Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest użytecznym narzędziem do bardzo czułego wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów i wariantów liczby kopii DNA. W tym miejscu przedstawiamy kluczowe zagadnienia dotyczące pomiaru rzadkich wariantów w ludzkim genomie za pomocą cyfrowego PCR w formacie chip-in-a-tube.
Artykuł metodologiczny
Cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy pod kątem zmienności genetycznej u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą przy użyciu formatu chip-in-a-tube
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza ilościowa zmienności genetycznej człowieka jest kluczowa dla zrozumienia molekularnych cech poważnych schorzeń, takich jak nowotwory. Ponieważ cyfrowe reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR) umożliwiają precyzyjną ocenę ilościową wariantów liczby kopii DNA, stają się one niezbędnym narzędziem do wykrywania rzadkich zmian genetycznych, takich jak mutacje oporne na leki. Oczekuje się, że w niedalekiej przyszłości diagnostyka molekularna z wykorzystaniem cyfrowego PCR (dPCR) będzie dostępna w praktyce klinicznej; w związku z tym, jak skutecznie przeprowadzić dPCR z ludzkim materiałem genetycznym, jest gorącym tematem. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykrywania mozaiki somatycznej polipowatości gruczolakowatej coli (APC) za pomocą dPCR w formacie chip-in-a-tube, który pozwala na jednoczesne przeprowadzenie ośmiu reakcji dPCR. Należy zachować ostrożność podczas napełniania i uszczelniania mieszaniny reakcyjnej na wiórach. W tym artykule pokazano, jak uniknąć nadmiernego i niedoszacowania partycji dodatnich. Ponadto przedstawiamy prostą procedurę zbierania produktu dPCR z przegród na chipach, który można następnie wykorzystać do potwierdzenia określonego wzmocnienia. Mamy nadzieję, że ten raport pomoże promować dPCR z metodą chip-in-a-tube w badaniach genetycznych.
Wprowadzenie
Ilościowy PCR (qPCR) jest często używany do ilościowego określania zmienności genetycznej człowieka, w tym wariantów pojedynczych nukleotydów (SNV) i wariantów liczby kopii DNA (CNV). W qPCR reakcja polimerazy jest przeprowadzana w każdej probówce w taki sam sposób, jak w konwencjonalnym PCR w punkcie końcowym, a sygnał wzmacniający jest uzyskiwany z probówki po każdym cyklu termicznym. Natomiast w dPCR, co oznacza dPCR w punkcie końcowym w tym raporcie, mieszanina PCR jest ładowana do wielu mikroskopijnych komór, zwanych przegrodami, w których matryce DNA są obecne lub nieobecne w granicznym rozcieńczeniu, a każda partycja zawierająca mieszaninę PCR jest oceniana jako ujemna lub dodatnia po pełnym PCR. Chociaż łatwo jest oszacować, że w partycjach ujemnych nie ma matryc DNA, nie jest jasne, ile kopii matryc DNA jest obecnych w partycjach dodatnich. W związku z tym liczba matryc DNA w partycjach dodatnich jest szacowana na podstawie rozkładu Poissona, przy użyciu liczby z ujemnych partycji1. dPCR jest droższy i ma mniejszy zakres dynamiki w porównaniu do qPCR, ale ta metoda umożliwia bezwzględną kwantyfikację i oferuje wyższą czułość i większą precyzję2.
Jednym z głównych zastosowań dPCR jest walidacja wariantów zidentyfikowanych przez sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Szczególnie w przypadku rzadkich wariantów, czyli niskich frakcji wariantowych, walidacja jest kluczowa ze względu na błędy sekwencjonowania, które mogą wystąpić w NGS3. Chociaż sekwencjonowanie Sangera i qPCR są przydatnymi narzędziami do walidacji SNV i CNV, ich czułość jest niska w porównaniu z dPCR. Dlatego technologia dPCR jest poszukiwana w badaniach genetycznych zajmujących się rzadkimi wariantami. Ostatnio wykrywanie za pomocą płynnej biopsji rzadkich wariantów związanych z cechami nowotworu, takimi jak oporność na leki, stało się gorącym tematem w diagnostyce i terapii molekularnej4. Technologia dPCR wydaje się odpowiednia do badań nad płynną biopsją i oczekuje się, że w najbliższej przyszłości będzie miała ważne zastosowania kliniczne, chociaż nadal konieczne jest wdrożenie ulepszeń związanych z zakresem dynamiki i kosztami.
