Prezentujemy użycie mikroskopii 2-fotonowej do umieszczenia mikropipety w przestrzeni moczowej Bowmana u myszy, łącząc 2 podstawowe techniki fizjologii nerek. Zastosowanie mikroskopii 2-fotonowej pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia konwencjonalnej mikroskopii w badaniach fizjologii nerek z mikronakłuciem.
Artykuł metodologiczny
Mikronakłucie przestrzeni Bowmana u myszy ułatwione przez mikroskopię 2-fotonową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikropunkcja nerek i obrazowanie 2-fotonowe nerek to nowatorskie techniki w fizjologii nerek. Jednak mikronakłuwanie jest ograniczone przez zależność od konwencjonalnej mikroskopii w celu uzyskania cech nefronu powierzchniowego, a badania 2-fotonowe są ograniczone, ponieważ interwencje można ocenić tylko na poziomie narządu, a nie na poziomie nefronu. W szczególności badania mikronakłuć kłębuszków nerkowych myszy zostały zakwestionowane przez niedostatek kłębuszków powierzchniowych u myszy. Aby rozwiązać to ograniczenie, w celu kontynuowania badań nad aspiratem z przestrzeni Bowmana w modelach fizjologicznych myszy, opracowaliśmy 2-fotonową mikronakłuwanie kłębuszków nerkowych. Przedstawiamy nowatorski preparat chirurgiczny, który umożliwia boczny dostęp do nerki przy jednoczesnym zachowaniu wymaganej pionowej kolumny obrazowania do mikroskopii 2-fotonowej. Podawanie izotiocyjanianu fluoresceiny o dużej masie cząsteczkowej (FITC)-dekstranu służy do uwidocznienia układu naczyniowego nerek, a tym samym kłębuszków nerkowych do obrazowania 2-fotonowego. Pipeta pokryta kropką kwantową jest następnie wprowadzana pod kontrolą stereotaktyczną do kłębuszka nerkowego wybranego spośród kilku do wielu, które można zobrazować w oknie obrazowania. W protokole tym podajemy szczegóły dotyczące przygotowania, materiałów i metod niezbędnych do przeprowadzenia zabiegu. Technika ta ułatwia wcześniej niemożliwe fizjologiczne badanie nerki, w tym odzyskanie filtratu z przestrzeni Bowmana i wszystkich segmentów nefronu w granicach głębokości obrazowania, około 100 μm poniżej torebki nerkowej. Ciśnienie, ładunek i przepływ można mierzyć za pomocą dołączonej pipety. W tym miejscu podajemy reprezentatywne dane z chromatografii cieczowej/spektrometrii mas wykonanej na aspiracie z przestrzeni Bowmana. Spodziewamy się, że technika ta będzie miała szerokie zastosowanie w badaniach fizjologicznych nerek.
Wprowadzenie
Celem tej procedury jest zapewnienie rutynowego dostępu do mikronakłuć przestrzeni Bowmana i innych struktur kłębuszkowych u myszy. Badania mikronakłuć w fizjologii nerek zostały ograniczone do mikroskopii 1-fotonowej, która może obrazować tylko w promieniu kilku mikronów od powierzchni nerki i która oferuje ograniczoną precyzję w wymiarze z. Ponieważ myszy mają niewiele kłębuszków nerkowych powierzchniowych, nie zawsze jest możliwe znalezienie kłębuszka powierzchniowego za pomocą mikroskopii 1-fotonowej, dlatego większość badań mikronakłuć przeprowadzono na szczurach monachijskich-wistarskich, które mają liczniejsze kłębuszki powierzchniowe. W związku z tym korzyści płynące z pracy na modelach mysich zostały ograniczone w badaniach mikronakłuć1,2,3. Ostatnie postępy w technologiach obrazowania, w tym micro-CT4,5, obrazowanie nanocząstek6 i obrazowanie spektrometrii mas7 znacznie rozszerzyły zakres modalności mających zastosowanie do fizjologii kłębuszków nerkowych, ale nic nie zastąpi unikalnej zdolności do interwencji i pobierania próbek, którą zapewnia mikronakłucie. W związku z tym oczekuje się, że rozszerzenie stosowania mikronakłuwania przy użyciu przedstawionych tu technik ułatwi nowatorskie badania nad fizjologią nerek, w szczególności ocenę zawartości filtratu nerkowego (tj. metabolomikę) oraz podstawową fizjologię myszy transgenicznych, takie jak pomiary ciśnienia i ładunku przesączu, wcześniej wykonywane tylko u szczurów.
W tej technice, użycie mikroskopii 2-fotonowej umożliwia wizualizację i dostęp mikropipetą do struktur nerkowych do około 100 μm poniżej torebki nerkowej. Wiele (5-10) kłębuszków nerkowych jest zatem dostępnych do mikronakłucia w każdej nerce myszy dotychczas zobrazowanej. Chociaż technika ta ma pewne cechy wspólne z konwencjonalnym mikronakłuwaniem nerki, została zaprojektowana de novo i wymagane są rozległe modyfikacje konwencjonalnej techniki. W tym protokole demonstrujemy aspirację płynu z przestrzeni Bowmana i pokazujemy przykładowe wyniki późniejszej analizy za pomocą spektrometrii mas (nanoproteomika)8,9,10,11. Dalsze zastosowanie spektrometrii mas wymaga specjalistycznego procesu przygotowania próbki, co również zostało tutaj zademonstrowane.
