Artykuł metodologiczny

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

DOI:

10.3791/58173

⸱

14 września 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pszczoła miodna jest modelowym organizmem do oceny złożonych zachowań i wyższych funkcji mózgu, takich jak nauka, pamięć i podział pracy. Ciało grzyba (MB) jest wyższym ośrodkiem mózgu, który ma być neuronalnym substratem złożonych zachowań pszczół miodnych. Chociaż wcześniejsze badania zidentyfikowały geny i białka, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w MB i innych regionach mózgu, aktywność białek w każdym regionie nie jest jeszcze w pełni poznana. Aby ujawnić funkcje tych białek w mózgu, analiza farmakologiczna jest wykonalnym podejściem, ale najpierw konieczne jest potwierdzenie, że manipulacje farmakologiczne rzeczywiście zmieniają aktywność białek w tych obszarach mózgu.

Wcześniej zidentyfikowaliśmy wyższą ekspresję genów kodujących fosfolipazę C (PLC) w MBs niż w innych regionach mózgu i farmakologicznie oceniliśmy udział PLC w zachowaniu pszczół miodnych. W tym badaniu przetestowaliśmy biochemicznie dwa środki farmakologiczne i potwierdziliśmy, że zmniejszają one aktywność PLC w MB i innych obszarach mózgu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób wykrywać aktywność PLC w homogenacie mózgu pszczoły miodnej. W tym systemie testowym homogenaty pochodzące z różnych regionów mózgu reagują z syntetycznym substratem fluorogennym, a fluorescencja wynikająca z aktywności PLC jest określana ilościowo i porównywana między regionami mózgu. Opisujemy również naszą ocenę hamującego wpływu niektórych leków na aktywność PLC przy użyciu tego samego systemu. Chociaż na ten system prawdopodobnie wpływają inne endogenne związki fluorescencyjne i/lub absorbancja składników testu i tkanek, pomiar aktywności PLC przy użyciu tego systemu jest bezpieczniejszy i łatwiejszy niż przy użyciu tradycyjnego testu, który wymaga substratów znakowanych radioaktywnie. Prosta procedura i manipulacje pozwalają nam zbadać aktywność PLC w mózgach i innych tkankach pszczół miodnych zaangażowanych w różne zadania społeczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Europejska pszczoła miodna (Apis mellifera L.) jest owadem eusocjalnym, a samice pszczół wykazują rozmnażanie zależne od kasty i zależny od wieku podział pracy. Na przykład w bezpłodnej kaście pszczół określanej jako "robotnice" młodsze osobniki karmią czerwiu, podczas gdy starsze zbierają nektar i pyłek poza ulem1. Zdolność uczenia się i zapamiętywania jest niezwykle ważna w życiu pszczoły miodnej, ponieważ zbieraczki muszą wielokrotnie przemieszczać się tam i z powrotem między źródłami pożywienia a swoim gniazdem, a następnie komunikować się z lokalizacjami dobrych źródeł pożywienia swoim kolegom z gniazda za pomocą komunikacji tanecznej1. Wcześniejsze badania wykazały, że MB, wyższy ośrodek mózgu u owadów, jest zaangażowany w zdolność uczenia się i zapamiętywania pszczoły miodnej2,3,4. Różnie wyrażone geny i białka zostały zidentyfikowane w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej5,6,7,8,9,10,11, co sugeruje, że są one związane z unikalnymi funkcjami każdego regionu mózgu. Chociaż farmakologiczne hamowanie lub aktywacja białka będącego przedmiotem zainteresowania jest dobrze stosowanym podejściem do ujawnienia funkcji białka w zachowaniu pszczół miodnych12,13,14, nie wiadomo, czy wszystkie leki mają działanie funkcjonalne w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej. Walidacja funkcji takich leków wzmocni wnioski z badań farmakologii behawioralnej.