Komercyjnie dostępną technologię dPCR można z grubsza podzielić na platformy oparte na kropelkach i chipach; różnica polega na tym, jak szablony DNA są podzielone na części5,6,7. W przypadku dPCR w formacie chip-in-a-tube mieszanina PCR jest rozprowadzana przez działanie kapilarne do przegród na chipie. Chipy są zbudowane w ośmioprobówkowych paskach, z którymi wielu pracowników laboratorium będzie już zaznajomionych, a zatem osiem próbek może być poddanych obróbce jednocześnie8. Na etapie odczytu zajmuje < 1 godziny potraktowanie 96 próbek, wykrywając cały obraz chipa, a nie każdą partycję. Ponieważ dPCR w formacie chip-in-a-tube ma wysoką przepustowość w porównaniu z innymi systemami dPCR, użyteczność i produktywność są kluczowymi zaletami dla jego użytkowników.
W tym raporcie, somatyczna mozaikowość genu APC u pacjenta ze sporadyczną rodzinną polipowatością gruczolakowatą jest używana jako reprezentatywny przypadek i wyniki dPCR i NGS są porównywane. Głównym celem tego raportu jest jednoznaczne ilościowe określenie wariantu pojedynczego nukleotydu za pomocą dPCR w formacie chip-in-a-tube. Mamy nadzieję, że ten raport będzie pomocny dla badaczy zainteresowanych przyjęciem platformy dPCR w swojej własnej pracy.
Protokół
Projekt badania został zatwierdzony przez Komisje Bioetyczne Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Od pacjenta oraz jego rodziców uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.
1. Kontrola jakości DNA genomicznego
UWAGA: Genomowe DNA (gDNA) wyizolowano z krwi obwodowej przy użyciu sprawdzonej metody oczyszczania DNA opartej na membranie krzemionkowej. Przed przystąpieniem do poniższych procedur stężenie gDNA określono za pomocą spektrofotometru.
- Przygotować próbkę gDNA o stężeniu 10–100 ng/µL.
- Do paska z 8 probówkami dodać 10 µL buforu do próbek DNA.
- Do probówek dodać 1 µL drabinki DNA lub gDNA. Mieszaninę wortexować przez 1 min przy użyciu adaptera do mikropłytek.
- Wprowadzić probówkę, urządzenie do żelowania oraz końcówki do pipety do instrumentu do elektroforezy (Tabela materiałów) i rozpocząć analizę, naciskając przycisk „Start”.
UWAGA: System elektroforetyczny zostanie uruchomiony automatycznie po jednym kliknięciu przycisku Start. - Potwierdzić, czy dolny marker zawarty w buforze do próbek DNA został prawidłowo przypisany na elektroferogramach. W przypadku błędnego przypisania, marker należy przypisać ręcznie w trybie „Electroherogram mode” oprogramowania.
UWAGA: Wartość DIN (DNA integrity number) zostanie obliczona automatycznie. Wartość DIN wynika z integralności DNA. Wysokie i niskie wartości DIN wskazują odpowiednio na wysoce nienaruszony i silnie zdegradowany gDNA. - W trybie „Region mode” oprogramowania określić zakres wielkości gDNA (> 200 bp), aby automatycznie obliczyć stężenie gDNA (> 200 bp).
2. Projektowanie starterów i sond
- Oblicz wartości temperatury topnienia (Tm) przy użyciu dowolnego narzędzia z otwartym dostępem w następujących warunkach: 10–25 zasad, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTPs oraz 3 mM Mg2+ (Tabela materiałów). Zaprojektuj startery forward i reverse do amplifikacji regionu genomowego zawierającego docelowe allele z wartością Tm w okolicach 60 °C i długości amplikonu 100–300 bp.
