Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Streszczenie

Demonstracja inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI) w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) zwiastuje nową erę w leczeniu raka. Jednak niewielka populacja komórek nie reaguje na leczenie Tki, co skutkuje minimalną chorobą resztkową (MRD); nawet najsilniejsze TKI nie są w stanie wyeliminować tych komórek. Te komórki MRD służą jako rezerwuar do rozwoju oporności na terapię. Nie wiadomo, dlaczego leczenie TKI jest nieskuteczne w przypadku komórek MRD. Sygnalizacja czynnika wzrostu jest zaangażowana we wspieranie przeżycia komórek MRD podczas leczenia Tki, ale brakuje zrozumienia mechanistycznego. Ostatnie badania wykazały, że podwyższona ekspresja c-Fos i Dusp1 w wyniku zbieżnej sygnalizacji onkogennej i czynnika wzrostu w komórkach MRD pośredniczy w oporności na TTKI. Genetyczne i chemiczne hamowanie c-Fos i Dusp1 sprawia, że CML jest wyjątkowo wrażliwy na TKI i leczy CML zarówno w genetycznych, jak i humanizowanych modelach mysich. Zidentyfikowaliśmy te docelowe geny za pomocą wielu mikromacierzy z komórek wrażliwych i opornych na TKI. W tym miejscu przedstawiamy metody walidacji celu przy użyciu mysich modeli in vitro i in vivo. Metody te można łatwo zastosować do dowolnego celu w celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Wprowadzenie

Konstytutywna aktywność kinazy tyrozynowej onkogenu fuzji BCR-ABL1 powoduje CML, co stanowi uzasadnienie dla celowania w aktywność kinazy przez inhibitory małych cząsteczek. Sukces TKI w leczeniu pacjentów z CML zrewolucjonizował koncepcję terapii celowanej^1,2. Następnie terapia antykinazowa jako medycyna precyzyjna została opracowana dla kilku innych nowotworów złośliwych, w tym guzów litych. Do tej pory ponad trzydzieści inhibitorów kinaz zostało zatwierdzonych przez amerykańską FDA do leczenia różnych nowotworów złośliwych. Chociaż leczenie TKI jest bardzo skuteczne w tłumieniu choroby, nie jest wyleczalne. Poza tym podczas leczenia utrzymuje się niewielka populacja komórek nowotworowych: MRD^3,4,5. Nawet pacjenci, którzy wykazali całkowitą remisję, pozostają z MRD, które ostatecznie prowadzi do nawrotu, jeśli nie jest stale tłumione. Dlatego eliminacja komórek MRD jest konieczna, aby osiągnąć trwałą lub leczniczą odpowiedź. CML stanowi cenny paradygmat do definiowania koncepcji medycyny precyzyjnej, mechanizmów onkogenezy, racjonalnych terapii ukierunkowanych na cel, progresji choroby i oporności na leki. Jednak nawet dzisiaj mechanizm napędzający śmierć komórek indukowaną przez TKI w komórkach nowotworowych nie jest w pełni zrozumiały, ani dlaczego komórki MRD (składające się z białaczkowych komórek macierzystych [LSC]) są wewnętrznie odporne na TKIs^4,6. Niemniej jednak zjawisko "uzależnienia onkogenu" od zmutowanej onkoproteiny kinazy jest związane ze skutecznością TTKI, gdzie ostre hamowanie docelowego onkogenu przez TKI powoduje wstrząs onkogenny, który prowadzi do masywnej odpowiedzi proapoptotycznej lub spoczynku w sposób zależny od kontekstu komórki^6,7,8,9. Brakuje jednak mechanistycznych podstaw zależności onkogenowej. Ostatnie badania sugerują, że sygnalizacja czynnika wzrostu znosi zależność od onkogenu, a w konsekwencji nadaje oporność na terapię TKI ^10,11,12. Dlatego, aby uzyskać wgląd w mechanizm uzależnienia od onkogenów, przeprowadziliśmy profilowanie ekspresji całego genomu z komórek uzależnionych i nieuzależnionych BCR-ABL1 (hodowanych z czynnikami wzrostu), które ujawniły, że c-Fos i Dusp1 są krytycznymi mediatorami uzależnienia od onkogenu¹³. Genetyczna delecja c-Fos i Dusp1 jest syntetycznie śmiertelna dla komórek wykazujących ekspresję BCR-ABL1, a myszy użyte w eksperymencie nie rozwinęły białaczki. Co więcej, hamowanie c-Fos i DUSP1 przez inhibitory małocząsteczkowe wyleczyło CML indukowaną przez BCR-ABL1 u myszy. Wyniki pokazują, że poziomy ekspresji c-Fos i Dusp1 definiują próg apoptozy w komórkach nowotworowych, tak że niższe poziomy nadają wrażliwość na lek, podczas gdy wyższe poziomy powodują oporność na terapię¹³.

