Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

DOI:

10.3791/58200

⸱

7 listopada 2018

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biegunka jest nadal powszechnym problemem zdrowotnym o wysokim wskaźniku występowania na całym świecie1,2. Chociaż śmiertelność jest stosunkowo niska, niektórzy pacjenci wykazują różne objawy przez tygodnie (takie jak luźne i wodniste stolce, pilna potrzeba pójścia do łazienki), co sprawia, że wpływ społeczno-ekonomiczny jest bardzo wysoki3,4. Co gorsza, u niektórych pacjentów może nawet rozwinąć się zespół jelita drażliwego, jeśli nie jest leczony5. Istnieją różne rodzaje bakterii, wirusów i pasożytów, które mogą powodować biegunkę6. Salmonella spp./Shigella spp. są jednymi z najczęstszych bakterii przenoszących ostre zapalenie żołądka i jelit7,8,9,10,11. W związku z tym wiele hrabstw wydało przepisy ustawowe lub wykonawcze dotyczące regularnych badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. wśród osób, które miałyby do czynienia z żywnością i wodą. Na przykład rząd chiński wydał przepisy dotyczące obowiązkowych badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. raz w roku.

Złotym standardem w wykrywaniu Salmonella spp./Shigella spp. jest hodowla bakterii. Poprzez hodowlę bakterii oraz późniejszą identyfikację biochemiczną i charakterystykę serologiczną możemy zidentyfikować gatunki bakterii, co może ułatwić zarządzanie ogniskami choroby i profilowanie przeciwdrobnoustrojowe, aby wspomóc leczenie pacjentów12. Może to również pomóc w ustaleniu źródła infekcji podczas epidemii Salmonella spp./Shigella spp. 13. Metoda ta jest jednak pracochłonna (wymaga ręcznej obsługi) i czasochłonna (zajmuje kilka dni), szczególnie w przypadku testowania dużej liczby próbek7. Co więcej, żywotne, ale niehodowlane (VBNC) Salmonella spp./Shigella spp. mogą występować w niektórych próbkach kału14. Ze względu na te wady, wiele laboratoriów próbowało opracować nowe techniki wykrywania Salmonella spp./Shigella spp.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Wszystkie te metody wykorzystują test amplifikacji kwasu jądrowego (NAAT), wśród których najczęściej występuje reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Jednym z głównych ograniczeń tych metod opartych na NAAT jest to, że martwe bakterie, nawet szczątki bakteryjne zawierające niekompletne genomowe DNA, mogą wykazywać pozytywne wyniki26, co może w znacznym stopniu wpłynąć na dokładną diagnozę choroby. Blanco i wsp. wykazali, że test molekularny jest bardzo wrażliwy, nie tylko na żywotną Salmonellę w hodowlach, ale także na częściowe genomy i martwe lub niezdolne do życia bakterie z przeszłych infekcji lub zanieczyszczeń26. Dlatego należy opracować nową technologię.

Tutaj opisaliśmy nowatorską metodę, która łączy metodę opartą na NAAT i hodowlę. Jak pokazano na Rysunek 1, ta nowa metoda najpierw stosuje badania przesiewowe PCR w czasie rzeczywistym, a następnie pozytywne próbki są wysyłane do hodowli i identyfikacji bakterii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zgodny z wytycznymi ustalonymi przez komisję etyki badań klinicznych w Zhuhai International Travel Healthcare Center. Podczas eksperymentu należy stosować standardową sterylną operację.