UWAGA: Stężenia oligonukleotydów znajdują się w Tabeli 1. - Zaprojektuj sondy z kwasami nukleinowymi z blokadą (LNA) dla alleli referencyjnego i wariantowego w oparciu o następujące warunki: (i) w każdej sondzie obecnych jest 1–6 LNA; (ii) na końcach 5' i 3' każdej sondy znajdują się odpowiednio barwnik fluorescencyjny i wygaszacz; (iii) różnica między wartościami Tm dla sond dopasowanych i niedopasowanych wynosi > 10 °C; (iv) wartości Tm dla sond dopasowanych i niedopasowanych są odpowiednio wyższe i niższe niż wartości dla starterów [np. starter forward: 60,8 °C, starter reverse: 59,8 °C, sonda allelu referencyjnego (dopasowana/niedopasowana): 62,6/45,3 °C, sonda allelu wariantowego (dopasowana/niedopasowana): 61,7/50,5 °C]. Wartości Tm obliczono przy użyciu narzędzia z otwartym dostępem, którego użyto również w kroku 2.1.
- Upewnij się, że zaprojektowane startery i sondy nie obejmują polimorfizmów pojedynczego nukleotydu o częstotliwości > 0,1% określonej w bazach danych [np. bazie danych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (dbSNP)].
3. Cyfrowy PCR
- Przygotować roztwory zapasowe starterów, sond oraz gDNA w stężeniach opisanych w Tabela 1 buforem TE, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C4 °C.
- Wymieszać odczynniki w temperaturze pokojowej do uzyskania całkowitej objętości wynoszącej 15 µL do stężenia końcowego opisanego w tabeli 1.
- Dodaj 3 µL wody destylowanej zamiast gDNA w kontroli negatywnej (NTC).
- Przygotować 3,5-krotność objętości mieszaniny do PCR w trzech powtórzeniach, aby uwzględnić błąd pipetowania.
- Wymieszaj mieszaninę PCR, pipetując ją kilkakrotnie w górę i w dół.
- Umieść platformę ładunkową na chipach zamontowanych w 8-probówkowej pasku, a następnie ustaw je w autoloaderze. Upewnij się, że istnieje kontakt pomiędzy chipem a platformą ładunkową.
- Zamocuj suwak ładujący na platformie i przytrzymaj go, odsuwając ogranicznik od ładowarki.
- Pipeta 15 µL mieszaniny PCR na platformie w pobliżu końcówki suwaka (Rysunek 1A).
- Uruchom urządzenie ładujące, naciskając jego przycisk (przez około 1 min).
UWAGA: Pozostanie niewielkiej ilości mieszaniny PCR na platformie nie stanowi problemu. Możliwe jest sekwencyjne ponowne uruchomienie dozownika. - Umieść chip w probówce wypełniony mieszaniną PCR w bocznym gnieździe wzmacniacza uszczelniania. Przesuń przesuwną pokrywkę oraz krawędź górnej pokrywy w taki sposób, aby nie uszkodzić chipa (Rysunek 1B).
- Uruchom program wzmacniający uszczelnianie (sealing enhancer) (około 2 min). Jeśli nadal widoczna jest kałuża cieczy, ponownie uruchom sekwencyjnie program wzmacniający uszczelnianie przez 1 min, ponieważ niepełne uszczelnienie powoduje kontaminację krzyżową sygnałów dodatnich (Rycina 1C i 1D).
- Dodaj 230 µL płynu uszczelniającego, odczynnika na bazie oleju, do probówek.
UWAGA: Płytki powinny być teraz zanurzone w cieczy. - Umieść probówki w termocyklerze. Przeprowadź cykl w termocyklerze zgodnie z opisem w Tabela 2 (przez około 2 h). Należy dostosować temperaturę lub czas trwania reakcji PCR w przypadku nierównomiernego rozkładu dodatnich partycji (Rycina 1E).
UWAGA: Zaleca się ustawienie szybkości narastania temperatury na około 1 °C/s. - Pozostaw probówki w termocyklerze przez co najmniej 15 min, aby zredukować szum linii bazowej.
UWAGA: Probówki można pozostawić również na noc. Sygnały fluorescencji były wykrywalne nawet następnego dnia. - Umieść probówki w uchwycie detekcyjnym i wlej do niego 6 ml wody destylowanej. Jeśli wewnątrz lub na zewnątrz probówek widoczne są pęcherzyki powietrza, należy je usunąć (Rycina 1F i 1G).
- Włóż uchwyt do detektora i uruchom go, klikając „Uruchomprzycisk oprogramowania po wybraniu zakładek Fluorescence, Experiment oraz Sample/NTC (Tabela materiałów).
