Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Streszczenie

Kilka patologicznych stanów oka wpływa na funkcjonalność i/lub przetrwanie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Należą do nich niektóre formy barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (RP) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Terapia komórkowa jest jedną z najbardziej obiecujących strategii terapeutycznych zaproponowanych w celu wyleczenia tych chorób, z już obiecującymi wstępnymi wynikami u ludzi. Jednak sposób przygotowania przeszczepu ma znaczący wpływ na jego wyniki funkcjonalne in vivo. Rzeczywiście, komórki RPE przeszczepione jako zawiesina komórkowa są mniej funkcjonalne niż te same komórki przeszczepione jako tkanka siatkówki. W niniejszym artykule opisano prostą i powtarzalną metodę inżynierii tkanki RPE i jej przygotowania do implantacji in vivo. Komórki RPE pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych są wysiewane na podłożu biologicznym, ludzkiej błonie owodniowej (hAM). W porównaniu ze sztucznymi rusztowaniami, to podparcie ma tę zaletę, że ma błonę podstawną, która znajduje się blisko błony Brucha, do której przyczepione są endogenne komórki RPE. Jednak jego manipulacja nie jest łatwa, dlatego opracowaliśmy kilka strategii jego prawidłowej hodowli i przygotowania do szczepienia in vivo.

Wprowadzenie

RPE jest kluczowe dla przetrwania i homeostazy fotoreceptorów, z którymi jest ściśle związany¹. Kilka stanów patologicznych zmienia jego funkcjonalność i/lub przeżycie, w tym RP i AMD.

RP to grupa dziedzicznych mutacji monogenowych, które wpływają na funkcje fotoreceptorów lub komórek RPE, lub obu^2,3. Szacuje się, że mutacje, które wpływają konkretnie na komórki RPE, stanowią 5% RP². AMD to kolejny stan, w którym warstwa RPE ulega zmianie, co ostatecznie prowadzi do utraty widzenia centralnego. AMD jest spowodowane złożonymi interakcjami czynników genetycznych i środowiskowych i dotyka osoby starsze^4,5,6. Według prognoz, do 2020 roku AMD będzie problemem dla 196 milionów pacjentów na całym świecie⁷. Na te zaburzenia nie ma skutecznego lekarstwa, a jedną z proponowanych strategii jest przeszczepianie nowych komórek RPE w celu skompensowania martwych/niefunkcjonalnych wcześniej istniejących komórek RPE⁸.

Sposób formułowania produktu końcowego, który ma być szczepiony, jest niezbędny do zapewnienia najlepszych wyników funkcjonalnych. Komórki RPE wstrzykiwane jako zawiesina komórkowa, mimo że są łatwą i bezpośrednią metodą dostarczania, budzą obawy dotyczące ich przetrwania, integracji i funkcjonalności^{9,10,11,12,13}. Naukowcy opracowują obecnie bardziej złożone preparaty, aby zapewnić zmodyfikowaną tkankę siatkówki^{9,13,14,15,16}. W tym kontekście opracowaliśmy oryginalną metodę generowania in vitro tkanki RPE, która może być wykorzystana do transplantacji⁹.

Banki komórek RPE pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES) są używane w tym protokole. Jednak alternatywne banki komórek RPE z różnych źródeł komórkowych (ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, pierwotne komórki RPE itp.) i różnicowane inną metodą są również odpowiednie dla tego protokołu. Obejmuje protokoły ukierunkowanego różnicowania przy użyciu cytokin i/lub małych cząsteczek^{17,18,19,20,21,22}.

Aby można było przeszczepić, zmodyfikowana tkanka powinna być przygotowana na rusztowaniu. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano różne rusztowania oparte na polimerze lub na matrycy pochodzenia biologicznego^13,23,24. W tym przypadku stosowanym substratem biologicznym jest hAM, ale można zastosować inne substraty, takie jak obnażone błony Brucha. Opisana w niniejszym dokumencie metoda ma tę zaletę, że wykorzystuje rusztowanie biologiczne, które jest bardziej odpowiednie dla rodzimego środowiska RPE.

