Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Zespoły mielodysplastyczne (MDS) reprezentują zróżnicowany zestaw klonalnych zaburzeń krwi charakteryzujących się nieefektywną hematopoezą, morfologicznymi dowodami dysplazji i skłonnością do transformacji w ostrą białaczkę szpikową (AML)^1,2,3,4. Nieskuteczna hematopoeza jest rozpoznawana jako zatrzymanie dojrzewania szpiku kostnego i powoduje cytopenię krwi obwodowej pomimo hiperkomórkowego szpiku kostnego^1,3. Częstość występowania MDS była różnie szacowana na 2-12 przypadków na 100 000 osób rocznie w Stanach Zjednoczonych, a częstość występowania MDS wzrasta wraz z wiekiem, co czyni ten stan ważnym do zrozumienia, biorąc pod uwagę starzejącą się populację USA^3,5. Chociaż większość przypadków MDS nie ma jasnej etiologii, uważa się, że niektóre przypadki MDS są spowodowane ekspozycją na znane czynniki genotoksyczne, w tym rozpuszczalniki, takie jak benzen, i chemioterapia raka⁶.

Pacjenci z MDS zazwyczaj nabywają mutacje w komórkach MDS⁷. Chociaż stosunkowo rzadko, wielu pacjentów z MDS nabyło zrównoważone translokacje chromosomowe obejmujące geny takie jak NUP98, EVI1, RUNX1 i MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Nasze laboratorium od dawna interesuje się translokacjami chromosomów, które obejmują gen NUP98⁸. Transgeniczne myszy, które wyrażają transgen NUP98-HOXD13 (NHD13) regulowany przez promotor i elementy wzmacniające Vav1, wykazują wszystkie kluczowe cechy MDS, w tym cytopenię krwi obwodowej, morfologiczne dowody dysplazji i transformację do AML⁹.

Chociaż MDS są uznawane od ponad 60 lat¹⁰ i są uważane za chorobę klonalnych komórek macierzystych, próby wszczepienia ludzkiej komórki MDS myszom z niedoborem odporności zakończyły się w dużej mierze niepowodzeniem, ponieważ komórki MDS słabo się wszczepiają^11,12,13,14 A u myszy nie rozwija się choroba kliniczna. Starając się zidentyfikować, które komórki krwiotwórcze mogą przenosić MDS, zwróciliśmy się do modelu NHD13 i wykazaliśmy, że możemy wszczepić MDS jako jednostkę chorobową, która wykazuje wszystkie kardynalne cechy ludzkiego MDS, w tym cytopenię krwi obwodowej, dysplazję i transformację do AML¹⁵. W niniejszym raporcie przedstawiamy szczegóły techniczne tych eksperymentów, a także podejścia do dalszej frakcjonowania hematopoetycznych komórek macierzystych i prekursorowych (HSPC), w celu identyfikacji komórek inicjujących MDS.

Procedury dla zwierząt opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez National Cancer Institute przy Bethesda Animal Care and Use Committee i są zgodne z zasadami zawartymi w Polityce Publicznej Służby Zdrowia dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, Ustawie o dobrostanie zwierząt oraz Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie komórek

