Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Streszczenie

W ostatnich latach spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM) poszerzyła nasze zrozumienie właściwości i funkcji molekularnych. Dało nam to możliwość bardziej szczegółowego zbadania wielu mechanizmów biofizycznych, np. tego, w jaki sposób adhezyny bakteryjne wiążą się z receptorami na powierzchni gospodarza. Powodzenie eksperymentów SMFS zależy między innymi od funkcjonalnego i natywnego unieruchomienia interesujących biomolekuł na powierzchniach stałych i końcówkach AFM. W tym miejscu opisujemy prosty protokół kowalencyjnego sprzężenia białek z powierzchniami krzemu za pomocą karboksyli silan-PEG i dobrze znanego składu chemicznego N-hydroksysukcynimidu/1-etylo-3-(3-dimetylo-aminopropylo)karbodimidu (EDC/NHS) w celu zbadania interakcji adhezyny pilus-1 RrgA z bakterii Gram-dodatniej Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) z białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyną (Fn). Nasze wyniki pokazują, że funkcjonalizacja powierzchni prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła oraz do odpowiedniego stężenia RrgA na końcówce wspornika AFM, widocznego przez wartość docelową do 20% zdarzeń interakcji podczas pomiarów SMFS i ujawniło, że RrgA wiąże się z Fn ze średnią siłą 52 pN. Protokół można dostosować do parowania za pomocą wolnych grup tiolowych specyficznych dla danego miejsca. Powoduje to predefiniowaną orientację białka lub cząsteczki i nadaje się do innych zastosowań biofizycznych poza SMFS.

Wprowadzenie

Oprócz pęsety optycznej i magnetycznej, mikroskop sił atomowych (AFM)^1,2 okazał się użytecznym narzędziem do analizy i manipulowania cząsteczkami oraz badania ich właściwości i funkcji, w tym ich reakcji na siłę zewnętrzną^3,4. W przeciwieństwie do metod takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA), powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) lub mikrowaga kryształu kwarcu (QCM), AFM pozwala mierzyć interakcje na pojedynczej cząsteczce (SMFS)⁵ i na poziomie pojedynczej komórki (SCFS)⁶. Technologie te dostarczyły cennych informacji na temat mechanizmów wiązania, takich jak wiązania chwytliwe znalezione dla interakcji białka pilus E. coli FimH z mannose⁷, lub powtórzenia tandemu β-zipper utworzone przez białka wiążące Fn z S. aureus po związaniu z Fn⁸. Niedawno udało nam się wykazać, że adhezyna pilus-1 RrgA^9,10 z bakterii Gram-dodatniej Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)¹¹ jest w stanie wiązać się z fibronektyną¹² za pomocą swoich dwóch domen końcowych. W ten sposób odkryto nowy dwudomenowy mechanizm wiązania, który różni się od tandemowego β-zipper i może umożliwić piliowanym pneumokokom tworzenie i utrzymywanie przejściowego kontaktu z powierzchniami gospodarza zawierającymi fibronektynę¹³.

Sukces eksperymentów SMFS zależy przede wszystkim od funkcjonalnego i natywnego unieruchomienia biomolekuł na powierzchniach stałych i końcówkach AFM. Ponieważ podczas pomiarów SMFS mogą wystąpić duże siły, białka powinny być koencyjnie sprzężone z powierzchnią. Istnieje wiele różnych metod sprzęgania do immobilizacji białek i innych biomolekuł, a także całych komórek na (nieorganicznych) powierzchniach ciał stałych, nanocząstkach i innych urządzeniach opisanych w literaturze^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. Protokoły te często wykorzystują substancje niebezpieczne, są trudne do wykonania i/lub wymagają specjalnego sprzętu (np. czyszczenia plazmowego). Prostym sposobem na sprzężenie cząsteczek ze szkłem jest dołączenie grubszej warstwy polimeru heterobifunkcyjnych środków sieciujących z grupą reagującą silanem po jednej stronie i grupą aminowo-reaktywną po drugiej stronie. W zależności od zastosowania, środki sprzęgające mogą składać się z elastycznych łańcuchów węglowodorowych o zmiennej długości, np. glikolu polietylenowego (PEG). Tłumią one niespecyficzne oddziaływania modyfikowanych powierzchni (np. oddziaływania hydrofobowe, elektrostatyczne i van-der-Waalsa) i mogą zapewniać sprzężoną cząsteczce swobodę rotacyjną

.

Tutaj opisujemy ogólny protokół kowalencyjnego sprzężenia białek zawierających jedną lub więcej wolnych grup aminowych (-NH₂) z powierzchniami szklanymi i końcówkami AFM z azotku krzemu za pomocą heterobifunkcyjnego etoksysilanu-PEG-karboksylu (-COOH). Protokół ten może być stosowany w eksperymentach SMFS, czego przykładem jest interakcja RrgA i białka macierzy zewnątrzkomórkowej Fn (patrz Rysunek 1 dla przeglądu).

Pierwszym krokiem jest silanizacja powierzchni^28,29,30,31. Polega na hydrolizie grup etoksylowych czynnika sprzęgającego w celu wytworzenia wysoce reaktywnych grup SiOH. Mogą one reagować z grupami SiOH na podłożu. W pierwotnym etapie kondensacji silanole te tworzą wiązania wodorowe i rozprzestrzeniają się na podłożu. W reakcji kondensacji wtórnej (która zwykle wymaga ciepła lub próżni w celu usunięcia wody) powstają wiązania siloksanowe. W ten sposób powstaje kowalencyjnie przyczepiona warstwa krzemoorganiczna.

