Artykuł metodologiczny

Pomiar kinuryniny i kwasu kynureninowego metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej: powiązanie biochemii z funkcjami poznawczymi i snem u szczurów

10.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58129

⸱

19 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Zmiany w neuroaktywnych metabolitach szlaku kinureniny (KP) są związane z chorobami psychicznymi. Badanie funkcjonalnych wyników zmienionego szlaku kynureniny metabolizmu in vivo u gryzoni może pomóc w wyjaśnieniu nowych podejść terapeutycznych. Obecny protokół łączy podejścia biochemiczne i behawioralne w celu zbadania wpływu ostrej prowokacji kinureniną u szczurów.

Streszczenie

Szlak kynureniny (KP) degradacji tryptofanu jest związany z zaburzeniami psychicznymi. W szczególności metabolit kwasu kynureninowego (KYNA) pochodzący z astrocytów, antagonista zarówno receptorów N-metylo-d-asparaginianu (NMDA), jak i α7 nikotynowej acetylocholiny (α7nACh), jest zaangażowany w procesy poznawcze w zdrowiu i chorobie. Ponieważ poziomy KYNA są podwyższone w mózgach pacjentów ze schizofrenią, uważa się, że nieprawidłowe działanie receptorów glutaminergicznych i cholinergicznych jest przyczynowo związane z dysfunkcją poznawczą, która jest podstawową domeną psychopatologii choroby. KYNA może odgrywać patofizjologicznie istotną rolę u osób ze schizofrenią. Możliwe jest podniesienie endogennego KYNA w mózgu gryzoni poprzez leczenie zwierząt bezpośrednim bioprekursorem kinureniną, a badania przedkliniczne na szczurach wykazały, że ostre zwiększenie KYNA może wpływać na ich procesy uczenia się i pamięci. Obecny protokół szczegółowo opisuje to eksperymentalne podejście i łączy a) analizę biochemiczną poziomów kynureniny we krwi i tworzenia KYNA w mózgu (przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej), b) testy behawioralne w celu zbadania pamięci kontekstowej zależnej od hipokampa (paradygmat pasywnego unikania) oraz c) ocenę zachowania snu i czuwania [zapisy telemetryczne łączące sygnały elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG)] u szczurów. Podsumowując, badany jest związek między podwyższonym KYNA, snem i funkcjami poznawczymi, a niniejszy protokół szczegółowo opisuje eksperymentalne podejście do zrozumienia wyników funkcji podniesienia poziomu kinureniny i tworzenia KYNA in vivo u szczurów. Wyniki uzyskane dzięki wariacjom tego protokołu przetestują hipotezę, że KP i KYNA odgrywają kluczową rolę w modulowaniu snu i funkcji poznawczych w stanach zdrowotnych i chorobowych.

Wprowadzenie

KP jest odpowiedzialny za degradację prawie 95% niezbędnego aminokwasu tryptofanu1. W mózgu ssaków kynurenina przyjmowana do astrocytów jest metabolizowana do neuroaktywnej małej cząsteczki KYNA głównie przez enzym aminotransferazę kinureninową (KAT) II2. KYNA działa jako antagonista receptorów NMDA i α7nACh w mózgu2,3,4, a także celuje w receptory sygnałowe, w tym receptor węglowodorów arylowych (AHR) i receptor sprzężony z białkiem G 35 (GPR35)5,6. U zwierząt doświadczalnych wykazano, że zwiększenie KYNA mózgu pogarsza ich wydajność poznawczą w szeregu testów behawioralnych2,7,8,9,10. Pojawiająca się hipoteza sugeruje, że KYNA odgrywa integralną rolę w modulowaniu funkcji poznawczych poprzez wpływ na zachowanie podczas snu i czuwania11, co dodatkowo potwierdza rolę cząsteczek pochodzących z astrocytów w modulowaniu neurobiologii snu i funkcji poznawczych12.

Klinicznie, stwierdzono podwyższone wartości KYNA w płynie mózgowo-rdzeniowym i pośmiertnej tkance mózgowej u pacjentów ze schizofrenią13,14,15,16, wyniszczające zaburzenie psychiczne charakteryzujące się zaburzeniami poznawczymi. Pacjenci ze schizofrenią są również często nękani zaburzeniami snu, które mogą zaostrzyć chorobę17. Zrozumienie roli metabolizmu KP i KYNA w modulowaniu związku między snem a funkcjami poznawczymi, szczególnie między uczeniem się a pamięcią, może prowadzić do opracowania nowych terapii leczenia tych słabych wyników w schizofrenii i innych chorobach psychicznych.