Aby zidentyfikować geny napędzające uzależnienie od onkogenu, przeprowadziliśmy kilka eksperymentów profilowania ekspresji całego genomu w obecności czynnika wzrostu i TKI (imatynibu) przy użyciu zarówno myszy, jak i komórek pochodzących od pacjentów z CML (K562). Dane te analizowano równolegle z zestawami danych pacjentów z CML uzyskanymi z hematopoetycznych komórek macierzystych CD34⁺ przed i po leczeniu imatynibem. Analiza ta ujawniła trzy geny (czynnik transkrypcyjny [c-Fos], fosfatazę o podwójnej swoistości 1 [Dusp1] i białko wiążące RNA [Zfp36]), które są zwykle regulowane w górę w komórkach opornych na TKI. Aby potwierdzić znaczenie tych genów w nadawaniu oporności na leki, przeprowadziliśmy krok po kroku analizę in vitro i in vivo. Poziomy ekspresji tych genów zostały potwierdzone za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) i western blotting w komórkach opornych na leki. Co więcej, nadekspresja cDNA i knockdown przez spinki do włosów shRNA c-Fos, Dusp1 i Zfp36 ujawniły, że podwyższone ekspresje c-Fos i Dusp1 są wystarczające i konieczne do nadania oporności na TTKI. W związku z tym przeprowadziliśmy walidację in vivo przy użyciu modeli mysich tylko z c-Fos i Dusp1. W celu walidacji genetycznej c-Fos i Dusp1 stworzyliśmy myszy c-Fos^fl/fl indukowane przez ROSACreERT (warunkowy nokaut)^{14 i skrzyżowaliśmy} je z Dusp1^-/- (prosty nokaut)¹⁵, aby stworzyć myszy podwójnie transgeniczne ROSACreERT2-c-Fos^fl/flDusp1^-/-. Komórki c-Kit ⁺ pochodzące ze szpiku kostnego (z c-Fos^{fl / fl}-, Dusp1^-/-- i c-Fos^{fl / fl}Dusp1^-/-) wykazujące ekspresję BCR-ABL1 analizowano in vitro w teście jednostki tworzącej kolonię (CFU) oraz in vivo przez przeszczep szpiku kostnego u śmiertelnie napromieniowanych myszy, w celu zbadania zapotrzebowania na c-Fos i Dusp1 samodzielnie lub razem w rozwoju białaczki. Podobnie, chemiczne hamowanie c-Fos przez DFC (difluorowana kurkumina) ¹⁶ i Dusp1 przez BCI (benzylideno-3-(cykloheksyloamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on)¹⁷ testowano in vitro i in vivo przy użyciu ekspresji BCR-ABL1, pochodzących ze szpiku kostnego komórek c-Kit⁺ myszy typu dzikiego (WT). Aby potwierdzić wymóg c-Fos i Dusp1 w białaczkowych komórkach macierzystych, wykorzystaliśmy mysi model CML, w którym BCR-ABL1 był specyficznie indukowany w komórkach macierzystych przez doksycyklinę (transaktywator Tet ulega ekspresji w regulacji wzmacniacza genu 3' mysiej białaczki macierzystej (SCL))^18,19. Użyliśmy komórek ^{Lin-Sca +} c-Kit ⁺ (LSK) szpiku kostnego od tych myszy w teście przeszczepu in vivo. Ponadto ustaliliśmy poziomy phopsho-p38 i ekspresję IL-6 jako biomarkery farmakodynamiczne dla hamowania Dusp1 i c-Fos, odpowiednio, in vivo. Wreszcie, aby rozszerzyć badanie pod kątem znaczenia dla ludzi, komórki CD34 ⁺ pochodzące od pacjentów (odpowiednik komórek c-Kit ⁺ od myszy) poddano długoterminowym testom komórkowym inicjującym hodowlę in vitro (LTCIC) oraz humanizowanemu mysiemu modelowi in vivo CML^20,21. Myszom z niedoborem odporności przeszczepiono komórki CML CD34 +, a następnie leczono farmakologicznie i analizowano przeżywalność ludzkich komórek białaczkowych.

W tym projekcie rozwijamy metody identyfikacji i walidacji celów przy użyciu narzędzi genetycznych i chemicznych, korzystając z różnych modeli przedklinicznych. Metody te mogą być z powodzeniem stosowane do walidacji innych celów, w których opracowywane są modalności chemiczne do rozwoju terapeutycznego.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati (CCHMC). Próbki ludzkie (normalny BM i białaczka CML (p210-BCR-ABL+)) uzyskano za pomocą protokołów zatwierdzonych przez Institutional Review Board (Institutional Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) i zgody świadomej dawcy z CCHMC i University of Cincinnati.

1. Analiza qPCR w czasie rzeczywistym

1. Wyizoluj całkowite RNA z komórek BaF3 rosnących w RPMI, uzupełnionych 10% FBS i 10% zużytej pożywki hodowlanej WEHI jako źródło interleukiny-3 (IL-3).
2. Pobrać komórki w fazie logarytmicznej (99% żywych) z próbek poddanych działaniu substancji (IL-3 i imatynib) oraz z próbek niepoddanych działaniu substancji i odwirować je przy 435 x g przez 3 minuty. Zdrowie i etapy wzrostu komórek mają kluczowe znaczenie, ponieważ ich profile ekspresji genów mogą się radykalnie zmieniać.
3. Wyizoluj RNA, oczyszczając całkowity RNA²². Określ ilościowo całkowity RNA; następnie poddaj go działaniu DNazy²³. Przekształć równe ilości RNA wolnego od DNA (2 μg) w cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy²⁴.
4. Wykonaj qPCR ze starterami specyficznymi dla genu (Tabela 1). Przeprowadzić PCR w reakcjach 20 μl w 0,2 ml, cienkościennych probówkach PCR z czapeczkami optycznymi, używając 1x mieszaniny polimeraz (patrz tabela materiałów), 0,5 μM każdego startera, 1 μl DNA i wody. Umieścić reakcję w termocyklerze w następującym cyklu: Etap 1, 95 °C przez 10 minut; Stopień 2, 95 °C przez 15 s; Etap 3 w temperaturze 60 °C przez 1 min; Krok 4, powtórz kroki 2–3 40 razy. Wykonaj wszystkie PCR w trzech powtórzeniach i znormalizuj dane w czasie rzeczywistym do wyrażenia β-aktyny przed wykreśleniem.

2. Western Blotting (Zachodnia Blotting)

UWAGA: Ekstrakty z całych komórek zostały przygotowane przez dodanie 250 μL 1x buforu do lizy, jak opisano w Kesarwani et al.¹³ uzupełnione koktajlem inhibitorów proteazy i koktajlem inhibitorów fosfatazy 2.

