In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Podsumowanie

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

Streszczenie

Wiele aspektów podstawowej czasoprzestrzennej organizacji komórek jest regulowanych przez systemy typu reakcyjno-dyfuzyjnego. Rekonstrukcja takich układów in vitro pozwala na szczegółowe badania mechanizmów leżących u ich podstaw, które nie byłyby możliwe do zrealizowania in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół rekonstytucji in vitro systemu MinCDE Escherichia coli, który umieszcza przegrodę podziału komórkowego w środku komórki. Test ma na celu dostarczenie tylko składników niezbędnych do samoorganizacji, a mianowicie błony, dwóch białek MinD i MinE oraz energii w postaci ATP. W związku z tym wytwarzamy otwartą komorę reakcyjną na szkiełku nakrywkowym, na którym tworzy się podparta dwuwarstwa lipidowa. Otwarta konstrukcja komory pozwala na optymalne przygotowanie dwuwarstwy lipidowej i kontrolowaną manipulację zawartością sypką. Dwa białka, MinD i MinE, a także ATP, są następnie dodawane do objętości masowej nad błoną. Obrazowanie jest możliwe za pomocą wielu mikroskopów optycznych, ponieważ konstrukcja obsługuje zarówno mikroskopię konfokalną, szerokokątną, jak i TIRF. W odmianie protokołu dwuwarstwa lipidowa jest tworzona na wzorzystym podłożu, na mikrostrukturach PDMS w kształcie komórki, zamiast na szkle. Obniżenie roztworu objętościowego do krawędzi tych przedziałów zamyka reakcję w mniejszej komorze i zapewnia granice, które pozwalają naśladować zachowanie oscylacyjne in vivo. Podsumowując, opisujemy protokoły rekonstrukcji systemu MinCDE zarówno z ograniczeniem przestrzennym, jak i bez niego, co pozwala naukowcom precyzyjnie kontrolować wszystkie aspekty wpływające na tworzenie wzorców, takie jak zakresy stężeń i dodawanie innych czynników lub białek, a także systematycznie zwiększać złożoność systemu w stosunkowo prostej konfiguracji eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Wzorce czasoprzestrzenne są niezbędne w przyrodzie, regulując złożone zadania zarówno na poziomie wielokomórkowym, jak i komórkowym, od morfogenezy do regulowanego podziału komórek^1,2. Systemy reakcjonacyjno-dyfuzyjne odgrywają ważną rolę w ustalaniu tych wzorców, ale nadal nie są dobrze poznane. Doskonałym przykładem systemu reakcyjnie dyfuzyjnego i najlepiej scharakteryzowanym systemem biologicznym do tej pory jest system MinCDE Escherichia coli^3,4,5,6,7. System MinCDE oscyluje od bieguna komórki do bieguna komórki w E. coli, aby określić środek komórki jako przyszłe miejsce podziału. System ten opiera się na ATPazie MinD, białku aktywującym ATPazę MinE oraz błonie jako przestrzennej macierzy reakcji⁸. MinC nie jest częścią mechanizmu tworzenia wzorca, ale jest rzeczywistym czynnikiem funkcjonalnym: inhibitorem głównego białka divisom FtsZ^5,6. MinC wiąże się z MinD i dlatego podąża za oscylacjami, co skutkuje uśrednionym w czasie gradientem stężenia białka, który jest maksymalny na biegunach komórki i minimalny w środku komórki, umożliwiając polimeryzację FtsZ tylko w midcell^9,10. System MinCDE jest częścią większej rodziny ATPaz Walker A, które są kluczowe dla organizacji czasoprzestrzennej u bakterii², do pozycjonowania i transportu kompleksów białkowych¹¹ i plazmidów¹² oraz do regulacji podziału komórek¹³ i segregacji chromosomów¹⁴. W związku z tym system reakcjacyjno-dyfuzyjny MinCDE nie tylko reprezentuje archetypowy system reakcyjny-dyfuzyjny, ale przyciągnął również uwagę ze względu na jego znaczenie dla organizacji czasoprzestrzennej u bakterii.

Szczegółowe badania funkcjonalne systemu MinCDE in vivo są skomplikowane, ponieważ manipulacja białkami i delecja genów zazwyczaj prowadzą do defektów podziału komórek. Co więcej, zmiana składu błony lub właściwości cytozolu in vivo jest bardzo trudna^15,16. Zmiany w systemie i czynniki wpływające są trudne do zinterpretowania w złożonym środowisku komórki, tym bardziej, jeśli jest ono zaburzone w tak istotnej funkcji, jak podział komórki. W związku z tym my i inni zwróciliśmy się ku podejściu do rekonstytucji in vitro, redukując system do jego podstawowych składników: MinD, MinE, ATP jako źródła energii i wspieranej dwuwarstwy lipidowej jako matrycy reakcyjnej^6,17,18. To oddolne podejście pozwala na szczegółowe zbadanie mechanizmu samoorganizacji bez złożoności żywej komórki. Białka tworzą przemieszczające się fale powierzchniowe⁶ i inne rodzaje wzorców^17,19 w tych warunkach, aczkolwiek o długości fali, która jest zwykle o około wielkość większa niż in vivo. Zastosowanie otwartej komory ułatwia precyzyjną kontrolę wszystkich aspektów wpływających na tworzenie wzorca: stężenia białek⁶, właściwości białek²⁰, skład błony¹⁰, skład buforu i stężenie ATP⁶, a także dodanie innych czynników, takich jak czynniki tłumiące²¹ i inne białka divisome²². Dla porównania, odtworzenie in vitro systemu MinCDE w komórce przepływowej^18,19,23 można wykorzystać do zbadania wpływu flow^17,23, warunki ograniczające białko¹⁹, skład błony¹⁹ i pełne uwięzienie 3D¹⁸ na wzorcach białkowych, ale sprawia, że dokładna kontrola stężenia białka/składnika i sekwencyjne dodawanie składników jest znacznie bardziej skomplikowane.

Korzystając z tej otwartej komory, również ukształtowaliśmy podparcie płaskich dwuwarstw lipidowych, dzięki czemu można zbadać, jak granice geometryczne wpływają na tworzenie wzorców²¹, zjawisko, które ostatnio zostało również zbadane in vivo przy użyciu bakterii uformowanych w mikrostruktury⁷. Zastosowaliśmy również ten test, aby zbadać, w jaki sposób zdefiniowane mutacje w MinE wpływają na tworzenie wzorca systemu²⁰. Co więcej, ten sam podstawowy format testu został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób tworzenie wzorca może być kontrolowane przez światło, wprowadzając do testu peptyd MinE usieciowany azobenzenem i obrazując za pomocą mikroskopii TIRF²⁴.

