Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58222

⸱

20 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, 2College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, 3Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Streszczenie

Regulacja zagęszczenia chromatyny jest ważnym procesem, który reguluje ekspresję genów u wyższych eukariontów. Chociaż zagęszczenie chromatyny i regulacja ekspresji genów są powszechnie zakłócone w wielu chorobach, brakowało specyficznej dla locus, endogennej i odwracalnej metody badania i kontrolowania tych mechanizmów działania. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy nowe dwufunkcyjne cząsteczki regulujące geny. Jeden składnik dwufunkcyjnej cząsteczki wiąże się z kotwicą DNA-białko, dzięki czemu zostanie zrekrutowany do locus specyficznego dla alleli. Drugi składnik angażuje endogenną maszynerię modyfikującą chromatynę komórkową, rekrutując te białka do interesującego genu. Te małe cząsteczki, zwane chemicznymi modyfikatorami epigenetycznymi (CEM), są zdolne do kontrolowania ekspresji genów i środowiska chromatyny w sposób zależny od dawki i odwracalny. W tym miejscu szczegółowo opisujemy podejście CEM i jego zastosowanie w celu zmniejszenia ekspresji genów i acetylacji ogona histonów w reporterze białka zielonej fluorescencji (GFP) zlokalizowanym w locus Oct4 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC). Charakteryzujemy wiodący CEM (CEM23) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Podczas gdy moc tego systemu została zademonstrowana w locus Oct4, koncepcyjnie technologia CEM jest modułowa i może być stosowana w innych typach komórek i w innych loci genomowych.

Wprowadzenie

Chromatyna składa się z DNA owiniętego wokół białek oktameru histonowego, które tworzą cząstkę rdzenia nukleosomu. Regulacja zagęszczenia chromatyny jest podstawowym mechanizmem prawidłowej naprawy, replikacji i ekspresji DNA1,2,3. Jednym ze sposobów, w jaki komórki kontrolują poziom zagęszczenia, jest dodawanie lub usuwanie różnych potranslacyjnych modyfikacji ogona histonowego. Dwie takie modyfikacje obejmują (1) acetylację lizyny, która jest najczęściej związana z aktywacją genów, oraz (2) metylację lizyny, która może być związana z aktywacją lub represją genu, w zależności od kontekstu aminokwasowego. Dodanie znaczników acetylacji i metylacji jest katalizowane odpowiednio przez acetylotransferazy histonowe (HAT) i metylotransferazy histonowe (HMT), podczas gdy usuwanie znaku odbywa się odpowiednio przez deacetylazy histonowe (HDAC) i demetylazy histonowe (HDM)4,5. Chociaż istnienie tych białek jest znane od dziesięcioleci, wiele mechanizmów działania maszynerii modyfikującej chromatynę w celu prawidłowej regulacji ekspresji genów pozostaje do zdefiniowania. Ponieważ procesy regulacyjne chromatyny są rozregulowane w wielu chorobach ludzkich, nowe informacje mechanistyczne mogą prowadzić do przyszłych zastosowań terapeutycznych.

