Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58143

⸱

30 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół opisuje technikę badania zdolności pierwotnych poliklonalnych ludzkich limfocytów T do tworzenia interfejsów synaptycznych za pomocą płaskich dwuwarstw lipidowych. Używamy tej techniki, aby pokazać zróżnicowaną zdolność tworzenia synaps ludzkich pierwotnych limfocytów T pochodzących z węzłów chłonnych i krwi obwodowej.

Streszczenie

Obecne zrozumienie dynamiki i cech strukturalnych interfejsów synaptycznych komórek T zostało w dużej mierze określone dzięki zastosowaniu dwuwarstwowych płaskich warstw opartych na szkle oraz klonów lub linii komórek T pochodzących in vitro1,2,3, 4. Nie wiadomo, w jaki sposób te odkrycia odnoszą się do pierwotnych ludzkich limfocytów T wyizolowanych z krwi lub tkanek limfoidalnych, częściowo z powodu znacznych trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby komórek do analizy5. W tym przypadku zajmujemy się tym poprzez opracowanie techniki wykorzystującej wielokanałowe szkiełka przepływowe do budowy płaskich dwuwarstw lipidowych zawierających cząsteczki aktywujące i adhezyjne. Niska wysokość szkiełek przepływowych sprzyja szybkiej sedymentacji komórek w celu synchronizacji łączenia komórka-dwuwarstwa, umożliwiając w ten sposób naukowcom badanie dynamiki powstawania interfejsu synaptycznego i kinetyki uwalniania granulek. Stosujemy to podejście do analizy interfejsu synaptycznego zaledwie 10,4 do 10,5 pierwotnych kriokonserwowanych limfocytów T wyizolowanych z węzłów chłonnych (LN) i krwi obwodowej (PB). Wyniki pokazują, że nowatorska technika dwuwarstwowego lipidu umożliwia badanie właściwości biofizycznych pierwotnych ludzkich limfocytów T pochodzących z krwi i tkanek w kontekście zdrowia i choroby.

Wprowadzenie

Wiedza naukowa na temat cech strukturalnych synaps immunologicznych komórek T i ich związku z funkcjonalną aktywnością limfocytów T została uzyskana głównie dzięki badaniom linii komórkowych i klonów pochodzących z PB. W jakim stopniu odkrycia te odnoszą się do pierwotnych limfocytów T uzyskanych z krwi lub ludzkich tkanek limfoidalnych, pozostaje niejasne, ponieważ interfejsy synaptyczne limfocytów T znajdujących się w tkankach limfatycznych i innych tkankach nie zostały do tej pory przeanalizowane. Co ważne, pojawiające się dane sugerują, że limfocyty T rezydujące w tkankach i pochodzące z narządów limfatycznych mogą mieć znaczące różnice w swoim fenotypie i aktywności funkcjonalnej w porównaniu z tymi w PB6,7. To jeszcze bardziej ugruntowało potrzebę lepszego zrozumienia cech interfejsu synaptycznego komórek T w pierwotnych ludzkich limfocytach T.

W tym celu opracowaliśmy nowatorskie podejście na mini-skalę, wykorzystujące dwuwarstwy lipidowe wbudowane w wielokanałowe szkiełka przepływowe, co pozwala nam na obrazowanie interfejsów limfocytów T/dwuwarstw z mniej niż 105 pierwotnymi limfocytami T wyizolowanymi z ludzkich PB i LN. Ta nowatorska technika umożliwia badanie właściwości biofizycznych pierwotnych interfejsów synaptycznych ludzkich komórek T w celu lepszego modelowania i zrozumienia interakcji komórka-komórka in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną świadomą zgodę, a próbki krwi i węzłów chłonnych pobrano za zgodą Institutional Review Board na University of Pennsylvania (IRB#809316, IRB# 815056). Wszyscy badani byli osobami dorosłymi. Próbki krwi pępowinowej zostały udostępnione przez oddział położnictwa i ginekologii (Labor and Delivery of the Department of Obstetrics & Gynecology) w Thomas Jefferson University. Wszystkie próbki zostały zanonimizowane.

