Tutaj opisujemy prostą metodę wywoływania klinicznie istotnych odleżyn skóry (PU) w mysim modelu uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI). Model ten może być wykorzystany w badaniach przedklinicznych do badań przesiewowych pod kątem różnych środków terapeutycznych w leczeniu PU u pacjentów po SCI.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model odleżyn po urazie rdzenia kręgowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odleżyny (PU) są częstymi wyniszczającymi powikłaniami urazowego uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI) i zwykle występują w tkankach miękkich wokół wypukłości kostnych. Niewiele jednak wiadomo na temat wpływu SCI na gojenie się ran skóry w kontekście modeli zwierzęcych w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. W niniejszej pracy przedstawiono prosty, nieinwazyjny, powtarzalny i klinicznie istotny mysi model PU w kontekście całkowitego SCI. Dorosłe samce myszy (Balb/c, 10 tygodni) zostały ogolone i wydepilowane. Po depilacji (24 h) myszy poddano laminektomii, a następnie całkowitemu przecięciu rdzenia kręgowego (kręgi T9-T10). Natychmiast po tym fałd skórny na grzbiecie myszy został podniesiony i umieszczony między dwoma dyskami magnetycznymi utrzymywanymi w miejscu przez następne 12 godzin, tworząc w ten sposób obszar niedokrwienny, który w ciągu następnych dni rozwinął się w PU. Zranione obszary wykazywały obrzęk tkanek i zanik naskórka do 3 dnia po zastosowaniu magnesu. PU spontanicznie rozwijały się i goiły. Gojenie było jednak wolniejsze u myszy SCI w porównaniu z myszami kontrolnymi bez SCI, gdy rana powstała poniżej poziomu SCI. I odwrotnie, nie zaobserwowano różnicy w gojeniu między myszami SCI a kontrolnymi myszami bez SCI, gdy rana została utworzona powyżej poziomu SCI. Model ten jest potencjalnie użytecznym narzędziem do badania dynamiki rozwoju i gojenia się PU skóry po SCI, a także do testowania podejść terapeutycznych, które mogą pomóc w gojeniu takich ran.
Wprowadzenie
Odleżyny (PU) są głównymi wtórnymi powikłaniami urazowego SCI1. PU to miejscowe urazy skóry i/lub tkanek leżących poniżej, które zwykle występują nad wypukłościami kostnymi, gdzie ciężar ciała jest skoncentrowany, gdy pacjent siedzi lub leży1. Skóra, tłuszcz i mięśnie są narażone na ten ciągły nacisk, który prowadzi do rozwoju miejscowego niedokrwienia, zapalenia tkanek, uszkodzeń mechanicznych i martwicy2,3.
Na rozwój PU wpływa kilka lokalnych czynników, w tym wielkość nacisku i ścinania, czas trwania obciążenia, wilgotność i temperatura skóry, długotrwałość urazów i ogólna higiena skóry. Istnieją również czynniki ogólnoustrojowe, które odgrywają rolę, takie jak ogólna kondycja fizyczna, morfologia i siła tkanki kostnej i mięśniowej4, wiek pacjenta, pomiary hematologiczne, płeć, a nawet czynniki społeczno-ekonomiczne, w tym stan cywilny, wykształcenie i dochód4,5.
Zapobieganie i leczenie PU pozostaje poważnym wyzwaniem u pacjentów po SCI. U pacjentów po SCI rozwijają się PU w ~30-40% przypadków, ze wskaźnikiem ponownego wystąpienia 60-85%, prawdopodobnie z powodu słabej tkanki bliznowatej i braku uczucia ochronnego1. W związku z tym PU często prowadzą do ponownej hospitalizacji pacjentów po SCI i ogólnie stanowią znaczne obciążenie finansowe (80% więcej w porównaniu z samym SCI) dla systemu opieki zdrowotnej5,6,7,8,9,10.
