$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników, a próbki krwi i węzłów chłonnych pobrano za zgodą Institutional Review Board na University of Pennsylvania (IRB#809316, IRB# 815056). Wszyscy badani ludzie byli dorośli. Próbki krwi pępowinowej zostały dostarczone przez Dział Pracy i Porodów Oddziału Położnictwa i Ginekologii Uniwersytetu Thomasa Jeffersona. Wszystkie próbki zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację.
1. Izolacja limfocytów T CD4+ do analizy obrazu
- Rozmrozić 1 ml podwielokrotności zawierającej 107 zamrożonych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) lub komórek jednojądrzastych węzłów chłonnych (LNMC) z pobranych próbek. W sterylnym kapturze dodaj rozmrożone komórki do 9 ml RPMI uzupełnionego penicyliną/streptomycyną i glutaminą.
- Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml uzupełnionego RPMI zawierającego 10% FBS (kompletna pożywka). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C.
- Następnego dnia należy oczyścić limfocyty T CD4+ metodą ujemnego sortowania immunomagnetycznego przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcją producenta.
- Aby zmierzyć liczbę świeżo oczyszczonych limfocytów T CD4+, należy zmieszać 5 μl zawiesiny komórek z równą objętością roztworu błękitu trypanowego. Załaduj hemocytometr mieszaniną niebieskiej komórki i trypana i policz żywe komórki w 5 sekcjach hemocytometru.
- Weź średnią liczby komórek i określ liczbę komórek w oryginalnej zawiesinie komórek: liczba komórek/1 ml = średnia liczba x 2 x 104. Jeśli łączna liczba wyizolowanych komórek jest zbyt mała, użyj komórek bez liczenia.
- Odwirować komórki przy 300 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić je w buforze testowym (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glukozy, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i 1% albuminy surowicy ludzkiej) przy 10 5 komórkach/50 μl lub mniej i utrzymywać komórki w temperaturze 4 °C (przez 1–2 godziny) do momentu, gdy będą gotowe do używać w eksperymentach.
- Wszystkie odpady biologiczne należy utylizować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi instytucjonalnymi.
- W razie potrzeby jako populację komórek kontrolnych, przygotować aktywowane limfocyty T CD8 z PBMC krwi pępowinowej, umieścić10-7 komórek w 5 ml kompletnej pożywki w kolbie hodowlanej T25 pokrytej mieszaniną przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 odpowiednio w stężeniach 10 μg/ml i 1 μg/ml.
- Następnego dnia należy wyjąć aktywowane krwinki pępowinowe z kolby, przemyć je 1x świeżą kompletną pożywką i namnażać komórki w obecności rekombinowanej IL-2 (100 U/ml) przez 2 tygodnie.
- Oczyścić limfocyty T CD8 + krwi pępowinowej przez ujemne sortowanie immunomagnetyczne przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcją producenta. Policz komórki i wymień pożywkę na bufor testowy, jak opisano w krokach 1.3–1.6 dla limfocytów T LN i PB CD8 +.
2. Składniki do przygotowania płaskich dwuwarstw lipidowych
- Przygotuj 3 rodzaje liposomów, jak opisano w innym miejscu5: (a) 0,4 mM liposomów DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny), (b) 0,4 mM liposomów DOPC zawierających 33% mol. DOGS-NTA (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-[(N-(kwas 5-amino-1-karboksypentylo)iminodiacenowy)sukcynylo] (sól amonowa)) lipidy, (c) 0,4 mM liposomy DOPC zawierające 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-(cap biotynyl) (sól sodowa)).
- Przygotuj 5% roztwór kazeiny, jak opisano wcześniej5.
- Rozpuścić 5 g kazeiny w proszku w 100 ml ultraczystej wody i dodać 350 μl 10 M wodorotlenku sodu. Wymieszać wszystko na zwykłym mieszadle magnetycznym z małą prędkością zgodnie z dostępną skalą, w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C. Dostosować pH do 7,3 i ultrawirować roztwór przez 2 godziny przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant sterylnym filtrem 0,22 μm i przechowywać roztwór w porcjach w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Roztwór wodorotlenku sodu może powodować oparzenia chemiczne i może wywołać trwałą ślepotę w kontakcie z oczami. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną lub jej roztworami należy używać gumowych rękawic, odzieży ochronnej i ochrony oczu.