Tutaj skupiamy się na PLC, jednym z enzymów związanych z poznaniem myszy15,16,17,18. PLC wyzwala sygnalizację wapniową poprzez rozkład 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu (2) na 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3) i diacyloglicerol (DAG)19,20,21. IP3 otwiera receptory IP3 na retikulum endoplazmatycznym (ER), prowadząc do uwolnienia jonów wapnia z ER. Uwolniony wapń aktywuje zarówno kinazę białkową II zależną od wapnia/kalmoduliny (CaMKII) z kalmoduliną i kinazą białkową C (PKC) w obecności DAG. Obie kinazy białkowe biorą udział w uczeniu się i zapamiętywaniu22,23, co jest zgodne z udziałem PLC w tym procesie. Sterowniki PLC są podzielone na podtypy, w tym PLCβ, PLCγ i PLCε, na podstawie ich struktur20. Każdy podtyp PLC jest aktywowany w innym kontekście20, a geny kodujące te podtypy są różnie wyrażane w różnych tkankach. Wcześniej wykazaliśmy, że MB pszczół miodnych wyrażają geny kodujące podtypy PLCβ i PLCε na wyższych poziomach niż pozostałe regiony mózgu24, oraz że dwa inhibitory pan-PLC (edelfozyna i siarczan neomycyny [neomycyna]) zmniejszają aktywność PLC w różnych regionach mózgu i rzeczywiście wpływają na zdolność uczenia się i zapamiętywania pszczoły miodnej24.

Tradycyjnie, aktywność enzymatyczna PLC była mierzona za pomocą radioznakowanego225, co wymaga odpowiedniego szkolenia, sprzętu i obiektów. Niedawno stworzono syntetyczny substrat fluorogeniczny PLC26, co ułatwia ocenę aktywności PLC w standardowym laboratorium. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykrywania aktywności PLC w różnych obszarach mózgu pszczoły miodnej za pomocą substratu fluorogenicznego, a następnie testowania hamującego wpływu edelfozyny i neomycyny na PLC w tych tkankach. Ponieważ protokół wymaga tylko podstawowych manipulacji, może mieć zastosowanie do badań aktywności PLC w innych tkankach lub obszarach mózgu pszczół przydzielonych do różnych zadań społecznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chwytanie pszczół miodnych zbierających

  1. Kup kolonie pszczół miodnych od lokalnego dystrybutora.
  2. Za pomocą siatki przeciw owadom złap pszczoły zbieraczki, które wracają do ula z workami na pyłek na tylnych nogach. Przenieś pszczoły do standardowej plastikowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zakryj probówkę (Rysunek 1). Umieść rurkę na lodzie, aby znieczulić pszczoły.
    UWAGA: Noś wyznaczone kurtki do pszczelarstwa, aby uniknąć użądleń pszczół. W zależności od eksperymentu można również zbierać pszczoły karmiące. Aby złapać pszczoły pielęgniarki, obserwuj zachowanie pszczoły na woskowym grzebieniu i łap pszczoły pielęgniarki, które wsadzają głowy w komórki czerwiu, aby nakarmić larwy, za skrzydło lub klatkę piersiową za pomocą pęsety. Następnie umieść pszczoły w plastikowej probówce o pojemności 50 ml, zakryj probówkę i umieść ją na lodzie, jak wspomniano w kroku 1.2.
  3. Złap losowo 12 zbieraczy.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się dwie pszczoły na partię, co daje sześć partii. W jednej probówce można złapać wiele pszczół, a liczba pszczół w jednej probówce nie jest ważna, ponieważ pszczoły w każdej partii są później łączone (patrz krok 3.1.1). Utrzymuj rurkę w chłodzie latem, ponieważ wysoka temperatura w rurce szkodzi pszczołom.