O ile nam wiadomo, nie przeprowadzono żadnych badań w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych, które badałyby wpływ SCI na proces gojenia PU z powodu braku odpowiednich modeli zwierzęcych. W tym miejscu opisano powtarzalny i klinicznie istotny mysi model PU w skórze. Model ten może być wykorzystany do badania dynamiki początku i późniejszego gojenia się PU, a także do testowania potencjalnych podejść terapeutycznych w celu zapobiegania PU lub poprawy gojenia PU w kontekście SCI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury chirurgiczne związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Rutgers University Institutional Animal Care and Use Committee. Myszy karmiono standardową dietą i wodą ad libitum.
1. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i niechirurgicznych
- Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne i niechirurgiczne w autoklawie.
- Wyczyść stół operacyjny 70% etanolem i rozgrzej poduszkę grzewczą do 37 °C.
- Umieść poduszkę grzewczą na stole operacyjnym i przykryj ją sterylnymi serwetami chirurgicznymi.
nuta: We wszystkich procedurach przetrwania stosuje się tu technikę "No Touch" w celu utrzymania sterylności.
2. Przygotowanie zwierząt i wykonanie laminektomii rdzeniowej T9-T10
- Zaopatrz się w dorosłe (Balb/c) 10-tygodniowe samce myszy. Wywołać znieczulenie u każdego zwierzęcia za pomocą inhalatora, zaczynając od 5% izofluranu, a następnie zmniejszyć do 2-3%, aby utrzymać sedację przez pozostałą część zabiegów.
- Potwierdź całkowite znieczulenie, wywołując brak reakcji na stymulację nocycepcyjną wywołaną szczypnięciem ogona/łapy.
- Ogol włosy na grzbiecie (od głowy do ogona) elektryczną maszynką do strzyżenia, a następnie nałóż krem do depilacji (3 min), aby usunąć pozostałe włosy. Na koniec umyj grzbiet bieżącą wodą/mokrym peelingiem i włóż zwierzęta z powrotem do klatek.
nuta: Jest to konieczne, aby uniknąć dodatkowego podrażnienia skóry i zanieczyszczenia chemicznego w momencie zranienia skóry - Następnego dnia nałóż maść okulistyczną na rogówkę, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas zabiegu chirurgicznego, a następnie wyszoruj skórę 3 alternatywnymi preparatami peelingu betadynowego i 70% etanolu.
- Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry (~1,0-1,5 cm) wzdłuż linii środkowej na plecach na poziomie kręgów T8-T12.
nuta: Poziom kręgów jest identyfikowany przez wsteczne liczenie kręgu od T13 przy użyciu lokalizacji pływających żeber, które odpowiadają kręgowi T1311,12. - Oczyść podskórną tkankę tłuszczową, aby uzyskać dostęp do mięśni przykręgosłupowych, a następnie powoli je wypreparuj, aby odsłonić wyrostki kolczyste i blaszki po obu stronach.
nuta: Wykonaj tę procedurę bardzo ostrożnie, aby uniknąć nadmiernego krwawienia lub jakiegokolwiek uszkodzenia rdzenia kręgowego w tym momencie. - Wykonaj laminektomię, aby odsłonić rdzeń kręgowy (kręgi T9-T10), delikatnie odklejając blaszkę rdzeniową za pomocą kleszczy do mikropreparacji.
nuta: Wykonaj laminektomię tak, aby nadmiar rdzenia kręgowego został odsłonięty, aby ułatwić powstanie urazu. W grupie kontrolnej wykonuje się tylko laminektomię.
3. Wykonywanie kompletnego uszkodzenia rdzenia kręgowego T9-T10
- Za pomocą kleszczy zabezpiecz kręgosłup w T8 i podnieś, aby wyolbrzymić krzywiznę kręgosłupa.
- Za pomocą cienkich nożyczek przeciąć rdzeń kręgowy między kręgiem T9 i T10 aż do dna kanału kręgowego, aby zapewnić całkowite przecięcie.