Ludzkie komórki RPE pochodzące z komórek ES są hodowane przez co najmniej 4 tygodnie, aby mogły być w pełni zorganizowane jako monowarstwa brukowa. Na tym etapie uzyskany nabłonek jest funkcjonalny i spolaryzowany⁹. Wreszcie, ponieważ tkanka ta łatwo się marszczy, jest ona zatopiona w cienkiej warstwie nośnika hydrożelowego, aby nadać jej większą sztywność i elastyczność oraz chronić ją podczas procedury wstrzykiwania. Produkt ten jest następnie przechowywany w temperaturze 4 °C do czasu szczepienia.

Protokół

Wszystkie materiały użyte w tym protokole zostały użyte zgodnie z przepisami Unii Europejskiej. Ludzka linia komórkowa ES wykorzystana w tym badaniu pochodziła z unikalnego zarodka. Para, która oddała zarodek, była w pełni poinformowana i wyraziła zgodę na anonimowe dawstwo. Z tego zarodka uzyskano kliniczną linię ludzkich komórek ES, które zostały zbankowane, zakwalifikowane i odpowiednio udokumentowane przez Roslin Cells (Wielka Brytania). hAM zostały pobrane w sterylnych warunkach podczas cesarskiego cięcia u matek, które podpisały świadomą zgodę na oddanie łożyska zgodnie z wytycznymi szpitala (APHP, Hôpital Saint Louis).

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i odczynników

1. Przygotowanie pożywki do hodowli komórek RPE
   1. Aby przygotować pożywkę do hodowli komórek RPE, dodaj 4% substytut surowicy (20 ml dla końcowej objętości 500 ml), 1000x rozcieńczony 2-merkaptoetanol (500 μl dla końcowej objętości 500 ml) i 1% roztworu aminokwasów endogennych (MEM) dla minimalnej pożywki egzogennej Eagle's (5 ml, dla końcowej objętości 500 ml) firmy Dulbecco do zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (475 ml dla końcowej objętości 500 ml).
2. Przygotowanie podłoża transportowego/konserwującego
   1. W celu przygotowania pożywki transportowej/konserwującej należy dodać 1% penicyliny-streptomycyny (5 ml dla końcowej objętości 500 ml) do pożywki niezależnej od CO₂ (495 ml dla końcowej objętości 500 ml) i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
3. Ponowne zawieszenie enzymu termolizyny
   1. Przygotowanie roztworu podstawowego termolizyny
      1. Aby przygotować podstawowy roztwór termolizyny, należy rozmrozić proszek termolizyny, który był przechowywany w temperaturze -20 °C, w temperaturze pokojowej.
      2. Ponieważ aktywność enzymatyczna może być zmienna w zależności od partii, należy obliczyć tę aktywność na podstawie świadectwa analizy dostarczonego z proszkiem termolizyny z partii, która ma być użyta. Podzielić "Obliczono proteazę neutralną pod względem aktywności = ANPC" (wskazaną w certyfikacie analizy) przez 181 (co jest masą cząsteczkową tyrozyny). Uzyskany wynik odpowiada całkowitej aktywności enzymatycznej dostarczonego proszku termolizyny (U/fiolkę).
      3. Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 200 j./ml, dodając objętość wody odpowiadającą całkowitej aktywności enzymatycznej (U/fiolkę) podzieloną przez 200 (j./ml).
      4. Rozpuść enzym, pipetując wodę, która została dodana w górę iw dół. Wirować roztwór przez 30 sekund i sprawdzić, czy proszek został całkowicie zawieszony. Do całkowitego rozpuszczenia może być konieczne dalsze pipetowanie.
      5. Podzielić roztwór podstawowy na porcje i przechowywać go w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotowanie roztworu roboczego termolizyny
      UWAGA: Roztwór termolizyny musi być przygotowany w dniu zabiegu hAM.
      1. Rozmrozić podstawowe porcje termolizyny w stężeniu 200 U/ml przechowywane w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 200x w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania końcowej aktywności enzymatycznej 1 U/ml. Przygotuj 40 ml do leczenia 1–4 plastrów hAM.
      2. Przed użyciem przefiltrować roztwór termolizyny przez filtr 0,2 μm.
4. Ponowne zawieszenie żelatyny
   1. Przygotowanie 20% roztworu żelatyny i Block
      UWAGA: 20% roztwór i blok żelatyny można przygotować do 1 tygodnia przed użyciem.
      1. Podgrzać podłoże niezależne od CO₂ do temperatury 42 °C w łaźni wodnej przez 30 min (do 1 h). W probówce o pojemności 50 ml dodaj 10 g żelatyny do 40 ml podgrzanej pożywki niezależnej od CO₂ i rozmieszaj roztwór.
      2. Rozpuścić żelatynę przez 30–60 minut w temperaturze 42 °C. Wirować co 10 minut w celu homogenizacji roztworu.
      3. Gdy roztwór będzie jednorodny, dodaj 4 ml 20% roztworu żelatyny do czterech 6-centymetrowych szalek hodowlanych. Unikaj bąbelków. Dodać plastikową folię parafinową w celu ochrony naczyń i pozostawić roztwór do zestalenia się w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotowanie 8% roztworu żelatyny
      UWAGA: 8% roztwór żelatyny można przygotować dzień przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      1. Podgrzać podłoże niezależne od CO₂ do 42 °C przez 30 min (do 1 h). W probówce o pojemności 50 ml dodaj 4 g żelatyny do 46 ml podgrzanej pożywki niezależnej od CO₂ i rozprowadź roztwór.
      2. Rozpuścić żelatynę przez 30–60 minut w temperaturze 42 °C. W celu ochrony probówki należy dodać folię parafinową z tworzywa sztucznego i przechowywać ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, jeśli ma być użyta tego samego dnia, lub przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli ma być użyta później.

