbki w górę i w dół, aż próbki tkanek staną się jednorodne i nie zatkają końcówki pipety.
      UWAGA: Zdefiniowanie konkretnej liczby pipet może zwiększyć odtwarzalność. Jeśli serca nie są optymalnie trawione, kawałki mięśnia sercowego mogą zatkać pipetę. Delikatne zetrzenie końcówki pipety z probówką mikrowirówki pomoże ujednolicić większe kawałki tkanki.
8. Wstępnie zwilż sitko o pojemności 40 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 1 ml zimnego HBB.
   1. Dodaj homogenizowaną próbkę do filtra i przemyj, powoli wlewając 12–14 ml zimnego HBB.
   2. Przefiltrowane próbki przenieść do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
9. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać z supernatantu.
   1. Lizować czerwone krwinki, dodając 1 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) do każdej próbki. Zawiesić próbki przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Po zakończeniu lizy dodaj 5-8 ml zimnego roztworu soli Hanka (HBSS), aby zatrzymać hemolizę.
10. Odwirować próbki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać z supernatantu.
11. Dodać 1 ml buforu FACS do każdej próbki i przenieść do oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu na okres do 2 godzin przy próbkach przechowywanych w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie i analiza cytometrii przepływowej

1. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   1. Aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciał, rozcieńczyć anty-CD16/CD32 i bloker monocytów w stosunku 1:100 (1:20) (patrz tabela materiałów), co odpowiada 50 μl FACS na próbkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. Przygotować rozcieńczenie przeciwciał (1:250 dla każdego przeciwciała), co odpowiada 50 μl FACS na próbkę.
      UWAGA: Do koktajlu przeciwciał można dodać barwnik żywotności w celu wykluczenia martwych komórek. Alternatywnie można zastosować wykluczenie małych rozmiarów przez analizę przepływu (Rysunek 1C i D).
   3. Bez przemywania dodać 50 μl głównej mieszanki przeciwciał do każdej próbki i wymieszać.
   4. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.
2. Dodać 600 μl FACS do każdej próbki, aby przepłukać i odwirować próbki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μL FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
   UWAGA: Niektóre barwniki żywotności, takie jak DAPI, wymagają barwienia w ciągu 10 minut przed uruchomieniem cytometrii przepływowej.
4. Przeprowadzić analizę za pomocą cytometrii przepływowej (patrz rysunki 1 i 2) w ciągu najbliższych 3 godzin. Jeśli wymagany jest dłuższy czas, zaleca się krótkotrwałe utrwalenie przy użyciu paraformaldehydu o niskim stężeniu (0,5–1% w PBS) w celu zachowania barwienia.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przefiltrowanie próbek przez sitko komórkowe 40 μm przed rozpoczęciem analizy cytometrii przepływowej, aby zapobiec niedrożności płynów cytometru przepływowego.

Wyniki

Do tej pory nie opracowano żadnej dobrej metody izolowania komórek odpornościowych od innych składników komórek serca, takich jak kardiomiocyty. W związku z tym analiza zawiesiny pojedynczej komórki serca za pomocą cytometrii przepływowej wymaga wstępnego bramkowania CD45 w celu identyfikacji populacji komórek odpornościowych, a następnie bramkowania pojedynczej komórki i wykluczenia o małym rozmiarze (Rysunek 1A). Alternatywnie można przeprowadzić bar...

Dyskusja

Zapalenie mięśnia sercowego lub zapalenie mięśnia sercowego jest cechą większości chorób sercowo-naczyniowych. Jednak mięsień sercowy nie jest pozbawiony własnych składników immunologicznych w stanach niechorobowych. W stanie stacjonarnym wiele komórek odpornościowych znajduje się w mięśniu sercowym i odgrywa podstawowe role w utrzymaniu i ochronie. Scharakteryzowanie tych różnorodnych populacji komórek nie byłoby możliwe bez metod takich jak ta przedstawiona w niniejszym protokole.

Połączenie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Żubr	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0,8 mm x 40 mm) Igła PrecisionGlide	BD	305167
Hank' s Zrównoważony roztwór soli Żubr		311-511-CL	1x HBSS
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Surowica bydlęca	Sigma	B9433
0,5 M Kwas etylenodiaminotetraoctowy	BioShop	EDT111
Filtr próżniowy, 0,2 i mikro; m Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc strzykawka	insulinowa BD	329424
60 ml strzykawka	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Bisent	319-005-CL	1x DMEM z 4,5 g/L glukozy i L-glutaminą oraz pirogronianem sodu
Kolagenaza I	Sigma	C0130	z Clostridium histolyticum
Hialuronidaza typu I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	z trzustki bydlęcej
Sitko komórkowe, 40 i mikro; m Nylon	Falcon	352340
Bufor do lizy chlorku amonu i potasu (ACK)	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anty-mysi/ludzki CD11b	Biolegend	101222	rozcieńczenie 1:250
APC/Cy7 anty-mysie Ly-6c	Biolegend	128025	rozcieńczenie 1:250
APC anty-mysie CD103	Biolegend	121414	rozcieńczenie 1:250
Brilliant Violet 605 anty-mysie CD11c	Biolegend	117334	1:250 rozcieńczenie
PE anty-mysie Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 rozcieńczenie
Pacific Blue anty-mysie I-Ab	Biolegend	116422	rozcieńczenie 1:250
FITC anty-mysie CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 rozcieńczenie
PE/Cy7 anty-mysie CD45	Biolegend	103113	Rozcieńczenie 1:250
PerCP/Cy5.5 anty-mysie CD45	Biolegend	103132	Rozcieńczenie 1:40
TruStain fcX (anty-mysie CD16/32)	Biolegend	101320	Rozcieńczenie 1:100
True-Stain Monocyte	Blocker Biolegend	426101	1:20
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mysz: Batf3-/-	Laboratorium Jacksona JAX	: 013755