Method Article

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

DOI:

10.3791/58194

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Cancer Blood Disease Institute, Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstracja inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI) w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej (CML) zwiastuje nową erę w leczeniu raka. Jednak niewielka populacja komórek nie reaguje na leczenie Tki, co skutkuje minimalną chorobą resztkową (MRD); nawet najsilniejsze TKI nie są w stanie wyeliminować tych komórek. Te komórki MRD służą jako rezerwuar do rozwoju oporności na terapię. Nie wiadomo, dlaczego leczenie TKI jest nieskuteczne w przypadku komórek MRD. Sygnalizacja czynnika wzrostu jest zaangażowana we wspieranie przeżycia komórek MRD podczas leczenia Tki, ale brakuje zrozumienia mechanistycznego. Ostatnie badania wykazały, że podwyższona ekspresja c-Fos i Dusp1 w wyniku zbieżnej sygnalizacji onkogennej i czynnika wzrostu w komórkach MRD pośredniczy w oporności na TTKI. Genetyczne i chemiczne hamowanie c-Fos i Dusp1 sprawia, że CML jest wyjątkowo wrażliwy na TKI i leczy CML zarówno w genetycznych, jak i humanizowanych modelach mysich. Zidentyfikowaliśmy te docelowe geny za pomocą wielu mikromacierzy z komórek wrażliwych i opornych na TKI. W tym miejscu przedstawiamy metody walidacji celu przy użyciu mysich modeli in vitro i in vivo. Metody te można łatwo zastosować do dowolnego celu w celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konstytutywna aktywność kinazy tyrozynowej onkogenu fuzji BCR-ABL1 powoduje CML, co stanowi uzasadnienie dla celowania w aktywność kinazy przez inhibitory małych cząsteczek. Sukces TKI w leczeniu pacjentów z CML zrewolucjonizował koncepcję terapii celowanej1,2. Następnie terapia antykinazowa jako medycyna precyzyjna została opracowana dla kilku innych nowotworów złośliwych, w tym guzów litych. Do tej pory ponad trzydzieści inhibitorów kinaz zostało zatwierdzonych przez amerykańską FDA do leczenia różnych nowotworów złośliwych. Chociaż leczenie TKI jest bardzo skuteczne w tłumieniu choroby, nie jest wyleczalne.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati (CCHMC). Próbki ludzkie (normalny BM i białaczka CML (p210-BCR-ABL+)) uzyskano za pomocą protokołów zatwierdzonych przez Institutional Review Board (Institutional Review Board: Federalwide Assurance #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) i zgody świadomej dawcy z CCHMC i University of Cincinnati.