1. Pobrać pięć milionów komórek BaF3 w fazie logarytmicznej (99% żywych) z komórek BaF3 poddanych działaniu substancji (IL-3 i imatynib), jak również z niepoddanych działaniu substancji komórek BaF3 przez wirowanie w temperaturze 435 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Poddać lizie komórki w buforze do lizy (250 μl), pipetując w górę i w dół 1x, a następnie przez 5 minut inkubację w temperaturze 80 °C. Sonikować lizat, aby rozbić całe DNA za pomocą 5-6 impulsów 5 s każdy w chłodni w temperaturze 4 °C.
2. Przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj go przy 16 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelki nierozpuszczalny materiał. Ekstrakt można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Przed załadowaniem próbki należy podgrzewać do temperatury 80 °C przez 5 minut w bloku grzewczym. Załadować 10 μl próbki za pomocą końcówki ładującej żel na 10% żel SDS-PAGE.
3. Rozpuścić białka pod napięciem 150 V, aż barwnik wzorcowy dotrze do dna żelu. Przenieść białko do membran nitrocelulozowych przez transfer elektroforetyczny przy 1 amperze przez 1 godzinę. Po przeniesieniu zablokuj błony w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris + 0,1% Tween 20 (TBST) z 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 godzinę i sonduj przez noc w temperaturze 4 °C z odpowiednimi przeciwciałami w rozcieńczeniu 1:1,000.
4. Przemyć membrany 3 do 5 razy TBST przez 10 minut każda, a następnie sondować odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (rozcieńczenie 1:5 000) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Ilość użytego TBST zależy od wielkości pojemnika. Upewnij się, że membrana jest całkowicie zanurzona w TBST. Przemyj przeciwciało drugorzędowe 3x przez 5 minut za pomocą TBST.
5. Rozwinąć blot za pomocą odczynnika do substratu chemiluminescencyjnego. Wymieszaj równe objętości substratu i buforu z dwóch butelek, tuż przed użyciem. Dodać substrat do górnej części membrany, aby pokryć całą membranę pipetą o pojemności 1 ml i inkubować przez 1 minutę. Skrzepy należy zobrazować w ciągu 1–10 minut od dodania substratu.
6. Za pomocą kleszczyków ostrożnie umieść membranę na platformie systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów), unikając dużej ilości płynu. Wybierz podgląd na żywo i wybierz z menu bloty i chemiluminiscencję. Korzystając z ręcznej akwizycji, uzyskaj wiele ekspozycji w różnych punktach czasowych. Pliki te można wizualizować i określać ilościowo za pomocą oprogramowania do obrazowania.

3. Generacja myszy Knockout

1. Skrzyżowanie myszy ^{c-Fos fl/fl} z myszami ROSACreERT2 w celu wygenerowania myszy ROSACreERT2c-Fos^fl/fl mice¹³. Aby stworzyć myszy z podwójnym nokautem (KO), wyhoduj myszy ROSACreERT2c-Fos^fl/fl z myszami ^Dusp1-/-, aby wygenerować myszy ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^-/- mice¹³. Genotyp myszy za pomocą klipsów ogonowych, a następnie PCR, jak opisano poniżej.
2. Genotypowanie:
   1. Aby przygotować DNA, przytnij niewielką część ogona nożyczkami i włóż ją do probówki o pojemności 1,5 ml. Kauteryzuj ogon rozgrzanymi nożyczkami. Dodać 200 μl 50 mM NaOH do obciętego ogonka w probówce i inkubować w temperaturze 95 °C w bloku grzewczym przez 1 godzinę.
   2. Dobrze zwirować probówkę, a następnie zneutralizować, dodając 50 μl 1 M Tris HCl o pH 6,8 i ponownie przetoczyć wir. Odwirować probówkę z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
   3. Przeprowadzić PCR w 20 μl reakcji w 0,2 ml, cienkościennych probówkach PCR przy użyciu 1x Taq mastermix polimerazy zawierającej barwnik, 0,5 μM każdego startera, 1 μL DNA i wody. Umieść probówki w termocyklerze i uruchom odpowiednie cykle, jak pokazano w Tabeli 2.
   4. Uruchom produkt PCR na 2% żelu agarozowym i zobrazuj za pomocą systemu dokumentacji żelu.

4. Izolacja komórek c-Kit⁺ ze szpiku kostnego

1. Złóż myszy w ofierze zgodnie z wytycznymi instytucji.
   nuta: W tym przypadku myszy były wystawione na działanie dwutlenku węgla (CO₂ ) w tempie zgodnym z zalecanym przez AVMA, dopóki śmierć nie została określona przez zaprzestanie oddychania i bicia serca, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
2. Zbierzkości nóg myszy - dwie kości udowe, dwie piszczele, dwa biodrowe. Oczyść wszystkie tkanki z kości, zeskrobując je skalpelem. Umieść kości nóg w zimnym 1x PBS na lodzie — 5 ml w probówce 15 ml. Wlej zawartość probówki do moździerza i zmiażdż ją tłuczkiem.
3. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do probówki z nakrętką o pojemności 50 ml z dołączoną pipetą o pojemności 10 ml za pomocą pipety. Umyj moździerz i tłuczek wiele razy zimnym 1x PBS, zbierając i dodając zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 ml. Wirować szpik kostny w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą podciśnienia z dołączoną szklaną pipetą. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml 1x PBS za pomocą pipety.
4. Za pomocą pipety powoli dodaj zawieszony szpik kostny do wierzchu 5 ml polisarozy o temperaturze pokojowej (temperatura jest krytyczna), uważając, aby nie naruszyć interfejsu. Wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu.
5. Zebrać mętną powierzchnię styku całkowitej komórki jednojądrowej (TMNC) za pomocą pipety i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 15 ml. Zwiększyć objętość do 10 ml za pomocą 1x PBS do prania, biorąc 20 μl do liczenia i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad na lodzie do kroku 4.6.1.
6. Wykonaj izolację komórek c-Kit⁺.
   1. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu mikrokulek do izolacji komórek c-Kit⁺. Zawiesić osad komórkowy w 80 μl 1x PBS + EDTA + BSA do 10⁷ komórek. Do zawiesiny komórek dodać 20 μl mikrokulek CD117 / 10⁷ komórek ogółem. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Doprowadzić objętość do 10 ml dodając 1x PBS + EDTA + BSA i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
   2. Usunąć supernatant za pomocą próżni i zawiesić osad komórek w 500 μl / 10 łącznie⁸ komórek w 1x PBS + EDTA + BSA. Za pomocą stojaka magnetycznego z dołączoną kolumną magnetyczną dodaj 3 ml 1x PBS + EDTA + BSA i pozwól mu przepłynąć grawitacyjnie do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml.
   3. Gdy pierwszy dodatek buforu zakończy przechodzenie przez kolumnę, dodaj zawiesinę komórek do kolumny, umożliwiając jej przepływ grawitacyjny do probówki zbiorczej o pojemności 15 ml. Ten przepływ jest niepożądaną frakcją komórkową.
   4. Przemyć kolumnę 3 razy 3 ml 1x PBS + EDTA + BSA za każdym razem, pozwalając jej przepływać grawitacyjnie do probówki zbiorczej. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją na górze probówki o pojemności 15 ml.
   5. Dodać 5 ml 1x PBS + EDTA + BSA i natychmiast przepłukać je tłokiem dostarczonym z kolumną. Zdjąć tłok i powtórzyć płukanie z dodatkowymi 5 ml 1x PBS + EDTA + BSA. Policz komórki w całkowitej objętości przy użyciu standardowych metod.
   6. Wirować komórki w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pełnym IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/ml] + mSCF [50 ng/ml] + ligand FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/ml]) do hodowli. Hodować te komórki przez noc w 2 x 10 6 komórek/1 ml kompletnej pożywki komórkowej IMDM, umieszczając je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