Test chromatyny in vivo (CiA) to niedawno opisana technika, która wykorzystuje chemiczny induktor bliskości () do kontrolowania rekrutacji maszynerii modyfikującej chromatynę do określonego locus6. Technologia ta została wykorzystana do zbadania rosnącej listy dynamiki chromatyny, w tym białek modyfikujących histony, remodelerów chromatyny i czynników transkrypcyjnych6,7,8,9. Wiązanie chromatyny oparte na białek o ekspresji egzogennej zostało również rozszerzone poza CiA w celu modulacji niezmodyfikowanych loci genetycznych poprzez zastosowanie z dezaktywowanym białkiem związanym z Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) (dCas9)10,11. W systemie CiA mESC zostały zmodyfikowane w celu ekspresji genu reporterowego GFP w locus Oct4, wysoce eksprymowanym i ściśle regulowanym obszarze genomu mESC. Wcześniej system ten był stosowany do opisu zależnej od dawki i odwracalnej rekrutacji egzogennego białka heterochromatyny 1 (HP1), enzymu, który wiąże H3K9me3 i propaguje znaczniki represyjne (np. H3K9me3) i metylację DNA6. Aby zrealizować ten rodzaj strategii rekrutacji, mESC są zakażone plazmidem, który wyraża białko wiążące FK506 (FKBP) połączone z Gal4, który jest kotwicą DNA-białko, która wiąże się z macierzą wiążącą Gal4 przed reporterem GFP. Komórki są również zakażone domeną wiążącą FKBP-rapamycynę (FRB) połączoną z HP1. Gdy mESC są wystawione na działanie niskich nanomolowych stężeń, rapamycyna, zarówno FRB, jak i FKBP, są łączone w miejscu docelowym. W ciągu kilku dni po leczeniu rapamycyną ekspresja genu docelowego zostaje stłumiona, o czym świadczy mikroskopia fluorescencyjna i cytometria przepływowa, a acetylacja histonów jest zmniejszona, co wykazano za pomocą sekwencjonowania ChIP i wodorosiarczynu. Chociaż rozwój i walidacja tego podejścia były znaczącymi postępami w dziedzinie badań i regulacji chromatyny, jedną z wad jest wymagana egzogenna ekspresja maszynerii modyfikującej chromatynę.

Aby technologia opierała się na rekrutacji tylko endogennych fizjologicznie istotnych enzymów i stworzyć bardziej modułowy system, zaprojektowaliśmy i scharakteryzowaliśmy nowe dwufunkcyjne cząsteczki, zwane CEMs (Rysunek 1)12. Jednym ze składników CEM jest FK506, który, podobnie jak rapamycyna, ściśle i specyficznie wiąże się z FKBP. W związku z tym CEM będą nadal rekrutowane do locus Oct4 w mESC CiA. Drugim składnikiem CEM-ów jest ugrupowanie, które wiąże endogenną maszynerię modyfikującą chromatynę. W badaniu pilotażowym przetestowaliśmy CEM, które zawierają inhibitory HDAC. Chociaż koncepcja użycia inhibitora do rekrutacji HDAC wydaje się sprzeczna z intuicją, inhibitor jest jednak w stanie zrekrutować aktywność HDAC do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez (1) przekierowanie HDAC do locus, uwolnienie enzymu i zwiększenie gęstości niehamowanych HDAC w tym obszarze oraz (2) utrzymanie hamowania HDAC w locus, ale rekrutację kompleksów represyjnych, które wiążą się z hamowanymi HDAC, lub (3) kombinację obu. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że CEM były w stanie skutecznie stłumić reportera GFP w sposób zależny od dawki i czasu, a także w sposób, który był szybko odwracalny (tj. w ciągu 24 godzin)12. Scharakteryzowaliśmy zdolność przedstawionej tutaj technologii CEM do kontrolowania ekspresji genów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej oraz zdolność do kontrolowania środowiska chromatyny za pomocą ChIP-qPCR6. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystania i charakterystyki CEM, która ułatwi adaptację tego systemu do odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z biologią chromatyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1) Hodowla linii komórkowej do produkcji lentiwirusa

