Artykuł metodologiczny

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58190

⸱

17 sierpnia 2018

 , 
1Department of Dermatology, University of California, Davis, 2Dermatology Service, Sacramento VA Medical Center, 3Department of Dermatology, State University of New York, Downstate Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Streszczenie

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie stosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy komórek. Federalna Agencja ds. Leków zatwierdziła PDT w leczeniu rogowacenia słonecznego, a wytyczne kliniczne zalecają PDT jako leczenie niektórych nieczerniakowych nowotworów skóry i trądziku pospolitego. PDT jest korzystną metodą terapeutyczną, ponieważ jest tania, nieinwazyjna i wiąże się z minimalnymi zdarzeniami niepożądanymi i bliznami. W pierwszym etapie PDT nakłada się PS i pozwala mu się akumulacji wewnątrzkomórkowej. Późniejsze naświetlanie światłem indukuje powstawanie reaktywnych form tlenu, co może ostatecznie prowadzić do apoptozy komórek, przerwania błony, uszkodzenia mitochondriów, modulacji immunologicznej, proliferacji keratynocytów i obrotu kolagenu. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę in vitro do badania PDT w adherentnej linii komórkowej. Ten protokół leczenia ma na celu symulację PDT i może być dostosowany do badania wykorzystania PDT z różnymi liniami komórkowymi, fotouczulaczami, temperaturami inkubacji lub długościami fal fotoaktywacji. Komórki raka płaskonabłonkowego inkubowano z kwasem 5-aminolewulinowym 0, 0,5, 1,0 i 2 mM (5-ALA) przez 30 minut i fotoaktywowano światłem niebieskim o długości 417 nm przez 1000 s. Pierwszorzędową miarą wyniku była apoptoza i martwica, mierzone za pomocą cytometrii przepływowej aneksyny-V i 7-aminoaktynomycyny D. Nastąpił zależny od dawki wzrost apoptozy komórek po trzydziestominutowej inkubacji 5-ALA. Aby osiągnąć wysoką trafność między testami, ważne jest utrzymanie spójnych parametrów inkubacji i światła podczas wykonywania eksperymentów PDT in vitro. PDT jest użyteczną procedurą kliniczną, a badania in vitro mogą pozwolić na opracowanie nowych PS, optymalizację protokołów i nowe wskazania do PDT.

Wprowadzenie

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie stosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy komórek. Federalna Agencja ds. Leków (FDA) zatwierdziła PDT do leczenia rogowacenia słonecznego (AK), a wytyczne kliniczne zalecają PDT jako leczenie niektórych nieczerniakowych nowotworów skóry i trądziku pospolitego 1,2. Pojawiające się niedermatologiczne zastosowania PDT obejmują leczenie raka przewodu pokarmowego, prostaty i ginekologicznego3. PDT jest korzystną metodą terapeutyczną, ponieważ jest tania, nieinwazyjna i wiąże się z minimalnymi zdarzeniami niepożądanymi i bliznowaceniem2.

W pierwszym kroku PDT stosuje się PS i pozwala na jego wewnątrzkomórkową akumulację2. W Stanach Zjednoczonych miejscowy kwas 5-aminolewulinowy (5-ALA) jest powszechnie stosowany w leczeniu AKs. Podczas fazy inkubacji 5-ALA jest przekształcany w protoporfirynę IX (PP-IX) poprzez szlak biosyntezy hemu w włączonych komórkach3. Komórki nowotworowe i przedrakowe mają zmniejszoną aktywność ferrochelatazy, która przekształca protoporfirynę IX (PP-IX) w produkt końcowy, hem. W rezultacie, komórki nowotworowe akumulują PP-IX w porównaniu z normalnymi komórkami4,5. Ta akumulacja PP-IX w komórkach nowotworowych i przedrakowych w stosunku do otaczającej tkanki pozwala na to, że PDT jest ukierunkowanym podejściem z minimalnymi zdarzeniami niepożądanymi. Naświetlanie światłem prowadzi do wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS), gdy tlen przyjmuje wzbudzone elektrony z PP-IX. PP-IX ma absorpcję pików w widmie ultrafioletowym z mniejszymi pikami w całym spektrum światła widzialnego, w tym światła niebieskiego i czerwonego2. Powstawanie ROS może ostatecznie prowadzić do apoptozy komórek, przerwania błony, uszkodzenia mitochondriów, modulacji immunologicznej, proliferacji keratynocytów i obrotu kolagenu6,7,8,9,10.