- Po zaobserwowaniu całego przekroju pod mikroskopem chirurgicznym, nałóż kawałek tłuszczu podskórnego na miejsce laminektomii, aby zapewnić dodatkową ochronę rdzenia kręgowego przed zamknięciem pola operacyjnego.
- Na koniec zamknij ranę i zszyj mięśnie przykręgosłupowe, powięź powierzchowną, używając szwu ciągłego, a następnie zamknij skórę za pomocą klipsów do szwów12.
- Po SCI obserwuj wypróżnienia następnego dnia, jednak kontroluj pęcherz moczowy poprzez ręczne opróżnianie pęcherza.
nuta: Skala Basso Mouse Scale (BMS) może być używana do monitorowania postępu odzyskiwania funkcji kończyn tylnych po SCI w 2 dniu, a następnie co tydzień, patrz rysunek uzupełniający 111,12,13.
4. Indukcja odleżyn skórnych po całkowitym SCI
- Bezpośrednio po operacji SCI należy wyszorować grzbiet zwierzęcia betadyną i 70% alkoholem.
- W przypadku PU poniżej miejsca SCI wstrzyknąć w skórę grzbietową w pobliżu kości krzyżowej bardzo małą objętość (10 μl) 0,125% roztworu bupiwakainy za pomocą igły 25 G w równe odległości od siebie ~0,5-1,0 cm, w elipsie wokół miejsca aplikacji magnesu.
nuta: W przypadku PU powyżej miejsca SCI należy wstrzyknąć skórę grzbietową w pobliżu odcinka szyjki macicy. - Delikatnie podnieś fałd skórny z tyłu myszy i umieść go pomiędzy 2 dyskami magnetycznymi (5×12 mm średnicy, 2.4 g każdy, siła magnetyczna 3800 G) (Rysunek 1). 11,12
- Natychmiast po przyłożeniu magnesu należy umieścić zwierzęta w pojedynczych klatkach umieszczonych na poduszce grzewczej, aż do odzyskania pełnej świadomości (Rysunek 1).
- Po 12 godzinach od przyłożenia magnesu lekko znieczulij zwierzę izofluranem i usuń magnesy. Zrób zdjęcie miejsc ran, aby zarejestrować początkowe pojawienie się PU (punkt czasowy dnia 0). Przykryj ranę przezroczystą folią opatrunkową (3 m), aby uniknąć wysuszenia lub zanieczyszczenia.
5. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami, eutanazja i pobieranie tkanek do badań histologicznych
- Bezpośrednio po zabiegu należy wstrzyknąć zwierzęciu 1 ml 0,9% soli fizjologicznej podskórnie w celu nawodnienia.
- Natychmiast wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę-SR (1 mg/kg) w celu znieczulenia.
- Codziennie wstrzykiwać podskórnie meloksykam (1 mg/kg) i cefazolinę (50 mg/kg przez 3-7 dni) oraz dwa razy dziennie manualne opróżnianie pęcherza.
- Umieszczaj zwierzęta w pojedynczych klatkach i zapewnij dostęp do pożywienia i wody ad libitum. Myszy z całkowitym SCI mogą bez problemu chodzić za pomocą kończyn przednich i zbliżać się do jedzenia i wody.
- Usuń klipsy chirurgiczne 7 dni po operacji SCI.
- W pożądanych punktach czasowych po SCI i zranieniu skóry, poddaj zwierzęta eutanazji przez wdychanie CO2 (3-5 min), zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji14.
- Pobrać próbki zranionej skóry, utrwalić w 10% formalinie przez 24 godziny, a następnie przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do momentu pokrojenia.