Protokół
Wszystkie procedury opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zdrowia i Nauki w Oregonie.
1. Konfiguracja używana do demonstracji
- Użyj pionowego mikroskopu 2-fotonowego, 3-osiowego kontrolera stolika, podstawy podstawowej/uchwytu pipety i 3-osiowego kontrolera do podstawy podstawy/uchwytu pipety; wymagane są wszystkie cztery elementy.
UWAGA: Dostępnych jest wiele podobnych konfiguracji, które wystarczą, o ile dostępne jest niezależne, ilościowe sterowanie pipetą i stolikiem mikroskopu w 3 osiach, a mikroskop jest przystosowany do obrazowania pionowego in vivo.
2. Materiały niezbędne przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych
- Użyj dekstranu FITC, 2 000 000 Da, 5% roztworu w soli fizjologicznej lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do wstrzyknięcia zaoczodołowego, aby oznaczyć układ naczyniowy nerek. Ta masa cząsteczkowa (MW) jest wybierana, ponieważ pozostaje w układzie naczyniowym i nie filtruje.
- Mikropipety ze szkła borokrzemianowego ciągnione maszynowo: Wyciągnij mikropipety do końcówki 6–10 μm, używając ustawień długiej, zamkniętej końcówki (np. ciepło = 610, prędkość = 150, czas = 250 ms, zapętlona) na ściągaczu do mikropipet. Skoś do 45° i lekko wypoleruj płomieniowo.
- Powlekanie mikropipet kropkami kwantowymi: Pokryj końcówki mikropipet kropkami kwantowymi zgodnie z przywołanym protokołem. 12
- Polisiloksanowa podpora/przekładka nerek. Użyj szpachli polisiloksanowej, aby stworzyć podporę/przekładkę nerki. Uformuj romb prostokątny o grubości 1 x 1 cm i wymiarach5 mm (tj. ścięty sześcian) z szpachli polisiloksanowej. Usuń środkowe 70% polisiloksanu z jednej krawędzi i okręgu obejmującego około 70% środka rombu. Pozostaw polisiloksan do wyschnięcia na 24 godziny. Zobacz Rysunek 1.
- Przygotowanie mikrowstrzykiwacza: Napełnij olejem rurkę z polietylenu (PE)-50 i uchwyt mikropipety z mikropipetami. Jeśli planowana jest spektrometria mas, wymagana jest perfluorodekalina, w przeciwnym razie można użyć oleju mineralnego. Ustawić mikrowstrzykiwacz za pomocą gazoszczelnej strzykawki typu Hamilton i napełnić perfluorodekaliną. Zostanie on podłączony do rurki PE-50 i uchwytu na pipety.
- Umieść pipetę w uchwycie na pipetę i napełnij do przodu rurkę PE-50 i pipetę, a następnie przymocuj proksymalny koniec rurki PE-50 do wypełnionej olejem strzykawki Hamiltona, tworząc układ hydrauliczny od pipety do strzykawki.
3. Boczny dostęp pipetą do nerki poniżej kolumny obrazowania płynów za pomocą nowatorskiego zabiegu chirurgicznego
UWAGA: Montaż systemu wspomagającego obrazowanie i przygotowanie chirurgiczne jest pokazane w Rysunek 1. Opisana procedura wykonywana jest na myszach C57BL/6 o masie ciała 20–25 g.
- Zważ mysz.
- Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu i utrzymuj za pomocą 1,5–2,5% izofluranu w mieszaninie powietrza i tlenu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona przez brak odpowiedzi na bolesny bodziec i zmniejszoną częstość oddechów.
- Nasmaruj oczy i ustaw zwierzę bokiem na płytce podstawowej. Unieruchomij 4 kończyny za pomocą taśmy.
- Wstrzyknąć podskórnie sól fizjologiczną zwykłą o pojemności 200 μl i umieścić sondę temperatury doodbytniczą. Kontroluj temperaturę za pomocą lampy grzewczej podczas operacji i poduszki grzewczej podczas obrazowania.
- Usuń wszystkie włosy po lewej stronie myszy za pomocą kremu do depilacji.
- Zlokalizuj śledzionę, która jest widoczna pod skórą, i zlokalizuj lewą nerkę po grzbietowej i ogonowej stronie śledziony.
- Wykonaj 0,5 cm nacięcie na skórze i mniejsze nacięcie na otrzewnej, tylko tyle, aby nerka mogła się łatwo przepchnąć.
- Wyciśnij nerkę z delikatnym naciskiem. Umieść formę stabilizatora nerki wykonaną z polisiloksanu wokół nerki i przymocuj za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Wyrównać nerkę z przekładką w taki sposób, aby najbardziej boczna powierzchnia nerki wystawała poza stabilizator na około 1 mm.
- Przymocuj płytę głowicy do formy stabilizatora za pomocą kleju i zamontuj płytę głowicy do prętów montażowych na płycie podstawy.
