Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych jajnika psów

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58163

⸱

16 grudnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę izolacji, ekspansji i różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki jajnika psów.

Streszczenie

Zainteresowanie mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (MSC) wzrosło w ciągu ostatniej dekady ze względu na łatwość ich izolacji, ekspansji i hodowli. Ostatnie badania wykazały szeroką zdolność różnicowania, jaką posiadają te komórki. Jajnik jest obiecującym kandydatem do terapii komórkowych ze względu na fakt, że jest bogaty w MSCs i że często jest wyrzucany po operacjach wycięcia jajników jako odpad biologiczny. W artykule opisano procedury izolacji, ekspansji i różnicowania MSCs pochodzących z jajnika psa, bez konieczności stosowania technik sortowania komórek. Protokół ten stanowi ważne narzędzie dla medycyny regeneracyjnej ze względu na szerokie zastosowanie tych wysoce zróżnicowanych komórek w badaniach klinicznych i zastosowaniach terapeutycznych.

Wprowadzenie

Liczba opublikowanych badań, które koncentrują się na komórkach macierzystych, znacznie wzrosła w ciągu ostatniej dekady, wysiłek badawczy, który był napędzany przez wspólny cel odkrycia skutecznych terapii medycyny regeneracyjnej. Komórki macierzyste mają dwa podstawowe markery definiujące: samoodnowę i różnicowanie. Mezenchymalne komórki macierzyste są odpowiedzialne za regularny obrót tkanek i mają bardziej ograniczoną zdolność różnicowania w porównaniu z embrionalnymi komórkami macierzystymi1. Ostatnio wiele badań wykazało szeroki zakres różnicowania MSCs, a tematem dyskusji jest to, czy różnice między embrionalnymi i dorosłymi komórkami macierzystymi w ogóle istnieją2.

Nabłonek powierzchniowy jajnika to niezaangażowana warstwa komórek, stosunkowo mniej zróżnicowana, która wyraża zarówno markery nabłonkowe, jak i mezenchymalne3, zachowując zdolność do różnicowania się w różne typy komórek w odpowiedzi na sygnały środowiskowe4. Dokładna lokalizacja komórek macierzystych w jajniku nie jest dobrze znana; Zaproponowano jednak, że bipotencjalne komórki progenitorowe w osłonce białawej dają początek komórkom rozrodczym5. Badania immunologiczne wysunęły hipotezę, że komórki te mają pochodzenie zrębowe6 lub są zlokalizowane w lub proksymalnie powierzchni jajnika7. Ponieważ mezenchymalne komórki macierzyste wyrażają liczne receptory, które odgrywają ważną rolę w adhezji komórek8, zaprojektowano eksperyment mający na celu przetestowanie hipotezy, że wybór populacji komórek o szybkiej adhezji wyizoluje populację komórek, które można wyraźnie scharakteryzować jako mezenchymalne w naturze. Niedawno nasza grupa poinformowała o wyprowadzeniu MSCs z tkanki jajnika na podstawie ich zdolności adhezji do plastycznej powierzchni szalki hodowlanej w ciągu pierwszych 3 godzin hodowli, w celu uzyskania oczyszczonej populacji komórek wykazujących szybką adhezję9. W niniejszej pracy opisano opracowaną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki jajnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten eksperyment został przeprowadzony na jajnikach czterech kundli, które zostały oddane po planowej operacji w programie sterylizacji psów. Eksperyment ten został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt UNESP-FCAV (protokół nr 026991/13).

1. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotuj lub kup 500 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez wapnia i magnezu.
  2. Przygotować roztwór podstawowy kolagenazy I, mieszając 40 μg enzymu w 1 ml DPBS. Przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przechowywać 2 ml porcji w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotuj pożywkę hodowlaną ze zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy z 10% surowicy płodowej i 1% antybiotyków.
  4. Zbierz sterylne materiały: nożyczki i kleszcze, kolbę do hodowli tkankowych, naczynia, probówki oraz pipety o pojemności 10 ml i 5 ml.
  5. Stosować standardowe wyposażenie laboratorium w hodowle komórkowe: komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC), inkubator do hodowli komórkowych ustawiony na 5% CO2 i temperaturze 38 °C oraz wirówkę.
  6. Wyczyść BSC: rękami w rękawiczkach wysterylizuj go 70% EtOH za pomocą lamp UV.

2. Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z jajnika

  1. Po operacji jajniki w PBS należy przechowywać na lodzie w stożkowej rurce, aż do ich przybycia do laboratorium.
  2. Napełnij dwie szalki Petriego o średnicy 100 mm 10 ml PBS.
  3. Wyjąć jajniki z probówki i przenieść je na pierwszą szalkę Petriego z PBS. Umyj je ruchami mieszającymi.
  4. Delikatnie wyjmij jajnik i umieść go w innym naczyniu. Za pomocą sterylnej pęsety i nożyczek zmiel tkankę na bardzo małe kawałki o wielkości około 1 mm.
  5. Przenieś tkankę jajnika na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i dodaj 2 ml kolagenazy. Zmiel tkankę trochę więcej.
  6. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 38 °C na 3 godziny i delikatnie wstrząsać szalką Petriego okrężnymi ruchami co 20 minut.
  7. Po 3 godzinach wyjąć szalkę Petriego z inkubatora.
  8. Przenieść zawartość naczynia do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml pożywki ekspansywnej.
  9. Delikatnie odwróć probówkę przed odwirowaniem. Odwirować probówkę o masie 2100 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad z 3 ml podłoża rozprężnego.
  10. Przenieść granulat do butelki T25. Umieścić butelkę w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 38 °C przez 3 godziny
    UWAGA: Najważniejszą częścią zabiegu jest zmiana pożywki po 3 godzinach inkubacji.
  11. Wyjąć butelkę z inkubatora i usunąć pożywkę wraz z pozostałą tkanką. Do butelki dodać 3 ml świeżej pożywki eksplatacyjnej.
  12. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin i obserwuj butelkę pod kątem zbiegu komórkowego.
    UWAGA: Główne kroki procedury można zaobserwować w Rysunek 1.

3. Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych z jajnika

  1. Przejście komórkowe
    1. Gdy komórki osiągną zbieżność, usuń pożywkę z butelki.
    2. Umyj butelkę 3 ml PBS. Usuń PBS.
    3. Dodać 1,5 ml trypsyny i umieścić butelkę w inkubatorze w temperaturze 38 °C na 3 minuty. Delikatnie postukać w butelkę, aby komórki się odłączyły.
      UWAGA: Komórki powinny osiągnąć zbieg około 5 - 7 dni po wstępnym posiewie.
    4. Dodać 3 ml pożywki eksplatacyjnej i przenieść zawartość do stożkowej probówki.
    5. Odwirować probówkę o sile 2100 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i dodać 1 ml pożywki eksplatacyjnej.
    6. Delikatnie ujednorodnić zawartość probówki.
    7. Pobrać podwielokrotność 10 μl próbki, aby przeprowadzić liczenie komórek i umieścić probówkę z komórkami z powrotem w inkubatorze.
    8. Umieścić 10 μl mieszaniny w hemocytometrze.
  2. Liczenie komórek
    1. Użyj obiektywu mikroskopu 10X i skup się na liniach siatki hemocytometru.
    2. Policz komórki w pięciu małych kwadratach (Rysunek 2).
    3. Pomnóż zliczoną liczbę przez 50 000, aby oszacować liczbę komórek na mililitr.

4. Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z jajnika

UWAGA: Testy różnicowania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi w sprawie Hill et al.9.