5. Transdukcja

1. Transfekcja plazmidu retrowirusowego
   1. Świeżo rozmrożone komórki HEK293 poprzedniego popołudnia w łaźni wodnej nastawionej na 37 °C. Wirować krioprobówkę zawierającą komórki HEK pod ciśnieniem 435 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą próżni i zawiesić osad komórkowy w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS, penicyliną, streptomycyną i glutaminą.
   2. Policz komórki i dodaj odpowiednią objętość do naczynia poddanego działaniu 10 cm (~4 x 10⁶ HEK293T komórek). Dodaj 14 ml pożywki DMEM 10 do naczynia i dobrze wymieszaj, przesuwając w górę iw dół, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie. Umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 na} noc.
   3. Następnego ranka sprawdź zbieganie się komórek pod mikroskopem odwróconego światła (50% lub więcej działa dobrze).
   4. Połączyć DNA (pożądany plazmid retrowirusowy), PclEco (plazmid pakujący), 2 M CaCl₂ i H₂0 w probówce o pojemności 1,5 ml (= 500 μl) za pomocą mikropipety w następujących ilościach: 7,5 μg DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 μg pCLeco, 62 μL 2 M CaCl₂ i wodę do końcowej objętości 500 μL. Dodaj 500 μL 2x HBS do kolejnej probówki 1,5 ml. Dodaj 500 μL 2x HBS do kolejnej probówki 1,5 mL.
   5. Dodaj mieszaninę DNA kroplami do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES i 1,5 mM Na₂HPO₄) podczas mieszania. Osiągnij to, ustawiając wir na najniższą prędkość i przytrzymując na nim rurkę HBS w celu ciągłego mieszania podczas dodawania mieszanki transfekcyjnej.
   6. Pozostaw mieszankę transfekcji do inkubacji przez 20–30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji dodać 25 nM chlorochiny do komórek HEK i umieścić je z powrotem w inkubatorze. Po inkubacji dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek HEK, a następnie delikatnie zamieszać pożywkę, aby wymieszać mieszankę transfekcyjną na całej płytce.
   7. Inkubować komórki z mieszanką przez ~8 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Zmień pożywkę na tych komórkach, bardzo powoli dodając 14 ml świeżej pożywki DMEM 10. Powolne dociskanie do ścianki naczynia pomaga zapobiec usuwaniu komórek HEK. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
   8. Zebrać supernatant wirusa za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, pobrać supernatant do strzykawki i założyć filtr strzykawkowy 0,45 μm. Zanurz wirusowy supernatant w nowej probówce do pobrania. Weź pierwszy zbiór wirusowego supernatantu ~16 godzin później.
2. Koncentracja i transdukcja wirusa fibronektyny
   1. Dodaj 2 ml rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny o stężeniu 0,1 mg w 1x PBS do nieleczonych 6-dołkowych płytek hodowlanych. Przygotuj tyle fibronektyny, ile potrzeba, w zależności od liczby komórek i genotypów. Jedna studnia może wystarczająco wydusić 10 milionów komórek c-Kit⁺. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 4 °C.
   2. Następnego dnia wyjmij fibronektynę z dołków za pomocą pipety, odpipetuj 2 ml sterylnego 2% BSA w 1x PBS, aby zablokować płytkę, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij BSA za pomocą odkurzacza i dokładnie umyj, pipetując 2 ml 1x PBS, a następnie wyjmij go za pomocą próżni
   .
   3. Natychmiast dodać świeżo zebrany i przefiltrowany (przy 0,45 μm) supernatant wirusowy do 5 ml. Wirować przy 435 x g w temperaturze 32 °C przez 2 godziny. Usunąć supernatant za pomocą próżni i powtórzyć ten krok z dodatkowym świeżo zebranym supernatantem wirusowym i ponownie odwirować. Usunąć supernatant za pomocą próżni i umyć studzienki, dodając 2 ml 1x PBS; Następnie usuń go za pomocą odkurzacza.
   4. Dodaj komórki myszy c-Kit⁺, które były hodowane przez noc (krok 4.6.6) do studzienek pokrytych wirusem, dobrze mieszając zawiesiny komórek i pipetując je do teraz wirusowej skoncentrowanej płytki fibronektyny. Wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 25 °C przez 90 min. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
   5. 48 godzin po transdukcji, osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i ponownie zawiesić je w buforze FACS #1 (1x PBS + 0,5% BSA) do 6 x 10⁶/ml. Określ procent komórek dodatnich BCR-ABL1, mierząc procent dodatnich komórek YFP za pomocą cytometrii przepływowej.
   6. Pobieranie zdarzeń za pomocą standardowej procedury. Najpierw bramkuj żywe komórki na podstawie rozproszenia do przodu i z boku. Następnie przebramuj żywe komórki YFP dodatnie, z wyłączeniem komórek ujemnych YFP określonych przez kontrolę negatywną (Rysunek 4).