1. Skład i przygotowanie podłoża hodowlanego

  1. Przygotuj bulion odżywczy: Rozpuść 1% peptonu, 0,3% ekstraktu wołowego, 0,5% chlorku sodu, 0,1% glukozy wH2O, dostosuj pH do 7,5 i autoklawuj w 121 °C przez 15 min.
  2. Przygotuj pożywkę selenitowo-cystynową: Rozpuść 0,5% peptonu, 0,4% laktozy, 1%Na2HCO3, 0,4% wodoroseleninu sodu, 0,001% L-cystyny w H2O, dostosuj pH do 7,0 i gotuj przez 5 min.
  3. Przygotuj płytkę z agarem ksylozy, lizyny, deoksycholanu (XLD): Rozpuść 0,3% ekstraktu drożdżowego, 0,5% L-lizyny, 0,375% ksylozy, 0,75% laktozy, 0,75% sacharozy, 0,5% chlorku sodu, 0,008% czerwieni fenolowej, 0,68% tiosiarczanu sodu, 0,08% cytrynianu żelaza amonu, 0,25% deoksycholanu sodu, 1,5% agaru w H2Oi dostosuj pH do 7,4. Następnie gotuj przez 5 minut i wlej do talerzy o średnicy 90 mm.
  4. Przygotuj chromogenną płytkę agarową Salmonella: Rozpuść 1,5% agaru, 0,7% peptonu i ekstraktu drożdżowego, 1,29% odczynnika selektywnego wH2O. Następnie gotuj przez 5 minut i wlej do talerzy o średnicy 90 mm.
  5. Przygotuj płytkę agarową z pożywką: Rozpuść 1% peptonu, 0,3% ekstraktu wołowego, 0,5% chlorku sodu, 1,5% agaru w H2Oi dostosuj pH do 7,3. Następnie sterylizuj go w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut i rozlej do płytek o średnicy 90 mm.
  6. Przygotuj płytkę z agarem MacConkey (MAC): rozpuść 2% peptonu, 1% laktozy, 0,5% chlorku sodu, 0,5% soli żółciowej OX, 0,0025% neutralnej czerwieni, 1,5% agaru, 0,0001% fioletu krystalicznego w H2O i dostosuj pH do 7,2. Następnie sterylizuj go w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut i przelewaj do płytek o średnicy 90 mm.

2. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Pobieranie próbek
    1. Włóż wacik z odbytu do odbytu pacjenta na głębokość 3-5 cm i obróć go o 360°.
    2. Umieść wacik z odbytu w sterylnej probówce do pobierania opłat. Zaznacz identyfikator próbki.
    3. Wyślij próbkę do laboratorium tak szybko, jak to możliwe.
      UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 24 godziny.
  2. Wzbogacanie wstępne
    1. Dodaj 3 ml bulionu odżywczego do każdej próbki w probówce.
    2. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 6 godzin w inkubatorze.
  3. Mieszanie próbek (opcjonalnie)
    1. Zebrać 100 μl każdej kultury wstępnie wzbogacającej i wymieszać 8-10 próbek z 1 próbki w probówce o pojemności 1,5 ml, jeśli jest więcej niż 10 próbek.
    2. Oznacz prawidłowo.
  4. Ekstrakcja DNA
    1. Odwirować kulturę wstępnego wzbogacania przy 800 x g przez 2 minuty, aby umożliwić duże cząstki ustabilizowanie się, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 12 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant przez aspirację.
    2. Dodać 100 μl roztworu do ekstrakcji DNA (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) do osadu. Wirować energicznie przez 1 min.
    3. Gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w suchej kąpieli.
    4. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać supernatant za pomocą nowej probówki, która posłuży jako matryca do kolejnej analizy PCR w czasie rzeczywistym.
  5. PCR w czasie rzeczywistym
    1. Ustawić mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: dla każdej próbki dodać 12,5 μl 2x mieszaniny reakcyjnej, 0,4 μM każdego startera, 0,2 μM każdej sondy (sekwencje w tabeli 1)27, 5 μL matrycy, jak przygotowano w kroku 2.4.4, i użyć ddH2O, aby dodać do 25 μL całkowitej objętości.
    2. Ustaw program cykliczny w następujący sposób: 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 34 s. Zbieraj sygnały fluorescencyjne z kanałów 6-karboksy-fluoresceiny (FAM) i heksachlorofluoresceiny (HEX) na etapie wydłużania (72 °C) automatycznie za pomocą fluorescencyjnego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym.
    3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym na fluorescencyjnym urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z instrukcjami urządzenia.
    4. Przejdź bezpośrednio do kroku 4 i wystawiaj negatywne raporty, jeśli na kanałach FAM/HEX wystąpią negatywne wyniki, co oznacza, że próbki są ujemne na obecność Salmonella spp./Shigella spp.
    5. Przejść do kroku 3.1 i/lub 3.2, jeśli wyniki dodatnie występują w kanałach HEX i/lub FAM, co oznacza, że próbka może być dodatnia odpowiednio na obecność Salmonella spp. i/lub Shigella spp.
      UWAGA: Jeśli w kroku 2.3 przeprowadzono mieszanie próbki, należy przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym na poszczególnych próbkach, które składały się na próbkę dodatnią, aby odsiać prawdziwą próbkę dodatnią.

