Tutaj opisujemy protokół przygotowania i utrzymania pierwotnych hodowli komórek przysadki mózgowej z medaka (Oryzias latipes). Zoptymalizowane warunki w tym protokole uwzględniają ważne parametry, takie jak temperatura, osmolalność i pH, naśladując warunki fizjologiczne ryb, umożliwiając w ten sposób fizjologicznie bardziej znaczące wyniki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie wysokiej jakości pierwotnej hodowli komórkowej z przysadki mózgowej ryb
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotna hodowla komórkowa jest potężnym narzędziem powszechnie używanym przez naukowców do badania właściwości komórkowych i mechanizmów izolowanych komórek w kontrolowanym środowisku. Pomimo ogromnych różnic w fizjologii między ssakami a rybami, pierwotne protokoły hodowli komórek od ryb są często oparte na warunkach hodowli ssaków, często z niewielkimi modyfikacjami. Różnice środowiskowe wpływają nie tylko na temperaturę ciała, ale także na parametry surowicy krwi, takie jak osmolalność, pH i pojemność buforowa pH. Ponieważ pożywki do hodowli komórkowych i podobne roztwory robocze mają naśladować charakterystykę płynu zewnątrzkomórkowego i/lub surowicy krwi, do której komórka jest przystosowana, ważne jest, aby parametry te były dostosowane specjalnie do danego zwierzęcia.
Obecny protokół opisuje zoptymalizowane warunki hodowli pierwotnej dla medaka (Oryzias latipes). Protokół zawiera szczegółowe kroki, jak wyizolować i utrzymać zdrowe zdysocjowane komórki przysadki mózgowej przez ponad tydzień i obejmuje następujące kroki: 1. dostosowanie osmolalności do wartości stwierdzonych w osoczu krwi medaka, 2. dostosowanie temperatury inkubacji do normalnej temperatury medaka (tutaj w akwarium) i 3. dostosowanie pH i buforu wodorowęglanowego do wartości porównywalnych z innymi gatunkami ryb żyjącymi w podobnych temperaturach. Wyniki przedstawione przy użyciu opisanego protokołu promują fizjologicznie znaczące wyniki dla medaka i mogą być wykorzystane jako przewodnik referencyjny przez naukowców tworzących pierwotne hodowle komórkowe z innych gatunków innych niż ssaki.
Wprowadzenie
Hodowla komórkowa jest jednym z głównych narzędzi wykorzystywanych w badaniach biologii molekularnej, dostarczając doskonałego systemu modelowego do odpowiadania na różne pytania biologiczne, począwszy od normalnej fizjologii komórkowej, a skończywszy na badaniach przesiewowych leków i rakotwórczości1. Komórki pierwotne, wyizolowane bezpośrednio z tkanki zwierzęcej przy użyciu metod enzymatycznych i/lub mechanicznych, są często uważane za bardziej istotne biologicznie niż linie komórkowe, ponieważ odpowiedź biologiczna może być bliższa sytuacji in vivo. Protokoły przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych powinny być zoptymalizowane dla każdego gatunku i typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania, aby naśladować cechy, do których komórka jest przystosowana, i uzyskać fizjologicznie miarodajne wyniki.
Liczne protokoły opisują warunki hodowli dla systemów komórkowych ssaków, podczas gdy podobne protokoły opisujące podstawowe warunki hodowli komórek ryb są raczej rzadkie w porównaniu. Komórki są podatne na gwałtowne zmiany temperatury, pH i osmolalności, a podczas procedury dysocjacji są szczególnie kruche. Komercyjne roztwory soli i pożywki hodowlane stosowane do hodowli komórek ssaków nie są optymalne dla ryb teleost, zwłaszcza pod względem systemów buforowych pH i osmolalności. Dlatego ważne jest, aby zmierzyć i dostosować roztwory do fizjologicznie istotnych poziomów tych parametrów u gatunków będących przedmiotem zainteresowania.