- Oznacz przeciwciało anty-CD3 biotyną w celu wytworzenia mono-bionylowanych cząsteczek przeciwciała za pomocą wcześniej opisanego podejścia8.
- Przygotować roztwór Biotyny-PEO4-NHS w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 0,1 mg/ml. Dodać 3,7 μl roztworu Biotin-PEO4-NHS do 1 mg przeciwciała w 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 100 mM wodorowęglanu sodu.
- Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór estru Alexa Fluor 488 NHS w stężeniu 10 mg/ml w DMSO. Dodaj roztwór estru Alexa Fluor 488 NHS do przeciwciała znakowanego przez Biotin-PEO4-NHS przy 10-krotnym nadmiarze molowym.
- Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, powoli mieszając na zwykłym mieszadle magnetycznym. Oddzielić niezwiązany barwnik za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.
- Oznaczyć stężenie przeciwciała, mierząc gęstość optyczną roztworu przeciwciała przy długości fali 280 nm (A280). Zmierzyć gęstość optyczną znakowanych przeciwciał przy długości fali 577 nm (A577).
- Określ stosunek barwnika do przeciwciała, korzystając z następującego równania:
UWAGA: Dodatkowe szczegóły można znaleźć w protokole producenta.
- Ekspresja rekombinowanego rozpuszczalnego białka ICAM-1 w systemie ekspresji Drosophila, jak opisano wcześniej3,4,9,10.
- Sklonuj, kodując cDNA, ektodomenę ICAM-1 do wektora ekspresyjnego Drosophila pMT / V5-His z indukowalnym promotorem metalotioneiny w celu wytworzenia rekombinowanego białka dołączonego znacznikiem His6 na końcu C.
- Kotransfekcyjne komórki S2 z powstałym ICAM-1 zawierającym plazmid i wektor ekspresyjny G418. Wybierz stabilne transfektanty za pomocą pożywki Drosophila firmy Schneider uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 0,5 mg/ml G418 przez 3 tygodnie. Rozmnoż komórki w pożywce dla owadów bez surowicy i indukuj ekspresję białka za pomocą 0,5 mM CuSO4 przez 3 dni.
- Zagęścić supernatant hodowli 10x i dializować względem PBS za pomocą koncentratora przepływu stycznego, jak opisano wcześniej11.
- Nałożyć skoncentrowany supernatant hodowli na kolumnę zawierającą Sepharose z kowalencyjnie unieruchomionym przeciwciałem monoklonalnym anty-ICAM-1 i eluować związany ICAM-1 za pomocą 50 mM buforu glicynowego o pH 3,0. Natychmiast zneutralizować eluowane białko ICAM-1 za pomocą 2 M buforu Tris o pH 8,0.
- Wymyty materiał należy dializować w stosunku do PBS, pH 8,0 i dodać dializowany materiał do kolumny zawierającej agarozę Ni-NTA. Eluować rozpuszczalny ICAM-1 z 200 mM imidazolem, pH 8,0. Uwolniony materiał należy dializować w buforze PBS o pH 8,0.
- Oznaczyć oczyszczony ICAM-1 estrem Cy5 NHS zgodnie z instrukcją producenta.
UWAGA: Najlepszy końcowy stosunek barwnika do białka wynosi 1:1.
- Wytworzyć fragmenty Fab z przeciwciała anty-CD107a przez trawienie papainą i oczyścić fragmenty Fab za pomocą chromatografii jonowymiennej, jak opisano wcześniej3. Oznacz fragmenty Fab estrem Alexa Fluor 568 NHS zgodnie z instrukcją producenta.
3. Tworzenie płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym
- Przygotuj świeży kwaśny roztwór piranii, mieszając 140 ml stężonego kwasu siarkowego i 60 ml 30% nadtlenku wodoru. Umyj szklane szkiełka nakrywkowe do szkiełek przepływowych, mocząc je w kwaśnym roztworze piranii przez 30 minut. Przytrzymaj szklane szkiełko nakrywkowe za pomocą polipropylenowych kleszczyków nożycowych.