Drugim krokiem jest sprzężenie białek z grupami funkcyjnymi (-COOH), które rozciągają się od polimeru³². Po pierwsze, kwas jest przekształcany w reaktywny półprodukt estru N-hydroksysukcynimidu (NHS), który jest uzyskiwany przez dobrze znaną chemię NHS / EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid33 i ulega podstawieniu nukleofilowemu, aby ostatecznie utworzyć wiązanie amidowe z pierwszorzędowymi aminami na białkach.

W ten sposób, RrgA został sprzężony z końcówkami AFM z azotku krzemu, a ludzki Fn ze szklanymi podłożami w losowej orientacji, a ich siły oddziaływania zostały przeanalizowane na poziomie pojedynczej cząsteczki. Z uzyskanych przez nas wyników wynika, że opisana chemia powierzchni prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła oraz do odpowiedniego stężenia RrgA na końcówce, co przejawia się w docelowej wartości do 20% zdarzeń oddziaływań podczas pomiarów SMFS. Ta chemia redukuje niespecyficzne interakcje tła, podlega niewielkim zmianom podczas pozyskiwania danych i dlatego doskonale nadaje się do precyzyjnych eksperymentów SMFS.

Protokół

1. Immobilizacja białek za pomocą funkcjonalnych środków sprzęgających silan

Uwaga: Rysunek 1 przedstawia przegląd chemii powierzchni zastosowanej w tym protokole.

UWAGA: W poniższym protokole stosowane są różne substancje chemiczne o właściwościach i drażniących skórę. Nosić odpowiednie (kwasoodporne) rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny oraz pracować pod wyciągiem podczas przygotowywania roztworów, aby uniknąć wdychania oparów.