Pierwotne kultury przysadki mózgowej zostały stworzone z kilku gatunków ryb teleost, w tym karpia pospolitego (Cyprinus carpio)2,3, amur (Ctenopharyngodon idella)4, złota rybka (Carassius auratus)5, pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss)6, węgorz europejski (Anguilla anguilla)7, tilapia (Oreochromis mossambicus)8, danio pręgowany (Danio rerio)9 i dorsz atlantycki (Gadus morhua)10. Oprócz dostosowania temperatury inkubacji do gatunków będących przedmiotem zainteresowania, kilka z tych protokołów inkubowało komórki w warunkach podobnych do ssaków, które mogą być nieoptymalne dla gatunku będącego przedmiotem zainteresowania, przy pH od 7,2 do 7,5 w wilgotnej atmosferze zawierającej 3 - 5% CO2 . Ponadto nie jest jasne, czy osmolalność roztworów użytych do przygotowania kilku z tych pierwotnych kultur komórkowych była dostosowana i stabilna między różnymi roztworami.
Obecny protokół opiera się na poprzedniej pracy z podstawowymi kulturami z atlantyckiego dorsza 10 i obejmuje dostosowanie temperatury inkubacji, osmolalności, pH i systemów buforowych pH, w tym ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla (pCO2), do fizjologii medaka (O. latipes). Medaka to mała (3–4 cm) ryba słodkowodna, pochodząca z Azji Wschodniej. Obecnie jest używany jako gatunek modelowy w wielu laboratoriach badawczych na całym świecie, ponieważ jest stosunkowo łatwy w hodowli i wysoce odporny na wiele powszechnych chorób ryb11. Istnieje kilka zalet korzystania z medaka jako modelu, w tym tolerancja temperatury od 4 do 40 °C11, krótki czas generacji, przezroczyste zarodki, gen determinujący płeć12 oraz sekwencjonowany genom13, a także wiele innych dostępnych zasobów genetycznych.
Warunki hodowli podstawowej w tym protokole są zoptymalizowane tak, aby odpowiadały temperaturze 26 °C, w której medaki są trzymane w obiekcie rybnym. Co więcej, osmolalność jest zmniejszona z 320 mOsm/kg u dorsza atlantyckiego żyjącego w słonej wodzie do 290 mOsm/kg u medaka żyjącego w wodzie słodkiej i jest zgodna z normalną osmolalnością medaka plasma14. Dla porównania, typowa osmolalność osocza ssaków mieści się w zakresie 275–295 mOsm15. Ryby żyją w różnych temperaturach i mają skrzela, które mają bezpośredni kontakt z wodą, co sprawia, że pH i pojemność buforowa krwi i płynu zewnątrzkomórkowego u ryb różnią się od tych u ssaków. Pożywki hodowlane ssaków zwykle obejmują systemy buforowe, które skutkują pH około 7,4, gdy pożywki są równoważone ze standardową atmosferą 5% CO2 w wilgotnym powietrzu w temperaturze 37 °C. pH jest zależne od temperatury, a wartość neutralnego pH (w wodzie) wzrasta wraz ze spadkiem temperatury16. Typowe pH osocza ryb teleost waha się od 7,7 do 7,917. Optymalizacja tego protokołu obejmowała obniżenie pH z 7,85 dla dorsza utrzymywanego w temperaturze 12 °C do pH 7,75 dla medaka utrzymywanego w temperaturze 26 °C poprzez zwiększenie CO2 z 0,5% do 1%.
Ponadto, pojemność bufora wodorowęglanowego jest zupełnie inna u ryb i ssaków. CO2 jest łatwo wymieniany przez skrzela u ryb, a pCO2 w wodzie to tylko niewielka część pCO2 w płucach18. Zmiana temperatury lub pCO2 spowoduje zmianę pH i buforu pożywki. W związku z tym ani pH, ani pCO2 zalecane do inkubacji komórek ssaków nie są optymalne dla komórek ryb, dlatego pożywki hodowlane powinny być zoptymalizowane za pomocą systemów buforowych zawierających fizjologicznie istotne wartości dla ryb i poszczególnych gatunków będących przedmiotem zainteresowania. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować pierwotne hodowle komórkowe z przysadek mózgowych medaka i obejmuje regulacje temperatury inkubacji, osmolalności, pH i systemu buforowego pH, a także inne ważne parametry, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania pierwotnych kultur komórkowych z gatunków innych niż ssaki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Norweski Uniwersytet Nauk Przyrodniczych, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt badawczych.