3. Kultura prowadzona

  1. Salmonella spp. Próbka dodatnia w PCR
    1. Selektywna hodowla w pożywce
      1. Dodaj 100 μl kultury wstępnie wzbogacającej do 5 ml pożywki selenitowo-cystynowej w probówce. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18–24 godziny w inkubatorze.
    2. Oddzielanie kultur na talerzu
      1. Zebrać jedną pętlę kultury za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce XLD lub chromogennej płytce agarowej Salmonella. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18-24 godziny w inkubatorze.
    3. Identyfikacja biochemiczna
      1. Wybierz podejrzaną kolonię na płytce XLD (różowa kolonia z/bez ciemnego serca; ciemna kolonia; żółta kolonia z/bez ciemnego serca) lub chromogenną płytkę agarową Salmonella (fioletowa lub prunosus kolonia, gładka i okrągła) (Rysunek 2).
      2. Poddaj podejrzaną kolonię w celu identyfikacji biochemicznej w automatycznym systemie identyfikacji mikrobiologicznej, zgodnie z instrukcjami urządzenia.
    4. Charakterystyka serologiczna
      1. Charakterystyka antygenu O
        1. Dodać jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu O na czysty szkiełku.
        2. Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.
        3. Przejdź do kroku 3.1.4.1.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowice (Rysunek 3). W przeciwnym razie przejdź do kroku 3.1.4.1.5.
        4. Użyć surowic monowalentnych antygenu O, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.3, aż do scharakteryzowania swoistego antygenu O.
        5. Użyć surowicy więzowej, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.3. Zebrać te kolonie reaktywne visurowica do probówki i gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut w suchej kąpieli. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać osad i powtarzać kroki od 3.1.4.1.1 do 3.1.4.1.4 aż do scharakteryzowania specyficznego antygenu O.
      2. Charakterystyka antygenu H
        1. Dodać jedną kroplę surowicy poliwalentnej antygenu H na czyste szkiełko.
        2. Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.
        3. Przejdź do kroku 3.1.4.2.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowice.
        4. Użyj surowic monowalentnych antygenu H, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.2.1 do 3.1.4.2.3, aż do scharakteryzowania swoistego antygenu H.
          UWAGA: Czasami może być konieczna indukcja surowicy w celu scharakteryzowania antygenu drugiej fazy H. Jeśli tak, należy wykonać następujące opcjonalne kroki.
        5. (Opcjonalnie) Dodaj jedną kroplę specyficznej surowicy antygenu H na płytkę agarową z pożywką. Poczekaj, aż wszystkie surowice zostaną wchłonięte.
        6. (Opcjonalnie) Zebrać jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce, na której wchłaniane są specyficzne surowice antygenu H. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18-24 godziny w inkubatorze.
        7. (Opcjonalnie) Użyć surowic monowalentnych antygenu H, aby powtórzyć kroki od 3.1.4.2.1 do 3.1.4.2.3, aż do scharakteryzowania antygenu drugiej fazy H.
        8. Przejdź do kroku 4.
  2. Shigella spp. Próbka dodatnia do PCR
    1. Oddzielanie kultur na talerzu
      1. Zebrać jedną pętlę kultury wstępnego wzbogacania za pomocą mikropętli i rozprowadzić na płytce XLD lub płytce MAC. Inkubować w temperaturze 36 °C przez 18–24 godziny w inkubatorze.
    2. Identyfikacja biochemiczna
      1. Zbierz podejrzaną kolonię na płytce XLD (gładka, okrągła, przezroczysta i czerwona kolonia) lub MAC (gładka, okrągła, przezroczysta i bezbarwna kolonia o średnicy 2-3 mm; Shigella sonnei może być większa i zmieniać kolor na jasnoróżowy wraz z wydłużeniem czasu inkubacji) (Rysunek 4).
      2. Poddaj podejrzaną kolonię w celu identyfikacji biochemicznej w automatycznym systemie identyfikacji mikrobiologicznej, zgodnie z instrukcjami urządzenia.
    3. Charakterystyka serologiczna
      1. Dodać jedną kroplę surowicy wielowartościowej Shigella spp. na czyste szkiełko.
      2. Zbierz jedną pętlę kolonii za pomocą mikropętli i zmiel w sera.
      3. Przejdź do kroku 3.2.3.4, jeśli wygląda jak płynący piasek, co oznacza, że kolonia reaguje na surowicę.
      4. Użyć surowic monowalentnych Shigella spp., aby powtarzać kroki od 3.2.3.1 do 3.2.3.3 aż do scharakteryzowania specyficznych surowic Shigella spp.
      5. Przejdź do kroku 4.