  1. Hoduj świeże, niskopasażowe (mniej niż pasaż 30) ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK) 293T w zmodyfikowanym podłożu bazowym Eagle's Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy Dulbecco uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10 mM HEPES, 1x aminokwasami endogennymi (NEAA), Pen/Strep, 2-merkaptoenthanolem w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Dziel komórki co 3 - 5 dni i zanim staną się > 95% zlewające.
  2. Pasaż komórek 293T HEK z 18 x 106 na 15-centymetrową płytkę (jedna 15-centymetrowa płytka na każdy wyprodukowany wirus).
    1. W przypadku formatu 15 cm odessaj stare podłoże, dodaj 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), odessaj PBS i dodaj 3 ml 0,05% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez 8 minut w temperaturze 37 °C, kołysząc i stukając w komórki w połowie inkubacji.
      UWAGA: Celem tego kroku jest wprowadzenie komórek do zawiesiny jednokomórkowej.
  3. Gdy następnego dnia komórki osiągną zbieżność 60% - 80%, wykonaj transfekcję polietyleneniminy (PEI) z 13,5 μg plazmidu psPAX2, 4,5 μg plazmidu pMD2.G, 18 μg wektora dostarczania zgodnego z lentiwirusem z genem będącym przedmiotem zainteresowania (tj. FKBP-Gal4), 108 μl PEI i 1,8 ml pożywki do transfekcji.
    1. Delikatnie wymieszaj DNA, PEI i pożywkę do transfekcji w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut i dodawaj ją kroplami do 15-centymetrowej płytki.
      UWAGA: Po tym kroku należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa i przestrzegać wszystkich instytucjonalnych i laboratoryjnych procedur bezpieczeństwa, ponieważ wszystkie odczynniki będą zawierały żywego wirusa.
  4. Po 16 godzinach transfekcji i inkubacji w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 należy odessać pożywkę i delikatnie dodać świeżą pożywkę o temperaturze 293 HEK (podgrzaną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) do płytek o średnicy 15 cm. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 godzin po zmianie pożywki. Wirus jest wtedy gotowy do zbioru.

2) Zakażenie embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) lentiwirusem

  1. Hoduj niskopasażowe (mniej niż pasaż 35), przystosowane do karmienia mESC CiA w pożywkach bazowych DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionych 20% FBS klasy ESC, 10 mM HEPES, 1x NEAA, Pen/Strep, 2-merkaptoenthanol i czynnik inhibitora białaczki 1:500 (LIF) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: LIF otrzymuje się z supernatantu komórek wytwarzających COS LIF, które są zbierane w partii i zamrażane w temperaturze -80 °C.
    1. Hoduj komórki na płytkach, które były wstępnie inkubowane przez 1 - 3 godziny z 0,1% żelatyny w 1x PBS, a następnie przemyte 1x PBS. Karmić komórki codziennie i dzielić je co 2 - 3 dni, w zależności od ich gęstości.
      UWAGA: Pod względem morfologicznym kolonie embrionalnych komórek macierzystych (ES) powinny być małe, okrągłe i różnić się od siebie.
  2. Przejście mESC do 12-dołkowej płytki (100 000 komórek/dołek) 1 dzień przed zakażeniem.
    1. Policz komórki za pomocą hemocytometru. W przypadku komórek hodowanych w formacie 10 cm odessać stare podłoże, dodać 5 ml 1x PBS, odessać PBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubować komórki w trypsynie przez 8 minut w temperaturze 37 °C, kołysząc i stukając w komórki w połowie inkubacji. Celem tego etapu jest wprowadzenie komórek do zawiesiny jednokomórkowej.
  3. 48 godzin po zmianie pożywki z komórek opakowania wirusa 293T15 cm z kroku 1.4 należy usunąć i przenieść supernatant do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Odwirować supernatant o sile 300 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórek.
  5. Przefiltrować supernatant przez membranę 0,45 μm.
    UWAGA: Upewnij się, że używasz membran z octanu celulozy (SFCA) niezawierających środków powierzchniowo czynnych, ponieważ niektóre inne materiały mogą zatrzymywać wirusa i znacznie zmniejszać wydajność.
  6. Zagęścić wirusa za pomocą ultrawirowania, używając wirówki z wirnikiem SW32 i wirować z prędkością 20 000 obr./min (~72 000 x g) przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.
  7. Podczas gdy wirus koncentruje się w ultrawirowaniu, należy potraktować mESC CiA na płytce 12-dołkowej świeżą pożywką ES zawierającą 5 μg/ml polibrenu.
  8. Po osiągnięciu stężenia wirusa ostrożnie odessać supernatant i zawiesić osad wirusa w 100 μl 1x PBS (unikać nadmiaru pęcherzyków).
  9. Dodaj wirusa i 1x PBS do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Odwiruj/potrząśnij probówką o gramaturze 300 x g (lub przy najniższym ustawieniu), aby całkowicie zawiesić wirusa. Wiruj probówkę w mini wirówce stołowej przez 5 - 10 sekund, aby usunąć pęcherzyki.
  10. Dodać 30 μl wirusa do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Zamieszać płytkę, a następnie odwirować płytkę przy 1 000 x g przez 20 min.
    UWAGA: Ilość dodawanego wirusa może się różnić w zależności od miana wirusa, które jest odwrotnie proporcjonalne do wielkości konstruktu dostarczającego.
    1. Alternatywnie, wirus należy błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem i przechowywać go w temperaturze -80 °C. Jednak zamrożenie wirusa obniży miano wirusa.
  11. Umieścić 12-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i zmienić pożywkę następnego ranka (~16 godzin później) na świeżą pożywkę ES (jak opisano w kroku 2.1).
  12. Po 48 godzinach od zakażenia należy wybrać komórki, które integrowały plazmid wirusa, dodając odpowiedni antybiotyk (tj. 1,5 μg/ml puromycyny, 10 μg/ml blasticydyny itp.). Zmieniaj pożywkę codziennie i myj komórki 1x PBS, jeśli większość komórek jest pływająca/martwa. Przechowywać pożywkę selekcyjną na komórkach przez 72 - 96 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .

3) Przygotowanie i leczenie chemicznych modyfikatorów epigenetycznych (CEM)

  1. Zawiesić sproszkowany CEM w dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia podstawowego 1 mM i stężenia roboczego 100 μM.
  2. Po poddaniu komórek selekcji przez 72 - 96 godzin, podziel mESC na format 12-dołkowy ze 100 000 komórek/dołek. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Następnie przygotuj roztwór pożywki o stężeniu 100 nM CEM z pożywką ES. Użyj tej pożywki do zasilania mESC CiA 1 ml / studzienkę. Aby służyć jako kontrola, utrzymuj studnię komórek bez żadnych dodatkowych CEM-ów.
    1. Zmienić pożywkę, odsysając stare pożywki i dodając 1 ml/studzienkę świeżo przygotowanej pożywki ES zawierającej CEM lub wolnej od CEM co 24 godziny przez czas trwania eksperymentu.

4) Analiza ekspresji za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej

  1. Po 48 godzinach leczenia CEM należy zobrazować komórki bez leczenia CEM i komórki potraktowane 100 nM CEM za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonaj reprezentatywne zdjęcia za pomocą fazy lub jasnego pola, aby zarejestrować morfologię mESC przy 20-krotnym powiększeniu; Komórki powinny uformować okrągłe kolonie z kilkoma zróżnicowanymi komórkami. W kanale fluorescencyjnym FITC zobrazuj oba warunki komórki.
  2. Wyizoluj komórki kontrolne i poddane działaniu CEM do cytometrii przepływowej, odsysając pożywkę, przemłukując komórki 1 ml 1x PBS, odsysając PBS i dodając 0,25 ml 0,25% trypsyny z EDTA przez 8 - 10 min.
  3. Upewnij się, że komórki nie są już w dużych kępach, patrząc w mikroskop. Użyj 20-krotnego powiększenia. Jeśli wydaje się, że komórki nie znajdują się w zawiesinie jednokomórkowej, delikatnie pipetuj w górę i w dół pipetą P1000, aby w pełni trypsynizować komórki.
  4. Ugasić trypsynę 1 ml świeżej pożywki i ponownie zawiesić komórki z dużą prędkością za pomocą pipety serologicznej (lub pipety i końcówki P1000), aż komórki znajdą się w zawiesinie jednokomórkowej.
  5. Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant. Przemyć 1x PBS i ponownie odwirować komórki. Odessać supernatant PBS.
  6. Zawiesić osad komórkowy w 200 ml buforu FACS (1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA], 1x PBS i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej [BSA]).
    1. Całkowita objętość bufora FACS będzie zależała od liczby obecnych komórek, ale stężenie powinno wynosić 1,000 - 3,000 komórek/μL. Policz liczbę komórek w 3 próbkach i uśrednij stężenie komórek. W razie potrzeby dodaj więcej bufora FACS.
  7. Wykonaj cytometrię przepływową na > 50 000 komórek z zawieszonymi komórkami, utrzymując komórki na lodzie, gdy nie są analizowane. Użyj filtra 530/40 (FITC, AF488, GFP itp.) do rejestrowania zmian w wyrażeniu. Określ odpowiednie napięcie fluorescencyjne za pomocą niepoddanej działaniu substancji próbki ogniwa kontrolnego i ustaw napięcie tak, aby pik fluorescencyjny znajdował się w środku zarejestrowanego widma intensywności. Próbki należy uruchamiać z prędkością osłony około 5 000 komórek/s.
  8. Wyeksportuj dane i przeanalizuj pliki FCS w programie do cytometrii przepływowej (tj. FlowJo), bramkując najpierw na rozproszeniu do przodu i rozrzuceniu bocznym dla żywych komórek, a następnie na wysokości rozproszenia do przodu w zależności od obszaru dla singletów. Następnie zwizualizuj dane kanału GFP na histogramie, aby określić względne wyrażenie GFP w populacji docelowej i kontrolnej.

5) Analiza chromatyny za pomocą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie qPCR