1. Przygotowanie roztworów
- Skalibruj osmometr i miernik pH zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapewnić prawidłowe pomiary.
- Przygotować 500 ml soli fizjologicznej Dulbecco (dPBS) buforowanej fosforanami bezCa2+- iMg2+, dostosowując pH do 7,75 (krok 1.2.1) i osmolalność do 290 mOsm/kg (etap 1.2.2) przed sterylną filtracją (etap 1.2.3).
- Dostosować pH do 7,75 za pomocą skalibrowanego pH-metru, ostrożnie dodając krople 1 M roztworu NaOH, ostrożnie mieszając roztwór.
- Zmierzyć osmolalność roztworu za pomocą skalibrowanego osmometru i obliczyć ilość mannitolu potrzebną do zwiększenia osmolalności do 290 mOsm/kg. Dodać wymaganą ilość mannitolu, a następnie ponownie zmierzyć osmolalność roztworu, aby zapewnić prawidłowe dostosowanie.
UWAGA: Potrzebna ilość mannitolu zależy od mierzonej osmolalności, która zwykle różni się w zależności od różnych partii. Jedna cząsteczka mannitolu to 1 cząstka osmotyczna. - Przefiltruj sterylnie roztwór dPBS za pomocą filtra 0,2 μm.
UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 miesiące.
- Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej Leibovitz (L-15) bez L-glutaminy i wodorowęglanu i uzupełnij ją 10 mM NaHCO3 (krok 1.3.1), 4,5 mM glukozy (krok 1.3.2) i 2 mM dostępnej w handlu glutaminy (krok 1.3.3). Doprowadzić roztwór do 290 mOsm/kg (krok 1.3.4), przefiltrować go sterylnie (krok 1.3.5) i dodać 2,5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (krok 1.3.6).
UWAGA: Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie.- Dodać 420 mg NaHCO3 na 500 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać 10 mM roztworu.
- Dodać 405 mg glukozy na 500 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać 4,5 mM roztworu.
- Dodaj 5 ml 100-krotnego wywaru roztworu glutaminy do 500 ml pożywki hodowlanej, aby uzyskać 2 mM roztworu. Mieszaj, aż wszystkie substancje rozpuszczone się rozpuszczą.
- Doprowadzić roztwór do 290 mOsm/kg z mannitolem za pomocą osmometru (jak wykonano w kroku 1.2.2).
- Przeprowadzić sterylną filtrację pożywki L-15 za pomocą filtra 0,2 μm.
- Po sterylnej filtracji dodać 2,5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny, co odpowiada 50 j./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
- Przygotować 50 ml roztworu trypsyny, używając 1 mg/ml (0,1%) trypsyny typu II-S rozpuszczonej w zmodyfikowanym dPBS (przygotowanym w kroku 1.2). Przygotować porcje po 2 ml w sterylnych plastikowych probówkach i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
UWAGA: Podwielokrotności 2 ml można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 miesiące. - Przygotować 50 ml roztworu inhibitora trypsyny, używając 1 mg/ml (0,1%) inhibitora trypsyny typu I-S i uzupełnić go 2 μg/ml DNazy I rozpuszczonej w zmodyfikowanym dPBS (przygotowanym w kroku 1.2). Przygotować porcje po 2 ml w sterylnych plastikowych probówkach i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
Uwaga: Podwielokrotności o pojemności 2 ml można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 miesiące.
2. Przygotowanie sprzętu
- Przygotuj szklane pipety przez polerowanie ogniem końcówki w celu dysocjacji komórek. Przygotuj końcówki o 2 różnych kategoriach wielkości (średni otwór 0,6–0,8 μm i mały otwór 0,4–0,6 μm), bawiąc się czasem i odległością od płomienia, jednocześnie obracając pipetę. Umieścić szklane pipety w czystym szklanym pojemniku i sterylizować je w autoklawie (w trybie stałym w temperaturze 105 °C przez 45 minut).
