Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Podsumowanie

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Streszczenie

Pszczoła miodna jest modelowym organizmem do oceny złożonych zachowań i wyższych funkcji mózgu, takich jak nauka, pamięć i podział pracy. Ciało grzyba (MB) jest wyższym ośrodkiem mózgu, który ma być neuronalnym substratem złożonych zachowań pszczół miodnych. Chociaż wcześniejsze badania zidentyfikowały geny i białka, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w MB i innych regionach mózgu, aktywność białek w każdym regionie nie jest jeszcze w pełni poznana. Aby ujawnić funkcje tych białek w mózgu, analiza farmakologiczna jest wykonalnym podejściem, ale najpierw konieczne jest potwierdzenie, że manipulacje farmakologiczne rzeczywiście zmieniają aktywność białek w tych obszarach mózgu.

Wcześniej zidentyfikowaliśmy wyższą ekspresję genów kodujących fosfolipazę C (PLC) w MBs niż w innych regionach mózgu i farmakologicznie oceniliśmy udział PLC w zachowaniu pszczół miodnych. W tym badaniu przetestowaliśmy biochemicznie dwa środki farmakologiczne i potwierdziliśmy, że zmniejszają one aktywność PLC w MB i innych obszarach mózgu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób wykrywać aktywność PLC w homogenacie mózgu pszczoły miodnej. W tym systemie testowym homogenaty pochodzące z różnych regionów mózgu reagują z syntetycznym substratem fluorogennym, a fluorescencja wynikająca z aktywności PLC jest określana ilościowo i porównywana między regionami mózgu. Opisujemy również naszą ocenę hamującego wpływu niektórych leków na aktywność PLC przy użyciu tego samego systemu. Chociaż na ten system prawdopodobnie wpływają inne endogenne związki fluorescencyjne i/lub absorbancja składników testu i tkanek, pomiar aktywności PLC przy użyciu tego systemu jest bezpieczniejszy i łatwiejszy niż przy użyciu tradycyjnego testu, który wymaga substratów znakowanych radioaktywnie. Prosta procedura i manipulacje pozwalają nam zbadać aktywność PLC w mózgach i innych tkankach pszczół miodnych zaangażowanych w różne zadania społeczne.

Wprowadzenie

Europejska pszczoła miodna (Apis mellifera L.) jest owadem eusocjalnym, a samice pszczół wykazują rozmnażanie zależne od kasty i zależny od wieku podział pracy. Na przykład w bezpłodnej kaście pszczół określanej jako "robotnice" młodsze osobniki karmią czerwiu, podczas gdy starsze zbierają nektar i pyłek poza ulem¹. Zdolność uczenia się i zapamiętywania jest niezwykle ważna w życiu pszczoły miodnej, ponieważ zbieraczki muszą wielokrotnie przemieszczać się tam i z powrotem między źródłami pożywienia a swoim gniazdem, a następnie komunikować się z lokalizacjami dobrych źródeł pożywienia swoim kolegom z gniazda za pomocą komunikacji tanec....

Protokół

1. Chwytanie pszczół miodnych zbierających

1. Kup kolonie pszczół miodnych od lokalnego dystrybutora.
2. Za pomocą siatki przeciw owadom złap pszczoły zbieraczki, które wracają do ula z workami na pyłek na tylnych nogach. Przenieś pszczoły do standardowej plastikowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zakryj probówkę (Rysunek 1). Umieść rurkę na lodzie, aby znieczulić pszczoły.
   UWAGA: Noś wyznaczone kurtki do pszczelarstwa, aby uniknąć użądleń pszczół. W zależności od eksperymentu można również zbierać pszczoły karmiące. Aby złapać pszczoły pielęgniarki, obserwuj zachowanie pszczoły na woskowym grzebieniu i łap ....

Wyniki

Stężenia białek w homogenatach mózgu:
Przygotowaliśmy homogenaty z wykorzystaniem pszczół zbieraczek. Obliczone stężenia białek w oryginalnych homogenatach przedstawiono na Rysunku 3. Przybliżone stężenia białek w oryginalnym homogenacie wynosiły odpowiednio: 1,5 mg/mL w ciałkach grzybkowatych (MBs) oraz 2,3 mg/mL w pozostałych obszarach mózgu. Wykorzystano dwie pszczoły na partię i przeanalizowano sześć partii.

Dyskusja

Biochemiczne badanie aktywności białek jest niezwykle ważne dla zrozumienia sygnalizacji molekularnej w mózgu, ponieważ na aktywność enzymu wpływają różne cząsteczki, takie jak substraty i inhibitory, a zatem mogą zmieniać się wraz z zachowaniem zwierząt (np. uczeniem się i ^pamięcią). W badaniach pszczół miodnych stwierdzono, że enzymy, takie jak cykliczna kinaza białkowa zależna od AMP A, cykliczna kinaza białkowa zależna od GMP, PKC, fosforylowany CaMKII i cyklaza adenylanowa wykazują r.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23227	Zestaw odczynników do pomiaru stężenia białka
Pierce Albumina bydlęca Standardowe ampułki 2 mg / ml	ThermoFisher Scientific	23209	Standardowe próbki używane w teście BCA
Wosk parafinowy	GC	13B1X00155000141	Wosk dentystyczny używany jako etap rozwarstwienia
Szpilka do owadów	Shiga	Nr 0	Nierdzewna, solidna głowica
PLCglow	KXT Bio	KCH-0001	Fluorogenne podłoże mikropłytki PLC
384-dołkowej	Corning	4511	Niskonakładowa płytka z okrągłym dnem w kolorze czarnym
Czytnik mikropłytek Gemini EM	Urządzenia
Edelfosine	Santa Cruz Biotechnology	sc-201021	inhibitor
pan-PLCSiarczan neomycyny	Santa Cruz Biotechnology	sc-3573	inhibitor pan-PLC

molekularne