2. Leczenie termolizyną ludzkich błon owodniowych

1. Płukanie błony owodniowej człowieka
   1. HAM należy dostarczyć w postaci małych kawałków (około 30 mm x 30 mm) zamocowanych w nylonowym rusztowaniu, już w temperaturze 4 °C w PBS lub zamrożonych. W przypadku zamrożenia membrany rozmrażać w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 30 minut.
   2. Umyj membrany:
      1. Umieść 1-4 membrany w butelce o pojemności 250 ml zawierającej 80 ml PBS. Użyj tylu butelek, ile potrzeba.
      2. Potrząsaj każdą butelką w wytrząsarce talerzowej na wysokich obrotach przez 5 minut, a następnie wyrzuć PBS. Dodaj 80 ml PBS i powtórz czynność.
2. Leczenie termolizyną
   1. Dodać 40 ml roztworu roboczego termolizyny (1 U/ml) na butelkę zawierającą membrany (1-4 membrany na butelkę; do 3 butelek na raz).
   2. Wstrząsaj butelkami przez 5 minut z prędkością 450 obr./min, a następnie wiruj je przez 30 s. Powtórz 1x.
   3. Odrzucić roztwór termolizyny i dodać 80 ml PBS.
   4. Potrząsaj butelkami przez 5 minut przy 450 obr./min. Wyrzuć PBS i dodaj 80 ml PBS. Powtórz 3 razy.

3. Utrwalenie błon owodniowych człowieka na wkładce hodowlanej

1. Użyj długich sterylnych kleszczyków (które mogą sięgać dna butelki), aby usunąć hAM jeden po drugim i przenieś każdy hAM do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego 10 ml PBS.
2. W nowym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm, zawierającym 10 ml PBS, umieść jedną z membran nylonem skierowanym w dół. Odłącz dwa z czterech zacisków, które służą do mocowania membrany do nylonu.
3. Włóż mniejszy pierścień wkładki hodowlanej między nylon a membranę.
4. Upewnij się, że membrana całkowicie zakrywa mniejszy pierścień. Przypnij drugą część wkładu hodowlanego do górnej części membrany. Błona podstawna hAM jest skierowana do góry wewnątrz wkładki hodowlanej. Odłącz dwa ostatnie klipsy.
5. W razie potrzeby odciąć sterylnymi nożyczkami nadmiar błony na zewnątrz wkładki hodowlanej. Za pomocą kleszczy przenieść membranę utrwaloną we wkładce hodowlanej na płytkę 12-dołkową, dodać PBS i przechowywać płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Powtórz te czynności (od kroku 3.2 do 3.5) z pozostałymi membranami.