PDT został opracowany w latach siedemdziesiątych XX wieku i jest rozwijającą się metodą terapeutyczną3. Zatwierdzony przez FDA protokół leczenia AK zaleca inkubację skóry 5-ALA przez 14-18 godzin, ale w praktyce klinicznej powszechnie stosuje się inkubacje trwające od 1 do 2 godzin2. In vitro wykazaliśmy, że krótsze, trwające 15 minut inkubacje 5-ALA mogą zwiększać apoptozę komórek fibroblastów w porównaniu z nieleczonymi fibroblastami11,12. Ponadto badane są nowe PS na bazie chloru, ftalocyjaniny i nanocząsteczek w celu poprawy skuteczności PDT3. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę in vitro do badania PDT w przylegających komórkach raka płaskonabłonkowego. W tym protokole komórki SCC-13 są inkubowane z 0, 0,5, 1,0 i 2 mM 5-ALA przez 30 minut i fotoaktywowane niebieskim światłem 417 nm przez 1,000 s. Pierwszorzędową miarą wyniku jest apoptoza i martwica, mierzone za pomocą cytometrii przepływowej aneksyny-V i 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD). Ten protokół leczenia ma na celu symulację PDT i może być dostosowany do badania wykorzystania PDT z innymi liniami komórkowymi, fotouczulaczami, temperaturami inkubacji lub długościami fal fotoaktywacji. Konieczne może być przygotowanie dodatkowych grup kontrolnych, w tym kontroli niebarwionych, barwionych pojedynczym fluoroforem, ujemnych i pozytywnych do cytometrii przepływowej. Obszerny przegląd teorii, protokołów, projektu eksperymentalnego i bramkowania dla cytometrii przepływowej apoptozy/martwicy można znaleźć gdzie indziej13.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Umieść 20 000 komórek w 2 ml pożywki hodowlanej w każdym dołku płytki 6-dołkowej przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Umieścić płytki 6-dołkowe w nawilżonym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 24 godziny, aby komórki mogły przylgnąć do płytek.

2. Przygotowanie fotosensybilizatora do leczenia komórek

  1. Przygotować 0,5, 1 i 2 mM roztwory 5-ALA w pożywce hodowlanej. Jeśli płodowa surowica bydlęca (FBS) jest składnikiem pożywki hodowlanej, należy przygotować i potraktować komórki 5-ALA w roztworze pożywki z 0,1% FBS do inkubacji. 11,12 W tym przypadku komórki SCC-13 nie wymagają FBS, więc 5-ALA dodano bezpośrednio do pożywki wolnej od surowicy keratynocytów, uzupełnionej ekstraktem z przysadki bydlęcej i czynnikiem wzrostu naskórka.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki co najmniej 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Odessać PBS i dodać 2 ml 0, 0,5, 1 lub 2 mM roztworów 5-ALA do oddzielnych płytek lub studzienek.
  4. Inkubować komórki z 0, 0,5, 1 lub 2 mM 5-ALA na bloku grzewczym o temperaturze 36-37 °C przez 30 minut. Chronić komórki przed światłem podczas inkubacji za pomocą folii aluminiowej.
  5. Odessać roztwory 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA i przemyć komórki 2 ml PBS.
  6. Odessać PBS i dodać 2 ml pożywki hodowlanej do napromieniania światłem niebieskim.

3. Fototerapia światłem niebieskim

  1. Przed naświetlaniem ogniw włącz urządzenie emitujące niebieskie światło (np. diodę elektroluminescencyjną, światło fluorescencyjne lub halogenowe) i uruchom je na jeden cykl (1,000 s), aby rozgrzać urządzenie. Urządzenie ze światłem niebieskim powinno mieć wyjściową długość fali 417 +/- 5 nm. Pozostawienie urządzenia do pracy przez jeden cykl przed zabiegami zapewnia, że długość fali i natężenie promieniowania światła niebieskiego są spójne przez całą fazę fotoaktywacji.
  2. Użyj fotometru, aby zmierzyć natężenie promieniowania na powierzchni ogniwa. Natężenie promieniowania światłem niebieskim na powierzchni ogniwa powinno wynosić 10 mW/cm2. Odległość między światłem a ogniwami może wymagać dostosowania w celu uzyskania natężenia promieniowania 10 mW/cm2 w zależności od intensywności źródła światła.
  3. Umieść 0, 0,5, 1 i 2 mM grupy leczenia ALA na czarnej powierzchni pod źródłem niebieskiego światła. Naświetlaj komórki niebieskim światłem przez 1 000 s (16 min i 40 s), uzyskując całkowitą fluencję 10 J/cm2. Po fotoaktywacji światłem niebieskim komórki są gotowe do analizy.