- Napełnij studzienkę w podłożu polisiloksanowym otaczającym nerkę 1% roztworem agarozy i umieść 10 mm szkiełko nakrywkowe na wierzchu i przytrzymaj, aż agaroza stanie się twarda. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe do płyty głowicy za pomocą kleju i utwórz pierścień wokół szkiełka nakrywkowego za pomocą cementu dentystycznego.
- Wstrzyknąć FITC-dekstran (2 000 000 Da, 5% roztwór, 100–150 μl) po orbicie i szybko przesunąć mysz i płytkę utrwalającą do stopnia mikroskopu 2-fotonowego, utrzymując znieczulenie i zapewniając odpowiednie oczyszczanie gazów odlotowych na stoliku mikroskopu.
4. Wybór odpowiedniego kłębuszka nerkowego i pipety dostęp do przestrzeni Bowmana
- Definicje:
- Zdefiniuj X jako lewo-prawo na ekranie i lewo-prawo skierowane w stronę mikroskopu
- Odczyt SX (stage X) z stage kontrolera
- Zdefiniuj PX jako pipetę X na sterowniku tarczy pipety
- Zdefiniuj Y jako góra-dół na ekranie i do przodu w kierunku mikroskopu i z powrotem w kierunku konfiguracji 2-fotonowej
- Zdefiniuj Z jako w górę w kierunku sufitu, w dół w kierunku podłogi i mierzoną na stole montażowym z położeniem celu Z.
- Zdefiniuj S(O)Z jako wysokość sceny (a właściwie obiektywną).
- Znajdź powierzchnię nerki, którą można zidentyfikować za pomocą ustawień filtra białka zielonej fluorescencji (GFP) w okularze. Ze względu na wstrzyknięcie FITC-Dextran, naczynia krwionośne będą jasnozielone.
- Zidentyfikuj odpowiedni kłębuszek nerkowy. Po zidentyfikowaniu powierzchni nerki za pomocą okularu przełącz się na 2-fotonowy (tryb bez skanowania) i zbadaj okno obrazowania. Korzystne cechy mikronakłucia to: odległość pionowa poniżej szkiełka nakrywkowego >30 μm (aby zapobiec kolizji pipety z szkiełkiem nakrywkowym podczas dostępu) oraz odległość boczna od bocznej torebki nerkowej do kłębuszków nerkowych <400 μm (powyżej tej odległości odchylenie pipety może zwiększyć prawdopodobieństwo chybienia).
- Zapisać odległość boczną i pionową do punktu nakłucia, punkt na torebce nerkowej bezpośrednio po stronie pipety kłębuszków nerkowych.
- Podnieś ognisko obiektywu do słupa wody, zachowując niezmienione współrzędne stopnia x i y, na odległość zaledwie około centymetra.
- Wbij końcówkę pipety do słupa wody i włącz wzbudzenie 4',6-diamidyno-2-fenylindoldol (DAPI). Przesuń pipetę w wymiarach x i y do punktu maksymalnej fluorescencji końcówki, będzie to środek obiektywu. Znalezienie pipety w oku jest trudne bez tego precyzyjnego pozycjonowania. Ponieważ kropki kwantowe fluoryzują na tej samej (w tym przypadku na czerwono) długości fali, niezależnie od długości fali wzbudzenia, wzbudzenie DAPI wytwarza czerwoną fluorescencję, która jest ściśle skupiona na końcówce, co ilustruje Rysunek 2.
- Zmień ustawienie wzbudzenia na czerwone białko fluorescencyjne (RFP) i wizualizuj pipetę w okularze, a następnie precyzyjnie wyśrodkuj ją w widoku oka.
- Przełącz się na 2-foton i znajdź pipetę w kategorii 2-photon, umieszczając ją dokładnie na środku obrazu. To jest stanowisko rejestracyjne.
- Zapisz zdjęcie pipety.
- Zarejestruj stolik i współrzędne kontrolera mikropipet.
UWAGA: Użyj dodatkowego pliku .html, który wykona obliczenia za pomocą kodu JavaScript (korzystne w systemach, które nie mają zainstalowanego oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych) lub arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć przesunięcie między współrzędnymi stolika i pipety oraz obliczyć współrzędne docelowe kontrolera pipet. - Wyjmij pipetę ze słupa wody w osi x, pozostawiając te same wartości z i y.
- Przesunąć pipetę Z do docelowego kłębuszka Z (tj. przesunąć pipetę w dół w kierunku Z poniżej szkiełka nakrywkowego)
- Przesunąć pipetę Y do docelowej współrzędnej Y kłębuszków nerkowych.
- Przesuń 2-fotonowy podgląd na żywo do docelowego kłębuszka nerkowego Z, a następnie do krawędzi nerki i zanotuj SX.
- Oblicz PX krawędzi nerki, korzystając z przesunięcia od rejestracji SX.
- Przesuń stolik w kierunku pipety (zwiększ SX) tak, aby krawędź nerki znajdowała się daleko na lewo od ekranu, ale nadal była widoczna.
- Szybko przesunąć pipetę do wartości o około 100 μm mniejszej niż PX na krawędzi nerki obliczonej powyżej.