UWAGA: Detekcja dwukolorowa ośmiu próbek przy domyślnej intensywności trwa około 4–5 min. - Zweryfikuj wykres pozycji, histogram oraz dwuwymiarowy wykres rozproszenia.
UWAGA: Jeśli intensywność fluorescencji w partycjach negatywnych jest wysoka, należy skorygować jej wartość, klikając przycisk Settings (Ustawienia) w oprogramowaniu, tak aby mieściła się ona w zakresie 30–70. - Oblicz frakcję allelu wariantowego (VAF), korzystając z następującego wzoru:
W tym przypadku Cv i Cr oznaczają odpowiednio liczbę kopii allelu wariantowego i referencyjnego.
UWAGA: Wartości te są obliczane automatycznie w programie komputerowym w oparciu o statystykę Poissona.
4. Odzyskiwanie produktu PCR
- Usunąć ciecz uszczelniającą z probówki.
- Do probówki dodać 100 µL buforu TE. Energicznie mieszać w wirówce typu vortex przez 30 s, a następnie krótko odwirować probówkę.
- Przenieść roztwór TE do drugiej probówki, a następnie dodać 30 µL 3 M octanu sodu i 200 µL etanolu.
- Chłodzić roztwór w temperaturze -20 °C przez noc.
- Wirować roztwór przez 30 min przy 16 000 x g i usunąć nadsącz.
- Do probówki dodać 300 µL 80% etanolu i wymieszać w wirówce typu vortex.
- Wirować roztwór przez 15 min przy 16 000 x g i usunąć nadsącz. Pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez 5 min.
- Po wysuszeniu rozpuścić osad w 1–5 µL buforu TE.
- W razie potrzeby ocenić wielkość produktu za pomocą urządzenia do elektroforezy, odnosząc się do kroku 1. Nanieść 1 µL roztworu na żel w celu uzyskania wysokiej czułości (Tabela materiałów).
Wyniki
Przeanalizowano mozaikowatość somatyczną genu APC u pacjenta ze sporadiczną rodzinną polipowatością coli zgodnie z opisanymi powyżej procedurami. W poprzednim badaniu, przy użyciu sekwencjonowania metodą Sangera oraz NGS, u pacjenta wykryto mutację APC c.834 + 2T > C, której nie stwierdzono u rodziców9. Projekty starterów i sond zastosowanych w reprezentatywnych wynikach przedstawiono w Tabeli 3. DNA genomowe wyizolowano z krwi probanda, rodziców oraz sześciu zdrowych dawców. Wartości DIN dla dziewięciu próbek gDNA mieściły się w zakresie 6,7–7,9 (Rysunek 2 i Tabela 4). Jako barwniki fluorescencyjne dla alleli C i T zastosowano odpowiednio FAM i HEX. Zielone i żółte punkty na wykresach pozycji reprezentują odpowiednio partycje dodatnie dla FAM i HEX (Rysunek 3A). Niebieskie punkty reprezentują partycje ujemne dla obu barwników, FAM i HEX. Czarne tło odpowiada partycjom, do których nie dodano mieszaniny reakcyjnej. U probanda wykryto wiele dodatnich partycji dla alleli C i T, podczas gdy u ojca probanda oraz w NTC wykryto niewiele dodatnich partycji dla allela C, a w tym ostatnim nie stwierdzono dodatnich partycji dla allela T. Separacja sygnału pomiędzy allelami C i T była wyraźna na dwuwymiarowym (2-D) wykresie rozrzutu, a najsilniejsze sygnały HEX i FAM były od siebie wzajemnie wykluczone (Rysunek 3B). VAF u probanda wynosił 13,2%, co jest wartością zbliżoną do określonej za pomocą NGS (12,7%) (Tabela 4). VAF u rodziców probanda oraz zdrowych dawców wynosił < 0,1%. Granicę wykrywalności dla mutacji APC c.834 + 2T > C oszacowano na 0,3%, stosując 3-krotność odchylenia standardowego dla pomiarów powtórzonych z użyciem 10–11 ng całkowitego gDNA10.
Przewidywana wielkość amplikonu w teście dPCR dla APC c.834 + 2T > C wynosiła 123 bp. Aby potwierdzić, że produkt dPCR został namnożony w formie pojedynczego prążka, produkt dPCR odbrano z analizowanego chipa. Wykorzystując elektroforezę, wyraźnie wykryto pojedynczy prążek, a wielkość produktu była zgodna z przewidywaniami (Rycina 4).