  1. Podzielić mESC na 10-centymetrową płytkę z 3 milionami komórek i 10 ml pożywki ES (jedna 10-centymetrowa płytka na każdy warunek eksperymentalny lub kontrolny). Następnego dnia dodaj 10 ml pożywki zawierającej CEM lub wolnej od CEM. Po 48 godzinach leczenia CEM odessać stare podłoże. Umyj i odessaj komórki 5 ml 1x PBS. Następnie zdysocjuj komórki za pomocą 0,25% trypsyny i wygadź trypsynę za pomocą 10 ml pożywki ES. Policz i wyizoluj próbkę 10 milionów komórek na warunek.
  2. Odwiruj każdą z 10 milionów próbek komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut.
  3. Zawiesić każdą osadkę w 10 ml 1x PBS i ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut.
  4. Zawiesić każdą osadkę w 10 ml buforu CiA Fix (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM glikolu etylenowego-bis[ß-aminoetylowego eter]-N,N,N',N'-tetraoctowego [EGTA] pH 8 i 100 mM chlorku sodu [NaCl]). Dodać 1 ml 11% roztworu formaldehydu i natychmiast odwrócić próbki 5x - 10x. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Dodaj 0,5 ml 2,5 M glicyny. Natychmiast odwrócić próbki i inkubować próbkę na lodzie przez 5 minut.
  6. Odwirować próbkę o sile 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant.
  7. Zawiesić osad w 10 ml CiA Rinse 1 (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10% glicerol, 0,5% Nonidet P-40 [NP40] i 0,25% Triton X100). Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut. Odwirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Zawiesić osad w 10 ml CiA Rinse 2 (10 mM tris[hydroksymetylo]aminometan [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 i 200 mM NaCl). Odwirować próbkę o sile 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Delikatnie dodaj 5 ml buforu ścinającego CiA (0,1% SDS, 1 mM EDTA i 10 mM Tris pH 8) wzdłuż boków stożkowej probówki, aby zmyć sól bez naruszania osadu. Odwirować próbkę o masie 1 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Powtórzyć etap płukania.
  10. Zawiesić osad w 90 μl buforu ścinającego CiA i świeżych inhibitorów proteazy (użyć mieszaniny leupeptyny, chymostatyny i pepstatyny A rozpuszczonych razem w ilości 10 mg / ml każdy w DMSO, aby uzyskać 1,000x roztwór podstawowy, co daje końcowe stężenie 10 μg / ml). Dodaj 10 μl nanokropelek wzmacniających sonikację, utrzymując wszystko na lodzie13,14.
  11. Przenieść 100 μl roztworu do szklanej probówki i zamknąć probówkę.
  12. Sonikować próbki przez 3,5 minuty (oznaczone na podstawie linii komórkowej i liczby komórek). Aby uniknąć przegrzania próbek, należy je przetwarzać w maksymalnym czasie cyklu 2 minuty, jeśli całkowity czas sonikacji przekracza 2 min.
    Uwaga: Zastosowany tutaj skoncentrowany ultradźwięki działa na wysokiej częstotliwości (500 kHz). Uruchom maszynę z mocą akustyczną 55 W. Czas trwania sonikacji powinien być z góry określony przez każde laboratorium z osobna.
  13. Przenieś każdą sonifikowaną próbkę chromatyny do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować probówki o sile 8 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  14. Aby przeanalizować wydajność ścinania i określić ilościowo względną ilość chromatyny, postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu ChIP.