2. Sekcja mózgu pszczoły miodnej

  1. W laboratorium umieść probówkę o pojemności 50 ml na lodzie na co najmniej 30 min6, aby znieczulić pszczoły.
  2. Aby przygotować etap sekcji, złóż kawałek wosku dentystycznego na pół (uzyskany rozmiar to około 3,5 x 7,5 cm) i wepchnij go do plastikowego naczynia (60 x 15 mm).
    UWAGA: Złożony wosk mocno trzyma szpilki owadów.
  3. Pod mikroskopem lornetkowym oddziel głowę pszczoły od jej ciała za pomocą pęsety i przymocuj ją do wosku dentystycznego, wkładając szpilki do owadów u podstawy każdej anteny, aby utrzymać przednią część głowy w pozycji do góry (Rysunek 2A).
    UWAGA: Umyj pęsetę przed użyciem przy użyciu etanolu lub wysterylizowanej wody.
  4. Wlej tyle roztworu soli (0,13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl i 1 mmol/L CaCl 2-2H 2O) na głowę, aby ją przykryć. Ponownie przebij głowę szpilkami, jeśli głowa unosi się w roztworze. W razie potrzeby użyj lodowatego roztworu soli fizjologicznej.
    UWAGA: Jednak ten protokół działa bez zimnego roztworu soli fizjologicznej.
  5. Usuń anteny za pomocą pęsety (Rysunek 2B).
  6. Wykonaj poziome cięcie w pobliżu podstaw czułków i wzdłużnie na granicy oczu złożonych, używając skalpela. Następnie wykonaj poziome nacięcie na czubku głowy. Usuń naskórek, aby otworzyć okno nad mózgiem (Rysunek 2C).
    UWAGA: W razie potrzeby przed użyciem umyj skalpel etanolem lub wysterylizowaną wodą.
  7. Usuń siatkówki z oczu i tchawicy na przedniej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (Rysunek 2D).
  8. Rozszerz nacięcie na granicy złożonych oczu grzbietowo i brzusznie, używając skalpela (Rysunek 2E). Następnie usuń tkankę łączną między naskórkiem oczu złożonych a siatkówką, wkładając pęsetę bezpośrednio pod naskórek oka (Rysunek 2F).
  9. Odrzuć naskórek oczu złożonych. Podnieś pęsetą grzbietowe końcówki siatkówki oczu złożonych i przesuń pęsetę w kierunku brzusznym, aby ostrożnie odkleić siatkówkę (Ryc. 2G).
  10. Ostrożnie usuń pozostałe tchawice z przedniej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (Rysunek 2H).
  11. Przetnij tkankę łączną między mózgiem i wokół tkanek za pomocą pęsety i wypreparuj mózg z torebki głowy (Rysunek 2H).
  12. Odklej tchawice na tylnej powierzchni mózgu za pomocą pęsety (Rysunek 2I).
  13. Za pomocą skalpela przetnij połączenie między MB a innymi obszarami mózgu obok pionowych płatów, które są częścią MB (Rysunek 2J).
  14. Umieść wypreparowane MB i pozostałe tkanki mózgowe w probówkach o pojemności 1,5 ml i szybko zamroź je suchym lodem lub ciekłym azotem (Rysunek 2K). Zamrożone chusteczki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w wyznaczonych rękawicach i wentylacji, aby uniknąć zimnych oparzeń i uduszenia. Z suchym lodem należy również obchodzić się ostrożnie w rękawiczkach. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Sekcja i przechowywanie tkanek mózgowych powinny być wykonywane po jednej pszczole na raz, aby uniknąć degradacji białka.