- Zlokalizuj końcówkę pipety, powoli przesuwając pipetę. Zwiększ wzmocnienie czerwieni i obserwuj histogram czerwonych pikseli (rozkład pikseli zmienia się przed obrazowaniem pipety w oknie, ze względu na ekstremalną jasność kropek kwantowych i fluorescencję poza celem).
- Przejdź do krawędzi nerki w obrazowaniu 2-fotonowym na żywo.
UWAGA: Przed wprowadzeniem do kapsułki nerkowej możliwe jest przekierowanie pipety w wymiary Y i Z. Może to jednak spowodować uszkodzenie końcówki pipety. Bardziej konserwatywnym środkiem, jeśli pipeta nie jest zamierzona, jest wycofanie w wymiarze X do 2 cm, przekierowanie, a następnie powrót w wymiarze X do krawędzi nerki. Gdy pipeta znajdzie się w tkance, ruch w dowolnej osi innej niż X prowadzi do zgięcia pipety, co wymaga dużego doświadczenia i często prowadzi do pęknięcia. - Powoli kieruj pipetę w osi X do docelowego PX, obserwując SX. (Pomocne jest od czasu do czasu wracanie do kłębuszka nerkowego, aby sprawdzić, czy w ogóle się przesunął po włożeniu mikropipety).
- Gdy znajdujesz się we właściwej lokalizacji, udokumentuj pozycję za pomocą z-stack.
UWAGA: Po założeniu mikropipety można wstrzykiwać leki, białka lub znaczniki fluorescencyjne, zasysać płyn do późniejszej analizy lub mierzyć ciśnienie lub ładunek w stosunku do innej elektrody.
5. Aspiracja płynu z Przestrzeni Bowmana
- Ustaw mikropompkę tak, aby wstrzykiwała 100 nl perfluorodekaliny w ciągu 2 minut, aby zapewnić drożność pipety i zmniejszyć zakłócenia spowodowane zatkaniem pipety podczas wprowadzenia. Zobrazuj ponownie, aby upewnić się, że pipeta znajduje się w pozycji.
- Odczekaj 4–6 minut na dodatkową filtrację.
- Ustawić mikropompę tak, aby zasysała do 300 nL z szybkością do 50 nL/min.
UWAGA: Zmiany w morfologii kłębuszków nerkowych nie są obserwowane przy tym tempie, co sugeruje, że nie zmienia to szybkości dostarczania płynu do przestrzeni podczas aspiracji. Ponieważ nie ma bloku olejowego, jak w konwencjonalnej mikronakłuwalce, odzyskanie tej objętości, niezbędne do spektrometrii mas, może obejmować część wstrzykniętej perflourodekaliny i ewentualnie płyn rurkowy. W przypadku testów, takich jak pomiary elektrod wrażliwych na jony, spektroskopia fluorescencyjna, reakcja łańcuchowa polimerazy i inne wrażliwe punkty końcowe, można stosować mniejsze objętości. Jeżeli spektrometria mas nie jest punktem końcowym, do pomiaru zasysanej objętości przed przechowywaniem można zastosować olej mineralny i standardowe techniki mikronakłuwania. - Obraz jeszcze raz.
- Wyjąć pipetę i zakonserwować próbkę, dodając bufor TRIS i przechowując w temperaturze -80° przed analizą.
- Poddać mysz eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu lub innej zatwierdzonej metody.
UWAGA: Przesącz dostaje się do przestrzeni poprzez filtrację z naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych. Współczynnik filtracji kłębuszkowej pojedynczego nefronu (SNGFR) u myszy wynosi od 8 do 14 nL/min.3 Siły Starlinga rządzą jednak SNGFR, a zatem ujemne ciśnienie hydrostatyczne w przestrzeni Bowmana może zwiększyć SNGFR. Standardowe metody mikronakłuwania wykorzystują blokadę rurkową z olejem i neutralnym ciśnieniem do pobierania próbek płynu rurowego, jednak związki te zakłócają spektrometrię mas (patrz poniżej); Dlatego w tej technice wczesny kanalik proksymalny pozostaje opatentowany. Co więcej, w momencie aspiracji przestrzeń Bowmana zawiera nieznaną, ale dodatnią objętość filtratu. W związku z tym szybkość aspiracji płynu może przekroczyć SNGFR.
UWAGA: W opisanych tutaj eksperymentach celem było uzyskanie większej niż zwykle próbki filtratu kłębuszkowego do analizy spektrometrii mas za pomocą technik nanoproteomicznych. Ponieważ zastosowanie spektrometrii mas wyklucza użycie bloków olejowych z olejem mineralnym lub woskiem (złożone mieszaniny cząsteczek organicznych, które redukują sygnał:szum w spektrometrii mas), perfluorodekalina jest używana do napełniania mikropipety i strzykawki. Nie wiadomo, czy perflourodekalina blokuje przepływ rurkowy, ale jest biologicznie obojętna i nie zakłóca spektrometrii mas.