Niezawodna i spójna metoda pomiaru metabolitów KP jest ważna, aby zapewnić, że badania pochodzące z różnych instytucji mogą być zintegrowane z naukowym zrozumieniem biologii KP. Obecnie opisujemy metodologię pomiaru kinureniny w osoczu szczura i KYNA w mózgu szczura za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Obecny protokół, który wykorzystuje detekcję fluorymetryczną w obecności Zn2+, został po raz pierwszy opracowany przez Shibata18, a ostatnio dostosowany i zoptymalizowany do derywatyzacji z octanem 500 mM jako odczynnikiem pokolumnowym, co pozwala na wykrycie endogennych, nanomolowych ilości KYNA w mózgu11.

Aby stymulować endogenną produkcję KYNA de novo, jak opisano w niniejszym protokole, bezpośredni bioprekursor kinurenina jest wstrzykiwany dootrzewnowo (i.p.) szczurom. W połączeniu z ocenami biochemicznymi w celu określenia stopnia produkcji KYNA, bada się również wpływ prowokacji kinureniną na pamięć zależną od hipokampa (paradygmat pasywnego unikania) oraz architekturę snu i czuwania (sygnały EEG i EMG)11. Połączenie tych technik pozwala na badanie biochemicznego i funkcjonalnego wpływu prowokacji kinureniną in vivo u szczurów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Nasze eksperymentalne protokoły zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Maryland i były zgodne z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

UWAGA: Dorosłe samce szczurów rasy Wistar (250–350 g) były używane we wszystkich eksperymentach. Oddzielne kohorty zwierząt wykorzystano do analizy biochemicznej, eksperymentów behawioralnych i nagrań snu i czuwania. Zwierzęta były trzymane w ośrodku o kontrolowanej temperaturze w Maryland Psychiatric Research Center. Utrzymywano je w cyklu 12/12 godzin światło-ciemność, ze światłami włączonymi o czasie zeitgeber (ZT) 0 i wyłączonymi światłami o ZT 12. Podczas eksperymentów zwierzęta otrzymywały ad libitum dostęp do pożywienia i wody. Placówka została w pełni akredytowana przez American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Dootrzewnowe podawanie kynureniny szczurom

Uwaga: W tym protokole, kynurenina była podawana przy ZT 0 (początek fazy światła), a tkanka była pobierana przy ZT 2 i ZT 4 w celu określenia przebiegu czasowego metabolizmu kinureniny. Jako grupę kontrolną wykorzystano zwierzęta, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną. Na przykład, jeśli szczur waży 500 g, a pożądana dawka wynosi 100 mg/kg, szczur powinien otrzymać zastrzyk 5 ml roztworu kinureniny o stężeniu 10 mg/ml.

  1. Odważyć siarczan L-kinureniny ("kinureninę") i umieścić go w szklanej fiolce o pojemności 20 ml. Upewnij się, że kinurenina jest zawsze na lodzie.
  2. Dodać sól fizjologiczną, aby osiągnąć pożądane stężenie i dostosować pH do 7,6 za pomocą 1 N wodorotlenku sodu (NaOH). Zmieszać i poddać sonikacji roztwór, aż kinurenina całkowicie się rozpuści.
    UWAGA: Przestrzegaj wszystkich zalecanych środków ostrożności podczas obchodzenia się z NaOH.
    1. Na przykład, aby uzyskać roztwór o stężeniu 10 mg/ml, odważ 200 mg kinureniny i umieść ją w szklanej fiolce. Dodaj 15 ml soli fizjologicznej i odwiruj i poddaj sonikacji (20 kHz przez 5-10 s, mikrokońcówka o średnicy 1/8 cala) do rozpuszczenia. Używając NaOH, dostosuj pH roztworu. Na koniec użyj soli fizjologicznej, aby dostosować objętość do 20 ml.
  3. Zważyć każdego szczura doświadczalnego i obliczyć objętość każdego wstrzyknięcia w oparciu o masę ciała zwierzęcia i pożądaną dawkę leczniczą. Ostrożnie wyjmij zwierzę z jego domowej klatki, wstrzyknij roztwór dootrzewnowo i wróć zwierzę do klatki.