1. Analiza qPCR w czasie rzeczywistym

  1. Wyizoluj całkowite RNA z komórek BaF3 rosnących w RPMI, uzupełnionych 10% FBS....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzależnienie od onkogenu ma wpływ na skuteczność terapeutyczną TKI. Nie poznano jednak mechanizmów napędzających zależność od onkogenów. Przeprowadziliśmy wiele bezstronnych analiz ekspresji genów, aby zidentyfikować komponent genetyczny zaangażowany w aranżowanie uzależnienia. Analizy te wykazały zwiększenie poziomu trzech genów, c-Fos, Dusp1 i Zfp36, w komórkach nowotworowych, które nie są zależne od sygnalizacji onkogennej w celu przeżycia, a zatem są niewrażliwe na leczenie TTKI. Regu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku większości komórek nowotworowych odpowiedź terapeutyczna na TKI jest pośredniczona przez blokadę sygnałów kinazy-onkoproteiny tyrozyny, od których guz jest uzależniony. Jednak stosunkowo niewiele wiadomo na temat tego, w jaki sposób mniejszość komórek nowotworowych przyczyniających się do MRD unika uzależnienia od onkogenu i terapii4. Ostatnie badania wykazały, że sygnalizacja czynnika wzrostu pośredniczy w oporności na leki zarówno w białaczce, jak i guzach narządów litych. Sugeruje t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni G. Q. Daleyowi za dostarczenie komórek BaF3 i WEHI oraz T. Reya za konstrukcje MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. Autorzy są wdzięczni M. Carrollowi za dostarczenie pacjentom próbek z kryzysu związanego z CML. Badanie to było wspierane przez granty dla M.A. z NCI (1RO1CA155091), Białaczki i V Fundacji oraz z NHLBI (R21HL114074-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biological Materials
RPMICellgro (corning)15-040-CV
DMEMCellgro (corning)15-013-CV
IMDMCellgro (corning)15-016-CVR
Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektynyTakaraT100B
MethoCult GF M3434 (metyloceluloza dla mysiego CFU)Komórka macierzysta3434
MethoCult H4434 Classic (metyloceluloza dla ludzkiego CFU)Komórka macierzysta4434
4-hydroksytamoksyfenSigmaH6278
Rekombinowana mysia SCFProspecCYT-275
Rekombinowany mysi Flt3-ligandProspecCYT-340
Rekombinowany Mysz IL-6ProspecCYT-350
Rekombinowana mysz IL-7Peprotech217-17
DFCLKT Laboratories Inc.D3420
BCIChemzon ScientificNZ-06-195
Laboratorium ImatinibLCI-5508
KurkuminaSigma458-37-7
NDGASigma500-38-9
Penn/StrepCellgro (corning)30-002-CI
FBSAtlanta biologicznyS11150
Trypsyna EDTA 1xCellgro (corning)25-052-CI
1x PBSCellgro (corning)21-040-CV
L-GlutaminaCellgro (corning)25-005-CL5 mg/ml zapas w wodzie
PuromycinGibco (life technologies)A11138-03
HEPESSigmaH7006
Na2HPO4.7H2OSigmaS9390
Siarczan protaminySigmaP3369mg/ml w wodzie
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)SigmaT8154
DMSOCellgro (corning)25-950-CQC
WST-1Roche11644807001
0,45 μ M acro filtr tarczowyPALL2016-10
70 μ m Nylon cell starinerBecton Dickinson352350
FICOL (Histopaque 1083) (polisacharoza)Simga1083
PBSCorning21040CV
LS KolumnyMiltenyi130-042-401
Koktajl inhibitorów proteazyRocheCO-RO
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2SigmaP5762
Membrana nitrokululozowaBio-Rad1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (substrat chemiluminescencyjny)Thermo Scientific34075
CD5eBioscience13-0051-82
CD11beBioscience13-0112-75
CD45R (B220)BD nauki biologiczne553092
CD45.1-FITCeBioscience11-0453-85
CD45.2-PEeBioscience12-0454-83
hCD45-FITCBD Biosciences555482
Anti-Biotin-FITCMiltenyi130-090-857 
Anti-7-4eBioscienceMA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)eBioscience13-5931-82
Anti-Ter-119eBioscience13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7BD 
CD117 APC BD 
BD Pharm LyseBD 
BD Cytofix/Cytoperm (Roztwór utrwalający i przepuszczalny)BD 
BD trwała ondulacja/pranie  (roztwór do przepuszczania i przemywania dla przepływu fosfonu)BD 
phospho p38Technologie sygnalizacji komórkowej4511S
sygnalizacji komórkowejp389212
Mysia kontrola IgGBD 
Mąka Alexa 488 sprzężona InvitrogenA-11034
Chlorek wapniaInvitrogenK278001
2x HBSInvitrogenK278002
EDTAAmbionAM9261
BSASigmaA7906
Rurki naczyń włosowatychFisher22-260-950
Probówka do pobierania krwiGiene Bio-One450480
Surowica cielęca nowonarodzonego AtlantabiologicznaS11295
ErytropoeteinaAmgen5513-267-10
ludzki SCFProspecCYT-255
Ludzki IL-3ProspecCYT-210
G-SCFProspecCYT-220
GM-CSFProspecCYT-221
MyeloCult (pożywka do testu LTCIC)Stem Cell Technologies5100
Hydrokortyzon Hemibursztynian soduTechnologie komórek macierzystych7904
MEM alphaGibco12561-056
1/2 cc Strzykawka insulinowa Lo-Dose u-100 28 G1/2Becton Dickinson329461
Tłuczek MortorCoor tek 60316 i 60317
Izofloran (Isothesia TM)Butler Schien29405
SOCNew England BiolabsB90920s
AmpicillinSigmaA0166100 mg / ml zapas w wodzie
Agar baktonowy (agar)Difco214050
Wspaniały bulionBecton Dickinson243820
AgarozaGenemateE-3119-500
Doksycyklinachow TestDiet.com52662zmodyfikowany RMH1500, autoklawowalny 5LK8  z 0,0625% Doksycykliną 
TamoxifenSigmaT5648
Chlorek jodonitrotetrazolu SigmaI10406
Kits
Dneasy Zestaw do krwi i tkanekQiagen69506
GoTaq Green (polimeraza taq z zielonym barwnikiem loadign)PromegaM1722
miRNeasy Mini Kit  (zestaw do izolacji RNA)Qiagen217084
Zestaw Dnazy Wolnej od DNA (leczenie DNAzy dla RT PCR)Ambion, Life TechnologiesAM1906
Indeks górny III Synteza pierwszej nici (odwrotna transkryptaza do syntezy cDNA)Invitrogen18080051
SYBR Green (mieszanka polimerazy taq z zielonym barwnikiem interchalacyjnym do qPCR)Zestaw
CD117Miltenyi130-091-224
Długotrwały test komórkowy inicjujący hodowlę ludzkąkomórek tymczasowych
Instruments
NAPCO series 8000 WJ Inkubator CO2Thermo scientific
Wirnik kubełkowy wahadłowy cetrifuge 5810REppendorf
TC-10 automatyczny licznik komórekBio-RAD
C-1000 TermocyklerBio-RAD
Mastercycler Real Plex 2Eppendorf
ChemiDoc (system obrazowania żeli i plam zachodnich)Bio-RAD17001401
Hemavet (licznik boląców)Drew-Scientific
LSR II (analizator FACS)BD 
Fortessa I (analizator FACS)BD 
FACSAriaII (Sorter FACS)BD 
Stojak magnetycznyMiltenyi
Naradiator J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CAMark I Model 68Aźródło Cs 137
Mice
ROSACreERT2Jackson Laboratory
Scl-tTA Dr Claudia Huettner' s lab
BoyJ rdzeń myszy w CCHMC
C57Bl/6 Jackson Laboratory
NSGSw CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- Wyprodukowano w domu
ROSACreERT2/c-Fosfl/flWyprodukowano w domu
Cells
BaF3Prezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston
WEHIPrezent od George'a Daleya, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ i normalne komórkiCD34+Szpital Uniwersytecki, Uniwersytet w Cincinnati
5 558612553356555899554714554723całkowite technologie 554121 mikrokulek Bio-Rad 1725270 Technologie System obrazowania Główny ośrodek myszy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
  2. Druker, B. J., et al. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oncogene Dependencec Fos Dusp1Tyrosine Kinase InhibitorsChronic Myeloid LeukemiaMinimal Residual DiseaseBone Marrow IsolationMagnetic Activated Cell SortingRetroviral TransductionColony Forming Unit AssayRT qPCR Western Blot

Related Articles