Wyniki
Procedura ta wymaga specjalistycznego przygotowania chirurgicznego nerki do obrazowania dwufotonowego oraz dostępu, co zostało zilustrowane na Rysunku 1. Przedstawione tutaj przygotowanie umożliwia utworzenie pionowej kolumny obrazującej z obiektywem nad nerką przy minimalnych zmianach gęstości, co zapewnia optymalne warunki optyczne dla mikroskopii dwufotonowej, przy jednoczesnym dostępie bocznym dla pipety, poruszanej wyłącznie w wymiarze poziomym (x). Częściowe wysunięcie nerki zapobiega nadmiernemu napięciu szypuły nerkowej i zachowuje przepływ naczyniowy, a konstrukcja niestandardowego wspornika nerki pozwala na realizację dwóch celów: obrazowania i dostępu. Drugim wyzwaniem w tej procedurze jest precyzyjne pozycjonowanie pipety wewnątrz nerki w trzech wymiarach, co wymaga kalibracji układów współrzędnych pipety i stolika. Krytyczny krok tego procesu przedstawiono na Rysunku 2, który ukazuje nanoszenie punktu pipety w kolumnie wodnej mikroskopu dwufotonowego przy wzbudzeniu DAPI. Wprowadzenie do kolumny wodnej i zarejestrowanie współrzędnych pipety względem współrzędnych stolika przed wejściem do nerki jest kluczowe dla zapewnienia precyzyjnego pozycjonowania stereotaktycznego pipety w docelowej przestrzeni Bowmana. Pipeta wchodzi do obrazującej kolumny wodnej z prawej strony. Po włączeniu wzbudzenia DAPI, pokryta czerwonymi kropkami kwantowymi pipeta intensywnie fluorescencyzuje na kolor czerwono-pomarańczowy i może być ostrożnie ustawiona pod środkiem obiektywu. Ponieważ wiązka wzbudzająca przechodzi przez środek obiektywu, pipetę można swobodnie przesuwać do punktu maksymalnej fluorescencji, co gwarantuje jej widoczność w okularze.
Prawidłowe wyciąganie pipet oraz dobór kłębuszków są kluczowe dla powodzenia tego protokołu, co zilustrowano w Rycina 3, Rycina 4, Rysunek 5W Rysunek 3Awidoczna jest prawidłowo dociągnięta szklana mikropipeta pokryta czerwono fluorescencyjnymi kropkami kwantowymi, obrazowana w kolumnie cieczy podczas etapu rejestracji pipety w procedurze. Szerokość końcówki wynosi 6 mikronów. W Rycina 3B, niedokładnie pobranej pipetą objętości 12 µm widoczna jest końcówka. Pipeta ta nie może przebić torebki nerkowej bez spowodowania urazu naczyniowego ze względu na 12 µm średnica i nieregularna powierzchnia końcówki (należy zwrócić uwagę na wiór na górnej krawędzi skosu). W Rycina 3C i 3Dprzedstawiono znaczenie optymalnego ustawienia, a nie samego obrazowania kłębuszka docelowego. Piękny kłębuszek położony blisko powierzchni, zilustrowany w Rycina 3C wykazuje korzystne właściwości obrazowania (ze względu na swoje położenie powierzchniowe w 20 µm poniżej torebki nerkowej), jednak nie nadawałaby się do dostępu za pomocą tej procedury, ponieważ znajduje się zbyt blisko powierzchni, przez co pipeta uderzyłaby w szkiełko nakrywkowe. W Rycina 3D, przedstawiono optymalnie usytuowane kłębuszki. Należy zwrócić uwagę na różną skalę zastosowaną do zilustrowania obu kłębuszków (paski skali są wszystkie 50 µm). Kłębuszki te wydają się mniej wyraźne ze względu na refrakcję spowodowaną głębokością; obraz ten został wykonany przy 70 µm pod torebką nerkową. Boczna krawędź nerki jest 250 µm w prawo, co zapewnia dostęp do obu tych kłębuszków. Podczas procedury dostępu obrazowanie jest ściśle skoncentrowane na kłębuszku docelowym, jak pokazano w Rysunek 4stosuje się akwizycję obrazu co sekundę, co pozwala badaczowi na precyzyjną obserwację rozmieszczenia pipety w przestrzeni Bowmana.
Rysunek 4 przedstawia typowe wprowadzenie do nerki i wynik w postaci końcówki pipety w przestrzeni Bowmana. Na Rysunku 4A średnia projekcja intensywności ze stosu z-stack z widokami ortogonalnymi pokazuje końcówkę pipety w przestrzeni Bowmana. Należy zauważyć obecność czerwonego artefaktu spektralnego końcówki pipety (okrągła kula fluorescencji) wynikającego z niezwykle silnej fluorescencji kropek kwantowych rozmieszczonych na stożkowej sekcji końcówki. Na Rysunku 4B projekcja objętości danych ze stosu z-stack pokazuje kolejną pipetę w przestrzeni Bowmana. Należy zwrócić uwagę, że podczas wprowadzania pipeta pociągnęła torebkę Bowmana w kierunku ruchu, powodując widoczne namiotowanie za końcówką, zgodnie z opisem w protokole.