2. Pomiary kinureniny za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

  1. Pobieranie tkanek
    UWAGA: W tym protokole kynureninę podawano w ZT 0 (początek fazy światła), a tkankę pobrano w ZT 2 i ZT 4 w celu określenia przebiegu metabolizmu kinureniny w czasie. Jako grupę kontrolną wykorzystano zwierzęta, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną.
    1. Użyj dwutlenku węgla do eutanazji zwierzęcia. Po ustąpieniu objawów oddychania na 1 minutę należy przeprowadzić wtórną metodę eutanazji przez dekapitację.
    2. Aby pobrać krew z całego tułowia, umieść jednorazowy lejek w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 20 μl K3-EDTA (0,5 M). Pozwól, aby krew spłynęła z ciała do rurki. Kilkakrotnie odwróć probówkę, aby upewnić się, że EDTA jest wymieszany w całym tekście.
    3. Za pomocą nożyczek przetnij skórę na czubku głowy w dół linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Usuń nadmiar mięśnia szyi z tyłu czaszki i przy otworze na rdzeń kręgowy przeciąć czaszkę od tyłu do przodu.
      1. Delikatnie rozciągnij obie strony czaszki, aby odsłonić mózg, a następnie ostrożnie usuń mózg kleszczami, aby go nie uszkodzić. Usuń opuszki węchowe żyletką i przetnij mózg na pół wzdłuż linii środkowej. Za pomocą kleszczy rozkrój półmózg na obszary zainteresowania (tj. hipokamp i kora mózgowa).
    4. Umieść wszystkie wypreparowane kawałki mózgu na folii aluminiowej na suchym lodzie. Po całkowitym zamrożeniu tkanki przenieść ją do plastikowej fiolki o pojemności 20 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. Odwirować całą krew tułowia w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant (osocze) i przenieść go do nowych probówek wirówkowych przed przechowywaniem ich w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie próbki
    1. Osocze: pobrane od leczonych zwierząt
      1. Rozmrozić zamrożoną probówkę z osoczem (patrz krok 2.1 w celu pobrania tkanki) na mokrym lodzie.
      2. W nowej probówce wirówkowej rozcieńczyć próbkę ultraczystą wodą (1:2 dla kinureniny, 1:10 dla KYNA). Do 100 μl rozcieńczonej próbki dodać 25 μl 6% kwasu nadchlorowego.
        UWAGA: Przestrzegaj wszystkich zalecanych środków ostrożności podczas obchodzenia się z kwasem nadchlorowym.
      3. Zwirować wszystkie próbki, a następnie odwirować je przy 12 000 x g przez 10 minut. Po zakończeniu usunąć 100 μl supernatantu (z każdej probówki) i umieścić je w małej probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,25 ml w celu oznaczenia kinureniny lub KYNA.
    2. Mózg: pobrany od leczonych zwierząt
      1. Umieścić probówki z zamrożonymi próbkami mózgu (patrz krok 2.1 w celu pobrania tkanek) na suchym lodzie. Indywidualnie zważ każdą próbkę mózgu na precyzyjnej wadze analitycznej. Włóż go z powrotem do probówki i umieść z powrotem na suchym lodzie.
      2. Po zważeniu wszystkich próbek przenieś probówki na mokry lód. Rozcieńczyć każdą próbkę w stosunku 1:10 w/v ultraczystą wodą i homogenizować je za pomocą sonikatora (20 kHz przez 5-10 s, mikrokońcówka o średnicy 1/8 cala). Na przykład na 100 mg tkanki mózgowej dodaj 900 μl ultraczystej wody.
      3. Porcję 100 μl każdej rozcieńczonej próbki przenieść do nowej probówki i zakwasić ją 25 μl 25% kwasu nadchlorowego. Wirować, a następnie odwirowywać przy 12 000 x g przez 10 minut.
      4. Po odwirowaniu usunąć 100 μl supernatantu i umieścić go w małych probówkach mikrowirówek o pojemności 0,25 ml w celu oznaczenia KYNA.
  3. Konfiguracja i uruchomienie HPLC
    1. Przygotować 50 mM fazy ruchomej octanu sodu. Rozpuścić 6,81 g trójwodnego octanu sodu w 1 l ultraczystej wody. Dostosuj pH do 6,2 za pomocą lodowatego kwasu octowego, a następnie przefiltruj próżniowo do czystego szkła. Przenieść fazę ruchomą octanu sodu do czystej szklanej butelki o pojemności 1 l.
    2. Przygotuj 500 mM octanu. Rozpuść 54,88 g octanu w 500 ml ultraczystej wody, a następnie przefiltruj go próżniowo. Przełóż go do czystej szklanej butelki o pojemności 500 ml. Napełnij butelkę o pojemności 1 l ultraczystą wodą, a butelkę o pojemności 500 ml acetonitrylem klasy HPLC.