4. Zbieranie i barwienie

  1. Przygotować bufor przepływowy zgodnie z wytycznymi producenta (patrz tabela materiałów).
  2. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 2 ml PBS.
  3. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i pozwól komórkom oderwać się na około 3 do 5 minut. Komórki można badać pod mikroskopem, aby potwierdzić oderwanie komórek.
  4. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej (lub PBS) z 10% płodową surowicą bydlęcą, aby dezaktywować trypsynę.
  5. Zebrać zawiesinę komórek do oznakowanych probówek przepływowych o pojemności 5 ml.
  6. Wirować probówkę przepływową o pojemności 5 ml w wirówce o sile 201 x g przez 5 minut. Zasysać roztwór bez usuwania osadu komórkowego.
  7. Do każdej próbki dodać 200 μl buforu przepływowego ze sprzężonym przeciwciałem aneksyny-V (1 μl aneksyny-v na 39 μl buforu przepływowego).
  8. Zawiesić komórki i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 20 minut, aby umożliwić związanie aneksyny-V.
  9. Dodać 3 μl 7-AAD do każdej próbki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

5. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta cytometru przepływowego dotyczącymi konfiguracji (patrz tabela materiałów).
  2. Zbieraj i analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. 13
  3. Wykonaj statystyczne porównanie grup leczonych i kontrolnych przy użyciu analizy wariancji (ANOVA)14. Porównaj średnie z grup badanych ze średnią z grupy kontrolnej za pomocą testu Dunnetta do analizy post hoc.

Wyniki

Po inkubacji komórek SCC-13 przez 30 min z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA oraz napromieniowaniu niebieskim światłem przez 1000 s, zaobserwowano zależny od dawki wzrost apoptozy komórek. Całkowita apoptoza (średnia ± błąd standardowy średniej) wyniosła odpowiednio 3,94 ± 0,34, 7,90 ± 0,52, 23,86 ± 0,52 i 38,33 ± 1,81 po 30 min inkubacji z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA oraz 1000 sekundach naświetlania niebieskim światłem (Rycina 1). Średni procent komórek apoptotycznych w grupach inkubowanych z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA porównano za pomocą analizy ANOVA. Komórki traktowane 1 i 2 mM 5-ALA wykazały istotny wzrost apoptozy w porównaniu z komórkami traktowanymi 0 mM 5-ALA. Rycina 2A przedstawia reprezentatywne bramkowanie cytometryczne rozpraszania przedniego (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC) dla komórek SCC-13 inkubowanych z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA. Kołowa bramka obejmuje populację komórek SCC-13. W tym eksperymencie zebrano 7500 zdarzeń, a bramka populacji komórek SCC-13 uchwyciła co najmniej 90% zdarzeń. Rycina 2B przedstawia reprezentatywny wykres z 7-AAD na osi x oraz anneksyną-V na osi y. Populacje komórek zostały podzielone na cztery kwadranty (Q1 do Q4) w celu rozróżnienia komórek apoptotycznych. Q1 (wysoka zawartość anneksyny-V, niska zawartość 7-AAD) reprezentuje komórki we wczesnej fazie apoptozy. Q2 (wysoka zawartość anneksyny-V, wysoka zawartość 7-AAD) reprezentuje komórki w późnej fazie apoptozy lub martwicę. Q3 (niska zawartość anneksyny-V, wysoka zawartość 7-AAD) reprezentuje komórki przechodzące martwicę. Q4 (niska zawartość anneksyny-V, niska zawartość 7-AAD) reprezentuje komórki nieprzechodzące apoptozy ani martwicy. Aby obliczyć procent komórek przechodzących apoptozę, zsumowano procent komórek w Q1 i Q2. Niespójność czasu inkubacji z 5-ALA, temperatury inkubacji lub dawki promieniowania fotoaktywacyjnego może zmienić skuteczność PDT. Rycina 3 przedstawia reprezentatywny wykres cytometryczny anneksyny-V i 7-AAD przy zmiennej temperaturze inkubacji (tj. 27, 36 lub 42 °C). Zaobserwowano zależny od temperatury wzrost apoptozy.