Rycina 1: Uwagi dotyczące analizy dPCR w formacie chip-in-a-tube. (A) Ten panel pokazuje, jak ustawić pasek 8 probówek w autoloderze. (B) Ten panel przedstawia uszkodzone chipy. (C) Ten panel pokazuje powierzchnie chipów bezpośrednio po (i) załadowaniu i (ii) uszczelnieniu. (iii) W przypadku niepełnego uszczelnienia widoczna jest kałuża cieczy. (D) Ten panel przedstawia wykres pozycji w przypadku kontaminacji krzyżowej. (E) Ten panel przedstawia wykres pozycji w przypadku nierównomiernego rozkładu. (F) Ten panel pokazuje pęcherzyki powietrza na powierzchni probówki zanurzonej w wodzie. (G) Ten panel pokazuje pęcherzyki powietrza wewnątrz probówki. Na całej rycinie czarne i białe groty strzałek wskazują odpowiednio odłamki uszkodzonego chipa i pęcherzyki powietrza. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne elektroferogramy gDNA z krwi.Na górnym i dolnym panelu przedstawiono elektroferogramy gDNA z krwi z wartościami DIN odpowiednio 6,7 oraz 7,9. Gwiazdka oznacza marker dolny. DIN: liczba integralności DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki mozaikowatości somatycznej APC z wykorzystaniem dPCR w formacie chip-in-a-tube. (A) Przedstawiono wykresy pozycji oraz (B) wykresy rozproszenia dla kontroli bez matrycy (NTC), probanda oraz ojca. Kanały HEX i FAM odpowiadają odpowiednio allelowi referencyjnemu i wariantowi. Linie pionowe i poziome wskazują odpowiednio progi intensywności HEX i FAM. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kahyo et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Zbiór produktów dPCR z analizowanego chipa. Zebrane i skoncentrowane produkty dPCR poddano elektroforezie. Przewidywana wielkość celu wynosiła 123 bp. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Kahyo et al.10. NTC: kontrola bez matrycy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Odczynnik | Stężenie roztworu roboczego | Objętość (μL) | Stężenie końcowe | Zalecane stężenie końcowe |
| Woda destylowana wolna od DNazy/RNazy | - | 1.75 | - | - |
| 2x PCR Master mix | - | 7.5 | - | - |
| Sonda LNA dla allelu głównego | 2 μM | 0.5 | 66.7 nM | 3.33–100 nM |
| Sonda LNA dla allelu mniejszościowego | 2 μM | 0.5 | 66.7 nM | 3.33–100 nM |
| Startery forward | 1 μM | 0.5 | 33.3 nM | 3.33–50.0 nM |
| Startery reverse | 1 μM | 0.5 | 33.3 nM | 3.33–50.0 nM |
| 20x roztwór dPCR | - | 0.75 | - | - |
| gDNA | 3.33 ng/μL | 3 | 666 pg/μL | 20 pg/μL–2,000 pg/μL1 |
Tabela 1: Odczynniki wykorzystane w analizie dPCR. 1W zależności od oczekiwanej precyzji i czułości.
| Krok | Temperatura | Czas | Cykle |
| Wstępna denaturacja | 95 °C | 5 m | 1 |
| Denaturacja Przyłączanie i elongacja | 95 °C 58 °C | 50 s 90 s | 42 |
| Ostateczne przedłużenie | 70 °C | 5 m | 1 |
Tabela 2: Warunki cyklera termicznego.
| Nazwa | Sekwencja1 | Wartość Tm2 |
| Starter kierunkowy (Forward) | 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′ | 60.8 °C |
| Starter odwrotny (Reverse) | 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′ | 59.8 °C |
| Sonda LNA dla allelu T | 5'-HEX-ATTT[A]CCTGACCA-IBFQ-3' | Dopasowana: 62.6 °C Niedopasowana: 45.3 °C |
| Sonda LNA dla allelu C | 5'-FAM-TTT[G]CCTGACC-IBFQ-3' | Dopasowana: 61.7 °C Niedopasowana: 50.5 °C |
Tabela 3: Projekt starterów i sond. 1Podkreślone i ujęte w nawiasy litery oznaczają odpowiednio LNA oraz celowany wariant. 2Obliczone zgodnie z krokiem 2 protokołu.