Stwierdziliśmy, że kluczem do odtworzenia wzorca MinDE obserwowanego in vivo w systemie in vitro, było zamknięcie. Zastosowanie mikrokompartmentów w kształcie pręcików, o wymiarach dostosowanych do większej długości fali MinDE in vitro (10 x 30 μm), pokrytych podpartą dwuwarstwą lipidową, umożliwiło odtworzenie oscylacji MinDE między biegunami i tworzenie gradientu białek^10,25. W tym teście podparte dwuwarstwy lipidowe są osadzane na wzorzystym podłożu PDMS, które zawiera kilkaset replik mikrokompartmentów w kształcie pręcików, które pozostają otwarte na górze. W ten sposób reakcję można zapoczątkować w otwartej komorze, a następnie bufor jest opuszczany do krawędzi mikrokompartmentów, ograniczając w ten sposób reakcję do niewielkiej objętości. Mimo że te komory mają z jednej strony interfejs bufora powietrznego, a zatem nie reprezentują pełnego zamknięcia 3D przez błonę, dynamika białka naśladowała oscylacje in vivo^10,25. W porównaniu z pełnym zamknięciem 3D, które daje bardzo podobne wyniki¹⁸, otwarty test mikrostruktur jest stosunkowo prosty i łatwy w obsłudze, a także może być wykonywany przez laboratoria, które nie są wyposażone w specjalistyczny sprzęt mikrofluidyczny i pomieszczenia czyste

.

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół odtwarzania formowania wzorca MinCDE na wspieranych dwuwarstwach lipidowych in vitro przy użyciu otwartej komory, który pozwala na kontrolę wszystkich komponentów i łatwy dostęp za pomocą mikroskopii optycznej i, z niewielkimi modyfikacjami, można go również dostosować do technik sondowania powierzchni²⁶. Oprócz dwuwarstw lipidowych podpartych planarnie, pokazujemy również, w jaki sposób można uzyskać uwięzienie białek za pomocą prostych, wzorzystych dwuwarstw lipidowych na mikrostrukturach PDMS w kształcie pręcików. Testy te, choć zoptymalizowane pod kątem systemu MinCDE, mogą być również przenoszone do innych systemów białkowych, które oddziałują w podobny sposób z błoną, takich jak FtsZ²⁷ lub minimalna kora aktynowa²⁸.

Protokół

1. Produkcja białka

1. Ekspresja białek
   1. Przekształć E. coli BL21 (DE3) pLysS z odpowiednim plazmidem dla ekspresji MinD⁶, EGFP-MinD²⁹, mRuby3-MinD²⁴, MinE⁶ lub MinC³⁰. Aby zapoznać się z mapami plazmidowymi, zapoznaj się z informacjami dodatkowymi.
   2. Zaszczepić nocną kulturę w pożywce LB pojedynczą kolonią przy użyciu odpowiednich antybiotyków (np. 100 μg/ml ampicyliny lub 50 μg/ml kanamycyny) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 14-16 godzin, wstrząsając.
   3. Zaszczepić 500 ml pożywki przeciw gruźlicy zawierającej odpowiedni antybiotyk za pomocą nocnej kultury (rozcieńczenie 1:200) i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 180 obr./min.
   4. Indukuj ekspresję białka, dodając 0,5 mM IPTG, gdy kultura osiąga gęstość optyczną przy 600 nm 0,5-0,7. W przypadku EGFP-MinD lub mRuby3-MinD należy przenieść komórki do inkubatora w temperaturze 16 °C i hodować komórki przez 14-16 godzin, a w przypadku MinC, MinD lub MinE hodować komórki przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C po indukcji.
      Uwaga: Indukcja ekspresji MinC, MinD lub MinE jest toksyczna dla komórek, ponieważ nadekspresja powoduje defekty podziału komórek; Dlatego ważne jest, aby czas inkubacji w temperaturze 37 °C był utrzymywany poniżej 4 godzin. Jeśli potrzeba więcej białka, zwiększ ilość kultury, ale nie czas inkubacji.
   5. Po odpowiednim czasie inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie przy 4000 x g przez 10 minut i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
2. Oczyszczanie białek
   Uwaga: Białka mogą być oczyszczane za pomocą wstępnie zapakowanych kolumn Ni-NTA w zautomatyzowanym systemie oczyszczania białek lub za pomocą kulek Ni-NTA do oczyszczania grawitacyjnego na stanowisku badawczym.
   1. Do oczyszczania za pomocą wstępnie wypełnionych kolumn Ni-NTA w automatycznych systemach oczyszczania białek należy użyć buforu A1 (50 mM fosforanu sodu o pH 8,0, 500 mM NaCl, 10 mM imidazolu), buforu B1 (50 mM fosforanu sodu o pH 8,0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu) i buforu C1 (50 mM fosforan sodu o pH 8,0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol). Do oczyszczania stołu grawitacyjnego za pomocą kulek Ni-NTA należy użyć buforu A2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu), buforu B2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu) i buforu C2 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu). Bezpośrednio przed użyciem uzupełnić wszystkie 10 mM ß-merkaptoetanolem lub 0,4 mM TCEP (tris(2-karboksetylo)fosfiną) jako środkiem redukującym.
   2. Zawiesić komórki w 20-30 ml buforu A1 lub A2 uzupełnionego inhibitorem proteazy wolnym od EDTA, 100 μg / ml lizozymu, ~ 250 U / ml DNazy i 0,2 mM Mg²⁺-ADP (Mg²⁺-ADP w przypadku oczyszczania MinD lub EGFP-MinD, ze 100 mM zapasu ADP w 100 mM MgCl₂ o pH dostosowanym do 7,5).
   3. Lizować komórki za pomocą sonikatora końcówki (30% amplitudy, 2,5 min, 30 s impulsu, 30 s wyłączenia), jednocześnie utrzymując fiolkę zawierającą komórki w łaźni lodowej.
   4. Usunąć resztki komórek, odwirowując lizat komórkowy przez 45 minut w temperaturze 25 000 x g i 4 °C.
   5. Inkubować supernatant na kolumnie Ni-NTA lub kulkach Ni-NTA.
      1. W przypadku wstępnie napakowanych kolumn Ni-NTA należy załadować próbkę do kolumny za pomocą pompy do pobierania próbek automatycznego systemu oczyszczania białka.
      2. W celu oczyszczenia laboratoryjnego należy inkubować próbkę z kulkami Ni-NTA w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml na obrotowej wytrząsarce w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. W kolejnych krokach przenieś kulki Ni-NTA do pustej kolumny za pomocą pipety o pojemności 25 ml.
   6. Przemyć co najmniej 5 objętościami kolumn buforu A1 lub A2.
   7. Przemyć co najmniej 5 objętościami kolumny buforu B1 lub B2.
   8. Białko elutowane za pomocą buforu C1 lub C2.
   9. Oceń czystość białka za pomocą SDS-PAGE.
   10. Opcjonalnie: Dalsze oczyszczanie białka poprzez nałożenie go na żelową kolumnę filtracyjną zrównoważoną w buforze magazynującym (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerolu, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg²⁺-ADP w przypadku MinD)).
       Uwaga: Filtracja żelowa jest zalecana dla MinD w celu usunięcia zagregowanej frakcji białkowej.
   11. Jeśli filtracja żelowa nie jest stosowana, należy wymienić bufor elucyjny Ni-NTA na bufor magazynowy (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerolu, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (0,2 mM Mg-ADP w przypadku MinD)) za pomocą kolumny odsalającej grawitacyjnie (patrz tabela materiałów).
   12. Szokowe zamrożenie białek w podwielokrotnościach w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
   13. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda i określ aktywność białka za pomocą testu ATPazy²⁰.
       Uwaga: Nie należy oceniać stężenia białka na podstawie absorpcji przy 280 nm. Obecność nukleotydów podczas oczyszczania MinD i brak tryptofanów w MinE zniekształcają pomiary stężenia A₂₈₀. Zamiast tego użyj testów Bradforda lub BCA, aby zmierzyć stężenie białka.
3. Znakowanie białkami
   Uwaga: Fuzja białka fluorescencyjnego z małym białkiem MinE wywołuje poważne zmiany w jego właściwościach dyfuzyjnych i funkcji; W związku z tym znakowanie chemiczne białka (cysteina w pozycji 51) jest preferowane w stosunku do fuzji białek fluorescencyjnych.
   1. Rozpuścić 0,125 mg koniugatu maleimid-barwnik w 5-10 μl DMSO (dimetylosulfotlenku) i dodać pod wpływem wstrząsania do 0,5 ml podwielokrotności MinE w buforze do przechowywania o pH 7,2, przygotowanego w sposób opisany powyżej.
   2. Inkubować przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając lub mieszając.
   3. Oddzielić barwnik i białko za pomocą kolumny odsalającej z przepływem grawitacyjnym zrównoważonym buforem magazynowym (50 mM HEPES/KOH pH 7,2, 150 mM KCl, 10% glicerolu, 0,1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP).
   4. Aby dodatkowo usunąć nieprzyłączony barwnik, należy dializować białko w stosunku do nadmiaru buforu magazynującego.
   5. Zweryfikuj pomyślne etykietowanie, mierząc maksymalną wartość ekstynkcji dla danego barwnika i oblicz szacowaną skuteczność etykietowania. Prosimy o zapoznanie się z instrukcjami producenta barwnika, aby uzyskać szczegółowy protokół dotyczący szacowania stopnia oznakowania. Analizuj za pomocą SDS-PAGE i określaj masę całkowitą za pomocą spektrometrii mas, aby uzyskać więcej przydatnych informacji na temat jednorodności próbki i powodzenia etykietowania.