- Przygotuj styropianowe pudełko z lodem.
- Przygotuj plastikową probówkę z 1,5 ml zmodyfikowanego dPBS (przygotowanego w kroku 1.2) do przeniesienia przysadki mózgowej podczas sekcji i trzymaj ją na lodzie.
- Przygotować probówkę o pojemności 15 ml z 10 ml zmodyfikowanego dPBS (przygotowanego w kroku 1.2) i trzymać ją na lodzie do czasu dysocjacji komórek.
- Przygotować świeże lub rozmrożone porcje roztworów trypsyny i inhibitorów trypsyny (przygotowanych w krokach 1.4 i 1.5) i przechowywać je na lodzie do czasu użycia.
- Ustawić łaźnię wodną na 26 °C przed rozpoczęciem rozwarstwienia, aby woda mogła osiągnąć żądaną temperaturę przed chemiczną dysocjacją przysadki mózgowej.
- Wyczyść wszystkie narzędzia do preparowania 70% etanolem przed, w trakcie i po użyciu, w tym drobne kleszcze do użycia do sekcji oraz cienkie igły i woskową płytkę do przypinania ryby. Podczas całego zabiegu należy używać czystych rękawiczek (często zmieniać i czyścić), aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia komórek.
3. Rozwarstwienie przysadki mózgowej i dysocjacja komórek
- Rybę należy poddać eutanazji, zanurzając ją w lodowej brei (0 °C). Pozostaw rybę w lodowej brei pośniegowej na co najmniej 1 minutę, aby zapewnić nieodwracalny szok hipotermiczny.
UWAGA: Unieruchomienie i utrata równowagi nastąpi po kilku sekundach. Upewnij się, że ryba jest całkowicie zanurzona w lodowatej wodzie i nie leży na lodzie, ponieważ ten ostatni doprowadzi do uduszenia i potencjalnych oparzeń skóry, a nie do szybkiego i humanitarnego wstrząsu hipotermicznego. - Szybko przenieś rybę w sieci na woskową płytkę pod mikroskopem preparacyjnym i zniszcz kręgosłup przez wbicie igły w szyję.
- Przypnij głowę ryby do płytki woskowej za pomocą cienkich igieł, wkładając jedną igłę z przodu (nad ustami) i po jednej z każdej strony głowy (za mózgiem), aby ustabilizować głowę przed preparacją.
- Obejrzyj rybę pod mikroskopem preparacyjnym i delikatnie zeskrob łuski na czubku głowy za pomocą cienkich kleszczy z ukośną końcówką.
- Ostrożnie włóż kątową końcówkę cienkich kleszczy pod skórę od strony głowy i zdejmij dach czaszki, powoli przesuwając kleszcze w kierunku ust, trzymając mocno kleszcze otaczające dach czaszki.
- Całkowicie odetnij rdzeń kręgowy za pomocą kleszczy z kątową końcówką.
UWAGA: Czas jest ważnym czynnikiem, więc pracuj wydajnie i dokładnie, aby ograniczyć czas spędzony od wypreparowania przysadki mózgowej do momentu posiania komórek w naczyniu. Po pewnym czasie rozwarstwienie przysadki powinno zająć około 2-3 minut na rybę, z czego tylko około 10 s potrzeba do pobrania przysadki, gdy mózg jest już odsłonięty. - Ostrożnie odwróć mózg w kierunku ust, aby odsłonić przysadkę mózgową i wypreparuj go czystymi kleszczami z prostą końcówką. Przenieś przysadkę do plastikowej probówki zawierającej 1,5 ml zmodyfikowanego dPBS (w celu uzyskania szczegółowych informacji, patrz krok 2.3) umieszczonej na lodzie. Sprawdź końcówkę kleszczy pod mikroskopem, aby upewnić się, że przysadka została pomyślnie dodana do probówki i nic nie pozostało na kleszczach.