UWAGA: Roztwór piranii jest niezwykle silnym utleniaczem. Pamiętaj, aby podczas pracy z roztworem zawsze nosić okulary lub gogle ochronne lub osłonę pełnotwarzową wraz z grubymi gumowymi rękawicami. Pracuj tylko z roztworem piranii pod wyciągiem. Unikaj podgrzewania, transportu lub potrząsania nim w dowolnym momencie podczas użytkowania, ponieważ może eksplodować. Zbierz odpady piranii do szklanej butelki z otworem zawierającym ołów. Skontaktuj się z Instytucjonalnym Komitetem ds. Bezpieczeństwa w sprawie prawidłowego utylizacji odpadów.
- Umyte szkiełka nakrywkowe spłukać 7x ultraczystą wodą, przenosząc je kolejno do zlewek zawierających świeżą wodę. Odłóż mokre szkiełka nakrywkowe na bok, aby pozostała woda stoczyła się z czystej szklanki, pozostawiając suchą szklankę.
- Alternatywnie użyj końcówki pipety dołączonej do pompy próżniowej, aby ostrożnie usunąć pozostałe kropelki wody z szkiełek nakrywkowych.
- W sterylnym kapturze wykonaj rozcieńczenia różnych lipidów, aby wytworzyć mieszankę liposomów do tworzenia dwuwarstw. Najpierw połącz 37 μl liposomów DOPC i 3 μl liposomów Biotinyl-Cap-PE. Po drugie, wymieszaj 14 μl liposomów DOPC i 15 μl liposomów DOGS-NTA. Po trzecie, dodaj 1 μl pierwszej mieszanki do 29 μl drugiej mieszanki, aby wytworzyć końcową mieszaninę liposomów.
- W sterylnym kapturze przygotuj miejsce do pracy z suchymi szkiełkami nakrywkowymi w pobliżu. Podwielokrotność 2 μl końcowej mieszaniny liposomów (patrz krok 3.3) dokładnie w środku samoprzylepnego kanału ślizgowego. Natychmiast i bardzo precyzyjnie wyrównaj czyste i suche szkiełko nakrywkowe ze szkiełkiem podstawowym i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na lepką stronę szkiełka.
- Jeśli przygotowujesz więcej niż jedno szkiełko, pracuj na jednym szkiełku na raz, ponieważ mieszanina liposomów szybko odparowuje. Odwróć suwak i użyj zewnętrznego pierścienia polipropylenowych kleszczyków nożycowych, aby delikatnie docisnąć obwodowy kontakt szkiełka nakrywkowego ze szkiełkiem, upewniając się, że szkiełko jest mocno przymocowane do szkiełka, aby wykluczyć wyciek.
UWAGA: Nie naciskaj na kanały szkiełka, aby uniknąć złamania lub pęknięcia szkiełka nakrywkowego.
- Ponownie odwróć szkiełko i zaznacz położenie uformowanej dwuwarstwy, która wygląda jak kropla między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem kanałowym, rysując 4 kropki trwałym markerem wokół dwuwarstwy po zewnętrznej stronie suwaka zespołu.
- Przed pierwszym wstrzyknięciem cieczy do kanału należy wyznaczyć jeden port kanału jako port wejściowy, a drugi jako port wyjściowy i utrzymywać to oznaczenie przez cały czas trwania eksperymentu.
- Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, włóż końcówkę końcówki pipety bezpośrednio do portu wejściowego kanału. Powoli napełnić kanały szkiełka 50 μl ciepłego (co najmniej w temperaturze pokojowej) buforu do oznaczania (patrz krok 1.5 w celu zapoznania się ze składem buforu).
- Przygotować 0,5 M roztwór chlorku niklu(II). Rozmrozić 2 ml roztworu kazeiny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut i uzupełnić go roztworem chlorku niklu o końcowym stężeniu 200 μM.
- Przemyć dwuwarstwy, najpierw wstrzykując 100 μl roztworu kazeiny do portu wejściowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 μl z portu wyjściowego na szkiełku przez pipetowanie. Zablokować dwuwarstwy tym samym roztworem, wstrzykując 100 μl roztworu kazeiny do portu wejściowego każdego kanału i inkubując szkiełko przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
- Rozmrozić podwielokrotności białek Cy5-ICAM-1-His6 i streptawidyny. Połączyć białka w buforze do oznaczania o końcowym stężeniu 2 μg/ml każde. Odwirowywać roztwór przez 30 minut w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich osadów.