    3. Rurkę dolotową z maszyny HPLC należy umieścić oddzielnie w fazie ruchomej, ultraczystej wodzie i 100% acetonitrylu. Roztwór octanu pompować oddzielnie przez pompę perystaltyczną, która łączy się z fazą ruchomą po kolumnie, a przed derywatyzacją.
    4. Korzystając z panelu sterowania na maszynie, zaprogramuj ją tak, aby uruchamiała 5% acetonitrylu i 95% ultraczystej wody z prędkością 0,5 ml/min. Pozwól mu pracować przez 20–30 minut, aby osiągnąć stabilne ciśnienie i linię bazową.
    5. Po ustaleniu stabilnej linii podstawowej zmień skład roztworu na 5% acetonitrylu i 95% fazy ruchomej octanu sodu. Równowaga przez 30 minut.
    6. Włącz lampę w detektorze fluorescencji i pozwól jej się rozgrzać.
    7. W międzyczasie włącz również pompę zakolumnową na natężenie przepływu 0,1 ml/min. Pozwól jej osiągnąć stabilne ciśnienie około 500 psi po około 20 minutach.
    8. Przygotuj standardy.
      1. W przypadku KYNA należy rozpocząć od roztworu podstawowego o stężeniu 1 mM i rozcieńczyć go, aby przygotować 5 standardowych stężeń (tj. 10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM i 500 pM).
        UWAGA: W ten sposób uzyskana zostanie standardowa krzywa w zakresie od 200 fmoli do 10 fmoli na 20 μl wstrzyknięcia.
      2. W przypadku kinureniny należy rozpocząć od roztworu podstawowego o stężeniu 1 mM i rozcieńczyć go, aby przygotować 5 standardowych stężeń (tj. 10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM i 500 nM).
        UWAGA: W ten sposób uzyskano standardową krzywą w zakresie od 200 pmoli do 10 pmoli na 20 μl wstrzyknięcia.
    9. Skonfiguruj oprogramowanie systemowe HPLC, aby kontrolować parametry sekwencji próbek i umożliwić automatyczne wstrzykiwanie wielu próbek.
      1. Na ekranie "Uruchom próbkę" kliknij "Plik" i przeciągnij w dół do "Utwórz nowy zestaw próbny". Gdy otworzy się nowe okno, wybierz "Opróżnij". Indywidualnie wymień wszystkie wzorce (patrz krok 2.3.8) lub próbki w kolejności, w jakiej powinny być uruchamiane.
      2. W kolumnie "Funkcja" oznacz wzorce i próbki. Wzorce powinny być badane na początku i na końcu sekwencji. Wstrzykiwać wodę między każdymi 5 próbkami.
      3. Ustawić czas pracy dla każdej próbki na 15 minut. Wstrzyknąć 20 μl próbki z wzorców i preparatu osocza lub wstrzyknąć 30 μl próbki z preparatu homogenatu mózgu.
      4. Ustaw długości fal wzbudzenia i emisji (w zależności od ocenianego związku) dla kinureniny do wzbudzenia: 365 nm, emisji: 480 nm, i czasu retencji: ~6 min, a dla KYNA do wzbudzenia: 344 nm, emisji: 398 nm, i czasu retencji: ~11 min.
      5. Po ustawieniu wszystkich parametrów i zrównoważeniu maszyny uruchom sekwencję.
      6. Aby określić ilościowo dane, przejdź do ekranu "Przeglądaj projekt". W zakładce "Zestawy próbek" kliknij dwukrotnie zestaw próbek, który ma zostać określony ilościowo. Z listy wszystkich wstrzyknięć zaznacz wszystkie standardy i kliknij prawym przyciskiem myszy. W nowym oknie wybierz "Proces", a następnie użyj menu rozwijanego, aby wybrać "Kalibruj i kwantyfikuj" obok "Jak":
      7. Ponownie zaznacz wszystkie standardy, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Przejrzyj". Gdy chromatogramy się otworzą, użyj przycisków u góry, aby "Integrować", a następnie "Kalibrować" każdy wzorzec; Spowoduje to automatyczne utworzenie krzywej standardowej.
      8. Wróć do zakładki "Sample Sets" i kliknij dwukrotnie na sample set. Następnie podkreśl wszystkie standardy. Powtórz proces opisany powyżej, ale zamiast tego wybierz "Ilościowo" z menu rozwijanego. Ponownie zaznacz wszystkie próbki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Recenzja". Po otwarciu chromatogramów użyj przycisków u góry, aby "Zintegrować", a następnie "Określić ilościowo" każdą próbkę.
        UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie stężenia każdej próbki w oparciu o wcześniej utworzoną krzywą wzorcową.