2. Przygotowanie małego pęcherzyka jednopłytkowego (SUV)

1. Wytwarzanie pęcherzyków wieloblaszkowych
   1. Oblicz ilość lipidów w chloroformie dla żądanej mieszaniny i końcowej objętości SUV. Stężenie powinno wynosić 4 mg/ml lipidów w Min-buforze (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂). W przypadku standardowego testu Min zalecana jest mieszanina 7:3 DOPC:DOPG (procent molowy). W przypadku stosowania ekstraktu lipidowego z E. coli należy użyć buforu SLB (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl) na wszystkich etapach przygotowania.
      Uwaga: Nie zaleca się stosowania ekstraktu lipidowego z polarnego lipidu E. coli dla początkujących użytkowników, ponieważ wytwarzanie jednorodnych SLB z tą mieszaniną jest znacznie trudniejsze.
   2. Za pomocą pipety wyporowej ze szklanymi końcówkami wymieszać lipidy z chloroformem w szklanej fiolce o pojemności 1,5 ml.
      1. Osuszyć lipidy pod niewielkim strumieniem azotu, powoli obracając fiolkę. Umieść lipidy pod silniejszym strumieniem azotu na 10 do 20 minut. Umieścić fiolkę zawierającą wysuszony film lipidowy w eksykatorze próżniowym i stosować próżnię przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Ponownie uwodnić lipidy w buforze Min, wirując w temperaturze pokojowej, aż mieszanina stanie się jednorodnie nieprzezroczysta.
      Uwaga: W celu wytworzenia małych pęcherzyków jednowarstwowych z pęcherzyków wielopłytkowych, lipidy mogą być wytłaczane w sposób opisany w ppkt 2.2. lub poddane sonikacji, jak opisano w ppkt 2.3. Ogólnie rzecz biorąc, ekstruzja daje węższy rozkład wielkości, co może pomóc w tworzeniu podpartych dwuwarstw lipidowych.
2. Przygotowanie SUV-a przez wytłaczanie
   1. Rozbijaj agregaty lipidowe i struktury wielopłytkowe i dalej rozpuszczaj lipidy przez zamrażanie i rozmrażanie przez 7 do 10 cykli.
      1. Przygotować zlewkę z wodą o temperaturze od 70 ° C do 99 ° C na płycie grzejnej i pojemniku z ciekłym azotem.
      2. Trzymaj fiolkę w ciekłym azocie za pomocą dużej pęsety, aż azot przestanie wrzeć. Następnie przenieść fiolkę do gorącej wody, aż roztwór całkowicie się rozmrozi. Powtarzaj te kroki, aż mieszanina lipidów stanie się przezroczysta dla oka, w zależności od mieszaniny.
   2. Zamontuj wytłaczarkę lipidową i wstępnie przepłucz system za pomocą buforu Min. Wytłaczaj mieszaninę lipidów od 35 do 41 razy przez membranę o wielkości porów 50 nm. Upewnij się, że kończysz na nieparzystej liczbie przejść, aby uniknąć agregatów, które nigdy nie przeszły przez membranę.
3. Przygotowanie SUV-a przez sonikację
   1. W celu lepszego rozpuszczenia lipidów w buforze, szklaną fiolkę zawierającą roztwór umieścić w bloku grzewczym ustawionym na 37 °C i wirować co 20 minut przez 1 minutę. Inkubować w sumie przez około 1 godzinę.
   2. Zanurzyć dno fiolki w kąpieli sonikołatora (w tej pracy 1,91 l, 80 W), mocując fiolkę na stojaku zaciskowym na wymaganej wysokości.
   3. Ustaw wysokość wody w kąpieli sonikatora tak, aby roztwór otaczający fiolkę był dokładnie poruszony przez impulsy i sonikuj mieszaninę lipidów przez około 20 minut. Sprawdź, czy sonikacja zakończyła się sukcesem, oceniając klarowność lipidów.
4. SUV-y mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia lub mrożone w temperaturze -20 °C w małych porcjach (~20 μL) i przechowywane przez kilka tygodni. Rozmrozić fiolki lub probówki w temperaturze pokojowej i ponownie poddać sonikacji, jak opisano w ppkt 2.2.3 lub 5.3, aż roztwór będzie klarowny, przed użyciem SUV do przygotowania podpartych dwuwarstw lipidowych (SLB). Należy pamiętać, że wąski rozkład wielkości SUV-ów uzyskany przez wytłaczanie jest tracony po zamrożeniu, a następnie rozmrożeniu i sonikacji.

3. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych

Uwaga: Czyszczenie i hydrofilizacja szklanych szkiełek nakrywkowych jest ważnym czynnikiem dla jednorodnych i płynnie nośników lipidowych. Szkiełka nakrywkowe można czyścić roztworem piranii w proporcji 7:2 kwasu siarkowego do 50% nadtlenku wodoru (3.1) lub plazmą tlenową w czyszczalni plazmowej (3.2). Obie metody dają podobne wyniki.

1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych metodą pirania
   1. Zastosuj roztwór piranii
      1. Rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na odwróconej szklanej szalce Petriego lub innej obojętnej powierzchni. Za pomocą szklanej pipety dodaj 7 kropli stężonego kwasu siarkowego (98%) na środek każdego szkiełka nakrywkowego.
         UWAGA: Kwas siarkowy jest silnie kwaśny i. Pracować w dygestorium i wyłącznie przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
      2. Dodaj dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka kropli kwasu.
         UWAGA: Nadtlenek wodoru działa żrąco na oczy i skórę.
      3. Przykryć reakcję i inkubować przez co najmniej 45 minut.
         Uwaga: Maksymalny czas oczekiwania w tym przypadku nie ma decydującego znaczenia dla wyniku eksperymentu i może zostać wydłużony nawet do kilku dni.
   2. Umyj szkiełka nakrywkowe oczyszczone z piranii.
      1. Podnieś szkiełka nakrywkowe pojedynczo za pomocą pęsety i spłucz kwas ultraczystą wodą. Umyte szkiełka nakrywkowe należy umieścić w nieprzywierającym uchwycie lub podobnym urządzeniu transportowym.
      2. Dokładnie spłucz każde szkiełko nakrywkowe ultraczystą wodą i osusz powierzchnię gazem pod ciśnieniem (azot, powietrze tylko wtedy, gdy nie zawiera oleju). Oczyszczoną stronę szkiełka nakrywkowego oznaczyć markerem permanentnym.
2. Plazmowe czyszczenie szkiełek nakrywkowych
   1. Spłucz szkiełka nakrywkowe nadmiarem etanolu, a następnie nadmiarem ultraczystej wody. Suche szkiełka nakrywkowe z gazem pod ciśnieniem. Zmontuj komorę zgodnie z opisem w 4.
   2. Po zmontowaniu komory, jak opisano w 4, należy pobrać szkiełka nakrywkowe z dołączoną komorą i umieścić w myjce plazmowej z tlenem jako gazem procesowym. Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić plazmą (w tej pracy zastosowano 30% mocy, ciśnienie tlenu 0,3 mbar przez 1 min). Wykonaj czyszczenie tuż przed powstaniem SLB, jak opisano w punkcie 5, ponieważ hydrofilizujący efekt czyszczenia plazmowego zanika z czasem.
      Uwaga: Czas i moc czyszczenia plazmowego powinny być zoptymalizowane przy użyciu membran znakowanych fluorescencyjnie, ponieważ zbyt małe lub nadmierne czyszczenie plazmowe może prowadzić do unieruchomienia membran lub membran z otworami.

4. Zgromadzenie Izby

1. Ostrymi nożyczkami odetnij i wyrzuć pokrywkę oraz stożkową część probówki reakcyjnej o pojemności 0,5 ml. Nałóż klej UV na górną krawędź tubki i równomiernie rozprowadź za pomocą końcówki do pipety.
2. Przyklej tubkę do góry nogami do wcześniej oczyszczonego szkiełka nakrywkowego. W przypadku czyszczenia piranii należy pamiętać o przyklejeniu jej do czyszczonej strony szkła. Utwardź klej UV, umieszczając wiele komór pod lampą 360 nm lub diodą LED na 5 do 15 minut.

5. Wspomagane tworzenie dwuwarstwy lipidowej (SLB)

1. Podgrzej wstępnie blok grzewczy do 37 °C i inkubuj 2 ml probówek reakcyjnych z buforem Min lub SLB, po 1 probówce na komorę.
2. Wdmuchnij azot do zmontowanych i utwardzonych komór, aby usunąć kurz lub inne cząstki, które mogły osiąść podczas utwardzania i montażu UV. Oczyścić plazmowo zgodnie z opisem w ppkt 3.2, jeśli szkiełka nakrywkowe nie zostały oczyszczone roztworem Piranha (3.1). Umieść komory na bloku grzewczym.
3. Rozcieńczyć 20 μl podwielokrotności czystych lipidów (w stężeniu 4 mg/ml) 130 μl buforu Min lub buforu SLB w przypadku ekstraktu lipidowego E. coli polar, uzyskując stężenie robocze 0,53 mg/ml. W przypadku, gdy lipidy zostały zamrożone, najpierw poddaj sonikację poprzez przytrzymanie probówki w soniku kąpielowym przed dodaniem buforu, a następnie ponownie sonikuj za pomocą buforu.
4. Dodaj 75 μl mieszaniny lipidów do każdej komory i ustaw timer na 3 minuty (dla mieszanin DOPC/DOPG; w przypadku innych mieszanin lipidowych może być konieczna dłuższa inkubacja). W przypadku polarnego ekstraktu lipidowego E. coli, należy pobrać pipetą CaCl₂ ze 100 mM materiału podstawowego do komory do końcowego stężenia 3 mM. W czasie inkubacji pęcherzyki pękają na powierzchni szkła hydrofilowego i łączą się, tworząc spójny SLB.
5. Po 60 sekundach dodaj 150 μl buforu Min do każdej komory.
6. Mycie komór: Po kolejnych 120 sekundach (łącznie 3 minuty) umyj każdą komorę, dodając 200 μl buforu Min lub SLB, ostrożnie pipetując kilka razy w górę i w dół, usuwając i dodając kolejne 200 μl.
   1. Po jednokrotnym umyciu każdej komory należy przystąpić do dokładnego mycia pierwszej komory, aż do zużycia 2 ml buforu. Mycie SLB wymaga pewnego doświadczenia, aby udoskonalić zakres ruchów w komorze i znaleźć odpowiednią intensywność mycia.
      Uwaga: Nigdy nie usuwaj całego płynu z komory, aby uniknąć wysuszenia SLB.
      Uwaga: Oprócz mycia, właściwości membrany będą się różnić w zależności od wielu dodatkowych czynników: rodzaju lipidów i ich względnych stężeń w mieszaninach lipidowych, metody przygotowania SUV-ów, obróbki powierzchni i wcześniejszego czyszczenia podłoża.