| NGS (sekwencjonowanie nowej generacji)3 | cyfrowa PCR4 | |||||||
| Próbka1 | Tkanka | Ilość wprowadzonego DNA (ng) | DIN2 | VAF (%) | Wariant (kopie) | Referencja (kopie) | VAF (%) | |
| Średnia | Względne odchylenie standardowe (RSD) | |||||||
| NTC (kontrola nietranskrybowana) | - | - | - | - | 1.23 | 0 | Nie dotyczy | Brak danych |
| Proband | Krew | 11.3 | 7.6 | 12.7 | 379 | 2,48 x 103 | 13.2 | 0.0353 |
| Ojciec | Krew | 10.3 | 7.7 | 0.0167 | 1.08 | 3,42 x 103 | 0.0341 | 0.439 |
| Matka | Krew | 10.8 | 7.6 | 0.0136 | 0.956 | 3,04 x 103 | 0.0313 | 0.637 |
| Dawca-1 | Krew | 11.7 | 7.3 | - | 1.64 | 3,01x 103 | 0.0543 | 0.414 |
| Dawca-2 | Krew | 10.5 | 7.6 | - | 1.06 | 2,90 x 103 | 0.0406 | 0.539 |
| Dawca-3 | Krew | 17.6 | 7.9 | - | 4.24 | 5,65 x 103 | 0.0713 | 0.783 |
| Dawca-4 | Krew | 12.3 | 7.6 | - | 2.38 | 4,16 x 103 | 0.0666 | 0.557 |
| Dawca-5 | Krew | 19.2 | 7 | - | 1.48 | 6,79 x 103 | 0.0213 | 0.571 |
| Dawca-6 | Krew | 14.4 | 6.7 | - | 3.44 | 4,67 x 103 | 0.0728 | 0.729 |
Tabela 4: Wyniki analizy dPCR w kierunku mozaikowatości somatycznej APC. 1NTC: kontrola bez matrycy; Donor: zdrowy dawca. 2DIN: wskaźnik integralności DNA (DNA integrity number). 3Iwaizumi et al.9, Hum Genome Var. 2 15057 (2015). 4Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach i powtórzono niezależnie 3x; dane przedstawiono jako wartość średnią; RSD: względne odchylenie standardowe; N/A: nie dotyczy. Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Kahyo et al.10.
Dyskusja
Wartość DIN jest często używana do oceny uszkodzonego DNA (np. gDNA z tkanki zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie) przed kwantyfikacją lub sekwencjonowaniem, ponieważ zaawansowana degradacja gDNA może skutkować niską jakością danych. Ocena DIN staje się zatem ważnym krokiem w kontroli jakości ludzkiego gDNA11. Ponieważ gDNA użyte w reprezentatywnym eksperymencie było przechowywane w temperaturze 4 °C przez 4–11 lat po ekstrakcji z krwi, jego wartości DIN zostały określone w celu kontroli jakości przed testem dPCR. Ten krok jest szczególnie zalecany, jeśli istnieje podejrzenie, że materiały są uszkodzone. Stężenie gDNA oznaczono również za pomocą elektroforezy. Ponieważ zakres dynamiczny dPCR nie jest tak szeroki jak w przypadku qPCR ze względu na ograniczenia partycji, pomiar stężenia gDNA jest ważnym krokiem dla udanego testu dPCR. Ponieważ ilość wejściowego DNA była skorelowana z całkowitą liczbą kopii wariantu i alleli referencyjnych w teście dPCR (R-kwadrat = 0,935; Tabela 4), elektroforeza jest przydatna do pomiaru stężenia gDNA przed testem dPCR.