1. Funkcjonalizacja powierzchni szklanych i wsporników z azotku krzemu za pomocą silanowych środków sprzęgających
   1. Usuń gruboziarnisty kurz i zanieczyszczenia ze szkiełek za pomocą izopropanolu i niestrzępiących się chusteczek precyzyjnych, a następnie przytnij szkiełka do żądanego rozmiaru (opcjonalnie).
      Uwaga: Oprócz szkła stałą powierzchnią może być krzemionka, kwarc oraz tlenki aluminium, miedzi, cyny, tytanu, żelaza, chromu, cyrkonu, niklu i.
      UWAGA: Cięcie szkiełek może spowodować ostre krawędzie.
   2. Umieścić szkiełka podstawowe w słoiku barwiącym wypełnionym kwasem solnym (33% HCl) rozcieńczonym wodą podwójnie destylowaną (ddH₂O) do 3 - 5% (v/v), zamknąć słoik odpowiednią pokrywką i umieścić go w łaźni ultradźwiękowej na 90 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Używany słoik ma średnicę 6 cm i przybliżoną wielkość 65-70 ml. Odpowiednia objętość rozcieńczonego HCl dla słoika to 50 ml zawierająca 5 ml 33% HCl i 45 ml ddH₂O. HCl skutecznie usuwa niewiążące jony metali, zwłaszcza sodu, potasu i wapnia oraz redukuje krzem w celu wytworzenia powierzchni szkła nasyconego hydroksylem.
      UWAGA: HCl działa żrąco i drażniąco na skórę. Nosić odpowiednie rękawice kwasoodporne, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny oraz pracować pod wyciągiem podczas przygotowywania roztworu, aby uniknąć wdychania oparów.
   3. Umieść sondy wspornikowe AFM z azotku krzemu na czystym szkiełku podstawowym końcówką skierowaną do góry i naświetlaj światłem ultrafioletowym od góry przez co najmniej 90 minut.
      Uwaga: Do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek odpowiednie są wsporniki o nominalnej stałej sprężystości od 0,01 do 0,1 N ^m-1. Naświetlanie powierzchni wspornika światłem UV usunie zanieczyszczenia organiczne, głównie substancje tłuszczowe, i sprawi, że będzie ona z jednej strony hydrofilowa. Jeśli druga strona jest silnie zanieczyszczona - co nie powinno mieć miejsca, lub jeśli sondy wspornikowe są używane prosto z pudełka dostawcy - może to wpłynąć na pomiar SMFS. Pomocne może być dokładne oczyszczenie całego chipa wspornikowego za pomocą roztworu piranii, który był używany w wielu badaniach³⁴, może być pomocny.
      UWAGA: Światło UV jest szkodliwe dla oczu; dlatego naświetlanie sond wspornikowych powinno odbywać się w komorze nieprzepuszczalnej dla promieniowania UV. Roztwór piranii jest wysoce reaktywny i może poparzyć skórę, papier i inny materiał organiczny. Nie używaj plastikowych pojemników. W przypadku umieszczenia w naczyniach lub słoikach nawet z niewielką ilością organicznych zanieczyszczeń powierzchni (np. po poprzednim użyciu) może szybko zareagować.
   4. Zastąp kwas solny w słoiku do barwienia ddH₂O, nie dopuszczając do wyschnięcia powierzchni szkła i umieść słoik z powrotem w łaźni ultradźwiękowej na kolejne 10 minut. Wymień wodę jeszcze dwa razy odpowiednio na 10 minut, aby prawidłowo zmyć kwas solny.
   5. W międzyczasie rozpuścić etoksy (lub metoksy)silan glikolu polietylenowego (Si(OC₂H₅)3-PEG-COOH) w mieszaninie etanolu i ddH₂O (v/v 95%/5%, pH 4,6 dostosowane kwasem octowym) do końcowego stężenia 0,1 mg ^mL-1. Przechowywać roztwór hermetycznie zamknięty, aby uniknąć parowania etanolu.
      Uwaga: Silanowe środki sprzęgające są wrażliwe na wilgoć i temperaturę. Dlatego należy je przechowywać w atmosferze gazu obojętnego (N₂), w niskiej temperaturze (-20 °C) i w suchych warunkach. Przed otwarciem kolby należy upewnić się, że silany osiągnęły temperaturę pokojową, aby zminimalizować hydratację, a tym samym pasywację grup reaktywnych. Heterobifunkcyjne łączniki PEG są dostępne z wieloma różnymi grupami funkcyjnymi i różnymi długościami dystansów. W przypadku losowego unieruchomienia białek poprzez ich wolne grupy aminowe (NH₂), jak opisano w niniejszym protokole, grupą funkcyjną dodatkową do etoksy/metoksysilanu musi być ester NHS. Oprócz zakupu środka silanowego z estrem NHS, prostym sposobem na uzyskanie takiego estru NHS jest aktywacja grupy karboksylowej (-COOH) za pomocą 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i NHS (patrz 1.2.1. i 1.2.2.).
      UWAGA: Etanol jest łatwopalny i działa drażniąco na skórę. Kwas octowy jest łatwopalny i. Należy uważać, aby nie dostać się reaktywnych silanów na skórę lub do oczu. Nosić odpowiednie rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny oraz pracować pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania oparów.
   6. Wlać roztwór silanu na dwie oddzielne szalki Petriego, umieścić przygotowane sondy wspornikowe i szkiełka podstawowe odpowiednio na jednej szalce Petriego, hermetycznie uszczelnić (np. parafilm), aby uniknąć parowania etanolu i inkubować nieruchomo przez 90 minut w temperaturze pokojowej><. Uwaga: Optymalny rozmiar szalki Petriego zależy od liczby sond wspornikowych i wielkości szkiełek szklanych, które powinny być funkcjonalizowane. Średnica zapewniająca dobrą obsługę i małą objętość odczynnika wynosi 50-60 mm. Aby uniknąć niepożądanego wygięcia wspornika podczas przenikania przez granicę faz powietrze-woda, wspornik powinien być trzymany pod kątem 90° do granicy faz powietrze-woda. Inkubacja szkiełek szklanych (ale nie sond wspornikowych) może być opcjonalnie przeprowadzona na wytrząsarce orbitalnej.
   7. Przepłukać szkiełka wspornikowe i szklane w trzech kolejnych zlewkach zawierających czysty etanol, aby całkowicie zmyć niezwiązane związki silanu.
      Uwaga: Aby uniknąć niepożądanego wygięcia wspornika podczas przenikania przez granicę powietrzno-powietrzną, wspornik powinien być trzymany pod kątem 90°.
   8. Umieścić funkcjonalizowane szkiełka podstawowe w słoiku do barwienia, a wspornik na czystym szkiełku podstawowym i utwardzać w temperaturze 110 °C przez 30 min.
      Uwaga: Utwardzanie ciepłem indukuje tworzenie kowalencyjnych wiązań siloksanowych i usuwanie wody. Ponieważ szkiełka były funkcjonalne tylko z jednej strony, należy upewnić się, że prawidłowo wskazała stronę powlekaną.
   9. Próbki ze szkła silanizowanego i sondy wspornikowe należy przechowywać w eksykatorze próżniowym przez okres do jednego tygodnia.
      Uwaga: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Wyrywkowa immobilizacja białek na szkle silanizowanym i wsporniku z azotku krzemu
   Uwaga: Aby uniknąć niepożądanego wygięcia wspornika, sonda wspornikowa powinna być trzymana pod kątem 90° podczas penetracji wszelkich interfejsów powietrze-woda.
   1. Przygotować roztwór zawierający 42 mg ^mL-1 EDC i 20 mg ^mL-1 NHS w standardowym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
      UWAGA: EDC działa żrąco i drażniąco na skórę oraz może spowodować poważne uszkodzenie oczu. Nosić odpowiednie rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.
   2. Przykryj szkiełka szklane pokryte silanem roztworem i umieść silanizowane sondy wspornikowe w kropli roztworu EDC/NHS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Do inkubacji sond wspornikowych odpowiednia jest oryginalna skrzynka wspornikowa. Aby sprzęgnąć białka poprzez ich wolne grupy aminowe z karboksylami (-COOH) heterobifunkcyjnych środków silan-PEG, grupa -COOH jest aktywowana za pomocą szeroko stosowanej chemii EDC/NHS. EDC sprzęga NHS z kwasem karboksylowym, tworząc "stabilny" ester NHS, który umożliwia wydajną koniugację z aminami pierwszorzędowymi o fizjologicznym pH w następnym kroku.
   3. Dokładnie wypłukać wspornik i szkiełka podstawowe za pomocą PBS w trzech kolejnych zlewkach, aby całkowicie zmyć nadmiar EDC/NHS.
      Uwaga: Ten etap płukania ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozostałe EDC/NHS mogą sieciować białka, a tym samym zmieniać ich funkcjonalność.
   4. Inkubować aktywowane szkiełka podstawowe z sondami wspornikowymi w kropli pożądanego roztworu białkowego w mokrej komorze o temperaturze pokojowej. Stężenie białka i czas inkubacji powinny być dostosowane do wymagań doświadczenia. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie od 0,5 do 1 mg ^mL-1 i czas inkubacji od 30 minut do 2 godzin są odpowiednie dla większości białek. W przypadku fibronektyny (na szkiełku podstawowym) i białka końcówki pilus-1 RrgA (na wsporniku) wystarczające jest stężenie molowe odpowiednio 1,5 μM i 3 μM oraz czas inkubacji wynoszący 2 godziny.
   5. Umyć szkiełka podstawowe i sondy wspornikowe dokładnie PBS w trzech kolejnych zlewkach w celu zmycia niezwiązanych białek.
   6. Nasycić pozostały ester NHS tris(hydroksymetylo)-aminometanem, umieszczając sondy w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Ten krok zmniejsza niepożądane kowalencyjne sprzężenie białek między funkcjonalizowaną powierzchnią końcówki AFM a szkłem, ponieważ grupy aminowe Tris mogą wiązać się z pozostałymi aktywowanymi grupami COOH na powierzchni wspornika i podłoża.
   7. Umyć szkiełka podstawowe i sondy wspornikowe za pomocą PBS i przechowywać je na oddzielnych szalkach Petriego pokrytych PBS do czasu użycia.
      Uwaga: Próbki powinny być przygotowane na świeżo i zużyte tego samego dnia.

2. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek oparta na mikroskopii sił atomowych

Uwaga: W tej pracy użyto mikroskopu sił atomowych firmy JPK Instruments, a ustawienia do uzyskiwania krzywych siła-odległość zostały zdefiniowane za pomocą Force RampDesigner.

1. Kalibracja wspornika metodą szumu termicznego³⁵
   Uwaga: W celu kalibracji wspornika należy postępować zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Większość dostawców wsporników podaje przybliżoną stałą sprężystości, która jest zwykle obliczana na podstawie nominalnego kształtu wspornika (długość, szerokość, grubość) i dlatego nie jest zbyt wiarygodna. Ponieważ prawidłowa stała sprężystości ma kluczowe znaczenie, zaleca się przeprowadzenie opisanej poniżej kalibracji wspornika w trzech egzemplarzach i zastosowanie średnich wartości czułości optycznej dźwigni i stałej sprężystości. Przydatne może być zarejestrowanie ugięcia wspornika w woltach (V) podczas eksperymentu i przeliczenie go na siłę (pN) później, przy użyciu czułości dźwigni optycznej i średnich wartości stałej sprężystości. Stałą sprężystości i czułość dźwigni optycznej można określić przed i/lub po eksperymencie, o ile pozycja lasera nie zostanie zmieniona na wsporniku (położenie odbitego lasera można ponownie wyregulować na fotodiodzie).
   1. Zamocuj czyste, świeże szkiełko na uchwycie próbki AFM i przykryj go buforem PBS.
      Uwaga: Kalibrację należy przeprowadzić na twardej powierzchni (np. szkle) i w tym samym buforze, co rzeczywiste eksperymenty.
   2. Zamocuj przygotowaną sondę wspornikową na uchwycie wspornika, umieść ją w głowicy AFM i ostrożnie zwilż wspornik kroplą buforu PBS.
      Uwaga: Zwilżenie wspornika zmniejsza napięcie powierzchniowe powstające podczas penetracji w buforze PBS na szkiełku kalibracyjnym, a tym samym niepożądane wygięcie wspornika.
   3. Powoli przesuwaj wspornik w kierunku powierzchni kalibracyjnej, aż wspornik zostanie całkowicie zanurzony w buforze PBS, ale nadal z dala od powierzchni kalibracyjnej.
   4. Użyj widoku z góry mikroskopu optycznego AFM lub (jeśli jest dostępny) mikroskopu odwróconego pod AFM, aby ustawić laser AFM z tyłu wspornika. Umieść plamkę lasera w pobliżu końca wspornika w pobliżu miejsca, w którym znajduje się końcówka.
      Uwaga: Plamka lasera powinna znajdować się blisko końca wspornika, ale nadal powinna znajdować się całkowicie na wsporniku. Jeśli mikroskop optyczny nie jest dostępny, użyj kawałka papieru w przypadku widzialnych diod laserowych lub karty detektora laserowego w przypadku diod laserowych na podczerwień, umieść ją pod głowicą AFM i przesuń plamkę lasera w kierunku krawędzi chipa wspornikowego, gdzie znajdują się wsporniki, aż zobaczysz plamkę na papierze lub karcie detektora. Następnie przesuń laser równolegle do krawędzi. Kiedy plama znika, znajduje się na ramieniu wspornikowym. W przypadku wsporników liniowych przesuń punkt w kierunku końca ramienia dźwigni, aż pojawi się na karcie papieru/detektora, a następnie przesuń go z powrotem, aż ponownie znajdzie się na ramieniu dźwigni (zniknie z papieru/karty). W przypadku trójkąta umieść miejsce pośrodku między dwoma ramionami wspornika i przesuwaj je w kierunku końca wspornika, aż zniknie z papieru/karty. Sprawdź, czy znajdujesz się w środku wspornika, przesuwając miejsce prostopadle do długiej osi wspornika.
   5. Wyreguluj położenie czterokwadrantowej fotodiody detektora AFM w taki sposób, aby odbita wiązka laserowa znajdowała się w środku fotodiody.
      Uwaga: Postępuj w następujący sposób: Użyj mikrometrycznych w pobliżu diody detektora, aby przesunąć diodę w poziomie i w pionie, aż do maksymalizacji sygnału sumy ze wszystkich czterech kwadrantów. Następnie przesuwaj diodę w kierunku pionowym, aż sygnał odchylenia pionowego wyniesie zero, i przesuwaj diodę w kierunku poziomym, aż sygnał odchylenia bocznego wyniesie zero. Wsporniki z azotku krzemu mają zwykle złotą powłokę, a zatem są bimetalem o dwóch różnych współczynnikach rozszerzalności cieplnej. Powoduje to dryft termiczny (widoczny w sygnale odchylenia pionowego), zwłaszcza w roztworze. Aby zmniejszyć ten dryft podczas pomiarów, przed rozpoczęciem kalibracji pozwól całemu systemowi się zrównoważyć przez kilka minut.
   6. Otwórz menedżera kalibracji w oprogramowaniu AFM i skalibruj czułość wspornika i stałą sprężystości wspornika za pomocą metody szumu termicznego w następujący sposób.
   7. Ostrożnie podejdź do powierzchni podłoża i zapisz krzywą siła-odległość.
   8. Określ czułość optyczną dźwigni w nm/V, dopasowując linię prostą do najbardziej stromej części krzywej siły cofania, w miejscu, w którym końcówka styka się z powierzchnią podłoża. Czułość umożliwia przeliczenie stałej sprężystości wspornika na pN/nm.
      Uwaga: Nachylenie krzywej wciągania to odległość przesuwu piezoelektrycznego w stosunku do zmiana napięcia fotodiody (mierzonego w nm/V).