Wykres słupkowy porównujący procent komórek apoptotycznych przy różnych stężeniach ALA; zaznaczono istotność statystyczną.
Rysunek 1: Zależny od dawki wzrost apoptozy po trzydziestominutowej inkubacji z 5-ALA. Inkubacja 5-ALA w temperaturze 36 °C przez trzydzieści minut, a następnie naświetlanie niebieskim światłem przez 1 000 s w komórkach SCC-13. Słupki przedstawiają średni procent komórek wykazujących pozytywną reakcję z anneksyną V w każdej grupie badawczej i kontrolnej. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych. Istotność statystyczną określono za pomocą analizy ANOVA, gdzie p <0,05 oznaczono gwiazdką (*). Słupki błędów reprezentują średnią ± błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy z cytometrii przepływowej; stężenie 5-ALA; analiza rozproszenia komórek i apoptozy; dane eksperymentalne.
Rycina 2: Reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej. (A) Reprezentatywne wykresy cytometrii rozproszenia przedniego vs. rozproszenia bocznego w jednostkach arbitralnych (AU) na osi x i y dla komórek inkubowanych z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA. W tym doświadczeniu zebrano 7500 zdarzeń, a bramka populacji komórek SCC-13 objęła 90% zdarzeń. (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej anneksyny-V vs. 7-AAD w AU na osi x i y dla komórek inkubowanych z 0, 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA. Q1: komórki w wczesnej fazie apoptozy, Q2: komórki w późnej fazie apoptozy/nekrotyczne, Q3: komórki nekrotyczne oraz Q4: komórki żywe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza apoptozy metodą cytometry lazyjnej; Annexin-V vs. 7-AAD, zmienność temperatury, wykresy rozrzutu.
Rysunek 3: Inkubacja 5-ALA w różnych temperaturach może zmieniać skuteczność PDT. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej annexin-V vs. 7-AAD w jednostkach AU na osi x i y dla komórek SCC-13 inkubowanych z 0,5 mM 5-ALA w temperaturach 27, 36 i 42 °C. Q1: komórki we wczesnej fazie apoptozy, Q2: komórki w późnej fazie apoptozy/nekrotyczne, Q3: komórki nekrotyczne i Q4: komórki żywe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nastąpił znaczny wzrost apoptozy SCC-13 po 30-minutowych inkubacjach 0,5, 1 i 2 mM 5-ALA, a następnie 1000 s niebieskiego światła. Wyniki te są zgodne z naszymi wcześniej opublikowanymi badaniami wykazującymi, że inkubacja 5-ALA trwająca 30 minut, po której następuje aktywacja światła niebieskiego, prowadzi do zależnego od dawki wzrostu odsetka komórek fibroblastów ulegających apoptozie12,14.

