Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) (NMDAR) są klasyfikowane jako jonotropowe receptory glutaminianu i odgrywają kluczową rolę w uczeniu się i zapamiętywaniu. Nieprawidłowe działanie NMDAR, wyrażone jako nadmierna lub niedostateczna aktywność spowodowana mutacjami, zmienioną ekspresją, transportem lub lokalizacją, może przyczyniać się do wielu chorób, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym. Dlatego zrozumienie biologii receptora, a także ułatwienie odkrywania związków i małych cząsteczek ma kluczowe znaczenie w trwających wysiłkach na rzecz zwalczania chorób neurologicznych. Obecne podejścia do badania receptora mają ograniczenia, w tym niską przepustowość, wysokie koszty i niemożność zbadania jego zdolności funkcjonalnych ze względu na konieczną obecność blokerów kanałów, aby zapobiec ekscytotoksyczności za pośrednictwem NMDAR. Ponadto istniejące systemy testowe są wrażliwe na stymulację tylko glutaminianem i nie mają wrażliwości na stymulację przez glicynę, drugi koligand NMDAR. Tutaj przedstawiamy pierwszy test na płytce o wysokiej przepustowości do badania receptora NMDA z wrażliwością na oba koligandy, glutaminian i D-serynę/glicynę. Takie podejście pozwala na badanie różnych składów podjednostek NMDAR i umożliwia badania funkcjonalne receptora w trybach wrażliwych na glicynę i/lub glutaminian. Dodatkowo metoda nie wymaga obecności inhibitorów podczas pomiarów. Za pomocą tego testu można wykryć działanie dodatnich i ujemnych modulatorów allosterycznych, a znana farmakologia NMDAR została odtworzona w naszym systemie. Technika ta pokonuje ograniczenia istniejących metod i jest opłacalna. Wierzymy, że ta nowatorska technika przyspieszy odkrycie terapii patologii zależnych od NMDAR.
Wprowadzenie
Dzięki obecnym postępom w medycynie, oczekiwana długość życia znacznie wzrosła; jednak rozpowszechnienie chorób związanych z wiekiem również wzrosło. Choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN), takie jak schizofrenia, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, między innymi, nie są wyjątkiem i przewiduje się, że ich liczba wzrośnie w ciągu następnej dekady1,2,3. Nieprawidłowe działanie jonotropowych receptorów glutaminianu znanych jako receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) zostało powiązane między innymi z chorobą Alzheimera, schizofreni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
UWAGA: Ten protokół, łącznie z generowaniem danych, wykorzystuje komórki HEK293 transdukowane bakulowirusem kodującym komórki NR1 i NR2A.
- Wysiewać odpowiednią liczbę komórek HEK293 i dodawać wirusa NR1 i/lub NR2A w odpowiednich stężeniach końcowych (1,00 μl każda). W przypadku płytki 384-dołkowej należy użyć 10 000 komórek/basenik w końcowej objętości 30 μl.
- Alternatywnie, wysiewaj komórki HEK293-NR1-NR2A w odpowiedniej liczbie i objętości komórek (w przypadku płytki 384-dołkowej użyj 10 000 komórek/basenik w końcowej objętości 30 μL). Dodać tetracyklinę w stężeniu 2 μg/ml w celu wywołania eksp....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przed badaniem efektów działania małych cząsteczek należy określić optymalne poziomy ekspresji NMDAR oraz optymalne stężenia ligandów. Zgodnie z opisem, komórki HEK293 wysiano w gęstości 10 0 komórek na dołek na płytce 384-dołkowej w obecności 5 µM CGP06067, a następnie poddano transdukcji za pomocą zmiennych ilości wirusów NR1 i NR2A. Po inkubacji przez noc zmierzono indukowany ligandem przepływ jonów wapnia (Rysunek 1). Wyniki tych eksperymentów wskazują na.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Powodzenie tego testu zależy w dużej mierze od stanu zdrowia użytych komórek HEK. Należy stosować komórki ulegające wzrostowi wykładniczemu i o niskiej liczbie pasażów. Test ten obejmuje wiele transferów i dodawania roztworów, więc zachowanie ostrożności zapewni większą dokładność jego wyników. Stężenia związków i wszystkich innych odczynników powinny być również sprawdzane krzyżowo w celu zminimalizowania błędów. Podczas zastępowania pożywki komórkowej buforem testowym do badania strumienia wapnia, płytkę należy delikat.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konfliktu interesów i nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Biuru Programu Stypendialnego Post Baccalaureate oraz Instytutom Badań Biomedycznych Novartis za sfinansowanie tego badania.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Ludzka linia komórkowa receptora NMDA (NR1 / NR2A) | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Wektor podwójnej ekspresji | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Przezroczysta mikropłytka z płaskim dnem | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Zestaw do oznaczania wapnia 6-QF | molekularny Urządzenia | R8192 | |
| Glicyna | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutaminian | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-seryna | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| Bufor HEPES | Boston Bio Produkt | BB-103 | |
| Roztwór chlorku magnezu | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Chlorek wapnia | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecyd | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Syntetyzowany we własnym zakresie | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Syntetyzowany we własnym zakresie | |
| CGP070667 | NIBR | Syntetyzowany w domu |
Bibliografia
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