1. Izolacja limfocytów T CD4+ do analizy obrazowej

  1. Rozmrozić 1 mL alikwot zawierający 107 zamrożonych monocyto-limfocytów krwi obwodowej (PBMC) lub monocyto-limfocytów węzłów chłonnych (LNMC) z zebranych próbek. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać rozmrożone komórki do 9 mL medium RPMI uzupełnionego o penicylinę/streptomycynę i glutaminę.
    1. Odwirować komórki przez 10 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C, odprowadzić supernatant i resuspender komórki w 5 mL uzupełnionego medium RPMI zawierającego 10% FBS (medium kompletne). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
  2. Następnego dnia oczyścić limfocyty T CD4+ poprzez negatywną selekcję immunomagnetyczną, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Aby zmierzyć liczbę świeżo oczyszczonych limfocytów T CD4+, zmieszać 5 µL zawiesiny komórkowej z równą objętością roztworu błękitu trypanu. Nanieść mieszaninę komórek z błękitem trypanu na komorę countingową (hemocytometr) i policzyć żywe komórki w 5 polach komory.
  4. Obliczyć średnią liczbę komórek i wyznaczyć liczbę komórek w oryginalnej zawiesinie: liczba komórek/1 mL = średnia liczba x 2 x 104. Jeśli całkowita liczba wyizolowanych komórek jest zbyt mała, użyć komórek bez ich przeliczania.
  5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 min i resuspender je w buforze do testów (20 mM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 oraz 1% albuminy surowicy ludzkiej) w zagęszczeniu 105 komórek/50 µL lub mniejszym i przechowywać komórki w temperaturze 4 °C (przez 1–2 h) do momentu rozpoczęcia eksperymentów.
  6. Utylizować wszystkie odpady biologiczne zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi.
  7. Jeśli wymagana jest populacja kontrolna, przygotować aktywowane limfocyty T CD8 z PBMC krwi pępowinowej: umieścić 107 komórek w 5 mL medium kompletnego w kolbie hodowlanej T25, a następnie dodać mieszaninę przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 w stężeniach odpowiednio 10 µg/mL i 1 µg/mL.
  8. Następnego dnia usunąć aktywowane komórki krwi pępowinowej z kolby, przemyć je raz świeżym medium kompletnym i namnażać komórki w obecności rekombinowanej IL-2 (100 U/mL) przez 2 tygodnie.
  9. Oczyścić limfocyty T CD8+ krwi pępowinowej poprzez negatywną selekcję immunomagnetyczną przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z instrukcją producenta. Policzyć komórki i wymienić medium na bufor do testów, postępując zgodnie z opisem w krokach 1.3–1.6 dla limfocytów T CD8+ z LN i PB.