6. Test samoorganizacji

1. Dostosuj objętość buforu w komorze do 200 μl Min. buforu minus ilość białka i roztworu ATP, a następnie dodaj MinD, oznaczone MinD, MinE i, w razie potrzeby, MinC. Delikatnie wymieszać składniki przez pipetowanie. Przykładowe stężenia to 1 μM MinD (domieszkowane 30% EGFP-MinD), 1 μM MinE (domieszkowane 10% chemicznie znakowanym MinE) i 0,05 μM MinC, ale wzorce tworzą się w zakresie stężeń6^,10,20,30.
2. Dodaj 2,5 mM ATP (ze 100 mM ATP w 100 mM MgCl₂, pH 7,5), aby rozpocząć samoorganizację MinDE.
   Uwaga: Kolejność dodawania komponentów (MinD, MinE i ATP) może być dowolna i nie będzie miała wpływu na ostateczny wynik wzorca⁴.
3. Obserwuj samoorganizację MinDE na mikroskopie fluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów). Samoorganizację MinDE można również zaobserwować za pomocą mikroskopii TIRF. Do obrazowania eGFP-MinD należy użyć lasera argonowego o długości fali 488 nm lub porównywalnego lasera diodowego (np. 490 nm). Do obrazowania mRuby3-MinD najlepiej użyć lasera diodowego o długości fali 561 nm.
   Uwaga: Unikaj wysokiego poziomu wzbudzenia przez dłuższy czas, ponieważ my i inni¹⁷ zaobserwowaliśmy fototoksyczność w systemie MinDE, prowadzącą do nieodwracalnej polimeryzacji białka na membranie.

7. Mikrostruktury PDMS

Uwaga: PDMS (polidimetylosiloksan) to polimer, który może być używany do produkcji mikrostruktur i urządzeń mikroprzepływowych. Wzorzysta płytka krzemowa służy jako forma do odlewania struktur PDMS. Struktury PDMS służą następnie jako wsparcie dla tworzenia SLB i konfiguracji testu.

1. Albo samodzielnie wyprodukuj płytkę krzemową z mikrokompartmentami za pomocą fotolitografii (zobacz Zieske i Schwille dla szczegółowego protokołu³¹ lub Gruenberger et al. dla protokołu wideo³²) lub zamów żądaną płytkę krzemową w odlewni. Wzór płytki użytej w niniejszym dokumencie znajduje się w informacjach dodatkowych.
2. Wytwarzanie mikrostruktur PDMS z wzorzystych płytek krzemowych.
   1. Użyj plastikowego kubka, aby zważyć 10 g bazy PDMS i 1 g środka sieciującego PDMS. Albo użyć urządzenia mieszającego do wymieszania i odgazowania mieszaniny PDMS, albo ręcznie wymieszać PDMS, a następnie odgazować w próżni
   .
   2. Użyj końcówki pipety, aby upuścić niewielką ilość PDMS bezpośrednio na strukturę na płytce krzemowej.
      Uwaga: Uważaj, aby nie zarysować wafla silikonowego.
   3. Natychmiast umieść szkiełko nakrywkowe #1 na kropli PDMS i weź górny koniec czystej końcówki pipety, aby delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe do płytki silikonowej. PDMS powinien rozprowadzać się cienko między szkiełkiem nakrywkowym a płytką krzemową.
   4. Umieść wafel z szkiełkami nakrywkowymi w piekarniku i utwardzaj PDMS przez 3-4 godziny lub przez noc w temperaturze 75 °C. Wyjmij wafel z piekarnika i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą żyletki ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z dołączonym PDMS z wafla SI.
      Uwaga: Aby zapobiec zabrudzeniu lub uszkodzeniu płytki krzemowej, należy zawsze przykrywać mikrostruktury PDMS i szkiełkiem nakrywkowym. Jednak PDMS starzeje się, co powoduje pęknięcia w mikrostrukturach, dlatego nie należy używać struktur PDMS, które są starsze niż dwa do trzech tygodni.

8. Samoorganizacja w mikrostrukturach PDMS

1. Użyj szkiełek nakrywkowych z mikrostrukturami PDMS, aby przymocować komorę zgodnie z opisem w punkcie 4.
2. Oczyścić i hydrofilizować powierzchnię w urządzeniu do czyszczenia plazmą tlenową zgodnie z opisem w ppkt 3.2.2. Nie czyścić podłoży PDMS piranią.
3. Skonfiguruj test samoorganizacji MinDE zgodnie z opisem w punkcie 6.
4. Po ustawieniu testu sprawdź, czy na mikroskopie fluorescencyjnym nie tworzy się regularny wzór MinDE i prawidłowo uformowane mikrostruktury.
5. Po utworzeniu regularnych wzorów MinDE (10 - 30 minut) delikatnie pipetuj dwukrotnie w górę i w dół, aby wymieszać składniki, a następnie stopniowo usuwaj bufor, pipetując. Usunąć dużą ilość buforu za pomocą pipety o pojemności 100 μl, a następnie ostrożnie usunąć resztę za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
   Uwaga: Ten krok może wymagać trochę praktyki. Jeśli wyjmie się zbyt dużo buforu lub proces trwa zbyt długo, mikrostruktury zostaną wysuszone; Jeśli weźmie się za mało, białka nie zostaną zamknięte w mikrostrukturach, ale nadal będą tworzyć przemieszczające się fale powierzchniowe.
6. Natychmiast zamknąć komorę pokrywą, aby uniknąć wysuszenia resztkowego buforu w mikrostrukturach.
7. Aby umożliwić dłuższy czas obrazowania, włóż zwilżony kawałek gąbki do komory, a następnie zamknij pokrywką. Upewnij się, że gąbka nie styka się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego.
8. Przed obrazowaniem mikrostruktur należy sprawdzić na powierzchni, czy bufor został na tyle obniżony, że na powierzchni powyżej mikrostruktur tworzenie wzoru MinDE zostało zatrzymane. Obraz Oscylacje MinDE w mikrostrukturach. Sprawdź, czy mikrostruktury nie są wysuszone lub wysychają podczas obrazowania.
   Uwaga: Szkiełka nakrywkowe z mikrokomorami należy wyrzucać po każdym użyciu, ponieważ tworzą się pęknięcia w PDMS.