   9. Zapisać kilka widm hałasu termicznego wspornika przy odległości około 100 μm lub więcej od powierzchni, aby wykluczyć jakiekolwiek tłumienie powierzchni.
   10. Określ stałą sprężystości wspornika w pN/V, dopasowując oscylator harmoniczny dostarczony przez oprogramowanie AFM do widm szumu termicznego.
   11. Powoli wycofaj wspornik i wyjmij go z roztworu.
   12. Zastąp szklaną powierzchnię używaną do kalibracji wspornikowej powierzchnią próbki zawierającą unieruchomione białka. Upewnij się, że wspornik i powierzchnia próbki (a tym samym białka) nie wyschną podczas wymiany szkiełek podstawowych.
2. Eksperymenty z siłą oddziaływania na poziomie pojedynczego białka
   1. Powoli przesuwaj wilgotny wspornik w kierunku powierzchni próbki, aż wspornik zostanie całkowicie pokryty buforem PBS, ale nadal z dala od powierzchni podłoża.
      Uwaga: Aby zmniejszyć dryft termiczny podczas eksperymentu, pozwól całemu systemowi ustawić się na kilka minut przed rozpoczęciem pomiarów spektroskopii sił.
   2. Zbliżyć się do powierzchni i zarejestrować wiele krzywych siła-odległość (≥ 500) w różnych miejscach powierzchni próbki, z siłą nacisku 250 pN, czasem kontaktu 1 s, długością wciągania 2 μm i prędkością cofania 1 μm ^s-1,
      Uwaga: W celu ogólnych regulacji spektroskopii sił należy postępować zgodnie z instrukcją producenta. Warianty: Prędkość wciągania można zmieniać w zakresie od 0,1 do 5 μm ^s-1 w celu obliczenia danych kinetycznych w zależności od rosnącego obciążenia siłą. Czas interakcji można zmieniać, aby przeanalizować wzmocnienie wiązania zależne od czasu. Zamiast utrzymywać stałą prędkość wciągania, można utrzymać stałą siłę (tryb zacisku siły).
3. Analiza danych
   Uwaga: Analiza danych została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania do przetwarzania danych. W zależności od unieruchomionych białek, czasu kontaktu lub prędkości retrakcji, od tego, czy odcisk stopy został włączony, czy nie, oraz od innych zmiennych parametrów, krzywe siła-odległość zawierają wiele różnych informacji. Analiza i interpretacja danych może się znacznie różnić w zależności od eksperymentu SMFS i dlatego nie można ich tutaj szczegółowo opisać. Jeśli chodzi o interakcję RrgA i Fn, poniższy protokół może być pierwszym krokiem do analizy danych SMFS.
   1. Otwórz pliki krzywej zmierzonej siły, wybierając ikonę Otwórz partię skanowania siły i przetwarzaj krzywe siła-odległość w następujący sposób:
   2. Przekształć ugięcie wspornika (V) na wprost proporcjonalną siłę (F), wybierając ikonę (Ponownej) kalibracji ugięcia w pionie, dostosowując czułość i stałą sprężystości.
      Uwaga: Jeśli kalibracja wspornika została przeprowadzona przed eksperymentem, wartości są zapisywane w plikach skanowania siły i są automatycznie używane podczas kalibracji odchylenia w pionie. Jeśli kalibracja została przeprowadzona po eksperymencie, oprogramowanie używa wartości domyślnych, które można zmienić na wartości zmierzone.
   3. Odejmij linię bazową kanału wciągania w obszarze krzywej siły daleko od powierzchni, aby ustawić zerowy poziom siły, wybierając ikonę Odejmowanie linii bazowej.
      Uwaga: W niektórych przypadkach wycofanie może nie mieć takiej samej stałej wartości siły, a krzywa może wyświetlać liniowe nachylenie, które można usunąć, wybierając opcję Przesunięcie + Pochylenie.
   4. Zdefiniuj punkt, w którym końcówka styka się z próbką, wybierając ikonę Wyznaczanie punktu kontaktu.
   5. Przekonwertuj sygnał wysokości na separację końcówka-próbka, wybierając ikonę Separacja końcówka-próbka. Oprócz odejmowania położenia punktu kontaktowego, procedura ta odejmuje zginanie wspornika w celu obliczenia odległości między powierzchnią podłoża a końcówką AFM.
      Uwaga: W celu dopasowania elastycznych modeli polimerowych, takich jak rozciągliwy model łańcucha ślimakowego, oraz określenia długości interakcji, potrzebna jest separacja końcówka-próbka, która jest korygowana pod kątem wygięcia wspornika. Aby określić natężenie obciążenia siłą na podstawie nachylenia krzywej siły i prędkości z-piezoelektrycznej, należy użyć nieskorygowanych krzywych siły.
   6. Przesiewaj ślady siła-odległość pod kątem szczytów siły występujących przy długościach zerwania powyżej 70 nm (długość rozciągniętego dystansu PEG)³⁶, aby uporządkować niespecyficzne interakcje i zastosować rozszerzalny model łańcucha ślimakowego do wybranych pików, wybierając ikonę Dopasuj model łańcucha polimerowego i wybierając rozszerzalny model łańcucha przypominającego robaka. Piki na krzywej siły cofania zostaną dopasowane do tego modelu i uzyskane zostaną siły i długości zerwania wraz z parametrami sprężystości polimeru.
   7. Wyświetl dane w postaci histogramów przedstawiających rozkład siły i długości. Użyj co najmniej 100 zdarzeń niewiążących dla histogramów.