6. Testy jednostek tworzących kolonie

1. Rozmrażać metylocelulozę z cytokinami dla myszy w temperaturze pokojowej przez 1–2 godziny. Podacz 3 ml metylocelulozy w probówce FACS za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml bez igły. Posortuj komórki z dodatnim wynikiem YFP w sortowniku komórek.
2. Zakręć ogniwami w dół i zawieś osad w kompletnym nośniku IMDM. Policz komórki do posiewu i rozcieńcz je, aby uzyskać 5,000 komórek YFP-dodatnich w 100 μl kompletnej pożywki IMDM.
3. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej zawierającej 5 000 komórek YFP-dodatnich i odpowiednich inhibitorów do 3 ml metylocelulozy (patrz tabela materiałów). Wiruj na haju, aby mieszać przez 10–30 sekund.
4. Po ucieczce większości pęcherzyków powietrza użyj strzykawki o pojemności 1 ml do podania 1 ml podłoża na trzech powtórzonych płytkach o średnicy 3 cm, wyrzucając pożywkę z jednej strony i powoli przechylając płytkę ruchami okrężnymi, aby równomiernie się rozprowadzić.
5. Końcowe stężenie stosowanych inhibitorów to imatynib w stężeniu 3 μM, DFC w stężeniu 0,2 μM i BCI w stężeniu 0,5 μM, pojedynczo lub w skojarzeniach. Tam, gdzie jest to właściwe, usunąć c-Fos poprzez posiew komórek z 4-hydroksytamoksyfenem (1 μg/ml) dodanym do metylocelulozy.
6. Po posianiu umieść płytki na dużej szalce Petriego z jednym otwartym naczyniem zawierającym 2 ml sterylnej wody pośrodku. Przykryć dużą szalkę Petriego i ostrożnie inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Zapisz liczbę kolonii po tygodniu posiewu, licząc całkowitą liczbę kolonii pod mikroskopem.
7. Przeanalizuj kilka kolonii z odpowiednich płytek pod kątem delecji c-Fos metodą PCR. Zbierz kolonie, ssąc je końcówką P1000. Usuń komórki w 500 μl 1x PBS, wielokrotnie myjąc końcówkę w PBS. Wiruj zawiesiny komórek w temperaturze 6 000 x g przez 1 minutę i wyekstrahuj DNA z osadu komórkowego za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA.
8. Genomowe DNA należy wykorzystać do PCR przy użyciu starterów mFos-FP3 i mFos-RP5, jak opisano w Tabeli 2. Przeanalizuj produkty PCR na 2% żelu agarozowym i zobrazuj za pomocą systemu dokumentacji żelu.
9. Aby uzyskać graficzną prezentację kolonii, zabarwić je za pomocą chlorku jodonitrotetrazoliowego. Rozpuścić 10 mg chlorku jodonitrotetrazolu w 10 ml wody, aby otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Filtr wysterylizować roztwór za pomocą śluzki Luer z filtrem 0,2 μm podłączonym do strzykawki o pojemności 10 ml w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowych.
10. Do okapu do hodowli tkankowej dodać kroplami 100 μl roztworu barwiącego wokół płytki CFU; należy uważać, aby nie przesunąć ani nie naruszyć kolonii. Inkubować płytki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Kolonie zmienią kolor na ciemnoczerwono-brązowy. Używając białego tła w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej, zrób zdjęcia poplamionej płytki CFU.

7. Test transplantacji i śmiertelności

1. Śmiertelnie napromieniować myszy podzielonym promieniowaniem za pomocą promieniowania gamma opartego na 137 Cs w dawce 7,0 Gy, a następnie 4,75 Gy (0,5 Gy / min), w odstępie 3 godzin przed przeszczepem.
2. Przeszczep 4 x 10⁴ niesortowane komórki YFP-dodatnie (obliczone na podstawie procentu YFP) z 3 x 10⁵ normalnymi komórkami szpiku kostnego jako nośnikiem do każdej myszy poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej.
3. Po tygodniu od przeszczepu należy określić wszczepienie, analizując komórki YFP-dodatnie z krwi obwodowej za pomocą FACS.
4. Wykonaj analizę krwawienia z żył ogonowych i FACS.
   1. Ogrzej klatkę myszy pod lampą grzewczą, uważając, aby ich nie przegrzać ani nie spalić.
   2. Unieruchomić mysz w unieruchomieniu myszy i naciąć żyłę ogonową sterylnym ostrzem. Delikatnie wydoić ogon od przodu do tyłu, pozwalając na zgromadzenie się kropli krwi. Pobrać krew za pomocą heparynizowanej rurki kapilarnej, aż do jej napełnienia (zebrać około 75 - 100 μl). Zanurz krew z napełnionej rurki kapilarnej w probówce do pobierania krwi zawierającej EDTA i dobrze wymieszaj.
   3. Lizuj erytrocyty, dodając 30-40 μl krwi do 3 ml 1x buforu do lizy RBC (150 mM chlorku amonu, 10 mM wodorowęglanu potasu i 0,13 mM EDTA). Dobrze wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10–15 minut. Wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą próżni i zawiesić osad w 2 ml 1x PBS do przemycia.
   4. Wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i zawiesić go w buforze FACS #1. Przeprowadź analizę FACS zgodnie z powyższym opisem w kroku 5.2.5–5.2.66. Pozostałą krew należy przechowywać krótkotrwale w temperaturze 4 °C, która może być wykorzystana do różnych innych celów.
5. Do eksperymentu wykorzystano przeszczepione myszy, które wykazywały 10-40% komórek YFP-dodatnich we krwi obwodowej. Myszy, które miały mniej niż 2% komórek YFP-dodatnich, zostały wykluczone z badania.
6. Przygotować tamoksyfen w stężeniu 20 mg/ml w oleju kukurydzianym w temperaturze 60 °C z przerywanym wirowaniem aż do całkowitego rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez cały czas trwania zabiegu. Po tygodniu od przeszczepu należy usunąć allel c-Fos^fl/fl, wstrzykując tamoksyfen (100 mg/kg w oleju kukurydzianym) dootrzewnowo (i.p.) myszom, codziennie przez trzy kolejne dni. Ważne jest, aby myszy zostały zważone w celu określenia, ile tamoksyfenu należy wstrzyknąć. Po leczeniu tamoksyfenem (w stosownych przypadkach) należy pogrupować myszy do leczenia farmakologicznego (n = 5 na grupę).
7. Monitoruj myszy pod kątem progresji i przeżycia białaczki oraz określ obciążenie białaczką (komórki YFP dodatnie przez FACS) co tydzień do ośmiu tygodni u myszy, które przeżyły.
8. W stosownych przypadkach należy przeanalizować krew pod kątem delecji c-Fos, jak opisano powyżej w punkcie 6. Rejestruj liczbę myszy, które przeżyły każdego dnia i narysuj krzywą przeżycia na końcu eksperymentu za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.