2. Komponenty do przygotowania płaskich dwuwarstw lipidowych

  1. Przygotować 3 rodzaje liposomów zgodnie z opisem zamieszczonym w innej publikacji5(a) 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoylo-sn(b) liposomy 0,4 mM DOPC zawierające 33 mol% DOGS-NTA (1,2-dioleojo-snlipidy (sól amonowa kwasu 1,2-dioleojlo-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-karboksypentyl)iminodiooctowej)sukcynylo]), (c) liposomy DOPC 0,4 mM zawierające 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleojlo-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotynil) (sól sodowa)).
  2. Przygotować 5% roztwór kazeiny zgodnie z wcześniejszym opisem5.
    1. Rozpuścić 5 g kazeiny w proszku w 100 ml wody ultraczystej i dodać 350 µL 10 M wodorotlenku sodu. Całość mieszać na standardowym mieszadle magnetycznym z małą prędkością (zgodnie z dostępną skalą) w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie przez noc w 4 °CDostosuj pH do wartości 7,3 i poddaj roztwór ultrawirowaniu przez 2 h przy 100 000 x g przy 4 °CPrzefiltruj nadsącz za pomocą 0.22 µm przefiltrować sterylnie i przechowywać roztwór w aliquotach w temperaturze -80 °C.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór wodorotlenku sodu może powodować oparzenia chemiczne i może doprowadzić do trwałej ślepoty w przypadku kontaktu z oczami. Podczas pracy z tą substkcją chemiczną lub jej roztworami należy stosować rękawice gumowe, odzież ochronną oraz ochronę oczu.
  3. Oznakuj przeciwciało anty-CD3 biotyną w celu otrzymania monobiotynowanych cząsteczek przeciwciał, stosując wcześniej opisany sposób.8.
    1. Przygotuj roztwór Biotin-PEO4-NHS w dimetylosulforksie (DMSO) o stężeniu 0,1 mg/ml. Dodaj 3.7 µL roztworu Biotin-PEO4-NHS do 1 mg przeciwciała w 0,5 mL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 100 mM wodorowęglanu sodu.
    2. Inkubować mieszaninę przez 2 h w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór estru NHS Alexa Fluor 488 w stężeniu 10 mg/mL w DMSO. Dodać roztwór estru NHS Alexa Fluor 488 do przeciwciała znakowanego Biotin-PEO4-NHS w 10-krotnym nadmiarze molowym.
    3. Inkubować mieszaninę przez 1 h w temperaturze pokojowej, powoli mieszając na standardowym mieszadle magnetycznym. Nie związany barwnik oddzielić za pomocą chromatografii żelowej.
    4. Wyznacz stężenie przeciwciał poprzez pomiar gęstości optycznej roztworu przeciwciał przy 280 nm (A280). Pomiar gęstości optycznej znakowanych przeciwciał przy 577 nm (A577).
    5. Wyznacz stosunek barwnika do przeciwciała, korzystając z następującego równania:
      Równanie obliczania liczby moli barwnika na mol białka przy użyciu absorbancji przy 577 nm; przedstawienie wzoru.
      UWAGA: Dodatkowe szczegóły znajdują się w protokole producenta.
  4. Ekspresja rekombinowanego rozpuszczalnego białka ICAM-1 w Muszka owocówka system ekspresyjny opisany wcześniej3,4,9,10.
    1. Klonować do, z cDNA kodującym domenę ektodomenową ICAM-1, do Muszka owocówka wektor ekspresyjny pMT/V5-His z indukowalnym promotorem metalotioneiny do produkcji białka rekombinowanego z dołączoną sekwencją His6 znacznik na końcu C-terminalnym.
    2. Przeprowadź kotransfekcję komórek S2 z otrzymanym plazmidem zawierającym ICAM-1 oraz wektorem ekspresyjnym G418. Wyselekcjonuj stabilne transfektanty, stosując pożywkę Schneidera. Muszka owocowa Pożywka uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FCS) oraz G418 w stężeniu 0,5 mg/ml przez 3 tygodnie. Namnażanie komórek w bezsurowiczej pożywce dla owadów i indukcja ekspresji białka za pomocą 0,5 mM CuSO4.4 przez 3 dni.
    3. Skoncentrować nadsącz z hodowli 10-krotnie i poddać dializie przeciwko PBS poprzez koncentrator do filtracji stycznej, zgodnie z wcześniejszym opisem11.
    4. Nałóż skoncentrowany nadsącz hodowli na kolumnę zawierającą Sepharose z kowalencyjnie unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym anty-ICAM-1, a następnie eluj związane białko ICAM-1 za pomocą buforu glicynowego 50 mM o pH 3,0. Natychmiast zneutralizuj eluowane białko ICAM-1 buforem Tris 2 M o pH 8,0.
    5. Przeprowadzić dializę eluatu przeciwko buforowi PBS o pH 8,0, a następnie przenieść zdializowany materiał na kolumnę z agarozą Ni-NTA. Rozpuszczalne ICAM-1 eluować za pomocą 200 mM imidazolu o pH 8,0. Przeprowadzić dializę eluatu przeciwko buforowi PBS o pH 8,0.
    6. Oznakuj oczyszczone ICAM-1 estrem NHS Cy5 zgodnie z instrukcją producenta.
      UWAGA: Najlepszy końcowy stosunek barwnika do białka wynosi 1:1.
  5. Wytworzenie fragmentów Fab z przeciwciała anty-CD107a poprzez trawienie papainą oraz oczyszczanie fragmentów Fab metodą chromatografii wymiany jonowej zgodnie z wcześniej opisaną procedurą3Oznakuj fragmenty Fab za pomocą estru NHS Alexa Fluor 568 zgodnie z instrukcją producenta.