Wyniki

Opisany tutaj protokół powoduje kowalencyjną immobilizację białek poprzez ich dostępne aminy pierwszorzędowe o losowej orientacji (Rysunek 1). Rysunek 2 pokazuje obraz AFM powierzchni szkła silanizowanego z (po lewej) i bez (po prawej) unieruchomionym Fn, zarejestrowany po odwodnieniu próbek pod delikatnym strumieniem azotu. Warstwa polimeru silanowego wykazuje tylko małe pofałdowania powierzchni o wysokości około 2-5 nm (Rysunek 2, po prawej), podczas gdy na powierzchni funkcjonalizowanej za pomocą Fn widoczne są cząsteczki Fn o wysokości około 10 nm (Rysunek 2, po lewej). W zbliżeniach można rozpoznać dimeryczną strukturę Fn. Cząsteczki Fn wydają się być zwarte o wysokości 4 - 5 nm nad powłoką powierzchniową PEG i długości ~ 120 nm (patrz wkładki).

Aby zbadać siły interakcji RrgA z Fn, które zostały niedawno szczegółowo opisane przez naszą grupę¹³, RrgA zostało sprzężone z końcówką AFM z azotku krzemu, a ludzkie Fn ze szklanym podłożem (Rysunek 3a). Rysunek 3 pokazuje reprezentatywne krzywe separacji próbek końcówek interakcji RrgA z Fn zarejestrowane przy prędkości ciągnięcia 1 μm ^s-1. Zastosowana chemia powierzchni doprowadziła do niskiej interakcji tła i dobrze ukształtowanych pojedynczych (lub podwójnych) zdarzeń interakcji (Rysunek 3a), które zostały dopasowane za pomocą rozszerzalnego modelu łańcucha przypominającego robaka (eWLC) (czerwone krzywe). Wykreślenie wyników dopasowania (siła zerwania i -długość, patrz Rysunek 4) pokazuje, że po pokonaniu niespecyficznych interakcji powierzchniowych między końcówką AFM a podłożem i rozciągnięciu łączników PEG (> 70 nm), do ~19% krzywych siły wykazało zdarzenia zerwania ze średnią siłą zerwania dla interakcji RrgA - Fn wynoszącą ~ 52 pN przy odległościach końcówka-próbka wynoszących około 100 nm. W przeciwieństwie do tego, niemożliwa do zastosowania chemia powierzchni (w tym przypadku pominięto hartowanie solą fizjologiczną buforowaną Tris Rysunek 3b) utrudni wyraźną ocenę pojedynczych zdarzeń interakcji z powodu niespecyficznych interakcji, wiązania wielu białek (ślad 2 i 3) i / lub kowalencyjnego sprzężenia białek między powierzchnią próbki a końcówką wspornika AFM. Prowadzi to do dużych sił zrywających (ślad 1), którym prawdopodobnie towarzyszy rozwijanie się domen białkowych (Fn) (ślad 4 i 5).