1. Pobieranie komórek jądrzastych szpiku kostnego (BMNC)
   1. Używaj tylko sterylnych materiałów. Sterylizuj narzędzia wielokrotnego użytku za pomocą autoklawu parowego. Kupuj igły, strzykawki i plastikowe wyroby w sterylnych pojemnikach jednorazowego użytku. Wszystkie manipulacje na zwierzętach i komórkach należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, typu A2.
   2. Przygotuj BMNC w 14 ml okrągłej probówce zawierającej 3 ml HF2 (zbilansowany roztwór soli Hanka uzupełniony 2% płodową surowicą bydlęcą).
   3. Eutanazja myszy dawcy C57Bl6 (dodatnie dla allelu CD45 CD45.2) w wieku zwykle 2-6 miesięcy, przy użyciu komory CO₂.
   4. Wysterylizuj tuszę myszy, rozpylając 70% etanolu na całe ciało za pomocą butelki z rozpylaczem. Zdejmij skórę z nóg, od miednicy w dół do kostki.
   5. Usuń kość udową i piszczelową z tuszy za pomocą sterylnych nożyczek (prostych, ostrych/ostrych, 11,5 cm) i kleszczyków (Graefe, ząbkowane, szerokość końcówki 0,8 mm). Wyraźnie przytnij przyczepione mięśnie.
   6. Odetnij bliższy i dalszy koniec kości piszczelowej nożyczkami. Trzymając kość piszczelową kleszczami, włóż strzykawkę o rozmiarze 27 ml i pojemności 3 ml zawierającą 2,5 ml HF2 do jamy szpiku piszczelowego na dystalnym końcu kości piszczelowej (kostki). Wypłucz komórki szpiku kostnego z kości piszczelowej, delikatnie uciskając do probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml.
      1. Powtórz dla drugiej kości piszczelowej.
   7. Przetnij bliższy i dalszy koniec kości udowej nożyczkami. Przepłukać jamę szpiku kości udowej, wkładając igłę o rozmiarze 20 dołączoną do strzykawki o pojemności 3 ml zawierającej 2,5 ml HF2 do dystalnego końca jamy szpiku kości udowej i delikatnie uciskając strzykawkę.
      1. Powtórz tę czynność dla drugiej kości udowej, zbierając cały szpik kostny z kości piszczelowej i udowej do tej samej 14 ml probówki z okrągłym dnem.
   8. Rozproszyć masę szpiku, kilkakrotnie zasysając w górę i w dół za pomocą tej samej igły o rozmiarze 20 dołączonej do strzykawki o pojemności 3 ml.
2. Barwienie przeciwciałami BMNC
   1. Policz BMNC. Dodać 20 μl 3% roztworu kwasu octowego do 20 μl zawiesiny BMNC utworzonej w kroku 1.1.8. Następnie policz za pomocą hemocytometru i odwróconego mikroskopu.
   2. Osadzać BMNC przez delikatne odwirowywanie przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad z HF2, używając 90 μl na 10⁷ komórek i dodać 10 μl biotynylowanego koktajlu przeciwciał antyliniowych do zawiesiny komórkowej.
   3. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 4 °C, przepłukać zabarwione komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   4. Ponownie zawiesić BMNC ze 100 μl HF2 na 10⁷ komórek. Dodać 2 μl przeciwciała antybiotyny sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) do zawiesiny komórkowej, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   5. Przepłukać wybarwiony BMNC 3 ml PBS i ponownie zawiesić BMNC z HF2 uzupełnionym 0,2 μg/ml jodku propidyny (PI) do sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej.
3. Sortowanie komórek BMNC za pomocą cytometrii przepływowej
   1. Kalibruj sortownik komórek cytometrii przepływowej. Zoptymalizuj wszystkie fotopowielacze (PMT), parametry rozpraszania i fluorescencji przy użyciu niebarwionych komórek i ustaw w zakresie liniowym każdego detektora.
   2. Przygotuj niebarwione, wybarwione PI i oznaczone APC komórki koktajlowe pochodzenia równolegle z kroku 1.2. Analizuj pod kątem kompensacji spektralnej.
   3. Dyskryminuj komórki dubletowe przez sekwencyjne bramkowanie FSC-H i SSC-H, 640-SSC-A i 640-SSC-H i 640-SSC-S przeciwko 640-SSC-W.
   4. Wyklucz nieżywotne komórki za pomocą PI wzbudzonego przy 561 nm i emisji zebranej za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 614/20. Wzbudzić komórki znakowane APC linii produkcyjnej przy długości fali 640 nm i zbierać emisję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 671/30.
   5. Rejestruj wartości fluorescencji jako wysokość napięcia i zbierz co najmniej 100 000 zdarzeń w plikach danych w trybie listy, aby zwizualizować populacje do posortowania.
   6. Oblicz kompensację spektralną po pobraniu trzech próbek po 10 000 komórek dla następujących: komórek nieznakowanych, komórek znakowanych PI i koktajlu przeciwciał antyliniowych sprzężonych z komórkami znakowanymi APC.
   7. Ustaw trzy regiony, aby posortować linię ujemną (LN), linię dodatnią (LP) ze słabą intensywnością fluorescencji (LP1) i populację LP z jasną fluorescencją (LP2) w probówkach o pojemności 5 ml zawierających 0,5 ml 10% pożywki FBS.
   8. Sortuj komórki za pomocą jednej kropli obwiedni i oczyszczaj tryb przerwania.
   9. Wykonaj analizę po sortowaniu z łączną liczbą 1 000 komórek w każdej posortowanej próbce, aby potwierdzić czystość i żywotność posortowanych komórek.
   10. Zebrać posortowane komórki przez odwirowanie w stężeniu 450 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad komórek z 0,5 ml HF2.
   11. Potwierdź posortowany numer komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypana. Dostosuj liczbę komórek za pomocą HF2 do przeszczepu.
       UWAGA: Szerokie spektrum populacji BMNC można wyizolować do przeszczepu przy użyciu dodatkowych kombinacji przeciwciał sprzężonych z fluorochromem w kroku 1.2.2 powyżej.