To eksperymentalne podejście do badania PDT ma zalety i ograniczenia. Opisane metody są zgodne z praktyką kliniczną, ponieważ zastosowano dostępny na rynku PS i źródło światła. Badacze mogą dostosować metody do różnych typów komórek, PS, źródeł światła i parametrów napromieniowania. Istnieją jednak ograniczenia tego podejścia, ponieważ protokół ten jest przeznaczony dla komórek adherentnych hodowanych w monowarstwie. W praktyce klinicznej różnice w architekturze tkanek lub patologii choroby (tj. nadmierne rogowacenie lub zwłóknienie) mogą zmniejszać wchłanianie PS lub penetrację światła15. W związku z tym dawki terapeutyczne i wyniki eksperymentu mogą nie odpowiadać bezpośrednio praktyce klinicznej. Modele guzów sferoidalnych i chip mikroprzepływowy były badane jako metody dokładniejszego replikowania mikrośrodowisk guza 16,17,18. Sferoidy mają wewnętrzne i zewnętrzne nisze komórkowe, które mogą w różny sposób zawierać fotosensybilizatory i reprezentować niejednorodną architekturę guza. Inni badacze wykorzystali chipy mikroprzepływowe do badań przesiewowych warunków leczenia i dostarczania naczyniowego fotouczulaczy. Jednak opracowanie chipów mikroprzepływowych może być kosztowne lub trudne do wdrożenia dla naukowców niezaznajomionych z tą techniką. Ponadto sferoidy i chipy mikroprzepływowe mogą nie odzwierciedlać klinicznego leczenia nowotworów skóry, w których fotouczulacze są bezpośrednio nakładane na powierzchnię guza bez rozsiewu naczyniowego. Naukowcy mogą być zmuszeni do oceny zalet i wad hodowli jednowarstwowej, sferoidalnych modeli guzów i chipów mikroprzepływowych do badania PDT w różnych systemach chorobowych. Ponieważ nie ma komórek odpornościowych ani macierzy zewnątrzkomórkowej, nie jest możliwe określenie, w jaki sposób PDT wpływa na złożone interakcje komórka-komórka. Naukowcy mogą być zmuszeni do potwierdzenia wyników eksperymentów in vitro z wykorzystaniem modeli zwierzęcych i badań klinicznych. Aby osiągnąć wysoką trafność między testami, ważne jest utrzymanie spójnych parametrów inkubacji i światła podczas wykonywania eksperymentów PDT in vitro.

Wiadomo, że temperatura zmienia skuteczność PDT19. Jedno z badań wykazało, że śmierć komórki, wychwyt 5-ALA, tworzenie PP-IX i uwalnianie cytokin mogą być wzmocnione przez inkubację komórek z 5-ALA w temperaturach do 44 °C19. Temperatury inkubacji powyżej 44 °C mogą prowadzić do indukowanej termicznie śmierci komórek, a temperatury inkubacji poniżej 20 °C mogą nie prowadzić do znaczącego wychwytu i akumulacji 5-ALA19. Zalecamy, aby naukowcy przeprowadzali inkubacje PS na bloku grzewczym o regulowanej temperaturze w stałej temperaturze, aby kontrolować potencjalnie zakłócające efekty termiczne. Dodatkowo ważne jest, aby inkubować fotouczulacz przez wystarczająco dużo czasu, aby umożliwić konwersję 5-ALA do PP-IX. W tym protokole komórki SCC-13 inkubowano z 5-ALA przez 30 minut, co skutecznie wywołało apoptozę komórek. Wcześniej wykazaliśmy, że 10-minutowa inkubacja 5-ALA nie zwiększyła znacząco apoptozy w fibroblastach w porównaniu z nieleczonymi fibroblastami kontrolnymi11,14. PP-IX zaczyna gromadzić się w skórze myszy po inkubacji 5-ALA przez sześć minut w temperaturze 37 °C. Dlatego po dziesięciu minutach inkubacji 5-ALA może nie być wystarczającej akumulacji PP-IX, aby indukować apoptozę komórek20. Zalecamy minimalny okres inkubacji 5-ALA wynoszący od 20 do 30 minut w oparciu o nasze poprzednie badania11,14. Naukowcy mogą być zmuszeni do optymalizacji okresu inkubacji w oparciu o warunki laboratoryjne, fotouczulacz, typ komórki i wskazania kliniczne. Eksperymenty z miareczkowaniem i optymalizacją przeciwciał można przeprowadzać w celu uzyskania najlepszych wyników zgodnie z wytycznymi producenta. Inne interesujące testy można przeprowadzić po fotoaktywacji światłem niebieskim, w tym cytometryczne oznaczanie ilościowe ROS metodą cytometrii przepływowej dihydroetydy. 14

Zmiana ilości światła dostarczanego na jednostkę powierzchni (tj. natężenie promieniowania) i całkowitej dawki promieniowania (tj. fluencja) podczas fazy fotoaktywacji może wpływać na tworzenie ROS i apoptozę komórek21. Zależność między płynnością, natężeniem promieniowania i czasem można opisać za pomocą następującego równania:

Fluencja (J/cm2) = Natężenie promieniowania (W/cm2) x czas (s)