Na Rysunku 5 przedstawiono wyniki nieudanej procedury, w której pipeta o zbyt dużym otworze pękła na wysokości torebki nerkowej, powodując krwawienie. Pipeta była zbyt tępa; podczas próby przebicia torebki nerkowej, torebka była pchana przed końcówką pipety, aż do momentu pęknięcia. Na tym obrazie torebka nerkowa jest widoczna w zielonej fluorescencji FITC, uwydatniona przez krwawienie podtorebkowe. Sygnał FITC jest widoczny wewnątrz samej pipety, co wskazuje, że krew pod ciśnieniem dostała się do światła pipety. Strzałka wskazuje liczne erytrocyty widoczne w świetle pipety jako ubytki wypełnienia w FITC-dekstranie.
Rysunek 6 przedstawia reprezentatywne widmo masowe uzyskanego aspiratu z przestrzeni Bowmana, białka moczowego myszy 17 (MUP17). Na koniec, Tabela 1 prezentuje przykładowe wyniki pomyślnych procedur aspiracji, wymieniając białka zidentyfikowane za pomocą nanomasowej spektrometrii w aspiracie pobranym w ciągu 6 minut od każdej z 3 myszy. W każdym przypadku obrazowano pipetę podczas jej wycofania z przestrzeni Bowmana; w przestrzeni Bowmana ani w świetle pipety nie zaobserwowano fluorescencji FITC, co wskazuje na brak zanieczyszczenia aspiratu osoczem. Zidentyfikowano 17 białek, głównie o niskiej masie cząsteczkowej, na podstawie minimum 2 unikalnych peptydów na białko. Liczba zliczeń spektralnych jest niska, co jest zgodne z wcześniejszymi szacunkami zawartości białek w filtracie kłębuszkowym; obecne są znane białka filtrowane, takie jak białko wiążące witaminę D (VTDB), albuminy (ALBU) oraz główne białko moczowe 17 (MUP17).
Rycina 1: Częściowa ekstruzja nerki z niestandardowym wspornikiem i unieruchomieniem do dostępu bocznego. Po lewej stronie przedstawiono elementy kolumny obrazującej i wspornika nerki, a w centrum kompletny zespół. Po prawej stronie pokazano preparat nerki przed (powyżej) i po (poniżej) zastosowaniu wspornika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Zakończone przygotowanie nerki na etapie rejestracji pipety w protokole. Tutaj wzbudzenie DAPI jest wykorzystywane do pozycjonowania mikropipety w kolumnie wody mikroskopu dwufotonowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Obrazowanie pipet oraz nerki po wstrzyknięciu FITC-dekstranu, demonstrujące kłębki nerkowe odpowiednie i nieodpowiednie do mikropunkcji. A. Dobrze wyciągnięta pipeta z końcówką 6 µm. B. Końcówka tępa, o nierównych krawędziach. C. Ten kłębek nerkowy jest wyraźnie zarysowany, ale znajduje się zbyt blisko szkiełka podstawowego, aby przeprowadzić mikropunkcję. D. Kłębki nerkowe o odpowiednim położeniu. Wszystkie paski skali wynoszą 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Prawidłowe wprowadzenie pipety prowadzi do jej umieszczenia w przestrzeni Bowmana – widoki z dwóch różnych procedur. A. Z-stack z projekcjami ortogonalnymi obrazuje końcówkę pipety w przestrzeni Bowmana, przylegającą do kłębuszka nerkowego. Pasek skali: 50 µm. B. Renderowanie objętościowe z z-stacku w podobny sposób obrazuje pipetę w przestrzeni Bowmana, przylegającą do kłębuszka nerkowego. Pasek skali: 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Nieudana procedura spowodowana tępą pipetą, co doprowadziło do przerwania torebki nerkowej i krwawienia do światła pipety. Wewnątrz pipety widoczna jest fluorescencja FITC z wynaczynionej plazmy oraz erytrocyty (strzałka). Strzałka wskazuje erytrocyty widoczne w świetle pipety. Pasek skali wynosi 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Widmo masowe głównego białka moczowego 17 (MUP17), uzyskane z analizy nanoscale liquid chromatography/mass spectrometry aspiratu z przestrzeni Bowmana. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Białko | MW (kDa) | Średnia liczba zliczeń spektralnych |
| ACTA_MOUSE | 42 | 2 |
| ACTB_MYSZ | 42 | 1 |
| CLPX_MYSZ | 69 | 2.5 |
| DHSA_MYSZ | 73 | 1 |
| FOLR2_MYSZ | 29 | 1 |
| GBLP_MYSZ | 35 | 1 |
| ALBU_MOUSE | 66 | 6.7 |
| HBA_MYSZ | 15 | 2 |
| HBB1_MOUSE | 16 | 1 |
| MIB1_MYSZ | 110 | 1 |
| MUP17_MYSZ | 21 | 1 |
| PERYFERIE_MYSZY | 54 | 1 |
| RNAS4_MYSZ | 17 | 2 |
| SPTB1_MYSZ | 2 | 1 |
| VIME_MYSZ | 54 | 1 |
| VTDB_MOUSE | 53 | 1 |
Tabela 1: Lista białek zidentyfikowanych w aspiracie z przestrzeni Bowmana u 3 myszy.