Procesy załadunku i zgrzewania są ważnymi krokami dla pomyślnych wyników. Kluczowe znaczenie ma potwierdzenie prawidłowego montażu mieszaniny PCR na platformie i zapewnienie kontaktu między chipem a platformą (rys. 1A). Wysunięcie mieszaniny PCR z suwaka może spowodować nieprawidłowy rozkład na chipie. Potwierdzenie rozkładu dodatnich i ujemnych partycji na wykresie pozycyjnym jest również niezbędne do precyzyjnej analizy, ponieważ w statystyce Poissona zakłada się, że matryce DNA są losowo podzielone na komory1. W reprezentatywnych wynikach dodatnie partycje były rozmieszczone w całym chipie (rysunek 3). Wynik ten spełnia wymagania dotyczące statystyk Poissona i odzwierciedla, że procedury załadunku i uszczelniania były skuteczne. Podczas umieszczania rurek w wzmacniaczu uszczelnienia, wióry mogą zostać pęknięte, jeśli środkowa część górnej pokrywy zostanie zbyt mocno dociśnięta (Rysunek 1B). Aby tego uniknąć, delikatnie popchnij krawędź górnej pokrywy. Jeśli istnieje sztuczny klaster partycji dodatnich (rysunek 1D), liczba kopii może być zawyżona z powodu zanieczyszczenia krzyżowego między partycjami. Procedurę uszczelniania należy ulepszyć, jeśli na powierzchni widoczna jest kałuża cieczy (rysunek 1C) (np. poprzez sekwencyjne uruchamianie wzmacniacza uszczelniającego przez 1 minutę). W przypadku nierównomiernego rozkładu przegród dodatnich (rysunek 1E), liczba kopii może być niedoszacowana z powodu niewystarczającego wzmocnienia lub zanieczyszczenia płynu uszczelniającego i wody. W takim przypadku należy dostosować warunki PCR [np. poprzez dostrojenie temperatury lub czasu trwania PCR (krok 3.11 protokołu) lub upewnienie się, że płyn uszczelniający i woda wlane do przyrządu są czyste]. Sygnały fluorescencyjne są wykrywane z 8-rurkowego paska zanurzonego w wodzie destylowanej. Jeśli pęcherzyki powietrza przylgną do powierzchni rury, istnieje możliwość, że mogą zakłócać wykrywanie sygnału (rysunek 1F). Dlatego pęcherzyki należy usunąć za pomocą narzędzia, takiego jak cienka końcówka do pipet. Dodatkowo, po umieszczeniu ich w przyrządzie, mogą tworzyć się pęcherzyki powietrza wewnątrz rurek (Rysunek 1G). Jeśli pęcherzyki wewnątrz rurek są wystarczająco duże, aby zakryć chip, należy je również usunąć. Bąbelki mogą się zniknąć, jeśli pozostawi się je na kilka minut w temperaturze pokojowej.
Niektóre dodatnie partycje mogą zostać wykryte w NTC. Aby uniknąć zanieczyszczenia matryc DNA, utrzymuj stół w czystości i, jeśli to możliwe, zrób czystą przestrzeń za pomocą wentylatora filtrującego. W przypadku podejrzenia zanieczyszczenia matryc DNA, należy dokładnie oczyścić pomieszczenie i/lub wyrzucić zużyte odczynniki. W przeciwieństwie do tego, jeśli dodatnie partycje allelu referencyjnego nie zostaną wykryte w obecności gDNA, ponownie potwierdź stężenia gDNA, starterów i sond. Warto zauważyć, że w reprezentatywnym eksperymencie startery stosowano w niższym stężeniu w porównaniu z konwencjonalnym PCR (Tabela 1)12. Kluczowe jest również potwierdzenie szybkości narastania, która rzadko jest zmieniana w konwencjonalnym PCR.
To, co sprawia, że dPCR w formacie chip-in-a-tube jest wyjątkowy, to podział mieszaniny PCR wewnątrz uniwersalnego 8-probówkowego paska 8,13. W tym systemie nie jest wymagane przenoszenie komór działowych do probówki PCR, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Zaletą systemu dPCR jest również format chip-in-a-tube; wykonanie 96 testów w tym systemie dPCR zajmuje < 4 godziny, podczas gdy wykonanie takiej samej liczby testów w systemie dPCR14 na bazie kropelek zajmuje co najmniej 5 godzin. Co więcej, uniwersalny pasek z 8 probówkami umożliwia użycie konwencjonalnego termocyklera, w przeciwieństwie do innego dPCR15 opartego na chipie, który wymaga termocyklera z płaskim blokiem. Również zgromadzona wiedza i odczynniki do konwencjonalnego PCR mogą być stosowane w systemie dPCR. Będzie to pomocne w rozszerzeniu zastosowań dPCR.