4. Rozmrażanie i wysiewanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na błonach owodniowych

1. Rozmrażanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki
   1. Bank komórek RPE zamraża się w ciekłym azocie po 1 milionie komórek na fiolkę kriogeniczną. Rozmrozić tyle fiolek kriogenicznych, ile potrzeba (350 000 komórek jest wysiewanych na błonę).
   2. Przygotować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 3 ml pożywki RPE na fiolkę kriogeniczną. Po rozmrożeniu fiolki przenieść komórki do każdej probówki. Powtórzyć tę operację dla pozostałych fiolek.
   3. Homogenizować (kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki w pożywce RPE) i pobrać 10 μl roztworu komórkowego i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl błękitu trypanowego. Umieść 15 μl tego roztworu w komorze liczącej, a następnie policz liczbę żywych komórek (nie zabarwionych na niebiesko) pod mikroskopem z obiektywem 4X. Powtórzyć tę operację dla pozostałych fiolek.
   4. W międzyczasie odwirować probówki o pojemności 15 ml o sile 110 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 700 000 komórek/ml.
2. Wysiewanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do ludzkich błon owodniowych
   1. Wyjąć z inkubatora 12-dołkową płytkę zawierającą błony.
   2. Zassać PBS. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 4.1.4 w środku wkładki hodowlanej. Dodać 1 ml pożywki RPE na zewnątrz wkładu hodowlanego (do studzienki). Powtórz tę czynność dla pozostałych membran.
   3. Umieścić 12-dołkową płytkę zawierającą błony w inkubatorze.

5. Utrzymanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na błonach owodniowych człowieka

1. Odnawiaj pożywkę 2 razy w tygodniu, zwykle w poniedziałki i piątki, co najmniej do 30 dnia hodowli.
2. Odessać pożywkę wewnątrz i na zewnątrz wkładki hodowlanej dla każdej studzienki i odnowić ją świeżą pożywką (1 ml na zewnątrz wkładki hodowlanej i 500 μl wewnątrz). Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}

6. Przygotowanie plastra nabłonka barwnikowego siatkówki do przeszczepu

UWAGA: Począwszy od 30 dnia hodowli, tkanka jest gotowa do przeszczepu.

1. Ogrzewać 8% roztwór żelatyny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Napełnić wewnętrzną komorę wibratomu zimnym podłożem niezależnym od CO₂ (w temperaturze 4 °C).
2. Umieść 20% blok żelatyny w wibratomie.
   1. Wyjmij z lodówki 6 cm naczynie hodowlane zawierające blok 20% żelatyny. Za pomocą skalpela wytnij blok o wymiarach 5 cm x 5 cm. Wklej górną stronę bloku do wspornika za pomocą kleju cyjanoakrylowego lub jego odpowiednika.
   2. Umieść nowe ostrze w wibratomie.
   3. Dostosuj poziom bloku, aż znajdzie się na tym samym poziomie żyletki.
   4. Napełnić wannę wokół podpory świeżym podłożem niezależnym od CO₂ w temperaturze 4 °C. Przeciąć blok wibratomem z prędkością średnią, aż blok zostanie równomiernie przecięty, co doprowadzi do uzyskania gładkiej powierzchni. Ustaw pozycję 0.
   5. Odessać pożywkę wokół bloku żelatyny aż do całkowitego wyschnięcia, a następnie pobrać 12-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą tkanki z inkubatora w temperaturze 37 °C.
   6. Za pomocą kleszczy ostrożnie otwórz wkładkę hodowlaną na górze bloku żelatyny. Przeciąć nożyczkami wszystkie części błon, które nie zawierają komórek (poza pierścieniem, w którym komórki nie były hodowane). Zassać całe pozostałe podłoże.
   7. Dodać 1 ml płynnego 8% roztworu żelatyny o temperaturze 37 °C w celu pokrycia membran. Ostrożnie usuń nadmiar. Odczekaj 5–8 minut, aby żelatyna stężała.
   8. Dodać świeżą pożywkę niezależną od CO₂ (w temperaturze 4 °C) do kąpieli, aż membrana zostanie pokryta.
   9. Cięcie, z wibratomem w pozycji -100 μm, ze średnią prędkością, zachowując świadomość tego, jak zachowuje się blok. Pod koniec sekcji należy uważać, aby utrzymać orientację tkanki.
   10. Za pomocą skalpela wytnij róg, aby określić orientację sekcji.
   11. Zebrać szpatułką membranę zatopioną w żelatynie i umieścić ją w 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką konserwującą w temperaturze 4 °C, aż do wszczepienia jej do oka biorcy.
   12. W momencie przeszczepienia należy dostosować wielkość implantu do wielkości oka biorcy pod mikroskopem operacyjnym (1–3 dla szczurów, 10–15^mm2 dla naczelnych innych niż ludzie).