4. Raport

  1. Wystawiaj pozytywne lub negatywne raporty zgodnie z powyższymi wynikami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zastosowany do badania przesiewowego Salmonella spp./Shigella spp. w próbkach kału odbytu od osób, które miały kontakt z jedzeniem i wodą.

Na etapie PCR w czasie rzeczywistym, jak pokazano na Rysunek 5A, nastąpiła udana amplifikacja w kanale HEX, co oznaczało, że mieszana próbka była pozytywna na obecność Salmonella spp. Następnie przeprowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ Salmonella spp./Shigella spp. są często związane z zatruciem pokarmowym i przenoszeniem fekalno-oralnym ostrego zapalenia żołądkai jelit 28,29, a rutynowa metoda jest albo pracochłonna, albo czasochłonna7, opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp., wykorzystującą PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Naukowo-Technologiczny w Zhuhai, Chiny (numer grantu 20171009E030064), Program Naukowo-Technologiczny Guangdong, Chiny (numer grantu 2015A020211004) oraz Program Naukowo-Technologiczny Generalnego Zarządzania Nadzorem, Inspekcją i Kwarantanną Chińskiej Republiki Ludowej (numer grantu 2016IK302, 2017IK224).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TrisSigma10708976001
EDTASigma 798681
NP40Sigma11332473001
ddH2OTakara9012
PrimeSTAR HS (Premix)TakaraR040Q
Bulion odżywczyLandBridgeCM106
Odżywka agarowaLandBridgeCM107
Selenit Cystyna podłożeLandBridgeCM225
XLDLandBridgeCM219
MAC LandBridgeCM908
Salmonella chromogenny agarCHROMagarSA130
Salmonella surowica diagnostycznaTianrunSAL60
ShigellaTianrunSHI54
(probówka zbiorcza plus)Huachenyang
slajdMingsheng7102
mikropętlaWeierkangW511
autoklaw JinghongDNP-9082
suchaAULSS-325
JinghongKB-20
zautomatyzowany system identyfikacji mikrobiologicznejbioMé rieuxVITEK2można zastosować inny równoważny system
, fluorescencyjną maszynę do PCR w czasie rzeczywistymThermoFisherABI7500inną równoważną maszynę
wymaz z odbytu inkubator kąpiel ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926(2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587(2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewowe badanie Salmonella i ShigellaPCR w czasie rzeczywistymhodowla kierowanawst pne namna anieekstrakcja DNAhodowla selektywnaidentyfikacja biochemicznacharakterystyka serologicznaautomatyczna identyfikacja drobnoustroj wcharakterystyka antygenu O

Powiązane artykuły