Należy zauważyć, że dPCR ma kilka ograniczeń. W przypadku dPCR w formacie chip-in-a-tube numer partycji chipa jest stosunkowo niski w porównaniu z innymi platformami dPCR. Dalsze ulepszenia urządzenia chipowego będą wymagane, aby zwiększyć zakres dynamiki, który zależy od liczby partycji. Ponieważ przestrzeń wewnętrzna uniwersalnej rury jest ograniczona, wymagany jest przełomowy projekt urządzenia chipowego w celu zwiększenia liczby partycji. Automatyzacja całej procedury dPCR w przyszłości znacznie zmniejszyłaby liczbę błędów ludzkich, co skutkowałoby jeszcze bardziej wiarygodnymi wynikami. Ze względu na wysoką przepustowość i wysoką czułość, oczekuje się, że dPCR w formacie chip-in-a-tube będzie stosowany do traktowania wielu próbek do płynnych biopsji i środowiskowego DNA.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Grant-in-Aid for Scientific Research (C) od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) (No. 15K08397) dla Tomoaki Kahyo, oraz przez granty z Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (No. 927960719), Grant-in-Aid for Exploratory Research (No. 16K15256), Wydatki na Projekty Powiązane z Motywacyjnym Specjalnym Budżetem na Promocję Reformy Krajowej Uczelni w Zakresie Dotacji na Wydatki Zarządzania (No. 1019253), oraz Fundacji Badań nad Tyciem dla Haruhiko Sugimury. Autorzy dziękują dr Iwaizumi i dr Kurachi za ich wsparcie kliniczne. Fundatorzy nie odegrali żadnej roli w przygotowaniu manuskryptu. Rysunek 3, Rysunek 4 i Tabela 4 zostały zaadaptowane i przedrukowane z artykułu Kahyo i wsp.10, za zgodą Elsevier.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Przed Protokołem 1: Ekstrakcja genomowego DNA |
| NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Przed Protokołem 1: Spektrofotometr |
| z 8-paskową probówką | Agilent Technologies | 401428 | Protokół 1 |
| Bufor próbki genomowego DNA | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protokół 1: Składnik testu taśmowego genomowego DNA |
| Drabinka DNA | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protokół 1: Składnik testu taśmowego Genomic DNA Screen Tape Test |
| MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protokół 1: Mieszalnik wirowy |
| Taśma ekranowa genomicznego DNA | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protokół 1: Urządzenie żelowe |
| System | TapeStation 2200Agilent Technologies | G2965AA | Protokół 1: Przyrząd do elektroforezy |
| Oprogramowanie do analizy TapeStation | Agilent Technologies | W zestawie z G2965AA | Protokół 1: Oprogramowanie analityczne |
| Startery oligologiczne | DNA IDT | Na zamówienie niestandardowe | Protokół 2 |
| Sondy LNA | IDT | Na zamówienie niestandardowe | Protokół 2 |
| Narzędzie programowe | IDT | Strona internetowa: http://biophysics.idtdna.com/ | Protokół 2 |
| dbBaza danych SNP | NCBI | : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protokół 2 |
| Bufor | TE ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protokół 3 |
| Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protokół 3 (Tabela 1) |
| Cyfrowa sonda PCR Clarity Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protokół 3 (Tabela 1): 2xPCR Master Mix Składnik #10011 |
| Płyn uszczelniający Clarity | JN Medsys | 12005 | Protokół 3: Płyn uszczelniający Składnik #10011 |
| Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protokół 3 (Tabela 1): Roztwór 20xdPCR Składnik #10011 |
| Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protokół 3: Chip-in-a-tube Składnik zestawu do ładowania próbek #10011 |
| Clarity | JN Medsys | 12008 | Protokół 3: Platforma załadowcza i suwak Składnik #10011 |
| Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protokół 3: Auto loader Składnik #10001 |
| Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protokół 3: Wzmacniacz uszczelnienia Składnik #10001 |
| Czytnik Clarity JN | Medsys | 11004 | Protokół 3: Reader Składnik #10001 |
| Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protokół 3: Oprogramowanie Clarity termocyklera |
| JN Medsys | w zestawie z #10001 | Protokół 3: Oprogramowanie analityczne | |
| Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protokół 4: Urządzenie żelowe zapewniające wysoką czułość |
Bibliografia
- Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355 (6326), 752-756 (2017).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1869-1875 (2017).
- Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057(2015).
- Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
- Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
- Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
- Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
- Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Przedruki i uprawnienia