9. Analiza formacji formacji MinDE

1. Określ ilościowo długość fali, prędkość fali i profile fal samoorganizacji MinDE na dwuwarstwach lipidowych podpartych planarnie. FIJI ze standardowym zestawem dołączonych wtyczek jest wystarczający do podstawowej analizy³³.
2. Analizuj oscylacje między biegunami w mikrokompartmentach, uzyskując kimografy i uśrednione w czasie profile stężenia białek. Podstawowe kimografy można uzyskać, ponownie dzieląc szereg czasowy wzdłuż wybranej linii na FIDŻI.

Wyniki

Oczyszczanie białek zgodnie z naszym protokołem powinno dać białka Min o odpowiedniej czystości. Jako odniesienie, Rysunek 1 przedstawia obraz SDS-PAGE MinD, fluorescencyjnie oznaczony MinD, MinE i MinC. Poszczególne etapy procedury przeprowadzania testu samoorganizacji MinDE na dwuwarstwach lipidowych bez wzoru są opisane w Rysunek 2. Korzystając z tego protokołu, regularne fale powierzchniowe MinDE przemieszczające się po całej komorze (Rysunek 3). Długość fali może się nieznacznie różnić w obrębie komory, ale ogólnie wzory wyglądają podobnie. Krawędzie komory nie powinny być wykorzystywane do porównań ilościowych, ponieważ membrany, które tworzą się na kleju UV, wydają się mieć inne właściwości niż na powierzchni szkła (patrz Rysunek 3C). Przemieszczające się fale powierzchniowe można analizować, wykreślając intensywność wzdłuż kierunku propagacji (Rysunek 3B). Podczas gdy fluorescencja MinD utrzymuje się dość szybko od krawędzi natarcia fali, a następnie gwałtownie spada na krawędzi spływu, fluorescencja MinE wzrasta prawie liniowo od początku fali MinD i osiąga maksimum po MinD na krawędzi spływu, gdzie wyraźnie spada⁶.

Obok jakości białka, jakość obsługiwanych dwuwarstw lipidowych jest najbardziej krytyczna dla regularnej samoorganizacji MinCDE. Z jednej strony, jeśli membrana zostanie umyta zbyt nadmiernie lub znajdująca się pod nią powierzchnia została oczyszczona, a tym samym zbyt mocno naładowana, w membranie mogą powstać (Rysunek 6A, góra). Z drugiej strony, jeśli membrana nie zostanie odpowiednio umyta lub znajdująca się pod nią powierzchnia nie zostanie oczyszczona/hydrofilizowana, pęcherzyki przykleją się do membrany lub płynność membrany zostanie zagrożona (Rysunek 6A, na dole). Chociaż nie są one tak oczywiste, jak podczas obserwacji błony bezpośrednio za pomocą znakowanych lipidów, problemy te można również wykryć na podstawie sygnału fluorescencji MinD, ponieważ wzory nie są regularne, a fluorescencja w maksimach nie jest jednorodna, ale zawiera "" lub jasne punkty, jak pokazano w środkowym panelu Rysunek 6A.

Dla samoorganizacji MinDE w mikrostrukturach PDMS w kształcie prętów, procedura jest podsumowana w Rysunek 4. Nie trzeba powtarzać kilku etapów protokołu, ponieważ białka i lipidy mogą być ponownie wykorzystane. Podobnie jak w przypadku podłoży bez wzorów, podłoże jest oczyszczane i hydrofilizowane (przez czyszczenie plazmowe), na PDMS tworzy się podparta dwuwarstwa lipidowa i przeprowadza się test samoorganizacji w objętości 200 μl. Aby sprawdzić, czy uformowała się właściwa membrana i MinDE samoorganizuje się na membranie, komory są obrazowane. Po uformowaniu właściwej membrany, MinDE tworzy regularne przemieszczające się fale powierzchniowe na powierzchni PDMS między poszczególnymi mikrostrukturami, a także samoorganizuje się na dole mikrostruktur, ponieważ fale mogą swobodnie przemieszczać się po całej powierzchni pokrytej membraną (Rysunek 5A). Po usunięciu bufora na powierzchni między komorami nie powinny pojawiać się żadne propagujące się wzorce MinDE (Rysunek 5B), ponieważ powinna być całkowicie sucha. Jeśli wzorce MinDE nadal się poruszają, należy usunąć więcej bufora. Białka są teraz zamknięte w mikrokompartmentach w kształcie pręcików przez pokryty błoną PDMS i przez powietrze na górnym interfejsie (Rysunek 5C), w których będą się samoorganizować. W tych warunkach oba białka mogą wykonywać oscylacje między biegunami, jak pokazano na Rysunek 5D. Ponieważ frakcja MinD i MinE jest zawsze związana z błoną, również podczas usuwania buforu, stężenia po usunięciu buforu nie są porównywalne ze stężeniami wejściowymi. Ze względu na ten efekt stężenia różnią się również między poszczególnymi mikrostrukturami na tym samym szkiełku nakrywkowym, ponieważ zależą od położenia wzorów przed usunięciem buforu. Produkcja wafli krzemowych lub formowanie PDMS z płytki krzemowej może skutkować niekompletnymi mikrostrukturami, których nie można wykorzystać do analizy (Rysunek 6B). Ponadto, ze względu na usunięcie buforu, mikrostruktury mogą wyschnąć w trakcie procesu, a co za tym idzie, powinny być wyłączone z dalszej analizy (Rysunek 6B). W rezultacie, tylko ułamek mikrostruktur w jednej komorze wykazuje pożądane oscylacje między biegunami. Aby przeanalizować dynamikę białek w mikrostrukturach, kimograf można uzyskać, rysując wybór na całej strukturze (Rysunek 5E). Gdy MinCDE oscyluje od bieguna do bieguna, MinC i MinD pokażą uśredniony w czasie gradient stężenia z maksymalnym stężeniem na biegunach przedziału i minimalnym stężeniem w środku przedziału (Rysunek 5F).