3. Tworzenie płaskich dwuwarstw lipidowych wspieranych szklaną podstawką

  1. Przygotuj świeży kwasowy roztwór piranha, mieszając 140 mL stężonego kwasu siarkowego i 60 mL 30% nadtlenku wodoru. Umyj szklane szkiełka zakryjące do płytek przepływowych, mocząc je w kwasowym roztworze piranha przez 30 min. Trzymaj szklane szkiełko zakryjące za pomocą polipropylenowych pęset nożycowych.
    OSTRZEŻENIE: Roztwór piranha jest niezwykle silnym utleniaczem. Podczas pracy z roztworem należy zawsze nosić okulary ochronne, gogle lub pełną przyłbicę oraz grube gumowe rękawice. Pracuj z roztworem piranha wyłącznie w dygestorium. Unikaj podgrzewania, transportowania lub wstrząsania roztworem w trakcie użytkowania, ponieważ może on eksplodować. Odpady z roztworu piranha zbieraj do szklanej butelki z otworem zawierającym ołów. Skontaktuj się z Instytucjonalnym Komitetem Bezpieczeństwa w sprawie właściwej utylizacji odpadów.
  2. Wypłucz umyte szkiełka zakryjące 7x wodą ultrapure, przenosząc je sekwencyjnie do zlewków zawierających świeżą wodę. Odstaw mokre szkiełka zakryjące, aby pozostała woda spłynęła z czystego szkła, pozostawiając je suche.
    1. Alternatywnie można użyć końcówki pipety podłączonej do pompy próżniowej, aby ostrożnie usunąć pozostałe krople wody ze szkiełek zakryjących.
  3. W komorze sterylnej wykonaj rozcieńczenia różnych lipidów, aby przygotować mieszaninę liposomów do tworzenia dwuwarstw. Po pierwsze, połącz 37 µL liposomów DOPC i 3 µL liposomów Biotinyl-Cap-PE. Po drugie, zmieszaj 14 µL liposomów DOPC i 15 µL liposomów DOGS-NTA. Po trzecie, dodaj 1 µL pierwszej mieszaniny do 29 µL drugiej mieszaniny, aby otrzymać końcową mieszaninę liposomów.
  4. W komorze sterylnej przygotuj stanowisko pracy z suchymi szkiełkami zakrywającymi w zasięgu ręki. Nanieś dokładnie 2 µL końcowej mieszaniny liposomów (patrz krok 3.3) precyzyjnie na środek samoprzylepnego kanału płytki. Natychmiast i bardzo precyzyjnie wyrównaj czyste i suche szkiełko zakryjące z płytką i delikatnie opuść je na lepką stronę płytki.
    1. W przypadku przygotowywania więcej niż jednej płytki, pracuj nad jedną płytką na raz, ponieważ mieszanina liposomów szybko odparowuje. Odwróć płytkę i użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowej pęsety nożycowej, aby wywrzeć delikatny nacisk na obwodowy styk szkiełka zakrywającego z płytką, upewniając się, że szkiełko jest ściśle przylega do płytki, aby zapobiec wyciekom.
      UWAGA: Nie naciskaj kanałów płytki, aby uniknąć pęknięcia lub uszkodzenia szkiełka zakrywającego.
    2. Ponownie odwróć płytkę i zaznacz pozycję utworzonej dwuwarstwy, która wygląda jak kropla między szkiełkiem zakrywającym a płytką kanałową, rysując 4 kropki markerem permanentnym wokół dwuwarstwy na zewnętrznej stronie płytki.
  5. Przed pierwszym wstrzyknięciem cieczy do kanału wyznacz jeden port kanału jako port wlotowy, a drugi jako port wylotowy i zachowaj to oznaczenie przez cały eksperyment.
  6. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, wprowadź końcówkę pipety bezpośrednio do portu wlotowego kanału. Powoli wypełnij kanały płytki 50 µL ciepłego (co najmniej w temperaturze pokojowej) buforu do analizy (skład buforu opisano w kroku 1.5).
  7. Przygotuj 0,5 M roztwór chlorku niklu(II). Rozmroź 2 mL alikwot roztworu kazeiny w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min i uzupełnij go roztworem chlorku niklu do końcowego stężenia 200 µM.
  8. Przepłucz dwuwarstwy, wstrzykując najpierw 100 µL roztworu kazeiny do portu wlotowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 µL z portu wylotowego na płytce za pomocą pipety. Zablokuj dwuwarstwy tym samym roztworem, wstrzykując 100 µL roztworu kazeiny do portu wlotowego każdego kanału i inkubując płytkę przez 45 min w temperaturze pokojowej.
  9. Rozmroź alikwoty białek Cy5-ICAM-1-His6 i streptawidyny. Połącz białka w buforze do analizy do końcowego stężenia 2 µg/mL każdego z nich. Wirować roztwór przez 30 min przy 20 000 x g i 4 °C, aby usunąć wszelkie agregaty.
  10. Usuń pozostałą część roztworu blokującego z portu wylotowego kanału płytki za pomocą pipety. Wstrzyknij 100 µL roztworu zawierającego ICAM-1 i streptawidynę do portu wlotowego.
  11. Inkubuj płytkę przez 45 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar roztworu białka z portu wylotowego. Przepłucz dwuwarstwę 2x, wstrzykując najpierw 100 µL buforu do analizy do portu wlotowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 µL z portu wylotowego.
  12. Rozcieńcz przeciwciało anty-CD3 znakowane Alexa-Fluor-488 w buforze do analizy do końcowego stężenia 2 µg/mL. Wstrzyknij 100 µL roztworu przeciwciał do portu wlotowego płytki i inkubuj przez 45 min w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar roztworu białka z portu wylotowego. Przepłucz dwuwarstwę 2x 100 µL buforu do analizy, analogicznie do kroku 3.11.