Rysunek 1: Przegląd składu chemicznego powierzchni. Po hydrolizie etoksysilanu-PEG-karboksylu następuje jego kondensacja na uwodnionej powierzchni szkła i tworzenie wiązań poprzecznych siloksanu. W wyniku reakcji EDC z grupami karboksylowymi powstaje reaktywna o-acylisomocznik, aminowo-reaktywny produkt pośredni o wyjątkowo krótkim okresie półtrwania w roztworze wodnym (hydroliza). Produkt pośredni jest stabilizowany przez tworzenie estru NHS, który ulega podstawieniu nukleofilowemu, aby ostatecznie utworzyć wiązanie amidowe z aminami pierwszorzędowymi na białkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Immobilizacja fibronektyny na podłożu szklanym za pomocą heterobifunkcyjnego karboksylowego środka sprzęgającego etoksysilan PEG. Obrazy AFM funkcjonalizowanych powierzchni szklanych z (po lewej) i bez (po prawej) Fn. Liczby wskazują pojedyncze cząsteczki Fn, które są równomiernie rozmieszczone na powierzchni podłoża (wstawki). Cząsteczki przyjmują dimeryczną i zwartą strukturę o wysokości 4-5 nm nad powłoką PEG i długości >100 nm. Przypomina to strukturę Fn w roztworze i jest zgodne z wcześniejszymi danymi AFM dotyczącymi innych powierzchni, np. mika (skala inkrustacji = 500 nm)³⁷. Pod obrazami AFM znajdują się profile wysokości wzdłuż linii wskazanych na obrazach AFM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ilustracja eksperymentu SMFS i reprezentatywne krzywe odległości siły oddziaływania RrgA - Fn. (a) RrgA i Fn były kowalencyjnie połączone za pomocą heterobifunkcyjnego karboksylowego środka sprzęgającego etoksy-silan PEG odpowiednio z końcówką wspornika AFM z azotku krzemu i powierzchnią szklaną. Przedstawiono reprezentatywne krzywe odległości siły SMFS uzyskane dla oddziaływania RrgA - Fn przy prędkości retrakcji 1 μm ^s-1 z opisanym unieruchomieniem RrgA i Fn. Czerwone krzywe reprezentują rozciągliwe pasowania łańcucha przypominającego ślimak stosowane w celu uzyskania sił i długości zerwania. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Becke, et al., ACSnano 2018¹³. (b) Reprezentatywne krzywe odległości siły SMFS uzyskane dla oddziaływania RrgA - Fn bez wygaszania solą fizjologiczną buforowaną Tris. W tym przypadku pierwszorzędowa amina Tris była nieobecna, więc pozostałe aktywne estry NHS pozostały nienasycone podczas eksperymentu. Doprowadziło to do wiązania wielu białek (ślad 2 i 3) i zaciśnięcia białek między powierzchnią a końcówką AFM, co skutkowało dużymi siłami zrywania, którym towarzyszyło rozwijanie się domeny (Fn-) (ślad 1, 4 i 5; zwróć uwagę na różne skale). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozkład siły i długości pojedynczych oddziaływań RrgA - Fn. Histogramy siły zrywającej i odpowiadającej jej długości zerwania uzyskane z pomiarów oddziaływań RrgA - Fn SMFS (n = 1400) przy prędkości retrakcji 1 μm ^s-1. Histogramy wskazują na najbardziej prawdopodobną siłę zerwania f_MP wynoszącą 51,6 pN (pasowanie Gaussa (pasowanie Gaussa – linia) oraz akumulację długości zerwania około 100 nm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Becke, et al., ACSnano, 2018¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Od czasu wprowadzenia SMFS opartego na AFM, przekształcił się on w szeroko stosowaną technikę bezpośredniego badania sił wewnątrz- i międzycząsteczkowych poszczególnych białek, kwasów nukleinowych i innych biomolekuł ^3,4,5. Aby eksperymenty z SMFS zakończyły się sukcesem, warunkiem wstępnym jest odpowiednia strategia sprzężenia powierzchniowego. Aby zbadać siły wewnątrzcząsteczkowe w polimerach naturalnych i syntetycznych, polimery mogą być bezpośrednio sprzężone z powierzchnią podłoża i końcówką AFM 36,38,39,40,41. Do badania oddziaływań międzycząsteczkowych, takich jak wiązania molekularne, zaleca się jednak stosowanie elastycznych cząsteczek łączących, takich jak hetero-bifunkcyjne łączniki PEG lub łańcuchy polipeptydowe, w celu przyłączenia partnerów interakcji do końcówki AFM i powierzchni substratu, aby umożliwić prawidłową orientację partnerów wiążących, przezwyciężyć siły powierzchniowe krótkiego zasięgu oraz uniknąć denaturacji i rozwijania się białek^21, 22,23,24,25,26,27,42. Dlatego opisaliśmy prosty i nieskomplikowany protokół kowalencyjnej immobilizacji białek poprzez ich dostępne aminy pierwszorzędowe przy użyciu hetero-bifunkcyjnych przekładek PEG.

Wykazaliśmy jego przydatność, badając siły interakcji między adhezyną RrgA z S. pneumoniae a białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej Fn, jak niedawno szczegółowo opisano w innym miejscu¹³.

Chemia powierzchni jest dobrze znana i analizowana, a podobne podejścia zostały z powodzeniem zastosowane w wielu eksperymentach SMFS 19,42,43,44,45. Eter sililowy używany do sprzęgania polimeru silanowego z powierzchnią ulega hydrolizie. Stopień hydrolizy zależy od ilości powstających wiązań siloksanowych, które można kontrolować podczas procesu silanizacji. Jeżeli podczas pomiarów SMFS spodziewane są duże siły oddziaływania (≥ 1000 pN), silanizację należy przeprowadzić poprzez osadzanie w fazie gazowej³⁰, co skutkuje powstaniem ciągłej warstwy siloksanów. Podobnie jak w przypadku wielu eksperymentów (np. wielu oddziaływań białko – białko), siły oddziaływania mieszczą się w zakresie kilkuset pN, a opisana procedura, w której tworzenie siloksanów odbywa się poprzez osadzanie z fazy wodnej, a niezwiązane silany organiczne są starannie zmywane etanolem (krok 1.1.7), a następnie utwardzane ciepłem (krok 1.1.8), jest wystarczający.