2. Przygotowanie myszy biorcy i przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)

1. Przygotowanie biorców przeszczepów
   1. Utrzymanie opieki weterynaryjnej i hodowlanej nad kongenicznymi myszami biorcami (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) w obiekcie dla zwierząt wolnych od określonych patogenów (SPF).
   2. W celu profilaktycznego odkażania przewodu pokarmowego należy dostarczyć biorcom sterylną wodę zawierającą 100 mg/l cyprofloksacyny przez 7 dni przed napromieniowaniem w dawce śmiertelnej (9 Gy) i utrzymywać przez 14 dni po napromienianiu.
   3. Zapewnić napromieniowanie w dawce śmiertelnej (9 Gy) ze źródła Cs w następujący sposób. Korzystaj z przeszkolonego, certyfikowanego operatora Cs. Ustaw instrument źródłowy Cs tak, aby dostarczał promieniowanie gamma o prędkości 70 cGy/min całkowitego ciała. Umieść 10 myszy w specjalnie zaprojektowanym uchwycie i włóż uchwyt do komory naświetlacza. Dostarcz napromienianie całego ciała 9 Gy w ciągu 13 minut i wróć myszy do klatek.
2. Przeszczepienie krwiotwórczych komórek macierzystych
   1. Zmieszać BMNC typu dzikiego (WT) od kongenicznej myszy biorcy (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) w dawce 2 x 10⁵ komórek na mysz z 2 do 5 x 10⁴ komórek oczyszczonego testowego BMNC przygotowanego z sortowaniem metodą cytometrii przepływowej, jak opisano w ppkt 1.3 powyżej. Wymieszaj komórki w tej samej strzykawce.
      UWAGA: WT BMNC zapewnia efekt oszczędzania promieniowania myszy biorcy i pozwala na przeżycie myszy biorcy, jeśli komórki testowe nie obsługują hematopoezy. WT BMNC używany w tego typu eksperymencie wykazuje ekspresję allelu CD45.1, a zatem można go odróżnić od komórek testowych za pomocą przeciwciał, które rozróżniają CD45.1 i CD45.2. Ogniwa WT BM są określane jako "ogniwa pomocnicze", "ogniwa oszczędzające promieniowanie" lub "ogniwa konkurencyjne
   ".
   2. Dostosuj objętość mieszaniny komórek do 200 μl na biorcę, używając sterylnego HF2 w celu ułatwienia wstrzyknięcia.
   3. Przeszczep mieszaniny komórek śmiertelnie napromieniowanym myszom biorcom poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły o rozmiarze 28, w ciągu 24 godzin od napromieniowania. Umieść ogon myszy pod lampą grzewczą, ponieważ ciepło prowadzi do rozszerzenia żyły ogonowej.
      UWAGA: Pod koniec badania należy poddać eutanazji wszystkie myszy biorcy i ocenić postęp choroby za pomocą sekcji zwłok, histologii i cytometrii przepływowej.

3. Test wszczepienia za pomocą cytometrii przepływowej

1. Aby ocenić wszczepienie komórek dawcy, należy pobrać krew obwodową (PB) od myszy biorcy w 6., 12. i 16. tygodniu po przeszczepie.
2. Ogrzej biorców w klatce z lampą grzewczą przez około 1 minutę i umieść mysz w respekcie.
3. Przeciąć żyłę ogonową skalpelem (ostrze 10, rękojeść skalpela #3) i zebrać 100 μl PB na biorcę za pomocą probówki mikrokapilarnej zawierającej EDTA jako antykoagulant.
4. Podzielić zebrany PB na dwie równe porcje, umieszczając 50 μl w sterylnej probówce do mikrowirówki. Należy użyć jednej podwielokrotności do automatycznej pełnej morfologii krwi (CBC) (wykonywanej w NCI Histopathology Core), a drugiej podwielokrotności do barwienia przeciwciał i cytometrii przepływowej.
5. Aby wykryć wszczepienie dawcy za pomocą cytometrii przepływowej, należy poddać lizie czerwone krwinki (RBC), dodając 1 ml hipotonicznego buforu do lizy RBC (8,29 g/L NH₄Cl, 1 g/L KHCO₃, 0,037 g/L Na₂EDTA, pH 7,2) do 50 μL pobranego PB. Zmieszać próbkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Odwirować zlizany PB przy 4 600 x g przez 1,5 minuty. Ostrożnie odessać supernatant i wyrzucić.
7. Częściowo rozerwij osad komórkowy, delikatnie stukając lub "trzepając" dnem rurki. Dodać 1,3 ml PBS do osadu znajdującego się w probówce i odwirować przy 4,600 x g przez 1,5 min. Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant.
8. Rozbij osad komórkowy przez stukanie lub trzeganie i dodaj 200 μl HF2 uzupełnionego 5% surowicą szczurzą do osadu komórkowego
.
9. Dodać przeciwciało anty-CD45.2 (1 μl) sprzężone z allofikocyjaniną (APC) do zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 minut i krótko zwirować mieszaninę.
10. Po barwieniu przemyć komórki dwukrotnie, jak opisano powyżej, i ponownie zawiesić 400 μl HF2 uzupełnionym 1 μg/ml PI.
11. Wykryj wszczepienie za pomocą 4-kolorowego cytometru przepływowego. Uzyskaj dodatkowe informacje na temat typów komórek we krwi obwodowej, dodając dodatkowe przeciwciała w celu wykrycia określonych typów komórek, takich jak limfocyty B lub T.
12. Rejestruj dane dotyczące seryjnego wszczepienia za pomocą arkusza kalkulacyjnego, aby umożliwić dalszą analizę danych.