Rysunek 1: SDS-PAGE przedstawiający końcowe produkty oczyszczania białek. His-MinD (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60,1 kDa), His-mRuby3-MinD (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) i His-MinC (28,3 kDa) są pokazane w kolejności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Diagram przepływu procesu przedstawiający poszczególne kroki i czas trwania protokołu samoorganizacji na dwuwarstwach lipidowych bez wzoru (kroki 1-6). Przerywane pola wskazują, że jedna z tych dwóch opcji może być użyta do czyszczenia. Strzałki oznaczone okręgami wskazują, gdzie protokół może zostać wstrzymany i wznowiony później. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Obrazowanie testu MinDE za pomocą mikroskopii konfokalnej. A) Regularna spirala Min, z której można uzyskać wykres prędkości rozchodzenia się fali, wykres intensywności i pomiary prędkości. Zastosowane stężenia: 0,6 μM MinD (30% eGFP-MinD), 1,8 μM His-MinE (30% His-MinE-Alexa647) B) Przykładowy wykres znormalizowanej intensywności dla obszaru oznaczonego w A. C) Przegląd całej komory testowej (podziałka: 1 mm, takie same stężenia białka jak powyżej). Można zaobserwować spirale obracające się w obu kierunkach, a także wzory celów. Powiększony obszar pokazuje, jak różnią się wzory fal na kleju UV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Diagram przepływu procesu przedstawiający poszczególne kroki i czas trwania protokołu samoorganizacji w mikrostrukturach w kształcie prętów (kroki 1-5, 7, 8). Szare pola wskazują etapy, w których produkty mogą być ponownie wykorzystane z protokołu na dwuwarstwach lipidowych bez wzoru. Strzałki oznaczone okręgami wskazują, gdzie protokół może zostać wstrzymany i wznowiony później. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla tworzenia wzorca MinDE w mikrokompartmentach PDMS w kształcie prętów. A) MinDE samoorganizuje się na powierzchni PDMS, tworząc przemieszczające się fale powierzchniowe (1 μM MinD (30% EGFP-MinD), 2 μM MinE i 2,5 mM ATP). B) Po opuszczeniu buforu na wysokość mikrostruktur, samoorganizacja białka zatrzymuje się na płaskiej powierzchni między mikrokompartmentami. C) Schemat jednej mikrokomory w kształcie pręta. D) Reprezentatywne obrazy oscylacji MinDE między biegunami po usunięciu bufora. E) Kymograf oscylacji wzdłuż podświetlonej linii pokazanej w D). F) Obraz i profil średniej intensywności fluorescencji szeregów czasowych pokazanych w D) wyraźnie pokazujący gradient białka, który jest maksymalny na biegunach mikrokompartmentów i minimalny w środku przedziału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykłady negatywnych wyników eksperymentalnych. A) Nadmiernie umyte błony gromadzą, podczas gdy nieoptymalne preparaty pęcherzykowe i kompozycje lipidowe prowadzą do sklejania pęcherzyków. Dwa środkowe panele pokazują kombinację obu problemów i sposób, w jaki stają się one widoczne podczas obserwacji minimalnych oscylacji. Membrany zostały oznaczone 0,05% Atto655-DOPE. (podziałka skali: 50 μm) B) Panel górny: Wysuszone mikrokomory mogą być spowodowane zbyt dużym usunięciem bufora lub odparowaniem buforu z czasem. Panel dolny: Podczas produkcji wafli lub formowania PDMS mogą powstawać niekompletne przedziały. (podziałka liniowa: 30 μm) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Mapa plazmidowa dla His-MinD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Mapa plazmidu dla His-EGFP-MinD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Mapa plazmidu dla His-mRuby3-MinD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Mapa plazmidu dla His-MinE. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Mapa plazmidu dla His-MinC. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: plik CAD dla płytki krzemowej z mikrokompartmentami w kształcie prętów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisaliśmy protokół rekonstytucji in vitro samoorganizacji MinCDE na dwuwarstwach lipidowych podpartych planarnie oraz w strukturach 3D pokrytych dwuwarstwami lipidowymi, na przykładzie mikrostruktur PDMS w kształcie pręcików. Aby uzyskać cenne dane z tych testów, najważniejszymi czynnikami, które należy kontrolować, są jakość białka i błony.

Aby zapewnić jakość białka, masę białka należy potwierdzić za pomocą SDS-PAGE i spektrometrii mas. Ponadto należy sprawdzić, czy białka są rozpuszczalne, a nie agregowane, za pomocą analitycznej filtracji żelowej lub dynamicznego rozpraszania światła. Filtracja żelowa może być stosowana do usuwania dowolnej zagregowanej frakcji białek. Staranne dostosowanie pH i jakości dodanych nukleotydów ma kluczowe znaczenie, ponieważ dodanie nieskorygowanych lub częściowo zdegradowanych nukleotydów do zapasów białek lub testów samoorganizujących się jest wystarczające do wyeliminowania aktywności białka, a tym samym zniesienia samoorganizacji.

Obok jakości białka, jakość błony jest najbardziej krytyczna, a niewłaściwe tworzenie błony jest najczęściej przyczyną wadliwej samoorganizacji i powstawaniem artefaktowych struktur powierzchniowych.

Podczas wykonywania protokołu po raz pierwszy pomocne jest oznaczenie obsługiwanych dwuwarstw lipidowych poprzez włączenie znakowanych lipidów, takich jak Atto-655-DOPE lub DiI, o niskiej zawartości molowej (0,05%). W ten sposób można bezpośrednio ocenić właściwości i jakość membrany. Za pomocą FRAP można ocenić płynność membrany. Co więcej, można bezpośrednio ocenić jakość mycia SLB, ponieważ albo będzie zbyt wiele pęcherzyków, albo nie będzie płynnej membrany, albo w ogóle nie będzie membrany, jeśli została zmyta. Podejście z otwartą komorą pozwala na rygorystyczne umycie membrany, a co za tym idzie również na usunięcie pęcherzyków, które przyklejają się do powierzchni SLB. Najważniejszymi czynnikami dla uzyskania płynnych i jednorodnych dwuwarstw lipidowych są czystość i hydrofilowość powierzchni nośnej oraz prawidłowy rozmiar i jednorodność SUVs. Pomocne może być sprawdzenie rozmiaru i rozkładu wielkości SUV-a za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. W przypadku wąskich rozkładów wielkości zalecamy wytłaczanie pęcherzyków, a nie ich sonikację. Inne metody czyszczenia szkiełek nakrywkowych, np. zabiegi mocnymi bazami, podstawowymi detergentami, czy stosowanie szkiełek nakrywkowych bezpośrednio po spłukaniu wodą, mogą przynieść dobre rezultaty, w zależności od zastosowania i mieszanki lipidów.