4. Obrazowanie interakcji limfocytów T z płaską dwuwarstwą

  1. Podgrzać stolik oraz obiektyw mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu fluorescencyjnego z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) do momentu ustabilizowania temperatury na poziomie 37 °C. Umieścić preparat z dwuwarstwami na podgrzewanym stoliku. Przesunąć stolik w odpowiednią pozycję zgodnie z oznaczeniami i ustawić ostrość na dwuwarstwie, wykorzystując fluorescencję cząsteczek ICAM-1 znakowanych Cy.
    1. W mikroskopie konfokalnym użyć obiektywu 61X, a w mikroskopie TIRF obiektywu 100X, przy odpowiednich ustawieniach filtrów.
  2. W przypadku obrazowania uwalniania ziarnistości za pomocą mikroskopii TIRF, do zawiesiny komórkowej przed wstrzyknięciem komórek do portów wlotowych dodać fragmenty Fab przeciwciał anty-CD107a znakowane Alexa-Fluor-568 do końcowego stężenia 4 µg/mL.
    1. Resuspendować przygotowane limfocyty T CD4+ wyizolowane z węzłów chłonnych (LN), krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej i wstrzyknąć 50 µL zawiesiny komórkowej do portu wlotowego kanału preparatu zawierającego dwuwarstwę.
  3. Wybrać żądaną liczbę pól i rejestrować obrazy każdego z nich raz co 2 min przez 30 min po wstrzyknięciu.
  4. Do pozyskania obrazów wykorzystać kanały pola jasnego, światła odbitego oraz fluorescencyjne (Alexa 488 i Cy5) mikroskopu konfokalnego. W mikroskopie TIRF użyć trybu TIRF dla fluorescencji Alexa-Fluor-488 i Alexa-Fluor-568 oraz trybu szerokopolowego (widefield) dla fluorescencji Cy5, a także do obrazowania w polu jasnym.