Kolejnym krytycznym krokiem jest wypłukanie pozostałych cząsteczek EDC i NHS z powierzchni (krok 1.2.3), ponieważ resztki doprowadzą do aktywacji grup karboksylowych na białkach. Może to spowodować sieciowanie białek na tej samej powierzchni, co może zmienić ich funkcjonalność lub kowalencyjnie sprzęgnąć aktywowane białka z innymi białkami na przeciwnej powierzchni. Może to prowadzić do zaciśnięcia białek między powierzchnią a końcówką AFM, co skutkuje dużymi siłami zrywania, którym może towarzyszyć rozwijanie domen (patrz Rysunek 3b, ślad 1, 4 i 5, rozwijanie domen Fn)⁴⁶. Ten sam problem może wystąpić, jeśli aktywne estry NHS przekładki PEG pozostaną nienasycone. Dlatego zaleca się inkubację z buforowaną solą fizjologiczną Tris (krok 1.2.6), ponieważ pierwszorzędowa amina Tris wygasza pozostałe grupy aminoworeaktywne.

Postępowanie zgodnie z protokołem krok po kroku prowadzi do jednorodnego rozkładu Fn na powierzchni szkła silanizowanego (patrz rysunek 2), pozostawiając dimeryczną formę białka. Przypomina to strukturę Fn w roztworze i jest zgodne z wcześniejszymi danymi AFM na innych powierzchniach próbek³⁷. Dodatkowo uzyskuje się odpowiednie stężenie RrgA na końcówce AFM, co generuje wartość docelową ~20% dobrze zdefiniowanych zdarzeń interakcji podczas pomiarów SMFS (Rysunek 3 i Rysunek 4). Innym eleganckim sposobem kontrolowania ilości cząsteczek sprzężonych z substratem próbki i końcówką wspornika, oprócz różnicowania stężenia białka i/lub czasu inkubacji, jest połączenie silanów z różnymi drugorzędowymi grupami funkcyjnymi. Zmieniając stosunek grup reaktywnych białek rozciągających się od polimeru PEG, można kontrolować liczbę immobilizowanych białek 15,16,17,18.

Opisany tutaj protokół może być również wykorzystany do unieruchomienia innych cząsteczek zawierających -NH₂ lub może być dostosowany do łączenia białek z inną powierzchnią tlenku krzemu poza szkłem i azotkiem krzemu. W zależności od projektu białka, grupa karboksylowa reaktywna aminy może zostać zmieniona na grupę reaktywną sulfhydrylu (np. maleimid lub disiarczek orto-pirydylu) w celu sprzężenia białka za pośrednictwem jego wolnych grup –SH. W przypadku Fn daje to predefiniowaną orientację 13,17,20.

Podsumowując, protokół ten może być dostosowany do różnych wymagań i nadaje się do innych zastosowań biofizycznych poza eksperymentami ze spektroskopią sił pojedynczych cząsteczek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał
2-propanol	Carl Roth	6752
1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodimid	Sigma-Aldrich	03450	EDC
Kwas octowy	Carl Roth	3738	100 %; czystość analityczna
Woda
Etanol	Carl Roth	9065	≥ 99,8 %; czystość analityczna
Kwas etoksysilanowy glikol polietylenowy	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Kwas solny	Carl Roth	X896	32 %
N-hydroksysukcynimid	Merck	804518	NHS; do syntezy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami - Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
Cząsteczka sondy np. Fibronektyna, osocze ludzkie	Sigma-Aldrich	F1056
Cząsteczka sondy np. RrgA			Wyprodukowano w laboratorium
Chlorek sodu	Carl Roth	9265	NaCl
Tris(hydroksymetylo)-aminometan	Carl Roth	AE15	≥ 99,3 %; TRIS; Klasa bufora
Nazwa<	silny>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Zlewki
Nóż
Szkiełka	Carl Roth	0656
Eksykator gazów obojętnych	Sicco
- Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
Oprogramowanie JPK NanoWizard SPM i DP	JPK Instruments Piec
laboratoryjny	Spoiwo
Mieszadło magnetyczne	IKA
Mikroszpatułka Probówki
			mikrowirówek
Microsoft Excel	Microsoft
Parafilm M	Marka	701606
szalki
pH-metr	bibelotowe
	Starlab		10-100 i mikro; l, 50-200 i mikro; l, 100-1000  &mikro; l
Waga precyzyjna	Acculab
Wspornik z azotku krzemu - MLCT	Bruker AXS S.A.S		Stała sprężystości ≤ 100 pN/nm
Kąpiel sonizacyjna	Bandelin
Słoik
Mikroskop stereoskopowy - Zeiss Stemi	Zeiss
Mieszadło
Chusteczki precyzyjne Kimtech science	Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	Widmo rtęci o energii pierwotnej 254  nm
Eksykator
Pompa
Mieszalnik wirowy	VWR
Papier wagowy	Carl Roth	TP64