Wideo uzupełniające 1: renderowanie objętościowe ze stosu obrazów z-stack, pozyskanych po umieszczeniu pipety w przestrzeni Bowmana, pokazuje końcówkę pipety wewnątrz tej przestrzeni, przylegającą do kłębuszka kapilarnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Przedstawiamy metodę dostępu do przestrzeni Bowmana kłębuszków niepowierzchniowych u myszy, ułatwioną przez mikroskopię 2-fotonową. Opracowaliśmy tę procedurę, aby rozwiązać kluczowe ograniczenie mikronakłucia kłębuszków nerkowych, rzadkość kłębuszków powierzchniowych adresowalnych za pomocą mikroskopii 1-fotonowej u myszy, w celu ułatwienia celu eksperymentalnego, aspiracji płynu z przestrzeni Bowmana do późniejszej analizy. Rozwój i praktyka tej techniki opiera się na sześciu kluczowych krokach. Po pierwsze, nowatorskie przygotowanie chirurgiczne musi być starannie przeprowadzone, tak aby słup wody do obrazowania nie spływał z szkiełka nakrywkowego, a szkiełko nakrywkowe rozciągało się na obszar nerki, który jest celem pipety. Po drugie, szklana pipeta używana do mikronakłuwania musi być widoczna dla mikroskopii 2-fotonowej, która jest realizowana za pomocą kropek kwantowych. Po trzecie, technika stereotaktyczna jest wymagana do precyzyjnego umieszczenia pipety w przestrzeni Bowmana w trzech wymiarach, do 100 μm poniżej powierzchni nerki. Dlatego precyzyjne rejestrowanie układów współrzędnych pipety i stolika jest kluczowym etapem. Po czwarte, konieczny jest staranny wybór docelowego kłębuszka nerkowego, aby zapewnić mu dostęp do pipety bez wpływu na strukturę nośną nerki i kolumnę obrazowania. Wreszcie, należy dokładnie rozważyć etapy analityczne związane z procedurą pozyskiwania, a objętość i czas pobierania próbek płynu muszą być dostosowane do analizy i fizjologii kłębuszków nerkowych.
Zaprojektowaliśmy procedurę akwizycji, która może być rozszerzona na wiele analiz, w tym tradycyjne punkty końcowe mikronakłucia, takie jak fotometria płomieniowa, pomiary elektrod jonowych, czy pomiary ciśnienia, objętości lub ładunku. Ponadto uważamy, że technika ta będzie podatna na nowatorskie analityczne punkty końcowe, w tym reakcję łańcuchową polimerazy (być może po odwrotnej transkrypcji miRNA) i metabolomikę po spektrometrii mas. Specjalne modyfikacje zastosowane w celu ułatwienia spektrometrii mas zasługują na dodatkowe omówienie i nakładają pewne ograniczenia. Po pierwsze, chociaż spektrometria mas jest bardzo czuła, niska zawartość białka i objętość próbek mikronakłuć sprawiają, że analiza białka znajduje się poniżej dynamicznego zakresu konwencjonalnych badań proteomicznych, a zatem konieczna była uproszczona nanoproteomika. 8,13 Po drugie, aby zoptymalizować wydajność białka dla wczesnych testów, ustaliliśmy, że konieczne jest 200-300 nL aspiratu, ale nabycie tej objętości filtratu de novo wymagałoby być może nawet 20 minut aspiracji, jeśli GFR myszy wynosi tylko 8-14 nL/min 3. Ponieważ Tojo i Endou wykazali, że przedłużona aspiracja zmienia zawartość albuminy we wczesnym płynie kanalików proksymalnych14, zdecydowaliśmy się na aspirację przez 6 minut; Oznacza to jednak, że nasza szybkość zasysania przewyższa szybkość napływu filtratu. Zachęca się użytkowników tej procedury do uwzględnienia fizjologii filtracji kłębuszkowej w swoim systemie eksperymentalnym przy projektowaniu przepływu pracy. Spektrometria mas, czuła technika, zostałaby przytłoczona przez sygnał z wprowadzonego destylatu ropy naftowej, takiego jak olej mineralny, który jest powszechnie stosowany w mikronakłuwaniu w celu uzupełnienia układu hydraulicznego do aspiracji i izolacji segmentów nefronu. Dlatego nie mogliśmy użyć oleju mineralnego do tego celu, ani do jego innego powszechnego zastosowania, oznaczania ilościowego objętości próbek o zakresie nanolitrów. Zamiast tego napełniamy układ perfluorodekaliną, która jest biologicznie obojętna, nie zaburza spektrometrii mas i ma korzystne właściwości optyczne. Uważamy, że ograniczenia narzucone przez perfluorodekalinę są możliwe do pokonania i pracujemy nad dodatkowymi innowacjami technicznymi, które naszym zdaniem pozwolą na pomiar objętości próbki i blokadę odcinka rurkowego.