8. Model białaczki BCR-ABL1 u myszy transgenicznych

1. Izolacja LSK
   1. Utrzymuj transgeniczne myszy Scl-tTA na karmie doksycyklinowej, aby zapobiec ekspresji BCR-ABL1. Cztery tygodnie przed przeszczepem należy odłączyć myszy od doksycykliny w celu ekspresji BCR-ABL1.
   2. Wyizoluj TMNC od myszy transgenicznych Scl-tTA, jak opisano powyżej w sekcji 4. Zawieś TMNC w buforze FACS #2 (1x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA), aby uzyskać 10⁶ komórek/ml.
   3. Zuboż TMNC dla komórek dodatnich pod względem linii, dodając 10 μl biotyny koktajlowej do wykrywania komórek liniowych (przeciwciała monoklonalne sprzężone z biotyną przeciwko CD5 [szczurza IgG2a], CD11b [szczurza IgG2a], CD45R [B220] [szczurza IgG2a], Anti-7-4 [szczurza IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G / C, szczurza IgG2a] i Anti-Ter-119 [szczurza IgG2b]) na 1 x 10⁶ komórek. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 10 minut w ciemności, a następnie przemyć 5 ml buforu FACS #2 i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Całkowicie odessać supernatant i zawiesić komórki w 400 μl buforu FACS #2.
   4. Dodać 5 μl koniugatu przeciwciała antybiotyny-FITC, 1,2 μl Ly-6A/E (Sca1)PECy7 i 2,4 μl przeciwciał APC CD117 (c-Kit) dla maksymalnie^10,8 miliona komórek. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przemyć, zwiększając objętość do 5 ml za pomocą buforu FACS #2; następnie odwirować przy 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i zawiesić osad komórek w 500 μl buforu FACS #2.
   5. Przefiltruj zawiesinę komórek do niebieskiej probówki FACS z nasadką filtrującą.
   6. Bramka na żywo komórki za pomocą rozproszenia do przodu i z boku. Następnie wybierz komórki lin^-, które wykazały MFI (średnia intensywność fluorescencji mniejsza niż 10²), aby uzyskać komórki LSK c-Kit⁺ i Sca1⁺ na wykresie dwuwykładniczym od rodzica Lin^- i posortuj je (Rysunek 7C).
   7. Zebrać posortowane komórki i odwirować je w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
2. transplantacja
   1. Myszy BoyJ należy śmiertelnie napromieniować podzieloną dawką promieniowania 7,0 Gy, a następnie 4,75 Gy po 3 godzinach, przed przeszczepem.
   2. Wstrzyknij 3 x 10 3 do 5 x 10³ komórek BCR-ABL1-LSK z 0,3 x 10⁶ pomocniczymi komórkami szpiku kostnego od myszy WT BoyJ przez żyłę ogonową (iv) do napromieniowanych myszy BoyJ.
   3. Cztery tygodnie po przeszczepie przeanalizuj myszy biorców pod kątem CD45.1 i CD45.2. Uzyskać TMNC z krwi obwodowej przez krwawienie z żyły ogonowej, jak opisano w kroku 7.4. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu FACS. Inkubować komórki z 1 μl każdego z przeciwciał CD45.1-FITC i CD45.2-PE w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Przemyć komórki, zwiększając objętość do 3 ml za pomocą buforu FACS i wirować w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 200 μl 1x PBS.
   5. Przeanalizuj procent na CD45.1 i CD45.2, najpierw bramkując żywe komórki na podstawie rozproszenia do przodu i bocznego, a następnie bramkując komórki FITC- i PE-dodatnie na podstawie niebarwionej próbki.
   6. Podziel myszy na cztery grupy (n = 6 na grupę). Leczenie należy rozpocząć od imatynibu (75 mg/kg mc. 2 razy na dobę) w monoterapii oraz w skojarzeniu z DFC + BCI (oba leki podawano w dawce 10 mg/kg mc. 2 razy na dobę).
   7. Podobnie, należy leczyć inne grupy kombinacjami imatynibu (75 mg/kg) + kurkuminy (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) i imatynibu (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) przez trzy miesiące, 2x dziennie, po wstrzyknięciu i.p.
   8. Analizuj myszy 1 x w miesiącu przez sześć miesięcy pod kątem chimeryzmu białaczkowego, określając procent komórek CD45.2 dodatnich we krwi obwodowej przez krwawienie z żyły ogonowej, jak opisano w kroku 7.4.

9. Ocena in vivo aktywności BCI i DFC

1. Analiza fosfo-p38
   1. Weźmy trzy myszy białaczkowe (w wieku 8-12 tygodni), którym przeszczepiono komórki c-Kit ⁺ z ekspresją BCR-ABL1, jak opisano w sekcji 7. Wstrzyknąć myszom BCI (10 mg / kg), wstrzykując i.p. cztery tygodnie po przeszczepie.
   2. Zmierz poziom TMNC fosfo-p38 we krwi obwodowej za pomocą zestawu do cytometrii przepływowej fosforylacji zgodnie z instrukcjami dostawcy. Zbierz krew od każdej myszy przed i 6 godzin po wstrzyknięciu leku. Wyizoluj TMNC przez wyczerpanie RBC i napraw je w następujący sposób.
   3. Dodać 4 ml roztworu do lizy RBC na 100 μl krwi obwodowej. Mieszać i inkubować na lodzie przez 5 minut w celu lizy erytrocytów. Wirować komórki w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz lizę jeszcze 1 raz.
   4. Po drugim etapie lizy przemyć granulki komórek 1 ml 2% BSA w PBS. Utrwalić komórki, dodając 100 μl roztworów utrwalających i przepuszczalnych, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Osadzać komórkę przez odwirowanie w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Umyj granulki 1 ml 1x płynu do płukania przepuszczalnego. Zablokuj komórki, dodając 300 μl 2% BSA do permeabilizacji buforu płuczącego w temperaturze pokojowej przez 20 min. Podziel komórki na trzy równe porcje po 100 μl każda (~1 x10⁶).
   6. Do każdej podwielokrotności utrwalonych komórek dodać odpowiednio 1 μl całkowitego przeciwciała p-38, 1 μl przeciwciała fosfo-p38 lub 1 μl izotypu kontrolnego IgG i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   7. Przemyć komórki 1x 5 ml 2% BSA w PBS i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1 μl sprzężonego Alexa Fluor-488) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj komórki ponownie 1x i zawieś je w 200 μl 1x PBS.
   8. Pozyskaj dane za pomocą FACS i przeanalizuj je za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
   9. Odjąć MIF kontroli IgG od MFI próbek doświadczalnych. Wartości MFI fosfo-p38 są następnie normalizowane do wartości całkowitego p-38 w celu określenia poziomów fosfo-p38 po wstrzyknięciu BCI.
2. Ilościowa analiza ekspresji genów docelowych genów c-Fos
   1. Weźmy trzy myszy białaczkowe (w wieku 8-12 tygodni), którym przeszczepiono komórki c-Kit ⁺ z ekspresją BCR-ABL1, jak opisano w sekcji 7. Pobrać krew obwodową od każdej myszy, a następnie wstrzyknąć myszom po 10 mg/kg DFC + BCI.
   2. Pobrać krew obwodową 6 godzin po wstrzyknięciu leku. Wyizoluj TMNC przez zubożenie RBC, jak opisano powyżej. Zdeponować TMNC i zawiesić je w buforze do lizy na bazie fenolu (patrz tabela materiałów).
   3. Przeprowadzić analizę RT-qPCR (zgodnie z opisem w sekcji 1) dla Bcl2l11, Lif i IL-6 przy użyciu starterów specyficznych dla genu (pokazanych w Tabeli 1).