3. Przygotowanie homogenatów mózgu

  1. Dodać 10 μl buforu homogenizacyjnego składającego się z 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/l KCl i 1,0 mmol/L CaCl2 do zamrożonej tkanki mózgowej i homogenizować tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml, ręcznie wywierając nacisk plastikowym tłuczkiem. Pogłaszcz tkankę co najmniej 200 razy < br / > UWAGA: Czynności opisane w rozdziale 3 należy wykonywać na lodzie. Użyj tłuczka mocującego się bezpośrednio w probówce, aby wystarczająco rozbić tkanki, które łatwo unoszą się w buforze homogenizacyjnym.
    1. Przenieść homogenizowany roztwór tkankowy do następnej tkanki w partii i homogenizować tkankę w ten sam sposób.
      UWAGA: Pszczoły miodne w każdej partii są łączone na tym etapie. W tym protokole wykorzystuje się sześć lotów.
  2. Dodać 30 μl buforu homogenizacyjnego.
  3. Odwirować homogenizowaną próbkę tkanki przez 10 minut w temperaturze około 900 x g27 i 4 °C.
  4. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować przez 20 minut w temperaturze około 9 500 x g27 i 4 °C.
  5. Umieścić supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowywać homogenat w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  6. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
    1. Rozcieńczyć 2,5 μl homogenatu w 17,5 μl wysterylizowanej wody (rozcieńczając w ten sposób homogenat ośmiokrotnie) i użyć całego rozcieńczonego homogenatu.
      UWAGA: Pobieranie próbek homogenatu za pomocą mikropipety musi być wykonywane ostrożnie ze względu na jego wysoką lepkość.
    2. Wykonać test BCA przy użyciu 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 i 2,0 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 20 μl jako wzorce.
      UWAGA: W razie potrzeby zmień skalę testu BCA w oparciu o objętość homogenatu i próbek wzorcowych. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Reakcja PLC w homogenatach mózgu

  1. Przygotować roztwór podstawowy podłoża fluorogenicznego WH-1526 rozpuszczonego w wysterylizowanej wodzie o stężeniu 50 μmol/l i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Przykryj roztwory zawierające podłoże folią, aby zapobiec blaknięciu.
  2. Przygotować premiks reakcyjny w wymaganej objętości, aby uzyskać następujący skład w 10 μl mieszaniny reakcyjnej: 50 mmol/l HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L ditiotreitol, 50 mg/L BSA i 12,5 μmol/L WH-15.
  3. W razie potrzeby rozcieńczyć homogenat buforem homogenizacyjnym.
  4. Wymieszać premiks reakcyjny i homogenat zawierający 1,3 μg białek w probówce do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), aby uzyskać końcową objętość 10 μl mieszaniny reakcyjnej.
    1. Przygotować dwa rodzaje mieszanin kontrolnych do analizy statystycznej: umieścić homogenat, ale nie WH-15 w mieszaninie (mieszanina kontrolna 1) i odwrotnie (mieszanina kontrolna 2).
      UWAGA: Przygotować mieszaniny reakcyjne i mieszaniny kontrolne na lodzie, aby zapobiec degradacji białek i reakcji PLC. Mieszaniny kontrolne 1 i 2 służą do wykrywania fluorescencji odpowiednio z homogenatu i wolnego substratu.
  5. Przepłukać probówkę i inkubować ją w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
  6. Zatrzymać reakcję, dodając 2 μl 25 mmol/L glikolu etylenowego bis (β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'--tetraoctowego.
    UWAGA: Odpowiednie ilości białka i czasy reakcji różnią się w zależności od eksperymentu. Tak więc, aby zoptymalizować warunki reakcji, może być konieczne powtórzenie procedur opisanych w krokach 4.1 - 5.3 we wstępnych eksperymentach poprzez zmianę ilości białka i czasu inkubacji, aż fluorescencja wzrośnie liniowo. Dla porównania, gdy stosuje się homogenat pochodzący z innych regionów mózgu, reakcja zwykle przebiega liniowo z 1,3 μg lub mniej białek w ciągu 30 minut, ale liniowość zmniejsza się albo przy co najmniej 2,7 μg białek, albo przy czasie inkubacji wynoszącym 90 minut lub dłużej.