UWAGA: Wypreparuj tyle przysadek mózgowych, ile potrzeba, w zależności od liczby potraw z kultur, które mają być przygotowywane jednocześnie. Z reguły należy obliczyć co najmniej 10 przysadek mózgowych z dorosłej ryby na danie, aby uzyskać odpowiednią gęstość komórek (w zależności od dalszej aplikacji). - Odwiruj przysadki mózgowe w wirówce stołowej przez 1-2 sekundy w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyjmij dPBS za pomocą szklanej pipety i uważaj, aby nie usunąć przysadki mózgowej.
- Dodaj 1 ml roztworu trypsyny (przygotowanego w kroku 1.4), aby umyć przysadki mózgowe, odwiruj je w wirówce stołowej przez 1-2 sekundy i usuń większość płynu za pomocą szklanej pipety przed dodaniem dodatkowego 1 ml roztworu trypsyny.
- Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 26 °C przez 30 minut, najlepiej delikatnie wstrząsając, lub alternatywnie, kilkakrotnie przesunąć probówkę w okresie inkubacji.
- Wiruj przysadki w wirówce stołowej przez 1-2 sekundy w temperaturze pokojowej i upewnij się, że wszystkie przysadki znajdują się na dnie probówki. Usuń większość roztworu trypsyny szklaną pipetą i dodaj 1 ml roztworu inhibitora trypsyny (przygotowanego w kroku 1.5) w celu dezaktywacji trypsyny i umycia przysadki mózgowej.
- Zbierz przysadki mózgowe na dnie probówki, obracając je w wirówce stołowej przez 1-2 sekundy w temperaturze pokojowej. Usuń większość płynu szklaną pipetą i dodaj 1 ml roztworu inhibitora trypsyny (przygotowanego w kroku 1.5). Umieścić probówkę na łaźni wodnej o temperaturze 26 °C na 20 minut, najlepiej delikatnie potrząsając, lub alternatywnie, przesunąć probówkę kilka razy w okresie inkubacji, aby dezaktywować trypsynę.
- Przygotować naczynie do hodowli komórkowych pokryte poli-d-lizyną o średnicy 35 mm z centralnym szklanym dnem, dodając 2 ml pożywki L-15 i pozostawiając ją do inkubacji przez co najmniej 10 minut w temperaturze 26 °C i z 1% CO2 tak, aby mogła osiągnąć odpowiednią temperaturę i pH przed posiewem komórek.
UWAGA: Można również użyć plastikowego naczynia do hodowli komórkowych. Główną zaletą używania naczynia z centralnym szklanym dnem jest to, że obszar, w którym posiewane są komórki, jest mniejszy, a zatem na jedno naczynie potrzeba mniej komórek przysadki mózgowej. Niektóre dalsze zastosowania mogą również wymagać szklanego dna (np. niektóre techniki obrazowania). - Ustawić wirówkę chłodzącą dla probówek o pojemności 15 ml na 4 °C, aby umożliwić jej osiągnięcie żądanej temperatury przed rozpoczęciem dysocjacji mechanicznej.
- Zebrać przysadki mózgowe na dnie probówki, obracając probówkę z roztworem inhibitora trypsyny (z kroku 3.11) w wirówce stołowej przez 1-2 sekundy w temperaturze pokojowej i upewnij się, że wszystkie przysadki znajdują się na dnie probówki przed ostrożnym usunięciem większości roztworu inhibitora trypsyny za pomocą szklanej pipety.
Uwaga: Aby uniknąć zanieczyszczenia komórek, należy wykonać wszystkie poniższe czynności protokołu w ławce z przepływem laminarnym (LAF) certyfikowanej do pracy z ogniwami. - Dodać 1 ml lodowato zmodyfikowanego dPBS (przygotowanego w kroku 2.4) do kawałków tkanki przysadki mózgowej i delikatnie zassać kawałki tkanki w górę iw dół (6–7 razy) w pipecie ze szkła polerowanego ogniowo (przygotowanej w kroku 2.1).