  1. Wysiew 1,0 x 104 komórki na studzienkę, w trzech powtórzeniach, przy użyciu 4-dołkowej płytki hodowlanej.
  2. Dodać 1 ml pożywki ekspansywnej.
  3. Delikatnie poruszaj naczyniem okrężnymi ruchami.
  4. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę hodowlaną pożądaną pożywką różnicującą.
  5. W przypadku różnicowania kościościennego, adipogennego i chondrogennego należy inkubować komórki z pożywką indukcyjną przez 30 dni, z wymianą pożywki co 3 dni. Do każdego z tych testów użyto specjalnych zestawów różnicujących.
  6. W celu różnicowania linii neurogennych inkubuj komórki przez 10 dni w pożywce indukcyjnej, z wymianą pożywki co 3 dni. Zastosowane tutaj podłoże zawierało DMEM o niskiej zawartości glukozy, 2 mM kwasu walproinowego, 1 μM hydrokortyzonu, 10 μM forskoliny, 5 mM chlorku potasu, 5 μg/ml insuliny i 200 μM butylowanego hydroksyanizolu.
  7. W przypadku prekursorów endodermy inkubować przez 5 dni w pożywce endodermalnej zgodnie z instrukcjami producenta odczynnika.
  8. W celu różnicowania pierwotnej linii komórek rozrodczych należy inkubować komórki w pożywce indukcyjnej przez 14 dni, z wymianą pożywki co 3 dni. Zastosowane tutaj podłoża zawierały DMEM, 10% FBS, 1 mM pirogronianu sodu, 10 ng/ml LIF, 1 mM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy, 5 μg/ml insuliny, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 60 μM putrescyny, 20 μg/ml transferyny, 10 ng/ml mysiego naskórkowego czynnika wzrostu, 1 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, 40 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z ludzkiej linii komórek glejowych i 15 mg/l penicyliny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z jajnika psa:

Procedura izolacji MSC z jajnika została podsumowana na Rysunku 1. Po przeprowadzeniu operacji, rozdrobnieniu tkanki, trawieniu kolagenazą oraz zmianie pożywki 3 h po rozpoczęciu hodowli, z tkanki jajnika psa pomyślnie wyizolowano domniemaną populację MSC o szybkich właściwościach przylegania do tworzywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiamy dowody na to, że MSCs można wyizolować z tkanki jajnika psów, która jest uważana za odpad biologiczny po wycięciu jajników. Ze względu na fakt, że w jajniku można znaleźć wiele typów komórek, zaproponowaliśmy protokół selekcji MSCs na podstawie ich szybkiego przylegania do plastiku, który z powodzeniem wyselekcjonował komórki, które rosły w monowarstwie o morfologii podobnej do fibroblastów.

Pierwsze doniesienie dotyczące pochodzenia MSCs ze szpiku kostnego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują programowi sterylizacji psów w UNESP-FCAV za uprzejme dostarczenie jajników. Prace te były wspierane przez granty z FAPESP (nr procesu 2013/14293-0) i CAPES.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DPBS Thermo Fisher14190144
Kolagenaza ITermo Fisher17100017
Termos do tkanekCorningCLS3056
DMEM o niskiej zawartości glukozyThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE expressThermo Fisher12604021
StemPro Zestaw do różnicowania adipogenezyThermo FisherA1007001
StemPro Zestaw do różnicowania chondrogenezyThermo FisherA1007101
StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezyThermo FisherA1007201
STEMdiff Definitive Endoderm KitStemCell5110
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
β-Tubulina MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG- FITCAbD SerotecSTAR120F

Bibliografia

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145(2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja mezenchymalnych kom rek macierzystychtkanka jajnika psar nicowanie kom rek macierzystychprotok ekspansji kom rekzastosowania w medycynie regeneracyjnejr d o tkanki z owariektomiitechniki hodowli kom rek macierzystychekspansja mezenchymalnych kom rek macierzystychr nicowanie kom rek macierzystych psa

Powiązane artykuły