5. Wykrywanie fluorescencji wynikającej z aktywności PLC

  1. Odwirować mieszaninę reakcyjną i mieszaniny kontrolne przez 5 minut przy około 310 x g28 i przenieść 10 μl supernatantu do różnych studzienek na 384-dołkowej mikropłytce mającej zastosowanie do wykrywania fluorescencji.
    UWAGA: Aby zapobiec blaknięciu i zabrudzeniu kurzem, przykryj płytkę folią.
  2. Przepłukać mikropłytkę za pomocą wirówki do mikropłytki.
  3. Umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i wykryć fluorescencję za pomocą technicznej trójkiplkatu.
    UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji wynoszą odpowiednio 344 nm i 530 nm. W stosownych przypadkach (w zależności od czytnika mikropłytek) mieszaniny próbek należy mieszać przez 5 s przed każdym wykryciem. Protokół można zatrzymać w tym miejscu.

6. Test hamującego działania środków farmakologicznych

  1. Przygotować roztwory podstawowe edelfozyny i neomycyny o odpowiednich stężeniach i przechowywać je do czasu użycia: edelfozyna w stężeniu 5,0 mmol/l i temperaturze -20 °C; neomycyna w stężeniu 550 mmol/l i temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowując premiks reakcyjny zgodnie z opisem w kroku 4.2, dodać inhibitory do premiksu, aby osiągnąć odpowiednie stężenia końcowe: edelfozyna, 1,0 mmol/l; neomycyna, 0,55 mmol/l.
  3. Dodać homogenat do premiksu reakcyjnego i odpowiednich mieszanin kontrolnych, jak w kroku 4.4.
    1. Przygotować trzy rodzaje mieszanin kontrolnych: umieścić homogenat i inhibitor, ale nie substrat, w mieszaninie kontrolnej 1; dodać substrat i inhibitor, ale nie homogenat, do mieszaniny kontrolnej 2; i umieścić inhibitor, ale nie homogenat lub substrat, w mieszaninie kontrolnej 3.
  4. Przeprowadzić reakcję PLC i detekcję fluorescencji zgodnie z opisem w krokach 4.5 - 5.3.

7. Analiza statystyczna

  1. W celu wykrycia aktywności PLC przy użyciu mieszanin opisanych w sekcji 4 należy obliczyć fluorescencję uzyskaną z reakcji między PLC a substratem, odejmując fluorescencję emitowaną z homogenatu lub wolnego substratu w następujący sposób:

    Fl (aktywność PLC) = Fl (mieszanina reakcji) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}

    UWAGA: Fl (aktywność PLC), Fl (mieszanina reakcyjna), Fl (ctrl 1) i Fl (ctrl 2) oznaczają fluorescencję w dobrej wierze pochodzącą z aktywności PLC, fluorescencję wykrytą w mieszaninie reakcyjnej oraz mieszaniny kontrolne 1 i 2.
    1. Po pomiarze fluorescencji w mieszaninach zgodnie z opisem w krokach 4.1 - 5.3, obliczyć Fl (aktywność PLC) zgodnie z równaniem w kroku 7.1, a następnie średnią Fl (aktywność PLC) trzylecia technicznego dla każdego homogenatu.
    2. Korzystając ze średniej Fl (aktywność PLC) z trójki technicznej otrzymanej w kroku 7.1.1, należy ponownie obliczyć średnią aktywność Fl (PLC) biologicznych powtórzeń MB i innych obszarów mózgu i porównać wartości między tkankami mózgowymi.
  2. W celu zbadania aktywności PLC w obecności inhibitorów przy użyciu mieszanin opisanych w sekcji 6 należy obliczyć fluorescencję uzyskaną w wyniku reakcji między homogenatem, substratem i inhibitorem w następujący sposób.