    UWAGA: Określ stężenie DNA spektrofotometrycznie (np. za pomocą przyrządu do nanokropli DNA) i uruchom ~ 200 ng DNA na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić, czy chromatyna jest sonikowana do około 200 - 500 par zasad (bp).
  15. Aby przeprowadzić immunoprecypitację i wyizolować chromatynę, postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu ChIP.
    UWAGA: W celu immunoprecypitacji próbek o wyższych stężeniach DNA należy ogrzać bufor elucyjny w temperaturze 37 °C i wymyć próbki 2x za pomocą 30 μl buforu elucyjnego (wirując za każdym razem przez 1 minutę).
  16. Aby wykonać qPCR, załaduj odczynniki do płytki 384-dołkowej. Dodać 5 μl 2x asymetrycznej cyjaninowej mieszanki barwników, 2,5 μM każdego startera, wodę i 0,1 - 10 ng DNA do każdej reakcji.
    1. Zaprojektuj startery do amplifikacji amplikonów 50 - 100 pz, a wartości CT są znormalizowane do genu utrzymania domu, intracisternalnych cząstek typu A (IAP).
      UWAGA: Więcej informacji na temat metod qPCR można znaleźć w protokole producenta zestawu. Zestaw starterów użyty do namierzenia locus Oct4 był następujący: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGCC. Zestaw starterów kontrolnych używany do kierowania na IAP był następujący: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.
    2. W oparciu o podkłady i pożądany produkt uruchomić qPCR z 40 cyklami wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 min.
      UWAGA: Uzyskane dane określono ilościowo przy użyciu porównań delta-delta Ct między próbkami, przy czym CiA:Oct4 znormalizowane przez IAP. Końcowe wyniki analizy są przedstawiane jako średnie z trzech próbek doświadczalnych, przy czym błąd jest reprezentowany jako odchylenie standardowe od średniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niedawno opracowaliśmy CEM-y i wykazaliśmy, że technologia ta może być stosowana do regulacji ekspresji genów oraz środowiska chromatyny w locus reporterowym w sposób zależny od dawki i odwracalny. Na Rysunku 1 przedstawiono model wiodącego CEM, CEM23. Aparat HDAC jest rekrutowany do locus reporterowego przez inhibitor HDAC, którym w tym przypadku jest reporter GFP wstawiony do locus Oct4.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy niedawno opracowany system CEM stosowany do regulacji ekspresji genów i środowiska chromatyny w określonym genie w sposób zależny od dawki. Zapewniamy dokładną metodę badania dynamiki związanej z regulacją ekspresji genów poprzez selektywną rekrutację określonych endogennych białek regulatorowych chromatyny. Jest to wysoce modułowa technologia, którą można zastosować do zbadania, w jaki sposób różne kompleksy modyfikujące białka i chromatynę współpracują ze sobą, aby prawidłowo regulować środowis...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratoriów Hathaway i Jin za ich pomocne dyskusje. Autorzy dziękują również Danowi Cronie i Ianowi MacDonaldowi za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace te były częściowo wspierane przez Granta R01GM118653 z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (dla N.A.H.); oraz przez Granty R01GM122749, R01CA218600 i R01HD088626 z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych (do J.J.). Prace te były również wspierane przez poziom 3 i grant studencki z UNC Eshelman Institute for Innovation (odpowiednio dla N.A.H i A.M.C). Dodatkowe fundusze z GM007092 T-32 (dla A.M.C.) wsparły te prace. Dane z cytometrii przepływowej uzyskano w UNC Flow Cytometry Core Facility, finansowanym z grantu P30 CA016086 Cancer Center Core Support Grant dla UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMCorning10-013CV