Ponieważ płynność jest zależna od czasu, wydłużenie lub skrócenie faz fotoaktywacji może zmienić skuteczność leczenia. Natężenie promieniowania jest proporcjonalne do kwadratu odległości między źródłem światła a tkanką docelową. W rezultacie, jeśli światło jest zbyt daleko, może nie być wystarczającej ilości energii świetlnej dostarczonej do docelowej tkanki, aby wzbudzić PS. Alternatywnie, natężenie promieniowania może być zwiększone przez światło odbijające się od otaczających powierzchni. Dlatego zalecamy wykonywanie naświetlania światłem za pomocą płytek do hodowli komórkowych umieszczonych na czarnej powierzchni, aby zapobiec odbiciu światła. Naukowcy mogą nabywać komercyjnie dostępne lub zatwierdzone przez FDA niebieskie diody elektroluminescencyjne i urządzenia fluorescencyjne do wykorzystania w eksperymentach PDT, ale urządzenia te mogą mieć różną moc wyjściową i jednorodność pola świetlnego. Fotometr specyficzny dla długości fali powinien być używany do pomiaru natężenia promieniowania na powierzchni komórki i jednorodności pola świetlnego przed każdym eksperymentem, aby uzyskać spójne wyniki. W razie potrzeby można zastosować dostępny na rynku dyfuzor w celu zwiększenia jednorodności pola.

Podsumowując, opisaliśmy podejście in vitro do badania PDT, szczegółowo opisując teorię, metody eksperymentalne, ograniczenia, potencjalne pułapki i zalecenia dotyczące optymalizacji. PDT jest użyteczną procedurą kliniczną, a badania in vitro mogą pozwolić na opracowanie nowych PS, optymalizację protokołów i nowe wskazania do PDT.

Oświadczenia

Firma DUSA/Sun Pharmaceutical dostarczyła urządzenie 5-ALA i BLU-U Light. Manuskrypt ten został wsparty przez szczątkowe fundusze dr Jagdeo. Treść nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy Thermofisher17005042Pożywka hodowlana dla komórek SSC-13
DMEM o niskiej zawartości glukozy glutamaxThermofisher10567022Możliwe podłoże hodowlane dla innych typów komórek
6-dołkowe płytki hodowlaneThermofisher720083
PBSThermofisher14190250
0,25% Trypsyna-EDTAThermofisher25200056
Trypan Niebieski roztwór, 0,4%Thermofisher15250061Do liczenia i powlekania komórek 
Światło BLU-U DUSAZapytanie producentaMożna stosować inne niebieskie światła LED, fluorescencyjne lub halogenowe 
5-ALADUSAZapytanie od producenta
FBSAtlanta BiologicalsC17032
FlowCellect Annexin Red KitMillipore Sigma FCCH100108 Jodek propidyny może zastąpić 7-AAD. W zestawie z aneksyną-V, 7-AAD i buforem przepływu
FACSCanto IIBDZapytanie producentaMożna użyć dowolnego cytometru przepływowego 
Komora liczącaHausser3120Do liczenia i galwanizacji komórek 
FlowJoFlowJo Żądanie producentaOprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej

Bibliografia

  1. Morton, C., et al. European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy. European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).
  2. Ozog, D. M., et al. Photodynamic therapy: A clinical consensus guide. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).
  3. Abrahamse, H., Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
  4. Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).
  5. Ohgari, Y., et al. Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin. Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).
  6. Kessel, D., Luo, Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).
  7. Goldberg, D. J. Photodynamic therapy in skin rejuvenation. Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).
  8. Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).
  9. Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).
  10. Allison, R. R., Moghissi, K. Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).
  11. Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).
  12. Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro. Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).
  13. JoVE Science Education Database. Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling. JoVE. , Cambridge, MA. (2018).
  14. Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts. British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).
  15. Gilaberte, Y., et al. Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy. Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).
  16. Yoon, H. K., et al. Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device. Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).
  17. Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures. Scientific Reports. 5, 12175(2015).
  18. Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. Low-dose PDT on breast cancer spheroids. Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).
  19. Yang, J., et al. The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).
  20. Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).
  21. Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inkubacja fotouczulaczemna wietlanie wiat em niebieskimanaliza cytometrycznabarwienie aneksyn Vdetekcja 7 AADtraktowanie 5 ALApomiar apoptozy kom rekPDT in vitrorakowo ci kom rkowek
Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.