- Usunąć pozostałą część roztworu blokującego z portu wyjściowego kanału szkiełkowego za pomocą pipetowania. Wstrzyknąć 100 μl roztworu zawierającego ICAM-1 i streptawidynę do portu wejściowego.
- Inkubować szkiełko przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. Przemyć dwuwarstwę 2x, najpierw wstrzykując 100 μl buforu testowego do portu wejściowego kanału, a następnie natychmiast usuwając 100 μl z portu wyjściowego.
- Rozcieńczyć przeciwciało anty-CD3 znakowane Alexa-Fluor-488 buforem testowym do końcowego stężenia 2 μg/ml. Wstrzyknąć 100 μl roztworu przeciwciała do portu wejściowego szkiełka i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar roztworu białkowego z portu wyjściowego. Przemyć dwuwarstwę 2x 100 μl buforu do oznaczania, jak w kroku 3.11.
4. Obrazowanie interakcji limfocytów T z dwuwarstwą planarną
- Rozgrzej stolik i obiektyw mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu fluorescencji z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), aż temperatura osiągnie równowagę na poziomie 37 °C. Ustaw szkiełko z dwuwarstwą (warstwami) na podgrzewanym stoliku. Przesuń stolik do odpowiedniej pozycji zgodnie ze śladami atramentu i skup się na dwuwarstwie wykorzystującej fluorescencję cząsteczek ICAM-1 znakowanych Cy.
- Użyj obiektywu 61X do mikroskopu konfokalnego lub obiektywu 100X do mikroskopu TIRF, z odpowiednimi ustawieniami filtrów.
- W celu obrazowania uwalniania granulek za pomocą mikroskopii TIRF, przed wstrzyknięciem komórek do portów wejściowych dodać fragmenty Fab przeciwciała anty-CD107a znakowane Alexa-Fluor-568 do zawiesiny komórkowej w końcowym stężeniu 4 μg/ml.
- Zawiesić przygotowane limfocyty T CD4+ wyizolowane z LN lub PB lub krwi pępowinowej i wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej do portu wejściowego kanału szkiełkowego zawierającego dwuwarstwę.
- Wybierz żądaną liczbę pól i rejestruj obrazy każdego pola 1x co 2 minuty przez 30 minut po wstrzyknięciu.
- Wykorzystaj jasne pole, światło odbite i kanały fluorescencyjne (Alexa 488 i Cy5) mikroskopu konfokalnego, aby uzyskać obrazy. Użyj trybu TIRF dla fluorescencji Alexa-Fluor-488 i Alexa-Fluor-568 oraz szerokiego pola dla fluorescencji Cy5, a także obrazowania w jasnym polu na mikroskopie TIRF.
5. Analiza obrazu
- Przeanalizuj pozyskane obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Obserwuj morfologię komórek na obrazach w świetle przechodzącym i wyklucz z analizy komórki skupione i widocznie uszkodzone lub apoptotyczne. Uwzględnij w analizie tylko te komórki, które produktywnie oddziałują z powierzchnią dwuwarstwy (tj. komórki akumulujące fluorescencję Alexa-Fluor-488 (przeciwciała anty-CD3) na granicy faz).
- Określić wielkość obszaru adhezji komórek po 20 minutach od zainicjowania interakcji komórka-dwuwarstwa.
UWAGA: Obszar adhezji to ciemny obszar powstały na granicy faz komórka-dwuwarstwa na obrazach mikroskopii interferencyjnej (IRM).
- Obserwuj nagromadzenie fluorescencji Cy5-ICAM-1 i tworzenie połączenia pierścieniowego przez segregowane cząsteczki Cy-ICAM-1 na granicy faz komórka-dwuwarstwa. Jeśli skumulowane cząsteczki ICAM-1 utworzyły połączenie pierścienia adhezyjnego na co najmniej dwóch kolejnych obrazach, oznacz takie komórki jako komórki tworzące obwodowy supramolekularny klaster aktywujący (pSMAC)12.
- Oceń uwalnianie granulek, mierząc intensywność fluorescencji Alexa-Fluor-568 na granicy limfocytów T-dwuwarstwa nad fluorescencją tła poza obszarem kontaktu w bliskiej odległości od komórki. Oznacz komórki o stosunku sygnału Alexa-Fluor-568 do tła wynoszącym co najmniej 1,3 jako komórki degranulujące.