UWAGA: Temperatura jest istotnym aspektem, dlatego wszystkie roztwory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C. Od tego momentu wykonuj wszystkie kroki na lodzie, jeśli to możliwe. - Odwiruj kawałki tkanek w wirówce stołowej przez 1-2 s w temperaturze pokojowej i ostrożnie przenieś górną część dPBS zawierającą zdysocjowane komórki (prawie 1 ml) do nowej probówki o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie. Unikaj przesuwania pipety w kierunku dna probówki, gdzie pozostały kawałki tkanki.
- Powtórz krok 3.16–3.17, dysocjując komórki w 1 ml lodowatego dPBS na raz, aż zostanie wykorzystane wszystkie 10 ml dPBS. Zacznij używać szklanej pipety ze średniej wielkości otworem i zmień na szklaną pipetę z mniejszym otworem pod koniec (dla ostatnich 3–4 ml dodanego dPBS) dysocjacji. Jeśli pod koniec procedury dysocjacji nadal widoczne są fragmenty tkanki, należy zwiększyć pipetowanie do około 10 razy w kierunku 2 ostatnich etapów dPBS do dysocjacji, a na koniec pozostawić pozostałe fragmenty tkanki. Delikatnie zawieś komórki i unikaj tworzenia pęcherzyków, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek, gdy komórki przyczepią się do powierzchni pęcherzyków.
UWAGA: Jest to krytyczny krok tego protokołu i wymaga pewnego treningu, aby osiągnąć dobry wynik. - Zrównoważyć probówkę w wirówce (wstępnie schłodzoną do temperatury 4 °C) i wirować komórki o sile 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że zaznaczyłeś stronę probówki, w której będzie znajdować się osad komórek.
- Ostrożnie wyjąć probówkę z wirówki i delikatnie przenieść supernatant szklaną pipetą do pustej probówki z tworzywa sztucznego o pojemności 15 ml bezpośrednio po odwirowaniu. Należy pamiętać o usunięciu większości supernatantu, ale należy uważać, aby nie stracić małej (często niewidocznej) osadki komórkowej.
- Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w 50–100 μl pożywki hodowlanej L-15.
UWAGA: Na tym etapie możliwe jest policzenie komórek i/lub wykonanie testu żywotności (takiego jak zliczanie komórek w obecności błękitu trypanowego za pomocą hemocytometru), ale należy pamiętać, że użycie części zawiesiny komórek do tego celu obniży wydajność. Unikaj stosowania dużej objętości zawiesiny, ponieważ zwiększy to ryzyko dyfuzji komórek poza środek naczynia. - Ostrożnie wlać zdysocjowane komórki na środek naczynia do hodowli komórkowej zawierającego 2 ml pożywki L-15 (przygotowanej w kroku 3.13). Pozwól komórkom opaść na dno naczynia na około 5 minut przed przeniesieniem ich do inkubatora, aby uniknąć rozprzestrzenienia się komórek poza zapadniętą część szklanego dna.
- Inkubować naczynie w temperaturze 26 °C i 1% CO2 , aby wszystkie komórki dokładnie opadły i przymocowały się do dna naczynia.
- Po 30 minutach spójrz na komórki w mikroskopie, aby upewnić się, że przyczepiły się do szalki hodowlanej.
- Kontynuować inkubację komórek w temperaturze 26 °C i 1% CO2 .
- Ostrożnie zmieniaj większość (ale nie całą) pożywkę co 3-4 dni.