5. Analiza obrazu

  1. Przeanalizuj uzyskane obrazy przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. Zaobserwuj morfologię komórek na obrazach w świetle przechodzącym i wyklucz z analizy komórki skupione oraz widocznie uszkodzone lub apoptotyczne. Uwzględnij w analizie wyłącznie te komórki, które wchodzą w produktywną interakcję z powierzchnią dwuwarstwy (t. j., komórki kumulujące fluorescencję Alexa-Fluor-488 (przeciwciała anty-CD3) na styku).
  2. Wyznaczyć wielkość obszaru adhezji komórkowej w 20. minucie po rozpoczęciu interakcji komórki z dwuwarstwą lipidową.
    UWAGA: Obszar adhezji to ciemny obszar powstający na styku komórki i dwuwarstwy na obrazach z mikroskopii odbiciowej interferencyjnej (IRM).
  3. Należy obserwować wszelkie gromadzenie się fluorescencji Cy5-ICAM-1 oraz formowanie się połączenia pierścieniowego przez segregowane cząsteczki Cy-ICAM-1 na styku komórka-dwuwarstwa. Jeśli zgromadzone cząsteczki ICAM-1 utworzyły pierścieniowe połączenie adhezyjne na co najmniej dwóch kolejnych obrazach, takie komórki należy oznaczyć jako komórki tworzące obwodowy supramolekularny klaster aktywacyjny (pSMAC).12.
  4. Oceń uwalnianie ziarnistości, mierząc intensywność fluorescencji Alexa-Fluor-568 na styku limfocyty T i dwuwarstwy w stosunku do fluorescencji tła poza obszarem kontaktu w bezpośrednim sąsiedztwie komórki. Komórki o stosunku sygnału Alexa-Fluor-568 do tła wynoszącym co najmniej 1,3 określ jako komórki ulegające degranulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pierwszej kolejności porównaliśmy strukturę interfejsu synaptycznego tworzonego przez aktywowane limfocyty T CD8+ pochodzące z krwi pępowinowej, wystawione na działanie dwuwarstw lipidowych zbudowanych albo w tradycyjnych wielkoskalowych systemach komór przepływowych (szczegóły w Tabeli Materiałów)1,2,3,4, albo w wielokanałowych szk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj nowatorska technika wykorzystuje podobne odczynniki wymagane do budowy płaskich dwuwarstw w konwencjonalnej komórce przepływowej5 i może być z powodzeniem stosowana do obrazowania pierwotnych granic faz ludzkich limfocytów T 3,4,15. Technika ta oferuje znaczne zmniejszenie zużycia cząsteczek fluorescencyjnych i wymaga 10–20 razy mniej limfocytów T w porównaniu z systemem komórek przepływowyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant R01AI118694 NIH dla Michaela R. Bettsa, który obejmuje podnagrodę 566950 dla Jurija Sykuleva. Dziękujemy Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging Shared Resource za ich doskonałe wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do izolacji limfocytów T CD4, ludzkiMiltenyl Biotec130-096-533
Zestaw do izolacji limfocytów T CD8, ludzkiMiltenyl Biotec130-096-495
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
PSY NTAAvanti Polar Lipids790528C
Czapeczka biotynylowa PEAvanti Polar Lipids870273C
Albumina surowicy ludzkiejOctapharma USANDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4ibidi80608
Szkiełka nakrywkowe do szkiełek samoprzylepnychibidi10812
Bioptech FCS2 ChamberBioptech060319-2-03
