Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zespoły mielodysplastyczne (MDS) to zróżnicowana grupa zaburzeń hematopoetycznych komórek macierzystych, które charakteryzują się nieefektywną hematopoezą, cytopeniami krwi obwodowej, dysplazją i skłonnością do transformacji w ostrą białaczkę. Transgeniczne myszy NUP98-HOXD13 (NHD13) podsumowują ludzki MDS pod względem cytopenii krwi obwodowej, dysplazji i transformacji w ostrą białaczkę. Wcześniej wykazaliśmy, że MDS można przenieść z genetycznie zmodyfikowanej myszy z MDS do biorców typu dzikiego poprzez przeszczepienie komórek jądrzastych szpiku kostnego MDS (BMNC). Aby lepiej zrozumieć komórkę MDS, z której pochodzą, opracowaliśmy podejścia do specyficznych dla przeszczepu, immunofenotypowo zdefiniowanych podzbiorów krwiotwórczych. W tym artykule opisujemy proces izolacji i przeszczepiania określonych populacji hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Po przeszczepieniu opisano podejścia do oceny skuteczności przeszczepu i trwałości komórek MDS dawcy.
Wprowadzenie
Zespoły mielodysplastyczne (MDS) reprezentują zróżnicowany zestaw klonalnych zaburzeń krwi charakteryzujących się nieefektywną hematopoezą, morfologicznymi dowodami dysplazji i skłonnością do transformacji w ostrą białaczkę szpikową (AML)1,2,3,4. Nieskuteczna hematopoeza jest rozpoznawana jako zatrzymanie dojrzewania szpiku kostnego i powoduje cytopenię krwi obwodowej pomimo hiperkomórkowego szpiku kostnego1,3. Częstość występowania MDS była różnie szacowana na 2-12 przypadków na 100....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury dla zwierząt opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez National Cancer Institute przy Bethesda Animal Care and Use Committee i są zgodne z zasadami zawartymi w Polityce Publicznej Służby Zdrowia dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, Ustawie o dobrostanie zwierząt oraz Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie komórek
- Pobieranie komórek jądrzastych szpiku kostnego (BMNC)
- Używaj tylko sterylnych materiałów. Sterylizuj narzędzia wielokrotnego użytku za pomocą autoklawu parowego. Kupuj igły, strzykawki i plastikowe wyroby w ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiamy reprezentatywne rysunki dla wyników kilku eksperymentów. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny eksperyment sortowania metodą cytometrii przepływowej. Podczas prawidłowej różnicowania krwiotwórczego, w miarę jak komórki nabywają predyspozycje do konkretnej linii krwiotwórczej, pojawiają się na ich powierzchni markery definiujące tę linię, a one same tracą zdolność do samoodnowy. W związku z tym u myszy typu dzikiego samoodnowa komórek macierzysty.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż MDS są klonalnym zaburzeniem hematopoetycznych komórek macierzystych, "komórki macierzyste" MDS, czyli komórki inicjujące, nie zostały jeszcze scharakteryzowane. Wcześniej wykazaliśmy, że MDS można przeszczepić myszom WT przy użyciu szpiku kostnego od myszy NHD13 za pomocą HSCT, charakteryzującego się niedokrwistością makrocytarną, leukopenią, neutropenią i morfologicznymi dowodami dysplazji15. Ponadto konkurencyjne testy ponownego populowania wykazały przewagę wzrostu komórek ze szpiku ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Cancer Institute, National Institutes of Health (numery grantów ZIA SC 010378 i BC 010983).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14 ml probówka z okrągłym dnem | Falcon | 352057 | |
| Zbilansowany roztwór soli Hanka | Lonza | 10-527F | |
| Przeciwciało anty-CD45.2 | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL | Monoject | 8881513934 | |
| igła 27-G | BD | 305109 | |
| igła 20-G | BD | ||
| Koktajl Lineage | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Przeciwciała anty-biotynowe | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Strzykawka | Excelint | 26027 | Strzykawka insulinowa |
| grzewcza | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS Maszyna | Cytec | FACScan | 2 lasery, 5 detektorów kolorów |
| Przyrząd sortujący FACS | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 laserów, 23 parametry, 6 jednoczesne sortowanie populacji |
| Jodek propidyny | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Probówka do pobierania krwi | RAM scientific | 76011 | |
| Odbiorca myszy | Charles River | B6-LY5.1 / Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 myszy | nie dotyczy | C57Bl / 6, CD45.2 | Kolonia utrzymywana w NIH |
| 5 ml okrągłej probówki | Falcon | 352058 |
Bibliografia
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification an....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