Uwaga: Unikaj częstszej wymiany podłoża, ponieważ może to zakłócić działanie komórek i spowodować ich oderwanie się od szklanego dna. Użyj komórek do eksperymentów w ciągu tygodnia po ich wysianiu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje przygotowanie pierwotnej hodowli komórek z przysadki medaki i pozwala na uzyskanie zdrowych komórek, które mogą być utrzymywane w hodowli przez co najmniej jeden tydzień. Protokół opiera się na wartościach fizjologicznie istotnych dla medaka14 i został dodatkowo zoptymalizowany pod kątem tkanki przysadki u dorosłych ryb, z zastosowaniem pH 7,75 oraz osmolalności 290 mOsm/kg podczas całej procedury, od pobrania tkanki do wysiania komórek d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Systemy hodowli komórkowych in vitro dostarczają naukowcom potężnych narzędzi do odpowiadania na mnóstwo różnych pytań biologicznych, jeśli są stosowane we właściwy sposób1. Ważne jest, aby pamiętać, że zdysocjowane komórki, które utraciły połączenia z sąsiednimi komórkami, mogły uzyskać inne właściwości funkcjonalne niż pierwotnie miały in vivo. Aby uniknąć ryzyka błędnej interpretacji wyników uzyskanych w doświadczeniach in vitro, ważne jest, aby rozważyć dostosowanie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany przez Norweski Uniwersytet Przyrodniczy i Norweską Radę ds. Badań Naukowych, grant numer 243811 i 244461 (program akwakultury). Jesteśmy wdzięczni Lourdes Carreon Tan z Norweskiego Uniwersytetu Przyrodniczego za utrzymanie obiektu do hodowli ryb.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (dPBS), bez chlorku wapnia i chlorku magnezu | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | D8537 | Dostosuj roztwór do pH 7,75 za pomocą 1M NaOH i 290 mOsm za pomocą mannitolu. |
| Pożywka L-15 (Leibovitz), bez L-glutaminy | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | L5520 | Suplement 500 ml pożywki hodowlanej z 10 mM NaHCO3, 4,5 mM glukozy, 2 mM Glutamax. Dostosuj roztwór do 290 mOsm z mannitolem i roztworem filtrującym przez 0,2 &mikro; m Sterylny filtr PES przed dodaniem 2,5 ml roztworu penicyliny-streptomycyny (szczegóły poniżej). |
| NaOH | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | S5881 | Dodaj krople 1 M roztworu, aby zwiększyć pH dPBS i pożywki hodowlanej do 7,75. |
| NaHCO3 | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | S5761 | 10 mM NaHCO3 równa się 420 mg na 500 ml pożywki hodowlanej. |
| D-mannitol | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | 63565 | Służy do zwiększania osmolalności dPBS i pożywki hodowlanej. Oblicz prawidłową ilość potrzebną do osiągnięcia osmolalności 290 mOsm. |
| D-glucose | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | G5400 | 4,5 mM D-glukoza wynosi 405 mg na 500 ml pożywki hodowlanej. |
| Suplement GlutaMAX | Gibco (Life Technologies, Paisley, Wielka Brytania) | 35050-061 | Alternatywa dla L-glutaminy, o zwiększonej stabilności. 2 mM Glutamax to 5 ml 100x bulionu w 500 ml pożywki hodowlanej. |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | P0781 | Roztwór podstawowy 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny na ml. Użyć 2,5 ml roztworu podstawowego w 500 ml pożywki L-15 (odpowiednik 50 U/ml penicyliny i 50 &mikro; g/ml streptomycyny). |
| Trypsyna typu II-S | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | T7409 | Przygotować 1 mg/ml w roztworze dPBS. |
| Inhibitor trypsyny typu I-S Sigma | (Merck, Damstadt, Niemcy) | T6522 | Przygotować 1 mg/ml w roztworze dPBS, uzupełnić 2 &mikro; g/ml Dnazy I (szczegóły poniżej). |
| Dnase I | Sigma (Merck, Damstadt, Niemcy) | D5025 | Stosować w roztworze inhibitora trypsyny (patrz wyżej). |
| 0,2 &mikro; m Sterylny system filtrów polieterosulfonowych (PES) | Corning Inc. (Corning, NY) | 431097 | Służy do sterylnej filtracji pożywki dPBS i L-15 po regulacji. |
| Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm ze szklanym dnem, pokryte poli d-lizyną | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | Można również zastąpić plastikowym naczyniem, w zależności od dalszego zastosowania. |
| Kleszcze Dumont #5 | Fine Science Tools (CA) | 11254-20 | Proste końcówki |
| Dumont #5/45 | Fine Science Tools (CA) | 11253-25 | Kątowe końcówki 45° |
| Mikroskop stereoskopowy SZ61 | Olympus Corp. (Tokio, Japonia) | Służy do preparowania przysadek mózgowych. | |
| Alegra X-22R Centrufuge | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | Z opcją chłodzenia (podobnie jak obecny model XR-30). | |
| Kąpiel wodna | Techne (Staffordshire, Wielka Brytania) | Każda kąpiel wodna z możliwością regulacji temperatury będzie odpowiednia. | |
| Pipety szklane Pasteura | VWR (NY) | 612-1701 | Średnica zewnętrzna 1,6 mm, przed użyciem wypolerować ogniowo i autoklaw. |
| Wirówka stołowa Galaxy MiniStar | VWR (NY) | 521-2844 | Wystarczy każda mała centryka stołowa. |
| Cienkie igły/szpilki do owadów | Fine Science Tools (CA) | 26001-40 | Średnica 0,03 mm. Zamiast tego można użyć innych cienkich igieł. |
| Talerz | Wykonany na zamówienie przez dodanie stopionego wosku parafinowego na dużej szalce Petriego. |
Bibliografia
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
- Ribeiro, L. P., Ahne, W. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp (Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro. In Vitro. 18 (5), 419-420 (1982).