anty-CD3Thermo Fisher Scientific16-0037-81Klon OKT3, komórki hybrydoma są dostępne w ATCC
przeciwciało anty-CD28GenetexGTX146649.3 klon
kazeinySigmaC5890
Biotin-PEO4-NHSThermo Fisher Scientific21329
DMSOSigmaD2650-5
Alexa Fluor 488 zestaw do znakowania białek z kolumną do oczyszczania znakowanych białekThermo Fisher ScientificA10235
Zestaw do znakowania białek Alexa Fluor 568 z kolumną do znakowanego oczyszczania białekThermo Fisher ScientificA10238
Amersham Cy5 NHS EsterGE Life SciencePA15101
pMT/V5-His Wektory ekspresyjne Drosophila A, B, C ThermoFisher ScientificV412020
pcopneo, G418 Wektor ekspresji Drosophila do selekcji pozytywnejATCC37409
Surowica wolna od pożywki drozofialnej Owad-XPRESSLonza12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4ATCCCRL1878Hybrydoma wydziela przeciwciało przeciwko ICAM-1.
Sepharose aktywowana bromkiem cyjanu 4BSigma-AldrichC9142Stosowany do przygotowania sefarozy z kowentnie związanym przeciwciałem anty-ICAM.
Koncentrator przepływu stycznego MasterFlexCole-Parmer77601-60 7592-40Stosowany do zagęszczania supernatantu zawierającego ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant
Centramate Lab Systemy przepływu stycznegoPall LaboratoryFS002K10 OS010T12 FS005K10Stosowany do zatężania supernatantu ICAM-1 i dializy ICAM-1 zawierającego supernant
Ni-NTA AgarozaQIAGEN30210
Rurki do dializySpectra/Por131384
Papaina z lateksu papaiMysie przeciwciałoP3125
przeciwko CD107aBD Bioscences555798Klon H4A3
Naturalne niebieskie rękawiczki AnsellFisher Scientific19-014-539
Kleszczyki nożycowe z polipropylenu NalgeneThermo Fisher Scientific6320-0010
StreptavidinProZymeSA10
Mikroskop konfokalnyNikonNikon TiE wyposażony w PFS do długoterminowej kontroli stabilności obrazu, obiektywy olejowe 60X, 4 lasery z liniami wzbudzenia przy 405, 458, 488, 514, 561 i 640 nm, 2 detektory GaAsP i 2 PMT o wysokiej czułości, światło przechodzące DIC, programowalny stolik X,Y,Z do wielu pozycji i łączenia dużych obszarów, funkcje poklatkowe, komora Tokai-Hit z kontrolą temperatury i CO2 do obrazowania na żywo oraz stół z izolacją antywibracyjną
Mikroskop TIRFSystem AndorAndor Revolution XD wyposażony w oświetlacz Nikon TIRF-E, Lasery z liniami 405,488,561 i 640, światło przechodzące DIC, głowica dysku obrotowego Yokogawa CSU-X1 do obrazowania konfokalnego, obiektyw 100/1,49 NA, kamera EM-CCD Andor iXon X3, grzałka obiektywu i piezoelektryczny stolik z napędem silnikowym z systemem Perfect Focus System (PFS)
Oprogramowanie do analizy obrazu MetaMorph PremierUrządzenia molekularne
przeciwciało anty-ludzkie Sigma Mikroskop odwrócony

Bibliografia

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18, Unit 18 13 (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973(2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interfejs synaptyczny limfocytów Tpłaska dwuwarstwa lipidowawielokanałowe slajdy przepływowemikroskopia TIRFobrazowanie uwalniania ziarnistościlimfocyty T z krwi obwodowejlimfocyty T z węzłów chłonnychICAM-1 streptawidynaFluoro-4 anty-CD3
Ocena interfejsu synaptycznego pierwotnych ludzkich limfocytów T z krwi obwodowej i tkanki limfatycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.