- Aby przetworzyć tkanki, zanurz je w parafinie i wygeneruj cienkie skrawki (5 μm) na mikrotomie. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wizualizacji morfologii tkanek (Rysunek 3). W przypadku badań immunohistochemicznych (Rysunek 4), wybarwić skrawki przy użyciu odpowiednich przeciwciał dla Ki67 (proliferacja), CD31 (angiogeneza) i aktyny alfa-mięśni gładkich (α-SMA), jak opisano w Kumar et al.12
nuta: Oprogramowanie do analizy obrazu może być używane do ilościowego określania cech obrazu12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół służy do tworzenia odleżyn w warunkach całkowitego uszkodzenia rdzenia kręgowego (SCI). W skrócie (jak zilustrowano na Rysunku 1), wszystkie myszy, z całkowitym SCI lub bez, bardzo dobrze zniosły obecność magnesów, które pozostały w pierwotnej pozycji przez pełne 12 h (Rysunki 1c, 1d, 1f, 1h). U wszystkich myszy powstały dwie okrągłe rany przedzielone mostkiem prawidłowej tkanki (Rysunek 1e, 1g...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół w tym badaniu opisuje nowatorski model eksperymentalny PU w celu oceny wpływu SCI na gojenie się ran. Poliuretanowe składniki skóry indukowano poprzez 12-godzinne nakładanie dwóch magnesów dyskowych o średnicy 12 mm na grzbietowy fałd skórny, umieszczony powyżej lub poniżej miejsca SCI. Dane pokazują, że SCI spowalnia gojenie się ran skóry u myszy. Co ważne, obserwacje te zostały przeprowadzone w szczególności w przypadku ran skóry poniżej poziomu unerwienia SCI, ponieważ rany powstałe powyżej poziomu SCI, a zat...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR15IRG010), Departament Obrony Stanów Zjednoczonych (SC160029) oraz Yale Department of Surgery Ohse Research Grant Program. Dziękujemy Seanowi O'Leary'emu z W.M. Keck Center for Collaborative Neuroscience w Rutgers za pomoc techniczną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Magnesy | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Siła magnetyczna |
| Myszy standardowa dieta | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Granulat spożywczy | |
| Izofluran | HENRY SCHEIN Zdrowie zwierząt | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| BETADINE Peeling chirurgiczny | HENRY SCHEIN Zdrowie zwierząt | ||
| Maść okulistyczna | HENRY SCHEIN Zdrowie zwierząt | SKU 008897 | |
| NAIR-Balsam do depilacji | Kościół & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloksykam) Wtrysk | HENRY SCHEIN Zdrowie zwierząt | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 ml |
| Cefazolina Sód | HENRY SCHEIN Zdrowie zwierząt | SKU 054846 | 1 g, butelka 10 ml |
| Buprenorfina-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | |
| -0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% neutralna buforowana formalina | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Samiec myszy | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Klipsy do szwów | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Szew chirurgiczny, USA | Henry Schein Zdrowie zwierząt | Numer katalogowy: 101-2636 |
Bibliografia
- Rappl, L. M. Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing. International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).
- Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. Animal models in pressure ulcer research. The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).
- Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).
- National Pressure Ulcer Advisory Panel. Prevention and Treatment of Pressure Ulcers: Clinical Practice Guideline. , Cambridge Media. Osborne Park, Western Australia. (2014).
- Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries. Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).
- Krause, J. S. Skin sores after spinal cord injury: relationship to life adjustment. Spinal Cord. 36 (1), 51-56 (1998).
- Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. Pressure ulcers: more lethal than we thought? Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).
- Kruger, E. A., Pires, M., Ngann, Y., Sterling, M., Rubayi, S. Comprehensive management of pressure ulcers in spinal cord injury: current concept and future trends. The Journal of Spinal Cord Medicine. 36 (6), 572-585 (2013).
- Lala, D., Dumont, F. S., Leblond, J., Houghton, P. E., Noreau, L. Impact of pressure ulcers on individuals living with a spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 95 (15), 2312-2319 (2014).
- Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury. Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers. Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).
- Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models. Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).
- Basso, D. M., Fisher, L. C., Anderson, A. J., Jakeman, L. B., McTigue, D. M., Popovich, P. G. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois, USA. (2013).
- Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).
- Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat. Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