10. Długoterminowy test komórkowy inicjujący hodowlę

UWAGA: Test LTCIC został przeprowadzony zgodnie z wcześniejszym opisem²⁵.

1. Wyhoduj mysią linię komórkową fibroblastów MS-5 w MEMα do konfluencji w kolbie do hodowli tkankowej T175. Trypsynizuj komórki zgodnie z powyższym opisem dla HEK293T. Zawieś komórki w MEMα na poziomie 2 x 10⁶ komórek/ml. Pobrać 10 x 10⁶ komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i napromieniować ciśnieniem 80 Gy. Rozcieńczyć komórki do 0,5 x 10⁶ komórek/ml w MEMα uzupełnionym 10% pożywką FBS (M10). Umieścić 2 ml na basenie na 12-dołkowej płytce i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 2} przez noc.
2. Następnego dnia należy przygotować hydrokortyzon hemibursztynianu sodu, rozpuszczając 2,5 mg w 5 ml MEMα (1 M roztwór). Przefiltruj i wysterylizuj roztwór hydrokortyzonu za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Rozcieńczyć hydrokortyzon przez seryjne rozcieńczanie w MEM, aby otrzymać roztwór o stężeniu 100 μM. Dodać 250 μl tego do 25 ml pożywki do hodowli długoterminowej (HLTM) (patrz tabela materiałów) tuż przed użyciem, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μM.
3. Zakręć TMNC CML-CD34⁺ i UCP3 i zawieś je w HLTM przez krótkie wirowanie, a następnie określ liczby za pomocą hemocytometru.
4. Odkurz pożywkę M10 z 12-dołkowej płytki wysianej komórkami zrębu i zastąp ją 1 ml zawiesiny komórek pacjenta (CML-CD34 ⁺ [10 000] i UCP3 TMNC [1 x 10⁶]) w HLTM. Stosować trzy studzienki na kombinację leków na typ komórki.
5. Rozcieńczyć zapasy leków do 2x wymaganego stężenia w HLTM. Dodać 1 ml pożywki z lekami do wyżej wymienionych komórek, aby uzyskać 1x stężenie leku. Połowę pożywki należy wymieniać na świeżo przygotowany HLTM co tydzień przez pięć tygodni.
6. Pod koniec sześciotygodniowego okresu oznaczania LTC-IC należy zebrać nieprzylegające komórki do probówki z hodowli. Trypsynizuj przylegające komórki i połącz je z odpowiednimi komórkami nieprzylegającymi.
7. Umyj komórki i otrzymuj test na obecność CFU w pożywce metylocelulozowej zawierającej 30% płodowej surowicy cielęcej, erytropoetynę (3 jednostki / ml), SF (50 ng / ml) i IL-3 (20 ng / ml), IL-6 (20 ng / ml), g-csf (20 ng / ml) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów / makrofagów (GM-CSF) (20 ng / ml). Określ liczby za pomocą hemocytometru.
8. Płytka 5 x 10⁴ komórki w trzech powtórzeniach. Zamroź pozostałe komórki w 20% FBS i 10% DMSO. Ułóż talerze na dużej szalce Petriego z jednym otwartym naczyniem zawierającym wodę w środku. Ostrożnie przykryć dużą szalkę Petriego i inkubować ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez dwa tygodnie.
9. Zdobądź kolonie dwa tygodnie później. W niektórych przypadkach tylko część zbiorów jest oznaczana na obecność CFU). Obliczyć całkowitą liczbę LTCIC obecnych w początkowej zawiesinie komórek, ekstrapolując na podstawie jtk uzyskanych z części pobranych komórek. Średnia wydajność CFU na LTC-IC wynosi 8.
   nuta: Na przykład, jeśli początkowo 1 x 10⁶ komórek zostało posianych w studzience, po pięciu tygodniach zebrano 0,5 x 10⁶ komórek, a w przypadku CFU posiano 5 x 10⁴ komórek i uzyskano 50 CFU. Odpowiada to 500 jtk/1 milion platerowanych ogniw. Podziel tę liczbę przez 8, aby uzyskać LTCIC, czyli 62,5.