3. Paradygmat pasywnego unikania

UWAGA: Te eksperymenty behawioralne zostały zaprojektowane na podstawie naszych wyników biochemicznych z ostrym wyzwaniem kynureniny. Aby zmaksymalizować wzrost KYNA w mózgu, kynureninę (100 mg / kg) podawano w ZT 0, 2 godziny przed sesją treningową w paradygmacie pasywnego unikania w celu przetestowania uczenia się za pośrednictwem hipokampa, które miało miejsce przy ZT 2. Aparat składa się z 2 jednakowych komór (21,3 cm wysokości, 20,3 cm szerokości i 15,9 cm głębokości) oddzielonych drzwiczkami gilotynowymi i umieszczonych w dźwiękoszczelnym pudełku. Dwie komory aparatury badawczej są określane jako "jasna strona" i "ciemna strona". Ścianki jasnej strony są przezroczyste, a podczas prób włączy się światło, aby jeszcze bardziej oświetlić ten przedział. Ściany ciemnego przedziału są całkowicie zakryte, aby utrzymać stan zaciemnienia.

  1. Dzień 1: próba treningowa
    1. Przed badaniem należy oczyścić aparaturę 70% etanolem.
    2. Przyprowadź zwierzęta do pomieszczenia testowego.
    3. Delikatnie umieść zwierzę doświadczalne po jasnej stronie aparatury, a następnie zamknij i zatrzaśnij drzwi aparatu i dźwiękoszczelną skrzynkę.
    4. Korzystając z powiązanego oprogramowania, rozpocznij wersję próbną. Na ekranie głównym wybierz "Plik", a następnie "Otwórz sesję" z menu rozwijanego. W nowym oknie upewnij się, że wybrano właściwą procedurę i aparaturę, a następnie kliknij "Zamknij". Następnie wybierz "Konfiguruj", a następnie "Sygnały". W nowym oknie wybierz odpowiednie urządzenie i kliknij "Wydaj".
      UWAGA: Oprogramowanie zainicjuje włączenie światła po jasnej stronie urządzenia i otworzy drzwiczki gilotyny między dwiema komorami. Zostanie zainicjowany licznik czasu.
    5. Gdy zwierzę całkowicie znajdzie się po ciemnej stronie aparatu, drzwiczki gilotyny zamkną się i zostanie dostarczony nieunikniony wstrząs stopy (0,56 mA przez 1 s).
    6. Zapisać czas, jaki upłynął, zanim zwierzę znalazło się w ciemnym pomieszczeniu.
    7. Po tym, jak zwierzę otrzyma wstrząs, należy odczekać 30 sekund czasu na regenerację przed wyjęciem zwierzęcia z aparatu.
    8. Umieść zwierzę z powrotem w jego domowej klatce.
    9. Przed rozpoczęciem próby z kolejnym zwierzęciem należy wytrzeć aparat do czysta mokrym ręcznikiem i wyrzucić wszelkie granulki kału.
    10. Po wyszkoleniu wszystkich zwierząt zwróć je do ośrodka dla zwierząt.
  2. Dzień 2: próba testowa
    1. Przyprowadź zwierzęta z powrotem do pomieszczenia testowego 24 godziny po próbie szkoleniowej. Rozpocznij próbę testową dla pierwszego zwierzęcia, umieszczając je po jasnej stronie aparatu, zamykając i zatrzaskując drzwi i dźwiękoszczelne pudełko.
    2. Rozpocznij próbę testową za pomocą tych samych poleceń programowych, co poprzedniego dnia; światło włączy się po jasnej stronie aparatu i otworzą się drzwi gilotyny między dwoma komorami. Zostanie zainicjowany licznik czasu.
    3. Gdy zwierzę wejdzie do ciemnego przedziału, drzwiczki gilotyny zamkną się. Zapisz czas, który upłynął.
      UWAGA: Badanie zostanie zakończone za pomocą oprogramowania po maksymalnie 300 sekundach, jeśli zwierzę pozostanie po jasnej stronie aparatury testowej.
    4. Umieść zwierzę z powrotem w jego klatce domowej i wyczyść aparaturę (zgodnie z opisem w kroku 3.1.9) przed rozpoczęciem próby z następnym zwierzęciem.