Pokazujemy reprezentatywne dane liczbowe dla wyników kilku eksperymentów. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny eksperyment sortowania metodą cytometrii przepływowej. Podczas normalnego różnicowania układu krwiotwórczego, gdy komórki angażują się w określoną linię krwiotwórczą, nabywają markery powierzchni komórek definiujące linię i tracą potencjał do samoodnowy. Dlatego u myszy typu dzikiego samoodnawianie się komórek macierzystych jest ograniczone do BMNC ujemnego pod względem linii. W tym eksperymencie podzieliliśmy BMNC ze szpiku kostnego NHD13 na komórki ujemne pod względem linii, o niskiej linii dodatniej i dodatnie o wysokiej linii. Te posortowane komórki zostały następnie przeszczepione biorcom WT w celu określenia zdolności do samoodnawiania się.

Rysunek 2 pokazuje wyniki oddzielnego eksperymentu, w którym komórki ujemne lub niesortowane od dawców NHD13 z MDS zostały przeszczepione do śmiertelnie napromieniowanych biorców WT. Komórki dawcy NHD13 wyrażały marker powierzchniowy komórek CD45.2, podczas gdy komórki konkurencyjne WT (patrz sekcja 2.2.1 powyżej) wyrażały marker powierzchni komórek CD45.1. Rysunek 3 pokazuje analizę seryjnego wszczepienia niesortowanego NHD13 BMNC, albo NHD13 BMNC bez linii. Po około 16 tygodniach komórki NHD13 konkurują z komórkami WT, o czym świadczy rosnący odsetek komórek CD45.2 + we krwi obwodowej. Rysunek 4 pokazuje przykład transformacji białaczki u myszy przeszczepionej komórkami MDS NHD13.

Rycina 1: Strategia sortowania metodą cytometrii przepływowej BMNC barwionego koktajlem przeciwciał liniowych. Każde prostokątne pole na wykresie kropkowym reprezentuje populację komórek posortowaną pod kątem HSCT w celu oceny funkcji komórki. R4, pochodzenie ujemne; R5, niski rodowód dodatni; R6, wysoki rodowód pozytywny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Reprezentatywne profile FACS do testu wszczepienia z użyciem przeciwciała anty-CD45.2 swoistego dla dawcy. Biorca BMNC został przeszczepiony z 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +), a biorca LNBM z 5 X 104 ujemnymi komórkami BM linii NHD13 (CD45.2 +). W każdym przypadku jako ogniwa konkurencyjne zastosowano 2 x 105 WT BMNC (CD45.1+). Liczby w górnym i dolnym polu reprezentują CD45.2 dodatni (pochodzący od dawcy NHD13) i CD45.2 ujemny (pochodzący z komórek konkurencyjnych WT), odpowiednio po przeszczepie 6 i 24 tydzień. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Kinetyka wszczepienia poszczególnych biorców po przeszczepie. Każda linia na wykresie przedstawia seryjne testy wszczepienia pojedynczej myszy biorcy. Biorcom BMNC przeszczepiono 1 X 106 komórek całego BMNC NHD13, a biorcom LNBM przeszczepiono 5 X 104 BM linii NHD13 po sortowaniu. NHD wskazuje dawcę NHD13. BM, myszy biorcze BMNC; LNBM, odbiorca BM o ujemnym pochodzeniu; PBMC, komórka jednojądrowa krwi obwodowej. We wszystkich przypadkach komórki dawcy NHD13 stopniowo konkurują z komórkami WT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Barwienie szpiku kostnego (BM) Maya-Grünwalda Giemsy (MGG) od biorcy MDS, u którego doszło do AML. Zwróć uwagę na obecność licznych wybuchów i niedojrzałych form. Strzałki wskazują wybuchy, a groty strzał wskazują niedojrzałe formy. Oryginalny 400X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nie mamy nic do ujawnienia.