- Ribeiro, L., Ahne, W., Lichtenberg, V. Primary culture of normal pituitary cells of carp (Cyprinus carpio) for the study of gonadotropin release. In Vitro. 19 (1), 41-45 (1983).
- Wong, A. O., Ng, S., Lee, E. K., Leung, R. C., Ho, W. K. Somatostatin inhibits (d-Arg6, Pro9-NEt) salmon gonadotropin-releasing hormone- and dopamine D1-stimulated growth hormone release from perifused pituitary cells of chinese grass carp, Ctenopharyngodon idellus. General and Comparative Endocrinology. 110 (1), 29-45 (1998).
- Chang, J. P., et al. Use of a pituitary cell dispersion method and primary culture system for the studies of gonadotropin-releasing hormone action in the goldfish, Carassius auratus. I. Initial morphological, static, and cell column perifusion studies. General and Comparative Endocrinology. 77 (2), 256-273 (1990).
- Weil, C., Hansen, P., Hyam, D. Use of pituitary cells in primary culture to study the secretion in rainbow-trout - Setting up and validating the system as assessed by its responsiveness to mammalian and salmon gonadotropin-releasing hormone. General and Comparative Endocrinology. 62 (2), 202-209 (1986).
- Montero, M., LeBelle, N., Vidal, B., Dufour, S. Primary cultures of dispersed pituitary cells from estradiol-pretreated female silver eels (Anguilla anguilla L): Immunocytochemical characterization of gonadotropic cells and stimulation of gonadotropin release. General and Comparative Endocrinology. 104 (1), 103-115 (1996).
- Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
- Lin, S. W., Ge, W. Differential regulation of gonadotropins (FSH and LH) and growth hormone (GH) by neuroendocrine, endocrine, and paracrine factors in the zebrafish-An in vitro approach. General and Comparative Endocrinology. 160 (2), 183-193 (2009).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO2, and pH. General and Comparative Endocrinology. 178 (2), 206-215 (2012).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far East. Nature Reviews Genetics. 3, 53-64 (2002).
- Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
- Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Letters. 2 (12), (2016).
- Waymouth, C. Osmolality of mammalian blood and of media for culture of mammalian cells. In Vitro. 6 (2), 109-127 (1970).
- Cameron, J. N. Acid-base homeostasis - past and present perspectives. Physiological Zoology. 62 (4), 845-865 (1989).
- Claiborne, J. B., Edwards, S. L., Morrison-Shetlar, A. I. Acid-base regulation in fishes: cellular and molecular mechanisms. Journal of Experimental Zoology. 293 (3), 302-319 (2002).
- Perry, S. F., Tufts, B. L. Fish respiration. , Academic Press. San Diego, CA. (1998).
- Hildahl, J., et al. Developmental tracing of luteinizing hormone β-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function. Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).
- Strandabø, R. A. U., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Molecular and Cellular Endocrinology. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Verbalis, J. G. Brain volume regulation in response to changes in osmolality. Neuroscience. 168 (4), 862-870 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