Pierwsza połowa przedstawionego tutaj protokołu, rekonstytucja in vitro na dwuwarstwach lipidowych na płaskim podparciu w otwartych komorach, ma tę zaletę, że sprawia, że powierzchnia jest dostępna dla mikroskopii optycznych, takich jak mikroskopia TIRF³⁰, analiza FRAP⁶, śledzenie pojedynczych cząstek³⁴, a także technik sondowania powierzchni, takich jak mikroskopia sił atomowych²⁶. Duży, jednorodny obszar pozwala na lepsze statystyki przy zdefiniowanych stężeniach. Ponadto podejście z otwartą komorą pozwala na precyzyjną kontrolę stężenia białka oraz szybkie i proste dodawanie kolejnych składników, co pozwala na miareczkowanie stężenia białka w jednej komorze²⁰. Test można również rozszerzyć poprzez dodanie innych składników bakteryjnych, takich jak FtsZ^22,35, ZipA²² lub chimeryczne białko FtsZ-YFP-MTS^10,35.

Inne grupy przyjęły podobne podejście do odtworzenia systemu Min in vitro, ale używają komory przepływowej zamiast otwartej komory 17,18,19. Komórki przepływowe mają pewne zalety, w szczególności, gdy potrzebne jest całkowicie zamknięte środowisko 3D¹⁸, badany jest wpływ przepływu 17,19,23 lub składu błony²³ na wzorce MinCDE lub jeśli wzorce białek mają być obserwowane w warunkach ograniczających białka¹⁹. Niemniej jednak lokalna kontrola stężeń molekularnych jest trudniejsza. Składniki białkowe, zwłaszcza MinD, silnie wiążą się z błoną, z którą po raz pierwszy się zetkną^18,19. Z naszego doświadczenia wynika, że białka często wykazują niespecyficzne wiązanie z rurkami, wlotami, strzykawkami i innymi częściami mikroprzepływowymi. W związku z tym lokalne stężenia białek różnią się od stężeń wejściowych¹⁸, a także różnią się w zależności od długości komórki przepływowej, co skutkuje różnorodnością różnych wzorców białek na błonie między wlotem a wylotem, jak zaobserwowano przez innych¹⁹.

Druga połowa przedstawionego tutaj protokołu, rekonstytucja in vitro w mikrostrukturach w kształcie pręcików, przy użyciu podejścia z otwartą komorą na wzorzystym podłożu pokrytym dwuwarstwami lipidowymi, pozwala na proste naśladowanie zachowania białek in vivo , nawet jeśli precyzyjna kontrola nad stężeniami białek jest tracona z powodu usunięcia buforu. Należy zauważyć, że ponieważ długość fali MinDE jest o około jeden rząd wielkości większa in vitro niż in vivo , mikrokompartmenty w kształcie pałeczek są również o jeden rząd wielkości większe (10 x 30 μm) niż komórka E. coli w kształcie pałeczki.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pozwala na precyzyjną kontrolę wszystkich warunków, w tym stężenia białka, składu buforu i właściwości błony. Zastosowanie strukturalnych nośników 3D umożliwia badanie reakcji w zamknięciu przestrzennym, naśladując zachowanie in vivo bez konieczności stosowania skomplikowanego sprzętu mikroprzepływowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reodczynniki
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
DOPG	Avanti Polar Lipids	840475
Ekstrakt z lipidów polarnych E.coli	Avanti Polar Lipids	100600
Adenozyno-5&-trifosforanowa sól disodowa trójwodzian	Roche
Sól monopotasowa adenozyno-5′-difosforan dwuwodny	Sigma	A5285-1G
Chlorek sodu	VWR	27810.295
Chlorek potasu	Roth	6781.1
Tris-base	Sigma Aldrich	T1503-1kg
Kwas solny	Roth	9277.1
TCEP-HCl	Termo Fisher Scientific	20491
Tetraoctan etylenodiaminy	Merck Millipore	1.08418.1000
Kwas siarkowy 98%	Zastosowanie	173163.1611
Nadtlenek wodoru 50%	Applichem	147064.1211
HEPES	Biomol	05288.1
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Merck	102950	Uvasol
Glicerol 86%	Roth	4043.1
TB średni
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Roth	2316.x
Atto-655-DOPE	Atto Tec	AD 655-161
Ni-NTA agaroza	Qiagen	30210
PDMS baza	Dow Corning Corporation		SYLGARD 184
sieciownik PDMS	Dow Corning Corporation
Materials
UV Glue	Norland Products	6801	#68 i #63
Szkiełka nakrywkowe #1.5 24x24 mm	Menzel Glä ser
Szkiełka nakrywkowe #1 24x24 mm	Menzel Glä ser		stosowany tylko do mikrostruktur PDMS
0,5 ml probówka reakcyjna	Eppendorf
kolba hodowlana 2L	Corning	np. 734-1905
His-Trap HP	GE Healthcare Life Sciences Kolumna
do filtracji żelowej: HiLoad Superdex 75 PG lub 200 PG	GE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG kolumna odsalająca	kolumna z opakowaniem Biorad	7322010
urządzenie do dializy: Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 3,5 tys. MWCO, 0,1 - 0,5 ml lub 0,5-3 ml	Żyletka
< mocna>Instrumenty
ultraczysta woda: Milli-Q Typ 1 Systemy wody ultraczystej	Automatyczny
kta Pure	GE Healthcare Life Sciences
sonikator do kąpieli	Branson		np. Model 1510
Mikser ARE-250	Thinky Corporation
Myjka plazmowa Zepto	Diener elektroniczne		zastosowanie tlenu jako gazu procesowego
Pipety wyporowe	Marka		Transferpettor z końcówkami
szklanymiKonfokalny laserowy mikroskop skaningowy LSM780	Zeiss		Wyposażony w Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 soczewki zanurzeniowe w wodzie
Plasmids
pET28a-His-MinD_MinE	Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille		kodujący plazmid His-MinD i nieoznakowany MinE w celu poprawy wydajności
pET28a-His-MinE	Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille		kodujący plazmid His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD	Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille		kodujący plazmid His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD	Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille		kodowanie plazmidu His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC	Zakład Biofizyki Komórkowej i Molekularnej, MPI Biochemii, Prof. Schwille		kodujący plazmid His-MinC