4. Analiza snu

  1. Chirurgiczne wszczepienie bezprzewodowego nadajnika EEG/EMG
    UWAGA: Nadajniki telemetryczne należy wysterylizować i przygotować przed zabiegiem.
    1. Za pomocą żyletki delikatnie usuń niewielką część plastikowej powłoki, aby odsłonić przewody przewodów. Umieść nadajniki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej roztworem sterylizującym [np. Wavecide (2,65% aldehydu glutarowego)].
      1. Pozostawić nadajniki w roztworze dezynfekującym na co najmniej 12 godzin. Następnie, przed zabiegiem, należy przenieść roztwór do pojemnika na odpady. Przepłucz nadajnik sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
    2. W dniu zabiegu należy zważyć zwierzę przed umieszczeniem go w komorze anestezjologicznej. Wyindukuj 3-5% izofluranu za pomocą 100%O2.
    3. Po udanym znieczuleniu usuń zwierzę i ostrożnie ogol za pomocą elektrycznej maszynki do golenia czubek głowy i szyję, a także niewielką kępkę włosów z tyłu ciała, nieco po lewej stronie i poniżej klatki piersiowej.
    4. Karprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie w celu znieczulenia pooperacyjnego.
    5. Umieść pod zwierzęciem termostatycznie sterowaną poduszkę grzewczą z ciepłą wodą o temperaturze 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia podczas zabiegu.
    6. W ramce stereotaktycznej umieść zwierzę na stożku nosowym, aby utrzymać stan znieczulenia i umieść nauszniki, aby ustabilizować głowę. Wysterylizuj ogoloną skórę za pomocą naprzemiennych wacików z peelingu betadynowego i 70% etanolu. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby je nawilżyć.
    7. Aby zapewnić odpowiednie znieczulenie przed pierwszym nacięciem, należy użyć testu szczypania palców u stóp.
    8. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj nacięcie od tyłu oczu do tyłu szyi. Czaszka i grzbietowy mięsień szyjny szyi powinny być odsłonięte.
    9. Jeśli to konieczne, aby odsłonić czaszkę, użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby usunąć wszelkie błony. Zaciski Micro-bulldog mogą być używane do trzymania skóry z dala od czaszki. Zlokalizuj i zaznacz pozycję bregmy. Wywierć 2 otwory na zadziory i włóż metalowe 2,0 mm z przodu/+1,5 mm z boku i 7,0 mm z tyłu/-1,5 mm z boku w stosunku do bregmy. Wykonaj 2 obroty, aby dokręcić. Przykryj odsłoniętą czaszkę kawałkiem gazy.
    10. Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w jamie ciała, tuż pod żebrami.
    11. Na arkuszu chirurgicznym należy zapisać numer seryjny nadajnika, który ma zostać wszczepiony.
    12. Włóż sterylny nadajnik do jamy ciała. Przewody powinny nadal znajdować się na zewnątrz korpusu.
    13. Użyj wchłanialnych szwów, aby zszyć ścianę mięśnia, upewniając się, że wszystkie odprowadzenia są zebrane na jednym końcu nacięcia.
    14. Zdejmij gazę z głowy i unieś skórę tuż pod nacięciem. Wprowadź parę długich sterylnych hemostatów pod skórę od nacięcia głowy do nacięcia z boku. Utrzymuj nacisk na skórę, aby zminimalizować wszelkie obrażenia.
      1. Gdy hemostatyki będą widoczne w pobliżu nacięcia ciała, przytnij nożyczkami chirurgicznymi wszelkie błony, które mogą je pokryć, i chwyć cztery przewody przekaźnikowe z hemostatykami. Powoli wyciągnij hemostatyki, tak aby druty leżały pod skórą i biegły do czaszki.
    15. Wyznacz, które 2 przewody zostaną podłączone do czaszki. Za pomocą kleszczy jedną ręką chwyć koniec drutu, a drugą tuż pod końcem plastikowej osłony. Pociągnij za drut, aż będzie można po prostu dostrzec poszczególne pętle.
    16. Szczelnie owiń odsłonięty drut wokół jednej z metalowych 3–4x. Po zabezpieczeniu dokręć, aby zapobiec plątaniu się drutu i odetnij dodatkowy drut. Powtórz to z drugim przewodem i śrubą.
    17. Wyciągnij oba przewody EEG z jamy ciała tak, aby przylegały do czaszki.
    18. Użyj cementu dentystycznego, aby pokryć i przewody korowe, tworząc czapkę nad odsłoniętą czaszką. Upewnij się, że żaden cement dentystyczny nie przykleja się do skóry lub mięśni i nie tworzą się ostre krawędzie. Poczekaj, aż cement dentystyczny wyschnie.
      Uwaga: Czapka powinna być na tyle mała, aby można było zszyć skórę na wierzchu.