Wyniki

hAMs zawierają warstwę nabłonkową, która powinna zostać usunięta przed zasiewem komórek RPE. Enzymatyczną obróbkę błony przeprowadza się za pomocą termolizyny pod wstrząsem. Aby nie stracić polaryzacji błony (nabłonek znajduje się po jednej stronie), jest ona mocowana na podłożu, którego skład może się różnić w zależności od dostawcy (Rysunek 1A). Na tym etapie sprawdź przyczepność membrany do jej podparcia i w razie potrzeby dodaj klipsy. W momencie utrwalania we wsta...

Dyskusja

Opisano metodę hodowli komórek RPE na rusztowaniu biologicznym i jej przygotowania do implantacji w modelach zwierzęcych. Jednym z krytycznych etapów protokołu jest utrzymanie orientacji hAM przez cały czas trwania procedury, aż do jego włączenia do żelatyny. Rzeczywiście, natywny nabłonek błony jest usuwany, a jego błona podstawna zostaje odsłonięta⁹. Komórki RPE muszą być wysiane na tej błonie podstawnej. Podczas przygotowywania do zatapiania żelatyny ważne jest, aby pracować ze wszystkimi produ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylna szafa bezpieczeństwa biologicznego	TechGen International	Nie dotyczy
System usuwania odpadów płynnych do aspiracji	Vacuubrand	BVC 21
CO2 kontrolowany +37  ° Inkubator komórek C	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200  &mikro; Pipeta L: P200	Gilson	F144565
1  Pipeta mL: P1000	Gilson	F144566
Pipet	Drummond	75001
+4  ° C lodówka	Liebherr	Nie dotyczy
Vibratome	Leica	VT1000S
Drobne nożyczki	WPI	501758
Kleszcze (x2)	WPI	555227F
Łaźnia wodna	Grant subaqua pro	SUB6
Waga precyzyjna	Wirówka
	Eppendorff	5804
Mikroskop	Olympus	SC30
Wytrząsarka pozioma na biegunach	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
Vortex	VWR	LAB DANCER S40
Jednorazowy skalpel	WPI	500351
plastikowa folia parafinowa	VWR	PM992
0,200 &mikro; m Filtr strzykawkowy jednorazowego użytku	SARTORIUS	16532
Strzykawka bez igły 50 ml	Dutscher	50012
Butelki 250 ml	Dutscher	28024
15 ml sterylne probówki Falcon	Dutscher	352097
50 ml sterylne probówki Falcon	Dutscher	352098
wkładka hodowlana	Scaffdex	C00001N
60  mm dysze do hodowli komórkowych: B6	Dutscher	353004
12-dołkowa płytka do hodowli komórkowych	Corning	3512
6-dołkowe płytki do hodowli	Corning	3506
Żyletki	Ted Pella, Inc	121-9
Klej cyjanoakrylowy	Castorama	3178040670105
PBS 1x (500  mL)	Sigma	D8537
Thermolysine	Roche	5339880001
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA (100x)	Invitrogen	11140-035
b-merkaptoetanol (50  mM)	Invitrogen	31350-010
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen	15140122
CO2-independent	GIBCO	18045-054
Żelatyna	MERCK	104078
ludzka błona owodniowa	Bank tkanek Szpital St Louis (Paryż, Francja)	Nie dotyczy