NEAAGibco11140-050
HEPES (do hodowli tkankowych)Corning25-060-Cl
BME (2-merkaptoetanol)Gibco21985-023
FBSAtlantic BiologicalsS11550Indywidualne partie przetestowane pod kątem jakości
probówekCovarisThermoScientificC4008-632R
Nakrętki CovarisThermoScientificC4008-2A
PEI (polietylenimina)Polysciences23966-1
Media transfekcyjne (Opti-mem)Gibco31985070
Probówki wirówkowe do wirusówBeckman Coulter344058
Membrana filtrująca wirusyCorning431220
PolybreneSanta Cruz BiotechnologySC134220
0,25 % TrypsynaGibco25200-056z EDTA
0,05 % TrypsynaGibco25400-054z EDTA
PuromycynaInvivoGenant-pr
BlasticidinInvivoGenant-bl
SYBR Green Master Mix (asymetryczny barwnik cyjaninowy)Przeciwciało
H3K27acAbcamab4729
(zestaw ChIP) Zestaw o wysokiej czułości ChIP-ITActive Motif53040
SonicatorCovarisE110
UltrawirówkaOptimaXPN-80
SW-32 wirnik wirówkiBeckman Coulter14U4354
Wiadra wirówkowe SW-32 TiBeckman Coulter130.2
LentiX 293 Ludzka embrionalna nerkaClontech632180
PBSCorning46-013-CM
BSAFisherBP9700
EGTASigmaE3889
EDTAFisherS311-100
NaClFisherS271-1
GlicerolFisherG33-1
TrisFisherBP152
NP40Roche11754599001
TritonMP Biomedicals807426
GlicynaFisherBP381-500
Bufor TEFisherBP2474-1
HEPES (dla ChIP)FisherBP310-100
GelatinSigmaG1890
Cytometr przepływowy, Attune NxTThermo FisherA24858
Plazmid FKBP-Gal4Addgene44245
plazmid psPAX2Addgene12260
plazmid pMD2.GAddgene12259
NanokropelkiMegaShearN/A
DNA NanodropThermo FisherND1000
Inhibitory proteazy (Leupeptin)Calbiochem/EMD108975
Inhibitory proteazy (Chymostatin)Calbiochem/EMD230790
Inhibitory proteazy (pepstatyna)Calbiochem/EMD516481
CiA:Oct4 mESCMiły dar G. Crabtree
Lif-1C-alfa - wytwarzanie komórek CosMiły dar J. Wysockiej
Roche 4913914001

Bibliografia

  1. Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
  2. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Gräff, J., Tsai, L. -H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
  5. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
  6. Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
  7. Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
  8. Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
  9. Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
  10. Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
  11. Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560(2017).
  12. Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
  13. Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014(2015).
  14. Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
  15. Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja ekspresji gen wimmunoprecypitacja chromatynyanaliza cytometrii przep ywowejmikroskopia fluorescencyjnaembrionalne kom rki macierzyste myszytest reporterowy GFPprotok transfekcji wirusowejwykrywanie acetylacji histon wanaliza ilo ciowej PCR
Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.