    19. W przypadku przewodów EMG chwyć koniec przewodu i plastikowej osłony zgodnie z opisem w kroku 4.1.15. Rozciągnij drut, aż poszczególne pętle będą wyraźnie widoczne.
    20. Wprowadzić igłę 22 G pod mięsień szyi po prawej stronie na 2–3 mm, zanim pozwolisz mu się wyłonić. Za pomocą szwów niewchłanialnych umieść pojedynczy, luźny szew wokół osadzonej igły.
    21. Nawlecz drut EMG na igłę i wyciągnij igłę, pozwalając drutowi EMG przewlec się pod mięsień. Zaciśnij szew, aby upewnić się, że drut pozostaje na swoim miejscu i przypnij dodatkowy drut, który może wyłonić się z mięśnia.
    22. Powtórzyć kroki 4.1.20 i 4.1.21 dla drugiego elektrody EMG, około 1 mm w dół od pierwszego odprowadzenia.
    23. Wyciągnij oba przewody EMG z jamy ciała tak, aby przylegały do mięśnia.
    24. Użyj niewchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie głowy i szyi. Wsuń cały dodatkowy drut pod skórę ciała i użyj klipsów do ran, aby zamknąć nacięcie ciała.
    25. Nałóż maść lidokainową na oba miejsca nacięcia, aby pomóc zwierzęciu w bólu pooperacyjnym
      26. .
    26. Umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej, pozwalając klatce usiąść na poduszce grzewczej, dopóki zwierzę nie dojdzie do siebie po znieczuleniu.
      Uwaga: Zwierzę powinno dojść do siebie przez 7–10 dni przed rozpoczęciem nagrań.
  2. Zapis EEG/EMG
    UWAGA: W tym protokole podaliśmy sól fizjologiczną lub kinureninę w dawce ZT 0, a następnie rejestrowaliśmy wzorce snu i czuwania zwierzęcia przez 24 godziny.
    1. Wykonaj wszystkie nagrania snu w wyznaczonym pomieszczeniu, w którym zwierzęta nie będą przerywane na czas trwania nagrania.
    2. Umieść klatkę domową zwierzęcia (z wszczepionym nadajnikiem EEG/EMG) na odbiorniku. Włącz chirurgicznie wszczepiony nadajnik za pomocą magnesu.
      UWAGA: Gdy nadajnik jest aktywowany, na odbiorniku powinna pojawić się lampka.
    3. Skonfiguruj rejestrację danych EEG/EMG za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
      1. Wybierz "Eksperyment", a następnie "Utwórz" z menu rozwijanego. Nazwij eksperyment, a następnie zapisz go. Następnie wybierz "Sprzęt", a następnie "Edytuj konfigurację MX2".
      2. W nowym oknie wybierz wszystkie nadajniki używane w eksperymencie i wskaż, z którym padem odbiorczym każdy z nich jest sparowany. Gdy będziesz gotowy, rozpocznij nagrywanie, naciskając "Rozpocznij wszystkie ciągłe".
    4. Po zakończeniu eksperymentów wybierz "Stop All Continuous" w powiązanym oprogramowaniu i wyłącz nadajniki za pomocą magnesu.
    5. Poddaj zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie punkcję serca. Ostrożnie wyjmij nadajnik, ponownie otwierając nacięcie wzdłuż czubka głowy nożyczkami chirurgicznymi i odcinając przewody od cementu dentystycznego i mięśnia szyi.
    6. Następnie otwórz jamę ciała, zlokalizuj nadajnik i powoli wyjmij go z ciała.
  3. Analiza EEG/EMG
    1. Użyj powiązanego oprogramowania, aby przeanalizować dane dotyczące snu i czuwania. Otwórz program i wybierz "Dodaj nową lokalizację". W nowym oknie wybierz dane, aby zaimportować je do oprogramowania scoringowego.
      UWAGA: Spowoduje to utworzenie nowego pliku w oprogramowaniu zawierającego wszystkie surowe przebiegi zebrane podczas eksperymentu.
    2. Ręcznie oceń stany czujności dla żądanych eksperymentów. Po zdobyciu punktów przeanalizuj parametry, takie jak całkowity czas trwania, liczba napadów i średni czas trwania walki w różnych stanach czujności [szybki ruch gałek ocznych (REM), non-REM (NREM) i czuwanie].
      UWAGA: Analiza może być przeprowadzona na całym nagraniu lub skrócona do określonych punktów czasowych. W tym przypadku analizę przeprowadzono dla okresu rejestracji od ZT 0 do ZT 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zwalidować zastosowanie dostrzyczynowej iniekcji kynureniny jako metody podniesienia poziomu KYNA w mózgu, przeprowadzono analizę tkanek metodą HPLC. Krzywe wzorcowe (Rysunek 1) zostały sporządzone przy użyciu odpowiedniego oprogramowania, co umożliwiło ilościowe oznaczenie próbek tkanek. Reprezentatywne chromatogramy dla kynureniny i KYNA przedstawiono na Rysunku 2. Kynureninę zaobserwowano przy czasie retencji 6 min, natomi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać wiarygodną ocenę KYNA w mózgu po podaniu obwodowej kinureniny, kluczowe znaczenie ma połączenie i interpretacja eksperymentów biochemicznych i funkcjonalnych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który pozwala nowym użytkownikom ustalić skuteczne metody pomiaru stężenia kinureniny w osoczu i KYNA mózgu szczurów. Pomiar kinureniny w osoczu potwierdził dokładne wstrzyknięcie, a pomiar metabolitu KYNA potwierdza syntezę de novo w mózgu. Istnieje kilka zalet opisanej metody fluorometrycznej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Obecne badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Institutes of Health (R01 NS102209) oraz darowiznę od Clare E. Forbes Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczury WistarCharles River Laboratoriesdorosły samiec, 250-350 g
siarczanu L-kinureninyKolumna Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 (4 mm x 150 mm)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
Materiały montażowePlasticsOne00-96 X 1/16
Szwy niewchłanialneMedRep Express699BCP Medical Monomid Czarne Nylonowe Szewy, 4-0, P-3, 18", PUDEŁKO 12
Szwów WchłanialnychEthiconJ310H4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental CementStoelting Co.51458
WiertłoStoelting Co.5145510,45 mm
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Alliance System HPLC
E2695 moduł separacyjnyWaters176269503
2475 detektor fluorescencjiWody
menedżer odczynników po kolumnieWaters725000556
komputer LenovoWaters668000249
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Pasywna skrzynka unikająca dla szczurów
Extra wysoka kabina dźwiękochłonna MDFMedAssociatesENV-018MDWnętrze: 22 "(szer.) x 22" (wys.) x 16" (gł.)
modulator kanału środkowego komoraMedAssociatesENV-010MC
Podłoga kratkowa ze stali nierdzewnej dla szczurówMedAssociatesENV-010MB-GF
Automatyczne drzwi gilotynoweMedAssociatesENV-010B-S
Szybkozłączka przenośna z siatką podłogową dla szczurówMedAssociatesENV-010MB-QD
Światło stymulacyjne, soczewka 1" biała, montowana na panelu modułowymMedAssociatesENV-221M
Moduł Sonalert z regulacją głośności do komory dla szczurówMedAssociatesENV-223AM
Pakiet SmartCtrl 8 wejść/16 wyjśćMedAssociatesDIG-716P2
8-kanałowe sterowanie IR dla skrzynek wahadłowychMedAssociatesENV-253C
Źródło podczerwieni i paski detektoraMedAssociatesENV-256
Stołowa szafa interfejsowa, 120 V 60 HzMedAssociatesSG-6080C
Dwuzakresowy moduł awersyjnej stymulacji prądem stałymMedAssociatesENV-410B
Półprzewodnikowy moduł mieszacza podłogowegoMedAssociatesENV-412
Podwójny moduł kontroli wstrząsów A/BMedAssociatesENV-415
2' 3-pinowy przedłużacz mini-molexMedAssociatesSG-216A-2
10' wyjściowy przeciwwstrząsowy, DB-9 M/FMedAssociatesSG-219G-10
przeciwwstrząsowy wahadłowca 15', 6MedAssociatesSG-219SA
Mała szafka stołowa i zasilacz, 120 V 60 HzPakiet interfejsu PCI MedAssociatesSG-6080D
MedAssociatesDIG-700P2-R2
Zestaw narzędzi do unikania shuttle boxMedAssociatesSOF-700RA-7
Nazwa< strong>CompanyNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt do monitorowania snu i czuwania
Ponehmah softwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 Interfejs akwizycji źródłaData Sciences International (DSI)PNM-P3P-MX204
Komputer Dell, Optiplex 7020, Windows 7, wersja 64-bitowaData Sciences International (DSI)271-0112-013
19-calowy monitor komputerowy DellData Sciences International (DSI)271-0113-001
Odbiorniki do klatek plastikowych, 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Router VPN Cisco RV130Data Sciences International (DSI)RV130
Matrix 2.0Data Sciences International (DSI)271-0119-001
Przełącznik sieciowyData Sciences International (DSI)SG200-08P
Oprogramowanie NeuroscoreData Sciences International (DSI)271-0171-CFG
Przetwornik dwukanałowy z potencjałem biologicznym, model TL11M2-F40-EETData Sciences International (DSI)270-0134-001
186247500 Empower software Waters 176706100 wahadłowa

Bibliografia

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szlak kynureninowyparadygmat biernego unikaniaarchitektura snu i czuwaniatestowanie pami ci kontekstowejpomiar kynureniny w osoczuformowanie KYNA w m zguanaliza HPLCdetekcja fluorescencyjna

Powiązane artykuły