    Fl (aktywność PLC z inhibitorem) = Fl (mieszanina reakcji) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)

    UWAGA: W tym przypadku Fl (aktywność PLC z inhibitorem) to fluorescencja w dobrej wierze wynikająca z aktywności PLC w obecności inhibitora. Fl (mieszanina reakcyjna), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) i Fl (ctrl 3) są sygnałami fluorescencyjnymi wykrywanymi odpowiednio w mieszaninie reakcyjnej, mieszaninie kontrolnej 1, mieszaninie kontrolnej 2 i mieszaninie kontrolnej 3.
    1. Po pomiarze fluorescencji w mieszaninach zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.4 należy obliczyć Fl (aktywność PLC z inhibitorem) zgodnie z równaniem w kroku 7.2. Następnie należy obliczyć średnią Fl (aktywność PLC z inhibitorem) technicznego triplikata dla każdego homogenatu.
    2. Korzystając z wartości średniej obliczonej w kroku 7.2.1, należy obliczyć średnią Fl (aktywność PLC z inhibitorem) kontrprób biologicznych pochodzących z każdej tkanki mózgowej. Porównaj Fl (aktywność PLC z inhibitorem) i Fl (aktywność PLC) uzyskane w kroku 7.1.2 w każdej tkance mózgowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stężenia białek w homogenatach mózgu:
Przygotowaliśmy homogenaty przy użyciu pszczół zbieraczek. Obliczone stężenia białek w oryginalnych homogenatach są pokazane na Rysunek 3. Przybliżone stężenia białka w oryginalnym homogenacie były następujące: 1,5 mg/ml w MB i 2,3 mg/ml w innych obszarach mózgu. Użyliśmy dwóch pszczół na partię i przeanalizowano sześć partii.

Wykryw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biochemiczne badanie aktywności białek jest niezwykle ważne dla zrozumienia sygnalizacji molekularnej w mózgu, ponieważ na aktywność enzymu wpływają różne cząsteczki, takie jak substraty i inhibitory, a zatem mogą zmieniać się wraz z zachowaniem zwierząt (np. uczeniem się i pamięcią). W badaniach pszczół miodnych stwierdzono, że enzymy, takie jak cykliczna kinaza białkowa zależna od AMP A, cykliczna kinaza białkowa zależna od GMP, PKC, fosforylowany CaMKII i cyklaza adenylanowa wykazują r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4B - 4D został zmodyfikowany z Suenami et al.24 za zgodą Biology Open. Autorzy są wdzięczni wydawcy za zgodę. Prace te były wspierane przez Human Frontier Science Program (RGY0077/2016) dla Shota Suenamiego i Ryo Miyazakiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher Scientific23227Zestaw odczynników do pomiaru stężenia białka
Pierce Albumina bydlęca Standardowe ampułki 2 mg / mlThermoFisher Scientific23209Standardowe próbki używane w teście BCA
Wosk parafinowyGC13B1X00155000141Wosk dentystyczny używany jako etap rozwarstwienia
Szpilka do owadówShigaNr 0Nierdzewna, solidna głowica
PLCglowKXT BioKCH-0001Fluorogenne podłoże mikropłytki PLC
384-dołkowejCorning4511Niskonakładowa płytka z okrągłym dnem w kolorze czarnym
Czytnik mikropłytek Gemini EMUrządzenia
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021inhibitor
pan-PLCSiarczan neomycynySanta Cruz Biotechnologysc-3573inhibitor pan-PLC
molekularne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
  2. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3(2008).
  3. Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
  4. Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
  5. Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
  6. Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
  7. Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408(2009).
  8. Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213(2010).
  9. Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732(2013).
  10. Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
  11. Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841(2016).
  12. Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
  13. Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
  14. Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
  15. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  16. Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
  17. Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
  18. Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986(2015).
  19. Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
  20. Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
  21. Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
  22. Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
  23. Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
  24. Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
  25. Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
  26. Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
  27. Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
  28. Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
  29. Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
  30. Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
  31. Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
  32. Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
  33. Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

M zg pszczo y miodnejpod o e fluorogennecia o grzybowateinhibicja PLCsekcja tkanekkwantyfikacja fluorescencjianaliza farmakologicznaneuronauka pszcz miodnych

Powiązane artykuły