11. Humanizowany model myszy wykorzystujący komórki CML CD34⁺

1. Poddać subletalne napromienianie 8-tygodniowych myszy gamma NOD scid, wykazujących ekspresję ludzkich IL3, GM-CSF i SCF (NSGS), pojedynczą dawką 7,0 Gy (700 radów) z prędkością 50 radów / min.
2. Wstrzyknąć 3 x 10⁶ wybranych komórek CD34 ⁺ od pacjentów z BCR-ABL1-dodatnim CML w fazie przewlekłej do napromienianych myszy przez wstrzyknięcie dożylne.
3. Po dwóch tygodniach od przeszczepu należy określić wszczepienie białaczki do szpiku kostnego za pomocą FACS przy użyciu przeciwciał specyficznych dla myszy i człowieka przeciwko CD45.
4. Wykonaj analizę FACS.
   1. Weź aspirat szpiku kostnego z kości udowych przeszczepionych myszy. Poddać lizie erytrocyty za pomocą buforu do lizy RBC, jak opisano powyżej, i zebrać TMNC przez odwirowanie. Umyj granulat 1x zimnym 1x PBS.
   2. Zablokować komórki ludzkim blokiem FcR i mysim blokiem FcR, a następnie wybarwić anty-ludzkim CD45 FITC i anty-mysim CD45 APC^Cy7 przez noc w temperaturze 4 °C. Przeprowadzić analizę FACS na LSRII i przeanalizować dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
5. Myszy należy podzielić na cztery różne kohorty (n = 6 / grupę) w celu leczenia podłożem, imatynibem (75 mg / kg), DFC + BCI (oba w dawce 10 mg / kg) lub imatynibem (75 mg / kg) + DFC + BCI (oba w dawce 10 mg / kg). Rozcieńczyć podstawowe leki w 1x PBS (nośnik) i podawać je przez wstrzyknięcie i.p. 2x dziennie.
6. Leczenie myszy przez sześć tygodni i określanie obciążenia białaczką co dwa tygodnie, do ósmego tygodnia po przeszczepie, jak opisano powyżej w 11.4.

Wyniki

Uzależnienie od onkogenu ma wpływ na skuteczność terapeutyczną TKI. Nie poznano jednak mechanizmów napędzających zależność od onkogenów. Przeprowadziliśmy wiele bezstronnych analiz ekspresji genów, aby zidentyfikować komponent genetyczny zaangażowany w aranżowanie uzależnienia. Analizy te wykazały zwiększenie poziomu trzech genów, c-Fos, Dusp1 i Zfp36, w komórkach nowotworowych, które nie są zależne od sygnalizacji onkogennej w celu przeżycia, a zatem są niewrażliwe na leczenie TTKI. Regu...

Dyskusja

W przypadku większości komórek nowotworowych odpowiedź terapeutyczna na TKI jest pośredniczona przez blokadę sygnałów kinazy-onkoproteiny tyrozyny, od których guz jest uzależniony. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób mniejszość komórek nowotworowych przyczyniających się do MRD unika uzależnienia od onkogenu i terapii⁴. Ostatnie badania wykazały, że sygnalizacja czynnika wzrostu pośredniczy w oporności na leki zarówno w białaczce, jak i guzach narządów litych. Sugeruje t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektyny	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (metyloceluloza dla mysiego CFU)	Komórka macierzysta	3434
MethoCult H4434 Classic (metyloceluloza dla ludzkiego CFU)	Komórka macierzysta	4434
4-hydroksytamoksyfen	Sigma	H6278
Rekombinowana mysia SCF	Prospec	CYT-275
Rekombinowany mysi Flt3-ligand	Prospec	CYT-340
Rekombinowany Mysz IL-6	Prospec	CYT-350
Rekombinowana mysz IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Laboratorium Imatinib	LC	I-5508
Kurkumina	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biologiczny	S11150
Trypsyna EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamina	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/ml zapas w wodzie
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Siarczan protaminy	Sigma	P3369	mg/ml w wodzie
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0,45 μ M acro filtr tarczowy	PALL	2016-10
70 μ m Nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polisacharoza)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Kolumny	Miltenyi	130-042-401
Koktajl inhibitorów proteazy	Roche	CO-RO
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2	Sigma	P5762
Membrana nitrokululozowa	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (substrat chemiluminescencyjny)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD nauki biologiczne	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD
CD117 APC	BD
BD Pharm Lyse	BD
BD Cytofix/Cytoperm (Roztwór utrwalający i przepuszczalny)	BD
BD trwała ondulacja/pranie  (roztwór do przepuszczania i przemywania dla przepływu fosfonu)	BD
phospho p38	Technologie sygnalizacji komórkowej	4511S
sygnalizacji komórkowej	p38	9212
Mysia kontrola IgG	BD
Mąka Alexa 488 sprzężona	Invitrogen	A-11034
Chlorek wapnia	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Rurki naczyń włosowatych	Fisher	22-260-950
Probówka do pobierania krwi	Giene Bio-One	450480
Surowica cielęca nowonarodzonego Atlanta	biologiczna	S11295
Erytropoeteina	Amgen	5513-267-10
ludzki SCF	Prospec	CYT-255
Ludzki IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (pożywka do testu LTCIC)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrokortyzon Hemibursztynian sodu	Technologie komórek macierzystych	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Strzykawka insulinowa Lo-Dose u-100 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Tłuczek Mortor	Coor tek	60316 i 60317
Izofloran (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg / ml zapas w wodzie
Agar baktonowy (agar)	Difco	214050
Wspaniały bulion	Becton Dickinson	243820
Agaroza	Genemate	E-3119-500
Doksycyklina	chow TestDiet.com	52662	zmodyfikowany RMH1500, autoklawowalny 5LK8  z 0,0625% Doksycykliną
Tamoxifen	Sigma	T5648
Chlorek jodonitrotetrazolu	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Zestaw do krwi i tkanek	Qiagen	69506
GoTaq Green (polimeraza taq z zielonym barwnikiem loadign)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (zestaw do izolacji RNA)	Qiagen	217084
Zestaw Dnazy Wolnej od DNA (leczenie DNAzy dla RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Indeks górny III Synteza pierwszej nici (odwrotna transkryptaza do syntezy cDNA)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (mieszanka polimerazy taq z zielonym barwnikiem interchalacyjnym do qPCR)	Zestaw
CD117	Miltenyi	130-091-224
Długotrwały test komórkowy inicjujący hodowlę ludzką			komórek tymczasowych
Instruments
NAPCO series 8000 WJ Inkubator CO2	Thermo scientific
Wirnik kubełkowy wahadłowy cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automatyczny licznik komórek	Bio-RAD
C-1000 Termocykler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc (system obrazowania żeli i plam zachodnich)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (licznik boląców)	Drew-Scientific
LSR II (analizator FACS)	BD
Fortessa I (analizator FACS)	BD
FACSAriaII (Sorter FACS)	BD
Stojak magnetyczny	Miltenyi
Naradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	źródło Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr Claudia Huettner' s lab
BoyJ	rdzeń myszy w CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	w CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Wyprodukowano w domu
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Wyprodukowano w domu
Cells
BaF3	Prezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Prezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ i normalne komórki	CD34+Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet w Cincinnati