Większość badań mikronakłuć przeprowadzono na szczurach Monachium-Wistar, które wykazały zwiększoną liczbę kłębuszków nerkowych, ale to znacznie ograniczyło fizjologiczne badania transportu kanalikowego i innej fizjologii nerek z powodu utraty podstawowego narzędzia biologii molekularnej, myszy transgenicznych 2,3. Ponieważ nowa technika ułatwia dostęp mikropipet do przestrzeni Bowmana u myszy, ta nowatorska technika łagodzi te krytyczne ograniczenia. Przyjęliśmy tę technikę w celu uzyskania dostępu do filtratu nerkowego do badań proteomicznych przy użyciu spektrometrii mas o wysokiej czułości, znanej jako nanoproteomika9. Prawdopodobnie jednak pojawią się dodatkowe aplikacje. Na przykład badanie fizjologiczne nerek przefiltrowanego białka zostało znacznie wsparte przez zastosowanie znaczników fluorescencyjnych z mikroskopią 2-fotonową 15,16,17. Dodanie mikronakłucia do mikroskopii 2-fotonowej daje możliwość przeprowadzenia badań fizjologicznych pojedynczych nefronów z cząsteczkami fluorescencyjnymi, dzięki czemu sąsiednie, niewstrzykiwane nefrony mogą służyć jako kontrole. Oczekuje się, że to jasne wyjaśnienie niezbędnych kroków pozwoli na szerokie zastosowanie w laboratoriach już wyposażonych w mikroskopię 2-fotonową i/lub mikronakłuwanie. Chociaż jest to skomplikowane, przeprowadziliśmy tę procedurę wiele razy, a przedstawione w niej udoskonalenia stanowią stabilną platformę dla odkryć fizjologicznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
NIDDK K08 DK090754 do MPH. NIGMS P41 GM103493 do RDS. Materiał ten jest wynikiem pracy (MPH), która została wsparta zasobami i wykorzystaniem obiektów w Portland Veterans Affairs Medical Center. Treść nie reprezentuje poglądów Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych ani rządu Stanów Zjednoczonych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pionowy mikroskop 2-fotonowy | mikroskopu Zeiss | LSM 7MP | |
| 3-osiowy kontroler sceny | czołowej Sutter | MP-285 | |
| Sutter | MP-225 | ||
| Urządzenia | molekularne | 1-HL-U | |
| Urządzenia molekularne | głowicy | CV203BU | |
| FITC-dekstran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
| rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego | Sutter | B150-110-7.5 | |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter | P-97 | |
| Kropki kwantowe, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
| Polisiloksan | Sugru | Brak numeru kota | www.sugru.com, "oryginalna formuła". Dowolny kolor. |
| Rurka PE-50 | Instech Labs | BTPE-50 | |
| Mikrowtryskiwacz | WPI | UMP-3 | |
| Kontroler mikroiniektorów | WPI | Micro4 | |
| Perfluorodekalina | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
| Agaroza | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| Szkiełko nakrywkowe, 10 mm | Aparat Harvarda | 64-0718 | |
| Płyta czołowa | Niestandardowy | Brak numeru części | Powszechne w laboratoriach neurologicznych, wielu dostawców |
| Urządzenie do mocowania głowy | Niestandardowe | Brak numeru części | Powszechne w laboratoriach neurologicznych, wielu dostawców |
| Igła 30 G | Becton-Dickinson | 125393 | Do wstrzykiwań zadoczodołowych |
| Strzykawka tuberkulinowa | Becton-Dickinson | 309626 | Do iniekcji zaoczodołowej |
Bibliografia
- Schnermann, J. Micropuncture analysis of tubuloglomerular feedback regulation in transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (12), 2614-2619 (1999).
- Lorenz, J. N. Micropuncture of the kidney: a primer on techniques. Comprehensive Physiology. 2 (1), 621-637 (2012).
- Vallon, V. Micropuncturing the nephron. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 458 (1), 189-201 (2009).
- Perrien, D. S., et al. Novel methods for microCT-based analyses of vasculature in the renal cortex reveal a loss of perfusable arterioles and glomeruli in eNOS-/- mice. BMC Nephrology. 17, 24(2016).
- Ehling, J., et al. Quantitative Micro-Computed Tomography Imaging of Vascular Dysfunction in Progressive Kidney Diseases. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (2), 520-532 (2016).
- Gimenez, Y., et al. 3D Imaging of Nanoparticle Distribution in Biological Tissue by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. Scientific Reports. 6, 29936(2016).
- Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).
- Piehowski, P. D., Zhao, R., Moore, R. J., Clair, G., Ansong, C. Quantitative proteomic analysis of mass limited tissue samples for spatially resolved tissue profiling. Methods in Molecular Biology. , (2017).
- Yi, L., Piehowski, P. D., Shi, T., Smith, R. D., Qian, W. J. Advances in microscale separations towards nanoproteomics applications. Journal of Chromatography A. 1523, 40-48 (2017).
- Clair, G., et al. Spatially-resolved proteomics: Rapid quantitative analysis of laser capture microdissected alveolar tissue samples. Scientific Reports. 6, 39223(2016).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nanoproteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), 1307-1314 (2016).
- Andrasfalvy, B. K., et al. Quantum dot-based multiphoton fluorescent pipettes for targeted neuronal electrophysiology. Nature Methods. 11 (12), 1237-1241 (2014).
- Huang, E. L., et al. SNaPP: Simplified nano-proteomics platform for reproducible global proteomic analysis of nanogram protein quantities. Endocrinology. 157 (3), (2016).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263 (4 Pt 2), F601-F606 (1992).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
- Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).
- Salmon, A. H., et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (8), 1339-1350 (2012).
Przedruki i uprawnienia
